CN103266163B - 一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鉴别滴虫和念珠菌的联检试剂盒，它包括凝固酶活性检测试剂、α-葡萄糖苷酶活性检测试剂和pH检测试剂；所述凝固酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的Gly-Arg二肽底物；所述α-葡萄糖苷酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的α-D-葡萄糖苷底物。为提高显色效果，它还可以包括显色液。本发明的优点在于灵敏度和特异性都比较高，比现有同类方法试剂的性能显著提高，可满足临床检测需要。

Description

一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒。

背景技术

念珠菌（Candida）是真菌中最常见的条件致病菌，又称假丝酵母，是引起人泌尿生殖道疾病的主要病原体之一，主要包括白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和克柔氏念珠菌等。在正常情况下，寄生在人体内的念球菌呈酵母细胞型，一般不致病。在机体某些生理、病理因素影响下，***/***内环境改变，机体抵抗力/免疫力降低时，念珠菌就会大量繁殖发展为菌丝型，侵犯组织，引起念珠菌病，所以念珠菌是一种条件致病菌。这些因素通常包括妊娠、糖尿病、口服避孕药、抗生素及皮质激素使用等。妇***道上皮细胞糖原增加，酸性增强时，念珠菌会繁殖引起***炎，故本病常见于孕妇、糖尿病患者及接受***治疗的患者。目前实验室检查方法有：l、涂片镜检：直接镜检是非常简单的实验室方法。女性用较长的消毒棉拭子取***、宫颈分泌物或***壁上乳白色薄膜，男性刮取******、***或***皮损表面鳞屑作为待检标本。取少许待检标本分泌物置于玻璃片上，加一滴10%氢氧化钾或生理盐水，覆盖上玻片，置于显微镜下，可见到成群的卵圆形念珠菌的孢子和菌丝。如找到较多的菌丝时，说明念珠菌处于致病阶段，对诊断更有意义。但这种方法受经验的影响大，而且受视野、干扰颗粒特别是取标本润滑所加的石蜡油影响比较大。2、培养法:此法敏感性很高，但出结果所需时间较长，时效性差，可能延误病情。3、乳胶凝集玻片试验:用多克隆抗体与某些念珠菌的酵母甘露聚糖发生反应，但未见能够用于临床的高品质的产品。4、生化酶法：通过检测念珠菌含有的特异性酶来诊断，此法准确性较高，方便快捷，结果直观，目前正在发展完善。

滴虫（Trichomonias）是一种微小有鞭毛的原虫生物，用肉眼无法看到，须在显微镜下观察。有三种是人类寄生虫:1、***毛滴虫，寄生在***、尿道及***，主要引起滴虫***炎；2、人毛滴虫，寄生于肠道，引起肠道滴虫病；3、口腔毛滴虫，寄生于口腔、齿垢，引起口腔滴虫病。目前实验室检查方法有： 1、悬滴法：将检体涂在载玻片上，再加1滴生理盐水后加盖玻片，显微镜下观察，可见原虫鞭毛波动膜活动。悬滴法是检查***毛滴虫最简单方法，但存在灵敏度低的问题，因为此方法检测滴虫是靠观察滴虫的运动性，而滴虫的运动性受温度影响较大，温度低时运动性明显降低。2、涂片染色法：将分泌物涂在玻片上，待自然干燥后可用不同染液染色，如革兰染色等，但这种方法受大小与滴虫类似的颗粒干扰，并且受视野范围影响。 3、培养法：将***分泌物或尿道分泌物加入培养基内，置37℃温箱中培养48小时，每隔72小时接种1次，取培养混匀液1滴涂片，染色镜检，这种方法检测所需时间长，临床一般需要一个小时内出结果，影响临床实际使用。 4.免疫学方法：检测***毛滴虫特定的抗原。常用的免疫学方法有荧光抗体检查法，ELISA法，乳胶凝集法等，其阳性率较涂片法高，但实际用于临床滴虫检测的高品质免疫学产品未见报道。

念珠菌和滴虫引起的疾病直接从症状上难以鉴别，往往需要辅以实验室检测手段。而目前能够直接鉴别滴虫和念珠菌的方法有显微镜镜检和免疫学的方法。显微镜镜检受检验人员的经验、观察视野以及标本中其他颗粒的影响大；免疫学的方法受技术所限，特别是病原体受白带包裹影响，灵敏度会受到影响。利用微生物所具有的特异性酶检测相应微生物的酶化学检测技术是微生物检测的又一大技术方向，事实上越来越多的科技人员正尝试利用该技术检测滴虫和念珠菌，比如通过胱氨酰蛋白酶检测滴虫，通过门冬酰胺蛋白酶检测念珠菌，但其灵敏度和特异性都有待考证。目前可以同时检测并鉴别滴虫和念珠菌的方法有N-乙酰-氨基己糖苷酶法，但此法灵敏度和特异性均偏低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高和特异性好且可满足临床检测需要的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，它包括凝固酶活性检测试剂、α-葡萄糖苷酶活性检测试剂和pH检测试剂；所述凝固酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的Gly-Arg二肽底物；所述α-葡萄糖苷酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的α-D-葡萄糖苷底物。

为提高显色效果，它还包括显色液；显色液为重氮盐化合物或氧化剂等配制的溶液，包括肉桂醛、固紫B盐、固蓝B盐、固蓝BB盐、固红、过氧化脲、三氯化铁等。

所述Gly-Arg二肽底物中的色原为4-甲氧基-β-萘胺、β-萘胺或硝基苯胺；所述Gly-Arg二肽底物中的荧光基团为香豆素衍生物或伞形酮衍生物。

所述α-D-葡萄糖苷底物中的色原为吲哚酚衍生物、硝基苯及其衍生物、萘酚衍生物或苯胺衍生物；所述α-D-葡萄糖苷底物中的荧光基团为伞形酮衍生物或香豆素衍生物。

所述凝固酶活性检测试剂和α-葡萄糖苷酶活性检测试剂可以固化在滤纸、玻璃纤维或塑料的固相载体上，也可以直接配制成液体使用。

所述pH检测试剂可以固化在滤纸、玻璃纤维或塑料的固相载体上，也可以直接配制成液体使用。

本发明试剂盒的使用方法为：

将待检测标本（如***分泌物）用适量的生理盐水稀释后，分别取一滴（25-50μl）加在凝固酶活性检测试纸、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸和pH检测试纸上，pH检测试纸可直接读出pH值，α-葡萄糖苷酶活性检测试纸与凝固酶活性检测试纸一起在37℃下温育15分钟，取出后,根据显示颜色读出结果或根据荧光强度读取结果。其中凝固酶活性检测试纸和α-葡萄糖苷酶活性检测试纸也可滴加显色液促进显色。

本发明原理为：

凝固酶（Coagulase）是指能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，促使血液凝固后可以保护病原菌不被吞噬或免受抗体等的作用。主要产生于葡萄球菌、鼠疫耶尔森菌、念珠菌等。α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase，EC 3.2.1.20)又被称为α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶(GTase)，是一种α-D-葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖。α-葡萄糖苷酶来源广泛，在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。

目前临床上没有开展凝固酶检测项目，α-葡萄糖苷酶临床上一般用于Ⅱ型糖原积累症和***的检测。经研究发现，滴虫有α-葡萄糖苷酶和凝固酶活性，白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌也同样具有该酶活，虽然克柔氏念珠菌等无该酶活性，但白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌占所有病原念珠菌中的95%以上，因此以α-葡萄糖苷酶和凝固酶活性可以把滴虫及绝大多数念珠菌检测出来。另外滴虫属于厌氧生物，其代谢过程产生大量的低级有机胺，从而使标本的pH值明显升高，达到5.0甚至更高，而感染念珠菌的标本一般检测会低于4.5。实验表明，感染滴虫的标本pH值都不低于4.8，而感染念珠菌的标本的pH值都不高于4.6，从而可以通过pH值把滴虫和念珠菌区别开来。因此通过α-葡萄糖苷酶、凝固酶和pH值可以把滴虫和念珠菌检测鉴别开来，即α-葡萄糖苷酶和凝固酶全阴性或任何一项阴性表明没有感染滴虫或念珠菌，α-葡萄糖苷酶和凝固酶同时阳性表明感染滴虫或念珠菌，其中若同时pH值不低于4.8表明感染滴虫，若同时pH值不高于4.6表明感染念珠菌。

本发明的优点在于灵敏度和特异性都比较高，比现有同类方法试剂的性能显著提高，可满足临床检测需要。

临床试验2523例郑州市妇幼保健院妇科门诊患者，通过扩阴器，用无菌试子采四份***后穹隆分泌物，一份采用悬滴法镜检滴虫和念珠菌，一份采用本发明试剂盒检测滴虫和念珠菌，另两份分别采用沙宝罗培养基和滴虫培养基培养检测念珠菌和滴虫，以培养法为金标准。检测结果见下表。

表1 本发明试剂盒与培养法滴虫检测对比结果

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表2 本发明试剂盒与培养法念珠菌检测对比结果

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上述结果显示，采用本发明试剂盒检测鉴别滴虫的灵敏度为97.5%，特异性为98.0%；检测鉴别念珠菌的灵敏度为85.5%，特异性为89.6%。

本发明试剂盒的使用方法方便快捷，不需要显微镜等特殊设备（采用荧光底物时需要荧光仪或紫外灯），在加热的情况下，15分钟内即可出结果；检测结果客观可靠，由于是根据颜色变化判断结果，大大减少了检测人员主观因素的影响；操作简单，无需长时间的经验积累，易于推广应用。

具体实施方式

实施例1

一、试剂盒的制备

1、称甘氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺盐酸盐（Gly-Arg-4-methoxy-β- naphthylamine·HCl，Sigma-Aldrich公司生产）（也可用甘氨酰-精氨酸-β-萘胺），用400mM磷酸盐缓冲液（pH4.0-8.0）溶解，使其浓度达到2-5mg/ml；称对二甲氨基肉桂醛（也可以是对二甲氨基苯甲醛）0.2g溶于1000ml 0.3mol/L  H₂SO₄溶液中；以上两种溶液体积比1:1，混合均匀，按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得凝固酶检测试纸。

2、称6-氯-3吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷（卡博森斯化学科技（苏州）有限公司生产）（也可以用5-Br-6-氯-3吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷、5-Br-4-氯-3-吲哚-a-D-吡喃葡萄糖苷），用适量甲醇溶解后，再溶于400mM磷酸盐缓冲液（pH5.0），使其浓度达到0.5-2mg/ml,混合均匀。按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得a-葡萄糖苷酶检测试纸。

3、称取溴甲酚绿用无水乙醇溶剂，混合均匀后，使其浓度达到2mg/ml，按15μl/片加到边长5mm的纸片上，干燥过夜，即得pH值检测试纸。

4、称固紫B盐用纯化水溶解，混合均匀，使其浓度达到0.5g/l，即可得到显色液。

二、本发明试剂盒使用方法

1、将待检测标本（如***分泌物）用适量的生理盐水（0.3-0.5ml）稀释。

2、分别取一滴（25-50μl）加在凝固酶活性检测试纸、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸和pH检测试纸上，pH检测试纸可直接读出pH值。

3、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸上加一滴显色液后与凝固酶活性检测试纸一起在37℃下温育15分钟，取出后,根据显示颜色,读取结果：α-葡萄糖苷酶检测试纸和凝固酶检测试纸显示红色为阳性结果，根据显色深浅又可分为弱阳性结果（标记为“±”）和强阳性结果（标记为“+”），不显色或者显示浅淡色为阴性结果（标记为“-”）。

4、结果判读

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实施例2

一、试剂盒制备

1、称 Z-甘氨酰-精氨酸-对硝基苯胺（Z-Gly-L-Arg-4-nitroanilide，上海瀚鸿化工有限公司生产），用400mM磷酸盐缓冲液（pH4.0）溶解，使其浓度达到5mg/ml；按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得凝固酶检测试纸。

2、称6-Br-2-萘酚-a-D-吡喃葡萄糖苷（卡博森斯化学科技（苏州）有限公司生产）（也可以用6-Br-1-萘酚-a-D-吡喃葡萄糖苷），用适量乙醇溶解后，再溶于400mM磷酸盐缓冲液（pH5.5），使其浓度达到2mg/ml,混合均匀。按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得α-葡萄糖苷酶检测试纸。

3、称取溴甲酚绿用无水乙醇溶剂，混合均匀后，使其浓度达到2mg/ml，按15μl/片加到边长5mm的纸片上，干燥过夜，即得pH值检测试纸。

4、称固紫B盐用纯化水溶解，混合均匀，使其浓度达到0.5g/l，即可得到显色液。

二、本发明试剂盒使用方法

1、将待检测标本（如***分泌物）用适量的生理盐水（0.3-0.5ml）稀释。

2、分别取一滴（25-50μl）加在凝固酶活性检测试纸、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸和pH检测试纸上，pH检测试纸可直接读出pH值。

3、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸上加一滴显色液后与凝固酶活性检测试纸一起在37℃下温育15分钟，取出后,根据显示颜色,读取结果：α-葡萄糖苷酶检测试纸显示红色为阳性结果，根据显色深浅又可分为弱阳性结果（标记为“±”）和强阳性结果（标记为“+”），不显色或者显示浅淡色为阴性结果（标记为“-”）。 凝固酶检测试纸显示黄色为阳性结果，根据显色深浅又可分为弱阳性结果（标记为“±”）和强阳性结果（标记为“+”），不显色或者显示浅淡色为阴性结果（标记为“-”）。

4、结果判读

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实施例 3

一、本发明试剂盒制备

1、称 甘氨酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素（Gly-L-Arg-7-amino-4-methylcoumarin，上海吉尔生化有限公司生产），用100-400mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）溶解，使其浓度达到0.2-1mg/ml；按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得凝固酶检测试纸。

2、称4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（卡博森斯化学科技（苏州）有限公司生产）（也可以用香草醛-α-D-吡喃葡萄糖苷、4-甲基香豆素-α-D-吡喃葡萄糖苷、4-甲基香豆素-2-脱氧-2-硫酸氨基-α-D-吡喃葡萄糖苷钠），用适量二甲基亚砜溶解后，再溶于100mM-400mM乙酸盐缓冲液（pH5.1），使其浓度达到1mg/ml,混合均匀。按10ul/片加到5mm直径的圆纸片上，干燥过夜，即得a-葡萄糖苷酶检测试纸。

3、称取溴甲酚绿用无水乙醇溶剂，混合均匀后，使其浓度达到2mg/ml，按15μl/片加到边长5mm的纸片上，干燥过夜，即得pH值检测试纸。

二、本发明试剂盒使用方法

1、将待检测标本（如***分泌物）用适量的生理盐水（0.3-0.5ml）稀释。

2、分别取一滴（25-50μl）加在凝固酶活性检测试纸、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸和pH检测试纸上，pH检测试纸可直接读出pH值。

3、α-葡萄糖苷酶活性检测试纸与凝固酶活性检测试纸一起在37℃下温育15分钟后，用Perkin Elemer LS50B 荧光仪观察荧光情况,读取结果：α-葡萄糖苷酶检测试纸和凝固酶检测试纸根据荧光强度可分为弱阳性结果（标记为“±”）和强阳性结果（标记为“+”），不显色或者显示浅淡色为阴性结果（标记为“-”）。

4、结果判读

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Claims (6)

1.一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：它包括凝固酶活性检测试剂、α-葡萄糖苷酶活性检测试剂和pH检测试剂；

所述凝固酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的Gly-Arg二肽底物；

所述α-葡萄糖苷酶活性检测试剂所用的酶底物为含有色原或荧光基团的α-D-葡萄糖苷底物。

2.根据权利要求1所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：它还包括显色液。

3.根据权利要求1或2所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：所述Gly-Arg二肽底物中的色原为4-甲氧基-β-萘胺、β-萘胺、硝基苯胺；所述Gly-Arg二肽底物中的荧光基团为香豆素衍生物或伞形酮衍生物。

4.根据权利要求1或2所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：所述α-D-葡萄糖苷底物色原包括吲哚酚衍生物、硝基苯及其衍生物、萘酚衍生物或苯胺衍生物；所述α-D-葡萄糖苷底物荧光基团包括伞形酮衍生物或香豆素衍生物。

5.根据权利要求1或2所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：所述凝固酶活性检测试剂和α-葡萄糖苷酶活性检测试剂固化在滤纸、玻璃纤维、塑料的固相载体上或直接配制成液体使用。

6.根据权利要求1所述的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其特征在于：所述pH检测试剂固化在滤纸、玻璃纤维、塑料的固相载体上或直接配制成液体使用。