CN105063173A - 一种检测b群链球菌感染的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测B群链球菌感染的方法，采用马尿酸或马尿酸盐类似物作为显色底物与缓冲液配制的检测试剂，通过B群链球菌中具有的马尿酸酶能够特异性识别显色底物中甘氨酸与苯甲酸的结合，并水解链接二者的酰胺键，使显色底物颜色改变，以此来判断检测样本中是否感染B群链球菌。本发明还公开了检测B群链球菌感染用试剂盒。本发明的检测方法简单，无需细菌划线分离技术所需要的专业培训，仅通过简单加样和短时孵育即能得到鉴定结果，检测时间远远短于培养基培养所需要的时间，且目测鉴定结果直观准确；本发明试剂盒结构简单，方便操作，性能良好，统计显示，采用该试剂盒检测，阳性预期值达85%以上，阴性预期值达97%以上。

Description

一种检测B群链球菌感染的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及干化学酶快检技术，尤其是涉及一种采用干化学酶快检技术检测B群链球菌感染的方法，本发明还涉及检测B群链球菌感染用试剂盒。

背景技术

B群链球菌(groupBstreptococcus,GBS)，又称B族链球菌或无乳链球菌(S.agalactiae)，兼性厌氧，革兰氏阳性球菌，在显微镜下呈单个、成双或链状排列，长短不一；在血琼脂平板上36±1℃培养18~24h，形成灰白色、表面光滑、有乳光、圆形、β溶血的菌落，也有少数菌株无β溶血环；触酶试验阴性、马尿酸钠试验阳性、CAMP试验阳性。

B群链球菌正常寄居于人类***和直肠，是一种条件致病菌，大约1/3的成人肠道和1/4的妇***道存在B群链球菌，新生儿可直接自母体或分娩时由母体生殖道寄殖菌上行感染。成人中B群链球菌感染少见，以产妇为主，少数情况下亦可为免疫功能低下者，如糖尿病、慢性肝功能不全、HIV感染、恶性肿瘤接受免疫抑制剂治疗等病人也可感染B组链球菌病。根据美国疾病预防控制中心（CDC）统计，约10%~30%的孕妇感染GBS，有40%~70%在生产过程感染新生儿，其中1%~3%出现早期侵入性感染，造成呼吸道的症状，引起新生儿肺炎、脑膜炎，甚至败血症等症状，更严重的可能造成死亡，近年来死亡率达4%~6%。1996年美国疾病预防控制中心发布《围产期B族链球菌感染及预防指南》，并于2002年、2010年两次修订，明确提出：对所有孕妇于妊娠35~37周进行B群链球菌筛查，结果阳性者进行预防性治疗。

目前B群链球菌筛查方法有四种：1、标本经血琼脂平板培养分离后，可疑菌落进行触酶试验、马尿酸钠试验及CAMP试验等验证确认；2、标本经血琼脂平板培养分离，革兰氏染色阳性的可疑菌落用细菌鉴定仪直接鉴定；3、标本经血琼脂平板培养分离后，可疑菌落直接用MALDI-TOF质谱仪鉴定；4、标本经B群链球菌显色琼脂平板培养后直接鉴别。其中方法1所需时间最长，一般要2-3天，并且手工操作复杂，经验要求较高，工作量大；方法2所需时间也较长，一般1-2天，经验要求较高，特别是一旦染色误判，直接影响后面的上机鉴定结果，另外还需要较昂贵的仪器（细菌鉴定仪）；方法3所需时间较短一些，需要一天多一些，另需要极昂贵的仪器（MALDI-TOF质谱仪）；方法4操作简单，只需要根据培养后菌落的颜色直接鉴别B群链球菌即可，但由于也需要培养，因此所需时间也要1天。上述四种方法的共同点就是都需要进行标本的划线分离培养，而这一工作在医院临床科室人员中是没有能力进行的，直接影响了B群链球菌临床筛查工作的开展。

由于很多细菌都具有特异性的酶，根据相关酶反应的有无或强弱可以鉴别相关微生物，这一技术已广泛用于微生物的鉴别，具体的应用技术又有细菌显色培养基技术、用于细菌生化鉴别的鉴定技术以及快速检测微生物的干化学酶快检技术。虽然利用酶反应的高灵敏、高特异以及反应快等特点结合固相载体的局部富集技术产生的干化学酶快检技术，以其操作简单、检测时间短等优点近些年来得到了广泛的应用，但截止目前，尚未见到运用此技术检测B群链球菌的文献及产品，也未发现在马尿酸钠试验特别是快速马尿酸钠试验中，使用显色底物替代马尿酸钠进行试验的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，准确性高，在短时间内即能得到鉴定结果的检测B群链球菌感染的方法，本发明还提供检测B群链球菌感染用试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的检测B群链球菌感染的方法为：采用马尿酸或马尿酸盐类似物作为显色底物与缓冲液配制的检测试剂，通过B群链球菌中具有的马尿酸酶能够特异性识别显色底物中甘氨酸与苯甲酸的结合，并水解链接二者的酰胺键，使显色底物颜色改变，以此来判断检测样本中是否感染B群链球菌。

所述马尿酸或马尿酸盐类似物是一端为甘氨酸或甘氨酸盐通过酰胺键与另一端苯甲酸类似物的苯甲酸羧基相链接的一类化合物。如可以是3,3-二(4-羟基-5-异丙基-2-甲苯基)-3-羟基-苯甲酰甘氨酸或它的盐，也可以是2-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸或它的盐等等。

所述缓冲液为浓度0.025M~0.2M、pH3.8~5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

本发明所述的检测B群链球菌感染用试剂盒，包括固化有马尿酸酶检测试剂的检测试纸，所述马尿酸酶检测试剂由显色底物马尿酸或马尿酸盐类似物与缓冲液配制而成，所述马尿酸或马尿酸盐类似物是一端为甘氨酸或甘氨酸盐通过酰胺键与另一端苯甲酸类似物的苯甲酸羧基相链接的一类化合物，所述缓冲液为浓度0.025M~0.2M、pH3.8~5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

试剂盒中还包括与所述缓冲液组分相同的标本稀释液。

由于B群链球菌具有马尿酸酶，能够特异性识别甘氨酸与苯甲酸的结合，并水解链接二者的酰胺键，故显色底物被B群链球菌的马尿酸酶水解后可呈现出与显色底物不同的颜色，即发生颜色变化，根据颜色变化，即可判断标本中有无B群链球菌的存在。

本发明的检测方法简单，无需细菌划线分离技术所需要的专业培训，仅仅通过简单加样和短时（10~30分钟）孵育即能得到鉴定结果，检测时间远远短于培养基培养所需要的至少24小时的时间；且目测鉴定结果直观准确；本发明试剂盒结构简单，方便操作，性能良好，统计显示，采用该试剂盒检测，阳性预期值达85%以上，阴性预期值达97%以上。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。

实施例1

1、制备检测试剂纸片

配制100mM柠檬酸-柠檬酸钠作为缓冲液和样品稀释液(pH4.0，内含1％［v/v］TritonX-100)；将3,3-二(4-羟基-5-异丙基-2-甲苯基)-3-羟基-苯甲酰甘氨酸钠用上述配制的100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶解，使3,3-二(4-羟基-5-异丙基-2-甲苯基)-3-羟基-苯甲酰甘氨酸钠浓度达到2mg/ml，混合均匀，按15ul/片加到5mm边长的纸片上，干燥过夜后即可得到无色的检测试剂纸片。

2、检测方法

1）将分泌物标本试子置于洁净的试管中，加入上述配制的100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液300~400ml，充分搅拌试子，使试子中的分泌物充分溶解到样品稀释液中；

2）将上述溶解的分泌物样品40μl加到无色的检测试剂纸片上，振荡混合均匀，37℃放置15分钟；

3）观察纸片上颜色的变化：若纸片上的颜色由无色变为红色，显示该样本为阳性，证明为B群链球菌感染；若颜色保持不变，显示该样本为阴性，证明未出现B群链球菌感染。

如采用仪器判读，则根据检测值与预置界值的差异与否进行判断。

采用本试剂纸片对郑州市妇幼保健院妇科门诊患者418例进行检测，患者就诊前一周未使用任何抗生素。

每位患者用无菌试子取***分泌物两份按上述方法进行检测：以B群链球菌显色平板培养的结果为金标准，阳性预期值88%，阴性预期值97%。

实施例2

1、制备检测试剂纸片

配制100mM醋酸-醋酸钠作为缓冲液和样品稀释液(pH4.0，内含0.8％［v/v］TritonX-100)；将2-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸钠用上述配制的100mM醋酸-醋酸钠溶解，使2-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸钠浓度达到1.5mg/ml，混合均匀，按15ul/片加到5mm边长的纸片上，干燥过夜后即可得到无色或极淡红色的检测试剂纸片。

2、检测方法

1）将分泌物标本试子置于洁净的试管中，加入上述配制的100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液300~400ml，充分搅拌试子，使试子中的分泌物充分溶解到样品稀释液中；

2）将上述溶解的分泌物样品40μl加到无色的检测试剂纸片上，振荡混合均匀，室温放置20分钟；

3）观察纸片上颜色的变化：若纸片上的颜色由无色或极淡红色变为橙色或红色，显示该样本为阳性，证明为B群链球菌感染；若颜色保持不变或显示极淡红色，显示该样本为阴性，证明未出现B群链球菌感染。

如采用仪器判读，则根据检测值与预置界值的差异与否进行判断。

实施例3

1、制备检测试剂纸片

配制50mM醋酸-醋酸钠作为缓冲液和样品稀释液(pH5.2，内含0.8％［v/v］TritonX-100)；将2-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸用终浓度5%的二甲基亚砜溶解后，再加入上述配制的50mM醋酸-醋酸钠溶液稀释混合，使2-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-苯甲酰甘氨酸浓度达到1.0mg/ml，混合均匀，按15ul/片加到5mm边长的纸片上，干燥过夜后即可得到无色或极浅红色的检测试剂纸片。

2、检测方法

1）将分泌物标本试子置于洁净的试管中，加入上述配制的100mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液300~400ml，充分搅拌试子，使试子中的分泌物充分溶解到样品稀释液中；

2）将上述溶解的分泌物样品40μl加到无色的检测试剂纸片上，振荡混合均匀，室温放置30分钟；

3）观察纸片上颜色的变化：若纸片上的颜色由无色或极浅红色变为橙色或红色，显示该样本为阳性，证明为B群链球菌感染；若颜色保持不变或显示极浅红色，显示该样本为阴性，证明未出现B群链球菌感染。

如采用仪器判读，则根据检测值与预置界值的差异与否进行判断。

Claims (5)

1.一种检测B群链球菌感染的方法，其特征在于：采用马尿酸或马尿酸盐类似物作为显色底物与缓冲液配制的检测试剂，通过B群链球菌中具有的马尿酸酶能够特异性识别显色底物中甘氨酸与苯甲酸的结合，并水解链接二者的酰胺键，使显色底物颜色改变，以此来判断检测样本中是否感染B群链球菌。

2.根据权利要求1所述的检测B群链球菌感染的方法，其特征在于：所述马尿酸或马尿酸盐类似物是一端为甘氨酸或甘氨酸盐通过酰胺键与另一端苯甲酸类似物的苯甲酸羧基相链接的一类化合物。

3.根据权利要求1所述的检测B群链球菌感染的方法，其特征在于：所述缓冲液为浓度0.025M~0.2M、pH3.8~5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

4.一种检测B群链球菌感染的试剂盒，其特征在于：包括固化有马尿酸酶检测试剂的检测试纸，所述马尿酸酶检测试剂由显色底物马尿酸或马尿酸盐类似物与缓冲液配制而成，所述马尿酸或马尿酸盐类似物是一端为甘氨酸或甘氨酸盐通过酰胺键与另一端苯甲酸类似物的苯甲酸羧基相链接的一类化合物，所述缓冲液为浓度0.025M~0.2M、pH3.8~5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

5.根据权利要求4所述的检测B群链球菌感染的试剂盒，其特征在于：还包括与所述缓冲液组分相同的标本稀释液。