CN108330159A - 一种检测试剂卡和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测试剂卡和试剂盒，涉及疾病检测试剂技术领域。本发明公开的检测试剂卡，设有可检测唾液酸苷酶、过氧化氢酶、白细胞酯酶或pH值指标的检测槽。本发明还提供包含上述试剂卡及自热垫的细菌性***病多指标自检测试剂盒。本发明的试剂卡各项指标检测互相独立，均为一步法反应，无需加额外的显色液或者终止液，受试者仅需将采集的***分泌物加至试剂卡内即可进行检测；试剂盒引入自热垫，无需另外配备加热设备，检测条件大大放宽，方便受试者在家中使用，有利于细菌性***病检测的家庭化推广。

Description

一种检测试剂卡和试剂盒
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，尤其涉及一种检测试剂卡和试剂盒。
背景技术
细菌性***病的发生是由于***菌群失调，乳酸杆菌减少而导致其他病原如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等的大量繁殖，它实际上是以加德纳菌为主的一种混合感染。细菌性***病是妇产科最常见的疾病之一，感染率在15％～ 50％之间，且易复发。患细菌性***病的妇女中有50％的人易早产或分娩低体重儿，她们所生下的孩子也很可能会因此带有各种后遗症。
细菌性***病临床诊断标准是由Amsel提出的，包括***分泌物通过显微镜观察可见线索细胞，并且其性质需满足以下三项中的两项：***分泌增多，变稀有异味；pH值>4.5以及胺试验阳性。然而此诊断标准操作繁琐，易受一些与感染无关的因素影响。目前已有多种细菌性***病的检测的商品化试剂盒上市，其原理均为检测病原体分泌的特异性酶——唾液酸酶的活性来判定，并辅以其它指标如过氧化氢、pH值、白细胞酯酶以及多胺等。
然而，现有的检测试剂盒采用二联，三联或四联的形式，须在低温如2～8℃条件下冷藏，储存条件严格；在进行检测时，除加标本外还需加额外的多种显色液或终止液，并使用额外的加热设备对检测试剂进行孵育或者常温条件反应30 分钟以上。市场上现有的检测试剂盒使用过程不仅操作复杂，还需要添加额外的专业设备，到专门的医疗机构进行检查，不便于受试者在家庭等场所自测，用户体验差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种操作简便的、检测快捷准确的细菌性***病多指标自检测试剂卡和试剂盒，便于使用者在家庭等场所自行检测。
为了解决上述问题，本发明采取以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测试剂卡，所述试剂卡设有检测槽，所述检测槽内设置有试剂块；所述试剂块是由反应液滴入反应膜后干燥处理得到；
所述反应液为：唾液酸苷酶反应液、过氧化氢反应液、白细胞酯酶反应液或 pH反应液中的一种。
其进一步地技术方案为：唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.1～2g/L 5-溴- 4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸盐，30～60g/L糖，0.01～0.2％wt的氯化硝基四氮唑蓝，0.01～0.5mol/L 2-吗啉乙磺酸，0.1～1％wt牛血清白蛋白，0.05～1％wt表面活性剂以及1～5％wt硫酸钠；pH4.0～5.5。
具体地，表面活性剂为Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Tween 20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)或NP-40(乙基苯基聚乙二醇)中的一种。
具体地，糖为蔗糖或海藻糖。
其进一步地技术方案为：过氧化氢反应液包含以下组分：10～50U/mL辣根过氧化物酶，0.1～0.5mmol/L 4-氨基安替吡啉，0.5～4mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，10～200mmol/L磷酸盐缓冲液，5～100mmol/L保护剂，0.05～2％wt牛血清白蛋白以及5～20％wt甘油；pH6.8～7.2；所述保护剂为β-巯基乙醇或DTT (二硫苏糖醇)。
其进一步地技术方案为：白细胞酯酶反应液包含以下组分：0.1～1g/L吡咯酯，0.05～0.5g/L 1-重氮-2-萘酚-4磺酸盐，10～30％wt PVPK-30(聚乙烯吡咯烷酮-K30)，0.05～0.2mol/L柠檬酸盐缓冲液，1～5％wt癸醇，40～90％wt丙酮，1～5％wt DMSO(二甲基亚砜)；pH7.5～8.5。
其进一步地技术方案为：pH反应液包含以下组分：0.1～1g/L溴甲酚绿，2 ～5mmol/L 2-吗啉乙磺酸，0.1-0.3mmol/L氢氧化钠以及8～12％wt乙醇；pH4.4～4.6。
具体地，反应膜为滤纸、层析膜或玻璃纤维膜。
优选地，反应膜为滤纸。
第二方面，本发明提供一种细菌性***病多指标自检测试剂盒，包括如第一方面所述的试剂卡以及自热垫；所述自热垫位于试剂卡的下方。
其进一步地技术方案为：还包括标本处理液，所述标本处理液包含以下组分： 0.7～1.1％wt氯化钠，1～4mmol/L 2-吗啉乙磺酸以及0.03～0.07％wt ProClin-300； pH4.3～4.6。
其进一步地技术方案为：自热垫内部材料包含以下重量份组分：50～70份铁粉，10～13份活性炭，8～15份蛭石，5～15份氯化钠，0.2～0.3份吸水材料以及19～22份水。
与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：
1)本发明的试剂卡各项指标检测互相独立，且均为一步法反应，检测时无需加额外的显色液或者终止液，操作简单；
2)唾液酸苷酶作为检测细菌性***病的关键指标，本发明在传统的检测方法上引入表面活性剂Triton X-100，Tween-20或NP-40等，大幅度增强唾液酸苷酶的活性，在同等条件下检测到唾液酸苷酶的灵敏度提高1倍以上，孵育时间由传统方法的20～30分钟缩短至10分钟；
3)本发明的试剂盒引入自热垫，无需另外配备专用的加热设备，检测条件大大放宽，方便受试者在家中使用，有利于细菌性***病检测的家庭化推广。
具体实施方式
下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
实施例1
本实施例提供一种检测试剂卡，试剂卡上设有4个用于检测的检测槽，检测槽内设置有试剂块；试剂块是由反应液滴入反应膜后干燥处理得到。
反应液为：唾液酸苷酶反应液、过氧化氢反应液、白细胞酯酶反应液或pH 反应液中的一种。
具体地，反应膜可以是滤纸、层析膜或玻璃纤维膜中的一种。
优选地，反应膜是滤纸。
试剂卡的制备方法为：将滤纸裁成直径为5mm的小块，装入试剂卡上适配的检测槽内，将唾液酸苷酶反应液、氧化氢反应液、白细胞酯酶反应液以及pH 反应液各5μL分别加至含反应膜的4个检测槽内，将试剂卡置于37℃条件下干燥2hr。
在某些实施例，例如本实施例中，反应膜为Whatman 3MM滤纸。
具体地，反应液制备方法如下：
1)唾液酸苷酶反应液的配制方法(以10mL计)：称取2-吗啉乙磺酸195mg，溶于8mL纯化水中，用1mol/L氢氧化钠溶液将其pH值调节至5.0；然后按先后顺序分别加入5mg 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸钠盐，5mg氯化硝基四氮唑蓝，20mg Tween-20，0.5g蔗糖，0.2g硫酸钠，0.05g牛血清白蛋白，溶解混匀后加纯化水定容至10mL。
配得的唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.5g/L 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸钠盐，50g/L蔗糖，0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液，0.05％wt氯化硝基四氮唑蓝，0.2％wtTween-20，0.5％牛血清白蛋白，2％wt硫酸钠，pH 5.0。
2)过氧化氢反应液的配制方法(以10mL计)：称取磷酸二氢钠71mg，溶于8mL纯化水中，用1mol/L氢氧化钠将其pH值调节至7.0；然后按先后顺序分别加入1g甘油，50μL 1mol/Lβ-巯基乙醇水溶液，25μL100mmol/L 4-氨基安替吡啉水溶液，400μL 100mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠的水溶液，10mg 牛血清白蛋白，1mg辣根过氧化物酶(活性≥250U/mg，RZ值≥3.0)，溶解混匀后加纯化水定容至10mL；在4℃条件下保存。
配得的过氧化氢反应液包含以下组分：25U/mL辣根过氧化物酶，10％wt甘油，0.1％wt牛血清白蛋白，50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.25mmol/L 4-氨基安替吡啉，4mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，5mmol/Lβ-巯基乙醇，pH7.0。
3)白细胞酯酶反应液的配制方法(以10mL计)：
A液：称取柠檬酸钠129mg，溶于4mL纯化水中，用1mol/L盐酸将其pH 值调至8.0，加1g PVP K-30，溶解混匀后加纯化水定容至5mL。
B液：称取5mg 1-重氮-2-萘酚-4磺酸盐溶于300μL DMSO中，然后按顺序依次加入4mL丙酮，10mg吡咯酯，100mg癸醇，完全溶解后再用丙酮定容至 5mL。
白细胞酯酶反应液：将5mL A液与5mL B液混合即得。
配得的白细胞酯酶反应液包含以下组分：1g/L吡咯酯，0.5g/L 1-重氮-2-萘酚 -4磺酸盐，10％wt PVP K-30，0.05mol/L柠檬酸缓冲液，1％wt癸醇，3％wt DMSO， 50％丙酮；pH8.0。
4)pH反应液的配制方法(以10mL计)：称取5mg溴甲酚绿溶于1mL乙醇中，再加5.5mmol/L pH4.5的2-吗啉乙磺酸水溶液并定容至10mL。
配得的pH反应液包含以下组分：5mmol/L 2-吗啉乙磺酸，10％wt乙醇， 0.5g/L溴甲酚绿；pH为4.5。
本发明的试剂卡各项指标检测互相独立，且均为一步法反应，进行检测时无需加额外的显色液或者终止液，操作简单方便；唾液酸苷酶作为检测细菌性***病的关键指标，本发明在传统的检测方法上引入表面活性剂Triton X-100，Tween- 20或NP-40，可大幅度增强唾液酸苷酶的活性，提高检测的灵敏度，孵育时间由传统方法的20～30分钟缩短至10分钟。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：各检测指标的反应液组分含量不同，具体如下：
1)唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.1g/L 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸钠盐，30g/L海藻糖，0.01mol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液，0.01％wt氯化硝基四氮唑蓝，0.05％wtNP-40，0.1％牛血清白蛋白，1％wt硫酸钠，pH 4.5。
2)过氧化氢反应液包含以下组分：10U/mL辣根过氧化物酶，5％wt甘油， 0.05％wt牛血清白蛋白，10mmol/L磷酸盐缓冲液，0.1mmol/L 4-氨基安替吡啉， 0.5mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，20mmol/Lβ-巯基乙醇，pH7.2。
3)白细胞酯酶反应液包含以下组分：0.1g/L吡咯酯，0.05g/L 1-重氮-2-萘酚-4磺酸盐，18％wt PVP K-30，0.05mol/L柠檬酸缓冲液，3％wt癸醇，1％wt DMSO， 40％丙酮；pH7.5。
4)pH反应液包含以下组分：2mmol/L 2-吗啉乙磺酸，12％wt乙醇，0.1g/L 溴甲酚绿；pH为4.6。
实施例3：
本实施例与实施例1的不同之处在于：各检测指标的反应液组分含量不同，具体如下：
1)唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.3g/L 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸钠盐，60g/L海藻糖，0.5mol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液，0.1％wt氯化硝基四氮唑蓝，0.5％wtNP-40，1％牛血清白蛋白，5％wt硫酸钠，pH 5.5。
2)过氧化氢反应液包含以下组分：50U/mL辣根过氧化物酶，20％wt甘油， 2％wt牛血清白蛋白，200mmol/L磷酸盐缓冲液，0.5mmol/L 4-氨基安替吡啉，2mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，100mmol/L DTT，pH7.0。
3)白细胞酯酶反应液包含以下组分：0.5g/L吡咯酯，0.3g/L 1-重氮-2-萘酚- 4磺酸盐，30％wt PVP K-30，0.2mol/L柠檬酸缓冲液，5％wt癸醇，5％wt DMSO， 90％丙酮；pH7.8。
4)pH反应液包含以下组分：4mmol/L 2-吗啉乙磺酸，10％wt乙醇，0.5g/L 溴甲酚绿；pH为4.4。
实施例4：
本实施例与实施例1的不同之处在于：各检测指标的反应液组分含量不同，具体如下：
1)唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.2g/L 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸钠盐，40g/L海藻糖，0.3mol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液，0.18％wt氯化硝基四氮唑蓝，0.9％wtTriton X-100，0.8％牛血清白蛋白，4％wt硫酸钠，pH 5.3。
2)过氧化氢反应液包含以下组分：40U/mL辣根过氧化物酶，15％wt甘油， 0.13％wt牛血清白蛋白，150mmol/L磷酸盐缓冲液，0.4mmol/L 4-氨基安替吡啉， 0.9mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，80mmol/L DTT，pH6.9。
3)白细胞酯酶反应液包含以下组分：0.8g/L吡咯酯，0.18g/L 1-重氮-2-萘酚 -4磺酸盐，18％wt PVP K-30，0.15mol/L柠檬酸缓冲液，2.5％wt癸醇，2％wt DMSO，80％丙酮；pH7.8.3。
4)pH反应液包含以下组分：3mmol/L 2-吗啉乙磺酸，9％wt乙醇，0.8g/L溴甲酚绿；pH为4.5。
实施例5
本实施例提供一种细菌性***病多指标自检测试剂盒，包括如实施例1-4任一项所述的试剂卡、自热垫、干燥剂以及标本处理液；自热垫位于试剂卡的下方，加入干燥剂一起密封装袋；标本处理液用于预处理采集得到的白带样本。
具体地，自热垫双面带胶，一面粘贴有易撕下的密封膜，另一面粘贴于试剂卡背面。使用时，撕下密封膜后即可发热，加热试剂卡。
具体地，标本处理液及自热垫的制备过程如下：
1)标本处理液的配制(以100mL计)：
称取0.9g氯化钠，39mg 2-吗啉乙磺酸，用80mL纯化水溶解完全后，再加入50mgProClin-300，混匀后用100mmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.5，再加纯化水定容至100mL，即得。
制得的标本处理液包含以下组分：0.9％wt氯化钠，2mmol/L 2-吗啉乙磺酸，0.05％wt ProClin-300，pH4.5。
2)自热垫的制备:取铁粉60g，先加水19g，再加氯化钠10g，活性炭13g，蛭石13g，吸水材料0.3g；混匀后将混合物加至外包装袋，每5g混合物装一袋即得自热垫。
实施例6
本实施例与实施例5的不同之处在于：标本处理液及自热垫的组分含量不同，具体如下：
1)标本处理液包含以下组分：1.1％wt氯化钠，3mmol/L 2-吗啉乙磺酸， 0.03％wtProClin-300，pH4.6。
2)自热垫内部材料包含以下重量份组分：70份铁粉，11份活性炭，10份蛭石，15份氯化钠，0.2份吸水材料以及22份水。
实施例7
本实施例与实施例5的不同之处在于：标本处理液及自热垫的组分含量不同，具体如下：
1)标本处理液包含以下组分：0.7％wt氯化钠，1mmol/L 2-吗啉乙磺酸， 0.07％wtProClin-300，pH4.4。
2)自热垫内部材料包含以下重量份组分：50份铁粉，10份活性炭，8份蛭石，5份氯化钠，0.3份吸水材料以及20份水。
实施例8
操作方式说明
现以实施例5的细菌性***病多指标自检测试剂盒为例，进行操作方式说明。
S1获取白带样本，将白带样本置于500-1000μL的标本处理液中预处理，得到含白带样本的标本处理液；
S2打开装有试剂卡的密封袋，将自热垫的密封膜私下，室温放置5min后备用；
S3将S1得到的含白带样本的标本处理液分别滴于试剂卡上的4个试剂块，室温下放置10min；
S4观察试剂块颜色并结合比色卡进行结果判定。
白带样本中的各检测指标的试剂块颜色判定结果如下：
唾液酸苷酶指标：阴性不变色，阳性为褐色，阳性表示有细菌性***病；
过氧化氢指标：阴性显紫色，阳性不显色或显浅黄色；阴性表示乳酸杆菌多，阳性则表示***环境处于病理或亚健康状态；
白细胞酯酶指标：阴性不变色；阳性显***、紫色或灰紫色；阳性表示有***炎；
pH值指标：不同的颜色根据pH比色卡对应不同的酸碱值，正常的***环境pH值呈弱酸性。
准确性实验
实验例：使用实施例5的细菌性***病多指标自检测试剂盒检测白带样本中的唾液酸苷酶、过氧化氢以及白细胞酯酶；
对比例：使用已上市的对照试剂盒(细菌性***病四联检测试剂盒，安徽深蓝医疗科技有限公司)检测同一白带样本中的唾液酸苷酶、过氧化氢以及白细胞酯酶；
参考例：使用革兰氏染色镜检测同一白带样本中的乳酸杆菌、线索细胞以及白细胞。
实验例与参考例的检测结果如表1：
表1实验例与参考例的检测结果
对比例与参考例的检测结果如表2：
表2对比例与参考例的检测结果
根据表1、表2的实验结果可知，本发明的细菌性***病多指标自检测试剂盒对检测细菌性***病的关键指标——BV/线索细胞的准确率高达95.9％；比已上市的检测试剂盒检测唾液酸苷酶的灵敏度提高1倍以上。
稳定性试验
将实施例5的细菌性***病多指标自检测试剂盒与已上市的对照试剂盒(细菌性***病四联检测试剂盒，安徽深蓝医疗科技有限公司)进行稳定性试验对比：将两种试剂盒分别置于37℃91d以及45℃38d两条件下进行加速稳定性实验。结果如下：
本发明的细菌性***病多指标自检试剂盒中的试剂卡上，四个检测槽内的试剂块在37℃91d和45℃38d的条件下无发生颜色变化，用于检测白带样本后的结果准确；
对照试剂盒的过氧化氢检测试剂块、白细胞酯酶检测试剂块在37℃15d或者45℃8d后均变成蓝色，无法投入正常使用；唾液酸酶检测试剂块在37℃20d 或45℃12d后变成淡蓝色，无法投入正常使用。
根据稳定性试验的结果可知，本发明的细菌性***病多指标自检试剂盒可在常温条件下稳定储存，保质期较对照试剂盒长；经进一步试验测定，本发明的细菌性***病多指标自检试剂盒，在常温下保存时间为一年，贮存条件宽松，便于受试者购买贮存。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种检测试剂卡，其特征在于，所述试剂卡设有检测槽，所述检测槽内设置有试剂块；所述试剂块是由反应液滴入反应膜后干燥处理得到；
所述反应液为：唾液酸苷酶反应液、过氧化氢反应液、白细胞酯酶反应液或pH反应液中的一种。
2.如权利要求1所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述唾液酸苷酶反应液包含以下组分：0.1～2g/L 5-溴-4氯-3吲哚基乙酰神经氨酸盐，30～60g/L糖，0.01～0.2％wt的氯化硝基四氮唑蓝，0.1～1％wt牛血清白蛋，0.01～0.5mol/L 2-吗啉乙磺酸，0.05～1％wt表面活性剂以及1～5％wt硫酸钠；pH4.0～5.5。
3.如权利要求2所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述表面活性剂为Triton X-100、Tween 20或NP-40中的一种。
4.如权利要求1所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述过氧化氢反应液包含以下组分：10～50U/mL辣根过氧化物酶，0.1～0.5mmol/L 4-氨基安替吡啉，0.5～4mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠，10～200mmol/L磷酸盐缓冲液，5～100mmol/L保护剂，0.05～2％wt牛血清白蛋白以及5～20％wt甘油；pH6.8～7.2；所述保护剂为β-巯基乙醇或DTT。
5.如权利要求1所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述白细胞酯酶反应液包含以下组分：0.1～1g/L吡咯酯，0.05～0.5g/L 1-重氮-2-萘酚-4磺酸盐，10～30％wt PVPK-30，0.05～0.2mol/L柠檬酸盐缓冲液，1～5％wt癸醇，40～90％wt丙酮以及1～5％wt DMSO；pH7.5～8.5。
6.如权利要求1所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述pH反应液包含以下组分：0.1～1g/L溴甲酚绿，2～5mmol/L 2-吗啉乙磺酸，0.1～0.3mmol/L氢氧化钠以及8～12％wt乙醇；Ph4.4～4.6。
7.如权利要求1-6任一项所述的一种检测试剂卡，其特征在于，所述反应膜为滤纸、层析膜或玻璃纤维膜中的一种。
8.一种细菌性***病多指标自检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-7任一项所述的试剂卡以及自热垫；所述自热垫位于试剂卡的下方。
9.如权利要求8所述的一种细菌性***病多指标自检测试剂盒，其特征在于，还包括标本处理液，所述标本处理液包含以下组分：0.7～1.1％wt氯化钠，1～4mmol/L 2-吗啉乙磺酸，pH4.3～4.6，0.03～0.07％wt ProClin-300。
10.如权利要求9所述的一种细菌性***病多指标自检测试剂盒，其特征在于，所述自热垫内部材料包含以下重量份组分：50～70份铁粉，10～13份活性炭，8～15份蛭石，5～15份氯化钠，0.2～0.3份吸水材料以及19～22份水。
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