CN107779494B - 一种检测感染性***炎的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测感染性***炎的试剂盒。所述试剂盒包括干化学反应装置、样品稀释液和至少一种显色剂：其中反应装置具有至少一种检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β‑葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β‑内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶；样品稀释液中含有TritonX‑100和树胶；显色剂由固蓝B、固红B、固蓝BB、固蓝RR、固紫B或固红TR中的至少一种组成。本发明试剂盒产品可同时评估受检者生殖道微生态环境、清洁度和细菌性***病致病菌状，其操作简便、快速、成本低廉。

Description

一种检测感染性***炎的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，具体地说，涉及一种检测感染性***炎的试剂盒及其制备方法。
背景技术
感染性***炎/病是妇科常见疾病，当病原体侵入***，在一定的条件下使***黏膜产生炎症变化而形成***炎，其是最常见的女性生殖器官炎症，各个年龄阶段都可以罹患。发病率约占妇科门诊患者的1/3，而临床上约50％-60％的***炎为混合性感染。
***混合感染是指2种或2种以上病原体所致的感染，如果单纯依靠镜检或试剂盒，只针对某种***炎症或疾病进行检测，临床上50％以上的***炎/病将会出现漏诊、误诊的情况。
因此，为了能够降低诊断过程中出现的漏诊、误诊情况，针对于混合感染的检测是十分必要的，这不仅可以提高患者的诊治正确诊治率，同时可帮助后续治疗的给药建议，提高病人的康复率，减少患病复发率。由此可见，针对感染性***炎/病多指标的联合检测试剂盒是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测感染性***炎的试剂盒及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的检测感染性***炎的试剂盒，其包括：
1)干化学反应装置
所述反应装置具有至少一种检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶；
2)样品稀释液；
3)至少一种显色剂。
前述的试剂盒，所述反应装置的反应基板由ABS工程塑料制成，其中基板上设有若干个形状、大小一致的孔，分别为上述各指标的反应孔，在每个反应孔中装有相应的反应垫。
优选地，所述反应装置的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别作为过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶的反应孔。
所述反应装置的过氧化氢反应孔包被有辣根过氧化物酶、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物和3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐。
所述反应装置的唾液酸苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR。
所述反应装置的白细胞酯酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐。
所述反应装置的β-葡萄糖醛酸酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐。
所述反应装置的凝固酶反应孔包被有甘氨酰精氨酸-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
所述反应装置的乳酸反应孔包被有D-乳酸脱氢酶、黄递酶和谷丙转氨酶。
所述反应装置的乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR。
所述反应装置的β-内酰胺酶反应孔包被有头孢硝噻吩。
所述反应装置的脯氨酸氨肽酶反应孔包被有L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
所述反应装置的丙氨酸氨肽酶反应孔包被有L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR，优选固蓝B。
前述的试剂盒，所述样品稀释液中含有TritonX-100和树胶。
本发明的检测感染性***炎的试剂盒，可按照如下方法制备得到：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成；以0.001-1g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，用10mL水溶解，然后加入10000U的辣根过氧化物酶制成；
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以100-300mmol/L pH7.0-8.0的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.001-1g3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含1-10mol/L NaClO的100-300mmol/L pH5.0-6.0的乙酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2wt％硫酸钠的100-1000mmol/L pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含10-100mmol/L乙二醇的100-300mmol/L pH 6.0-7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以100-300mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液为溶剂，加入0.001-1g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.001-0.1g NBT(氯化硝基四氮唑兰)，加入2mL饱和β-环糊精溶液后，再加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.001-0.1g NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)制成；
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成，酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入10-100mg黄递酶和10-100mg谷丙转氨酶制成；
上述底物溶液的乳酸显色剂保护液由pH6-7 0.1-1mol/L Tris-HCl缓冲液加入10-100g葡聚糖T70及10-100g肌醇制得；
上述酶保护液由pH7-8 500-600mmol/L双甘肽缓冲液，加入1-10g蔗糖、1-10g D-海藻糖、1-10g牛血清白蛋白、1-10g肌醇和100-1000μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH5.0-6.0 500-600mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂，加入0.001-1g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，同时加入葡聚糖T70和L-组氨酸制成；底物溶液中葡聚糖T70和L-组氨酸终浓度均为0.005％-50％，L-组氨酸终浓度为0.005％-50％；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成0.001-0.01g/mL头孢硝噻吩、0.005％-50％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为200-600mmol/L pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH8.0-9.0 400-500mmol/L的Tris-HCl为缓冲液，制成10-40mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、0.005％-50％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以500-1000mmol/LpH8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液为溶剂，制成0.001-0.01g/mL L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、0.005％-50％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液；
(12)将步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存；
(13)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2；
(14)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒的制备方法如下：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000061
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000062
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000063
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000071
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt％硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000072
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000073
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000074
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g NBT，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g NAD制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000075
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000081
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582g L-组氨酸制成；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000082
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000083
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000084
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000091
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液。
(12)将步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存。
(13)样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2。
(14)显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
本发明进一步提供上述试剂盒在检测感染性***炎的中的应用。考虑到试剂盒保存的需要，所制备的反应垫必须具备相当高的稳定性，在大量实验研究的基础上，最终确定了上述酶液、显色液和各种底物液的组成及其配方，使得试剂盒具有理想的稳定性，能够在实际应用中推广。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)本发明解决了液体试剂的不稳定问题，通过加入激活剂、酶稳定剂等物质，在保证试剂垫上试剂稳定的前提下，能够快速地提高反应的灵敏度和准确性；试剂盒操作简便快速，准确性高，适用于临床常规检测特别是临床病人床旁检测使用，进而指导合理临床用药。
(二)采用本发明的试剂盒对临床上感染性***炎进行检测试剂盒检测结果准确率达95％以上。
(三)本发明试剂盒避免了单独观察单一指标产生的片面性和干扰因素，采用联合指标的检测对于临床上***混合感染的检测更准确有效。
(四)本发明试剂盒产品可在医院急诊室、基层医疗与保健单位及病人家庭使用。可同时评估受检者生殖道微生态环境、清洁度和细菌性***病致病菌状，其操作简便、快速、成本低廉。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1一种感染性***炎的干化学检测试剂盒的制备
本实施例的感染性***炎检测试剂盒包括：①干化学反应装置：具有检测过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶指标反应孔的反应基板；②***分泌物稀释液；③显色剂A及显色剂B。
反应装置按如下方法制备获得：
(1)反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
(2)过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000111
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000112
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
(3)唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000113
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
(4)白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000114
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt％硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
(5)β-葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000115
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸盐制成；
(6)凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000121
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
(7)乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000122
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g NBT，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g NAD制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000123
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
(8)乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000124
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582g L-组氨酸制成；
(9)β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000131
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1％甲基纤维素、10％聚乙烯吡咯烷酮、1％L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000132
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
(10)脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000133
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10％TritonX-100、1％葡聚糖T70和1％D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
(11)丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1μL滴加在
Figure GDA0002816227990000134
层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1％葡聚糖T70、1％D-海藻糖和10％TritonX-100的混合液作为底物溶液。
将上述步骤(2)-(11)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存。
***分泌物稀释液(样品稀释液)的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2。
显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B或固红TR溶液；
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
实施例2本发明***炎的干化学检测试剂盒的应用
本发明的试剂盒既可以对临床上患有妇科炎症人群的***分泌物样本进行检测，也可对健康人群的***分泌物样本进行检测，以检查待测人群是否患有***疾病，可作为病人的诊断、鉴别诊断和疗效评价的辅助指标，也可作为健康人***微生态评价的辅助工具。
本发明实施例1制备的试剂盒的具体使用方法如下：
1)在使用时，首先将试纸垫(反应垫)从保存温度下取出，平衡到室温开始使用；
2)稀释液处理：用棉签从***后穹窿取分泌物后加入400μL稀释液稀释分泌物；
3)取25μL分泌物稀释液分别加到试纸垫上；
4)唾液酸苷酶及乙酰氨基葡萄糖苷酶孔滴加显色液A；
5)在干浴器(设置温度为45℃)上反应7min后，凝固酶、脯氨酸氨肽酶和丙氨酸氨肽酶孔滴加显色液B，继续反应3min读取各孔显色结果。本领域技术人员应当理解，根据本领域的现有技术，在使用其他保温容器如培养箱、烘箱、水浴容器等的设置温度为35-50℃的条件下反应后，也能够实现结果的对比判断。
该试剂盒可一次性快速诊断临床常见的***炎症，主要用于辅助诊断女性***微生态健康状况，包括细菌性***病(BV)、外阴***假丝酵母菌病(VVC)、滴虫性***炎(TV)、需氧菌性***炎(AV)。其中丙氨酸氨肽酶阳性提示***分泌物内存在革兰氏阴性菌，脯氨酸氨肽酶阳性提示BV或VVC阳性，β-内酰胺酶阳性提示存在β-内酰胺类抗生素耐药菌，乙酰氨基葡萄糖苷酶阳性提示VVC或TV阳性，乳酸阳性提示***内部有乳酸存在，凝固酶阳性提示AV阳性，β-葡萄糖苷酶阳性提示AV阳性，白细胞酯酶阳性提示炎症存在，唾液酸苷酶阳性提示BV阳性，过氧化氢阳性提示***微生态异常。以上结果仅供参考，需结合临床其它病理指征进行综合判断。
反应结果判定标准：过氧化氢孔显蓝色，唾液酸苷酶孔不显色或黄色，白细胞酯酶孔不显色，β-葡萄糖醛酸苷酶孔不显色、凝固酶孔不显色或黄色，乳酸孔显蓝色、乙酰氨基葡萄糖苷酶不显色或显黄色、β-内酰胺酶孔显黄色、脯氨酸氨基肽酶不显色或显黄色、丙氨酸氨基肽酶不显色或显黄色，为阴性反应结果；过氧化氢孔不显色或显绿色，唾液酸苷酶孔显***或蓝色，白细胞酯酶孔显蓝色或绿色，为阳性反应结果；β-葡萄糖醛酸苷酶孔显蓝色或绿色，凝固酶孔显紫色红色、橘黄色，乳酸孔不显色、乙酰氨基葡萄糖苷酶孔显***，β-内酰胺酶孔显红色，脯氨酸氨基肽酶显红色、丙氨酸氨基肽酶显红色，为阳性反应结果。
本发明的试剂盒性能稳定，保质期为18个月。
采用本发明的试剂盒对临床上感染性***炎进行检测，本发明试剂盒检测结果准确率达95％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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2.Pheifer,T.A.,et al.,Nonspecific vaginitis:role of Haemophilusvaginalis and treatment with metronidazole.New England Journal of Medicine,1978.298(26):p.1429.
3.张萍,常见***炎症的治疗.中国慢性病预防与控制,2011.19(2):p.218-219.
4.郜正美and黄爱武,女性***单纯感染和多重感染的鉴别诊断.中国微生态学杂志,2013.25(2):p.206-207.
5.肖冰冰,刘朝晖,and廖秦平,妇科门诊不同***症状就诊者***微生态状况调查.中华妇产科杂志,2009.44(1):p.6-8.

Claims (3)

1.一种检测感染性***炎的试剂盒，其特征在于，其包括：
1)干化学反应装置
所述反应装置包括检测以下指标的反应孔：过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶和丙氨酸氨肽酶；
2)样品稀释液；
3)至少一种显色剂；
所述反应装置的过氧化氢反应孔包被有辣根过氧化物酶、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物和3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐；
所述反应装置的唾液酸苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR；
所述反应装置的白细胞酯酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐；
所述反应装置的β -葡萄糖醛酸酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐；
所述反应装置的凝固酶反应孔包被有甘氨酰精氨酸-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的乳酸反应孔包被有D-乳酸脱氢酶、黄递酶和谷丙转氨酶；
所述反应装置的乙酰氨基葡萄糖苷酶反应孔包被有5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，其对应的显色剂A为固紫B或固红TR；
所述反应装置的β-内酰胺酶反应孔包被有头孢硝噻吩；
所述反应装置的脯氨酸氨肽酶反应孔包被有L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的丙氨酸氨肽酶反应孔包被有L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺，其对应的显色剂B为固蓝B、固红B、固蓝BB或固蓝RR；
所述反应装置的反应基板上设有若干个形状、大小一致的孔，分别为上述各指标的反应孔，在每个反应孔中装有相应的反应垫；
所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
（2）过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成；以0.001g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，用10mL水溶解，然后加入10000U的辣根过氧化物酶制成；
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以200 mmol/L pH 6.8的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
（3）唾液酸苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
（4）白细胞酯酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含2wt%硫酸钠的300mmol/L pH 8.3的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
（5）β -葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐制成；
（6）凝固酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；底物溶液以200 mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液为溶剂，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
（7）乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g氯化硝基四氮唑兰，加入2mL饱和β-环糊精溶液后，再加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制成；
所述酶垫由酶溶液滴加在载体上制备而成，酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
上述底物溶液的乳酸显色剂保护液pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
上述酶保护液由pH7.5 600 mmol/L双甘肽缓冲液，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
（8）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为溶剂，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，同时加入0.025g葡聚糖T70和0.0582 g L-组氨酸制成；
（9）β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1%甲基纤维素、10%聚乙烯吡咯烷酮、1% L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
（10）脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10% TritonX-100、1%葡聚糖T70和1% D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
（11）丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
所述反应垫由底物溶液滴加在载体上制备而成，底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液为溶剂，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1%葡聚糖T70、1% D-海藻糖和10% TritonX-100的混合液作为底物溶液；
（12）将步骤（2）-（11）制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，在孔上粘贴铝箔保护膜，装入铝箔袋中，即得反应装置，于2-8℃保存；
（13）样品稀释液的配制：
所述样品稀释液含有0.9％NaCL、10mmol/L氯化镁、2mmol/L氯化锌、4mmol/L氯化锰和10±2mmol/L MES，pH6.5±0.2；
（14）显色剂的配制：
以聚氧乙烯月桂醚为溶剂，配制质量百分浓度0.05～0.3％的固紫B、固红TR、固蓝B、固蓝BB或固蓝RR溶液。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）反应基板的制备：
反应基板由ABS工程塑料制成，其中由ABS工程塑料制成的基板上有10个直径为0.4mm的圆孔，分别对应过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、凝固酶、乳酸、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-内酰胺酶、脯氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶孔，在每个反应孔中填入相应的反应垫载体，所采用的载体为滤纸、玻璃纤维或层析纸；
（2）过氧化氢反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有酶垫和底物垫：
酶垫由酶溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液用10mL水溶解0.011g 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，加入15000UU的辣根过氧化物酶制成；
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液用10mL pH 6.8 200mmo/L的BK-柠檬酸缓冲液为溶剂，加入0.140g 3-(N-乙基-3-甲基苯胺基)-2-羟基丙磺酸钠盐制成；
（3）唾液酸苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2mol/L NaClO的200mmol/L pH5.5的乙酸盐缓冲液10mL，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-N-乙酰神经氨酸盐制成；
（4）白细胞酯酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含2wt%硫酸钠的300mmol/L pH8.3的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g5-溴-4-氯-3-吲哚-乙酸盐制成；
（5）β -葡萄糖醛酸酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以含50mmol/L乙二醇的200mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液10mL为溶剂，加入0.05g 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖醛酸盐制成；
（6）凝固酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以200mmol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液10mL，加入0.05g甘氨酰精氨酸-β-萘胺制成；
（7）乳酸反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和酶垫：
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液由500μL二甲基亚砜溶解0.01g氯化硝基四氮唑兰，再加入2mL饱和β-环糊精溶液后，加入2.5mL乳酸显色剂保护液和0.065g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸制成；
乳酸显色剂保护液是以80mL的pH 6.5 0.8mol/L Tris-HCl缓冲液，加入16g葡聚糖T70及12g肌醇制得；
酶垫由酶溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
酶溶液以5mL酶保护液为溶剂，加入5KU D-乳酸脱氢酶，搅拌至完全溶解，再加入76.9mg黄递酶和35mg谷丙转氨酶制成；
酶保护液由pH 7.5 600 mmol/L双甘肽缓冲液45mL，加入2g蔗糖、2g D-海藻糖、1g牛血清白蛋白、3g肌醇和250μL吐温-20制得；
（8）乙酰氨基葡萄糖苷酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 5.0 500mmol/L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液5mL，加入0.025g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、0.025g葡聚糖T70、0.0582 g L-组氨酸制成；
（9）β-内酰胺酶反应垫的制备，从孔底部向上依次叠放有底物垫和缓冲垫：
底物垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以异丙醇为溶剂，制成10g/mL头孢硝噻吩、1%甲基纤维素、10%聚乙烯吡咯烷酮、1% L-半胱氨酸和50mmol/L柠檬酸的混合液作为底物溶液；
缓冲垫由缓冲溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
所述缓冲垫由缓冲溶液滴加在载体上制备而成，缓冲溶液为pH 7.0、200mmol/L磷酸盐缓冲液；
（10）脯氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.0 500mmol/L的Tris-HCl 5mL为缓冲液，制成20mg/mL L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、10% TritonX-100、1%葡聚糖T70和1% D-海藻糖的混合液作为底物溶液；
（11）丙氨酸氨肽酶反应垫的制备：
反应垫由底物溶液1 μL滴加在φ4mm层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后制得，密封保存在4℃；
底物溶液以pH 8.5 500mmol/L的Tris-HCl缓冲液5mL，制成3.5g/L L-丙氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、1%葡聚糖T70、1% D-海藻糖和10% TritonX-100的混合液作为底物溶液。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液中含有TritonX-100和树胶。
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