CN105441504B - 一种环二肽类化合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环二肽类化合物的制备方法，所述方法是将桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养5～7d后，再在25～30℃下静置4～5d，将培养液分离纯化，获得环(甘‑脯)二肽、环(丙‑脯)二肽、环(异亮‑脯)二肽和环(丙‑缬)二肽化合物；本发明所述培养方法使桔青霉MNP12010101细胞合成了常规培养条件下不能合成的环二肽；培养基组成简单，工艺简单，发酵成本低；桔青霉MNP12010101细胞合成的4种环二肽具有抗肿瘤活性。

Description

一种环二肽类化合物的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及利用一株海洋真菌——半知菌纲壳霉目杯霉科青霉属桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101制备环二肽的方法。

(二)背景技术

海洋天然产物已成为药物先导化合物的重要来源之一。从20世纪60年代起，寻找海洋来源的天然活性物质已成为一大研究热点。最初的研究，人们主要集中在一些海洋低等生物，如软体动物，藻类、浮游生物等。随着研究的深入，越来越多结构奇特并具良好活性的天然产物相继被分离。1988年～1992年间，海洋微生物产生的新化合物几乎从零升到12.7％，而来源于陆栖真菌产生的新化合物已由74.7％下降到50.5％。

常规方法培养海洋微生物，分离和筛选活性次生代谢产物，难度越来越大。如果利用环境胁迫、调节生物合成途径以及利用基因调控等手段，阻断途径特异性抑制子或激活相关的“沉默”基因，激活隐性次生代谢产物生物合成，挖掘海洋微生物合成次代谢产物的能力，从新合成的代谢中筛选具有生物活性物质，则有望筛选到新型生物活性物质或先导化合物。

在前期研究中，从海水中分离到一株桔青霉MNP12010101菌株(中国发明专利ZL201210572388.3)能够产生抑制神经癌细胞(PC12)，肝癌细胞(HepG2)和组织细胞淋巴瘤细胞(U937)的活性物质。是一个表现“突出”的海洋真菌，但从霉菌合成次生代谢产物多样性角度看，合成活性次生代谢产物的能力还没有完全“发挥”。如采用环境胁迫激活桔青霉“沉默”基因的表达，产生更多的次生代谢产物，就有可能筛选到更多或活性更好的次生代谢产物。本发明采用高浓度的钴离子胁迫培养桔青霉MNP 12010101菌株，从代谢产物中获得具有生物活性的化合物。

环二肽(cyclic dipeptides)，又名2,5-二氧哌嗪(2,5-dioxopiperazines)或2,5-二酮哌嗪(2,5-diketopiperazines)，由两个氨基酸通过肽键环合形成，是自然界中最小的环肽。环二肽在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中均有发现，由于它们的结构中有一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用，有2个氢键给体和2个氢键受体，氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因而环二肽在药物化学中是一个重要的药效团，目前发现许多环二肽具有较好的生理活性，如影响胞间信息传递、抑菌、抑制毒素活性、促癌细胞凋亡、镇痛以及免疫增强等。近些年来引起了有机化学、生物学和药物学研究领域的广泛兴趣。作为肽类化合物中最具有特点的一类化合物，其生物活性方面具有巨大的发掘和开发潜力。

(三)发明内容

本发明涉及利用一株海洋真菌—半知菌纲壳霉目杯霉科青霉属桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101制备环二肽类化合物(即环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽)的方法。采用常规的培养基培养，未发现该菌株产生环二肽，但在培养基中添加高浓度的钴离子(是常规微生物培养基的200～1000倍)，创造了一种重金属离子胁迫环境，菌体代谢途径受到影响，虽然细胞生长量有所下降，但发酵总浸膏的抗肿瘤活性则相对提高，从总浸膏中分离得到上述4种环二肽类化合物。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种环二肽类化合物的制备方法，所述方法是将桔青霉(Penicilliumcitrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养5～7d后(即培养至菌体干重达到10～12g/L)，再于25～30℃下静置4～5d，将培养液分离纯化，获得环二肽类化合物(即环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽)；所述发酵培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏1～2g/L，溶剂为体积比1:1～2的人工海水与蒸馏水混合液，pH 6～7，高压蒸汽121℃灭菌15～20min；所述每升人工海水组成为：NaCl24.48g，Na₂SO₄ 3.917g，KCl 0.664g，KBr0.096g，SrCl₂ 0.024g，MgCl·6H₂O 4.981g，CaCl₂·H₂O 1.102g，NaHCO₃ 0.192g，H₃BO₃0.026g，NaF 0.004g，用蒸馏水定容至1L。

进一步，所述钴离子以氯化钴的形式加入，所述氯化钴在发酵培养基中的终浓度为1～2g/L，优选1g/L，是常规微生物培养基的200～1000倍。

进一步，优选所述的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/L，溶剂为体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液，pH 7.0。

本发明所述桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101在发酵培养前先进行斜面培养和种子培养：

(1)斜面培养：将桔青霉MNP12010101接种于斜面培养基，于25～30℃培养48～60h，获得斜面菌种孢子；所述的斜面培养基组成为：马铃薯150～250g/L(煮沸30min后过滤去渣)，葡萄糖15～30g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为人工海水，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌15～20min；所述人工海水组成同发酵培养基；

(2)种子培养：将桔青霉MNP12010101的活化培养的菌种孢子接种于种子培养基中，于25～30℃、150～250r/min振荡条件下培养36～48h，得种子液；所述的种子培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏1～2g/L，溶剂为体积比1:1～2的人工海水与蒸馏水混合液，pH 6～7，高压蒸汽121℃灭菌15～20min；所述人工海水组成同发酵培养基。

本发明将桔青霉MNP12010101经过活化培养、种子培养和发酵培养，得到含环二肽的培养物，培养物经过提取分离纯化，可获得4种环二肽类化合物，即环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽，具体本发明所述从培养液分离纯化获得环二肽类化合物的方法为：

(1)将培养液过滤，滤液用同体积的乙酸乙酯萃取3～5遍，合并萃取液，于45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物；滤饼用等同过滤前培养液体积的甲醇浸泡12～24h，再于25℃、100KHz超声提取30～60min，二次过滤除去菌体，二次滤液于50℃减压蒸馏除去甲醇和水分，所得二次膏状物用甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次于50℃减压蒸馏除去甲醇，反复1～3次，获得菌体提取物，合并发酵液提取物和菌体提取物，即为发酵总浸膏；

(2)将步骤(1)制备的发酵总浸膏用少量甲醇溶解后采用AB-8大孔吸附树脂进行分离，先用2倍柱体积的纯水淋洗，洗脱液弃去，再分别用2倍柱体积的体积浓度为20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液f1、流出液f2和流出液f3，减压浓缩至膏状，获得膏状物F1、膏状物F2和膏状物F3；

(3)将步骤(2)中膏状物F1用少量甲醇溶解后进行MCI层析分离，分别用2个柱体积的体积浓度10％和体积浓度20％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液f4和流出液f5，流出液f4减压浓缩后获得的膏状物F4用少量甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度11％的甲醇水溶液为流动相，收集主峰的流出液，蒸干溶剂后，即得环(甘-脯)二肽；流出液f5减压浓缩后获得的膏状物F5用少量甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度19％的甲醇水溶液为流动相，收集2个主峰流出液，蒸干溶剂后，即得环(丙-脯)二肽和环(异亮-脯)二肽；

(4)将步骤(2)中膏状物F3用少量甲醇溶解后采用MCI层析柱分离，用体积浓度45％的乙醇水溶液洗脱，收集流出液f6浓缩后获得的膏状物F6用少量甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度47％的甲醇水溶液为流动相，收集主峰流出液，蒸干溶剂后，即得环(丙-缬)二肽。

本发明用于制备环二肽的产生菌种为桔青霉MNP12010101菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M2012318，保藏日期2012年8月28日。该菌株的分离、鉴定以及保藏已在中国发明专利ZL201210572388.3公开。

本发明所述流出液f1、流出液f2、流出液f3、流出液f4、流出液f5和流出液f6，均指收集的流出液，膏状物F1、膏状物F2、膏状物F3，膏状物F4、膏状物F5和膏状物F6，均指膏状物，为了便于表述不同步骤及组分而命名，字母本身没有含义。

本发明的有益效果主要体现在：(1)采用本发明的培养方法，桔青霉MNP12010101细胞合成了常规培养条件下不能合成的环二肽类化合物；(2)培养基组成简单，工艺简单，发酵成本低；(3)桔青霉MNP12010101细胞合成的环二肽具有抗肿瘤活性。

(四)附图说明

图1桔青霉MNP12010101在常规培养(A)与1.0g/L氯化钴胁迫培养(B)发酵总浸膏的HPLC的图谱。

图2桔青霉MNP12010101发酵液浸膏中单体化合物分离流程图，F1-F6分别表示不同分离阶段的洗脱液浓缩物。

图3分离得到的4种环二肽在HPLC图谱中对应出峰位点。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中所述每升人工海水组成为：NaCl 24.48g，Na₂SO₄ 3.917g，KCl0.664g，KBr 0.096g，SrCl₂ 0.024g，MgCl·6H₂O 4.981g，CaCl₂·H₂O 1.102g，NaHCO₃0.192g，H₃BO₃ 0.026g，NaF 0.004g，用蒸馏水定容至1L。

实施例1：培养基的选择

用高浓度金属离子培养基胁迫培养桔青霉MNP12010101，采用HPLC指纹图谱法分析代谢产物的多样性，四甲基偶氮唑法(MTT法)检测发酵总浸膏抗肿瘤活性的变化，从而筛选出一种金属离子，加入到培养基后能促使桔青霉产生更多的抗肿瘤活性物质。实验的金属离子包括Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Co²⁺和Cu²⁺等。结果表明，Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺和Cu²⁺加入到发酵培养基中，桔青霉的代谢产物多样性基本没有变化，发酵总浸膏的抗肿瘤活性也没有显著提高，唯有发酵培养基中添加1.0g/L氯化钴(CoCl₂)时，桔青霉的代谢产物多样性增加，发酵总浸膏的抗肿瘤活性增强，具体实验步骤和方法如下：

(1)将桔青霉MNP12010101接种于斜面培养基，于28℃培养48h，得到活化后的斜面菌种孢子，所述斜面培养基组成为：马铃薯200g/L(煮沸30min后过滤去渣)，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L，人工海水定容，pH 7.0，高压蒸汽121℃灭菌15min；

(2)将步骤(1)活化培养后的斜面菌种孢子接种至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶装中，于28℃、200r/min振荡条件下培养48h，得种子液。所述的种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸膏1g/L，用体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液溶解，pH 7.0，高压蒸汽121℃灭菌15min。

(3)将步骤(2)种子液以10％体积浓度的接种量，移种到50mL含1.0g/L氯化钴的发酵培养基中(250mL三角瓶装)，于28℃、200r/min振荡条件下培养5d后(菌体干重为10.7g/L)，再于28℃下静置4d，得到培养物。所述的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/L，用体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液溶解，pH 7.0，高压蒸汽121℃灭菌15min。

(4)将步骤(3)制备的培养液50mL用8层纱布过滤，分离菌体和发酵液，获得滤液45mL和滤饼，滤液用50mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液，萃取液45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物。滤饼用50mL甲醇浸泡12h，再于25℃、100KHz超声提取30min，过滤除去菌体，滤液50℃减压蒸馏除去甲醇和水，得膏状物用甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次于50℃减压蒸馏除去甲醇，反复1～3次，获得菌体提取物。合并发酵液提取物和菌体提取物，即为发酵总浸膏12.7mg。

(5)将步骤(4)制备的发酵总浸膏12.7mg用体积与质量比(mL:g)为5:1的甲醇溶解，经0.22μm滤膜过滤，滤液用HPLC分析代谢产物情况，并与未加氯化钴的培养基培养桔青霉MNP12010101制备的发酵总浸膏中代谢产物比较，结果如图1所示。从图1可以看出：上述方法制备的桔青霉MNP12010101发酵总浸膏(图1中A)中，HPLC图谱出峰数量明显多于培养基未加氯化钴时(图1中B)出峰数量，说明有新化合物合成。

(6)测定步骤(4)制备的发酵总浸膏的抗肿瘤细胞活性，并与未加氯化钴的培养基培养桔青霉MNP12010101制备的发酵总浸膏的活性相比较，结果显示：上述方法制备的桔青霉MNP12010101发酵总浸膏抗肿瘤活性明显增强，对人肺腺癌细胞(A549)抑制IC₅₀值由培养基未加氯化钴时的141.12μg/mL降低至61.23μg/mL，说明桔青霉MNP 12010101在浓度1.0g/L氯化钴的胁迫培养下，抗肿瘤活性代谢产物浓度提高或种类增加。

所述的发酵总浸膏抗肿瘤活性分析采用MTT法，测试的肿瘤细胞为人肺腺癌细胞(A549)，具体方法是：

收集对数期A549肿瘤细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液，每孔加入100μL，每孔细胞数在5000～10000个，边缘孔用无菌水填充。将待测样品(即步骤4制备的发酵总浸膏)用DMEM培养基溶解，并加1‰体积的二甲基亚砜(DMSO)助溶，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，将待测样品配制成终浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的样品液。试验组每孔加入样品液100μL；空白组则仅加入200μL含10％胎牛血清的DMEM培养基；阴性组则加入200μL细胞悬液；阳性对照组加入100μL相同浓度的5-氟尿嘧啶。每个样品设5个复孔做重复。加样后置于37℃，5％CO₂培养箱孵育48h后，每孔加入已过滤膜除菌的20μL5mg/mL MTT溶液，继续在原有条件下培养4h后，用移液枪小心吸掉上清，加入150μL DMSO，小心振荡10min，待结晶物充分溶解后，使用酶标仪测定在490nm处的吸光值，并用以下公式计算抑制率：

抑制率＝(A_对照组－A_试验组)/(A_对照组－A_空白)×100％。

按公式lg IC50＝X_m-I(P-(3-P_m-P_n)/4)计算IC50，X_m：lg最大剂量，I：lg(最大剂量/相临剂量)，P：抑制率之和，P_m：最大剂量抑制率，P_n：最小剂量抑制率。

实施例1的实验结果表明：发酵培养基中添加1.0g/L的氯化钴，能显著促进桔青霉MNP12010101合成抗肿瘤活性的代谢产物。

实施例2：发酵培养基钴离子浓度的选择

改变发酵培养基中氯化钴的浓度，胁迫培养桔青霉MNP12010101，采用HPLC指纹图谱法分析代谢产物的多样性，四甲基偶氮唑法(MTT法)检测发酵总浸膏抗肿瘤活性的变化，具体实验步骤和方法如下：

(1)按实施例1方法，制备桔青霉MNP12010101的种子液；

(2)将步骤(2)种子液以10％体积浓度的接种量，移种到50mL含不同浓度氯化钴的发酵培养基中(250mL三角瓶装)，氯化钴浓度见表1，于28℃、200r/min振荡条件下培养5d后(不同氯化钴浓度下菌体干重得率见表1)，再于28℃下静置4d，得到培养物。所述的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/L，用体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液溶解，pH 7.0，高压蒸汽121℃灭菌15min。

(3)将步骤(2)制备的培养液50mL用8层纱布过滤，分离菌体和发酵液，获得滤液45mL和滤饼，滤液用50mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液，萃取液45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物。滤饼用50mL甲醇浸泡12h，再于25℃、100KHz超声提取30min，过滤除去菌体，滤液50℃减压蒸馏除去甲醇和水，得膏状物用甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次于50℃减压蒸馏除去甲醇，反复1～3次，获得菌体提取物。合并发酵液提取物和菌体提取物，即为发酵总浸膏，不同氯化钴浓度下，50mL培养液制备的发酵总浸膏得率见表1。

(4)将步骤(3)制备的发酵总浸膏用体积与质量比(mL:g)为5:1的甲醇溶解，经0.22μm滤膜过滤，滤液用HPLC分析代谢产物情况，并与未加氯化钴的培养基培养桔青霉MNP12010101制备的发酵总浸膏中代谢产物比较，结果表明：发酵培养基中氯化钴浓度在0.5～2.5g/L范围内，上述方法制备的桔青霉MNP12010101发酵总浸膏中，HPLC图谱出峰数量均多于培养基未加氯化钴时出峰数量，但在氯化钴浓度为1g/L时，出峰数量增加的最显著。

(5)测定步骤(3)制备的发酵总浸膏的抗肿瘤细胞活性，并与未加氯化钴的培养基培养桔青霉MNP12010101制备的发酵总浸膏的活性相比较，结果显示：上述方法制备的桔青霉MNP12010101发酵总浸膏抗肿瘤活性明显增强，对人肺腺癌细胞(A549)抑制IC₅₀值由培养基未加氯化钴时的142.5μg·mL^-1降低至61.43～125.6μg·mL^-1，说明桔青霉MNP 12010101在浓度0.5～2.5g/L氯化钴的胁迫培养下，抗肿瘤活性代谢产物浓度提高或种类增加。

所述的发酵总浸膏抗肿瘤细胞活性测定方法同实施例1。

表1 发酵培养基不同氯化钴浓度下的菌体得率和抗肿瘤活性

比较表1中数据可以看出：在桔青霉MNP12010101的发酵培养基中氯化钴浓度的不同，对菌体得率、发酵总浸膏得率及对A549的抑制活性都有一定影响。在氯化钴浓度为1～2g/L范围内，较在未加氯化钴发酵培养中培养，菌体得率和发酵总浸膏得率没有显著下降，但是发酵总浸膏对A549的抑制率则显著提高，所以，胁迫培养桔青霉MNP12010101产生抗肿瘤活性物质的氯化钴浓度范围为1～2g/L。

实施例3：发酵总浸膏的制备

利用含1.0g/L的氯化钴的发酵培养基，对桔青霉MNP12010101大量发酵培养，制备发酵总浸膏，具体步骤是：

将桔青霉MNP12010101接种于斜面培养基，于28℃培养60h，得到活化后的菌种孢子；挑取活化培养后的菌种孢子接种至装有100mL种子培养基(500mL的三角瓶装)中，于28℃、200r/min振荡条件下培养36h，得到种子液；将种子液以10％体积浓度的接种量，移种到400mL发酵培养基中(1L三角瓶装)，于28℃、200r/min振荡条件下培养7d后(菌体干重为12.2g/L)，再于28℃下静置5d，得到培养物。按上述步骤，共发酵培养制备了80L培养物。

上述80L桔青霉MNP12010101培养物用8层纱布过滤，分离菌体和发酵液75L。发酵液于50℃下减压浓缩至3L，再用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，萃取液45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物。菌体用3L的甲醇浸泡24h，再于25℃、100KHz超声提取60min，50℃减压蒸馏除去甲醇和水分，再将提取物用100mL甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次50℃减压蒸馏除去甲醇，反复3次，以除去不溶于甲醇的盐类等物质，获得菌体提取物。合并发酵液提取物和菌体提取物，得桔青霉MNP12010101的发酵总浸膏16g。

所述的斜面培养基、种子培养基和发酵培养基组成同实施例1。

实施例4：代谢产物的分离与结构鉴定

运用AB-8大孔吸附树脂、MCI柱层析、ODS-C18柱层析手段成功从桔青霉MNP12010101的发酵总浸膏中分离得到4个环二肽化合物，即环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽，分离步骤如图2，具体方法步骤为：

(1)将实施例3制备的发酵总浸膏16g用50mL甲醇溶解后，上AB-8大孔吸附树脂柱，先用2倍柱体积的纯水淋洗，洗脱液弃去，再分别用2倍柱体积的体积浓度为20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液液f1、流出液f2和流出液f3，减压浓缩至膏状，分别获得膏状物F1、膏状物F2和膏状物F3。

(2)将步骤(1)中膏状物F1用少量甲醇溶解后上MCI层析柱。分别用2个柱体积的体积浓度10％和体积浓度20％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液f4和流出液f5，流出液f4减压浓缩后获得膏状物F4再用少量甲醇溶解后经制备色谱纯化(ODS-C18柱，流动相为11％的甲醇水溶液)，收集主峰的流出液，蒸干溶剂后得纯品化合物，经核磁共振(¹H-NMR和¹³C-NMR)法结构鉴定，确定其为环(甘-脯)二肽；流出液f5减压浓缩后获得膏状物F5用少量甲醇溶解再经制备色谱纯化(ODS-C18柱，流动相为19％的甲醇水溶液)，收集2个主峰流出液，蒸干溶剂后得纯品化合物，经核磁共振(¹H-NMR和¹³C-NMR)法结构鉴定，确定2个化合物分别为环(丙-脯)二肽和环(异亮-脯)二肽。

(3)将步骤(2)中膏状物F3用少量甲醇溶解后上MCI层析柱，用体积浓度45％的乙醇水溶液洗脱，流出液f6浓缩后获得膏状物F6用少量甲醇溶解再经制备色谱纯化(ODS-C18柱，流动相为47％的甲醇水溶液)，收集主峰流出液，蒸干溶剂后得纯品化合物，经核磁共振(¹H-NMR和¹³C-NMR)法结构鉴定，确定其为环(丙-缬)二肽。

上述环二肽都是首次在桔青霉的代谢产物中发现，它们的合成与发酵培养基中添加高浓度的氯化钴，以及本发明采用的发酵方法有直接关系。

实施例5：抗肿瘤活性测试

对实施例4从桔青霉MNP12010101发酵总浸膏中分离获得的环二肽类化合物进行了抗肿瘤活性的测定，选择人肺腺癌细胞(A549)、人***癌细胞(PC-3)和人结肠癌细胞(HCT116)肿瘤细胞株为实验对象，以5-氟尿嘧啶为阳性对照，结果见表2。

表2 各化合物对A549，PC-3和HCT116肿瘤细胞的IC₅₀

注:n＝5，x±s

从表2可以看出：4种环二肽对A549、PC-3和HCT116肿瘤细胞株均有一定的抑制活性。

所述的环二肽抗肿瘤细胞活性测定方法同实施例1。

本发明所述的4种环二肽具有实验测定抗肿瘤细胞活性外，已有大量文献报道它们的其他生物活性，如环(甘-脯)二肽具有抗癌和免疫增强活性(张平.虫草属真菌研究进展.生物学杂志,2003,20(6):43-45.)；环(丙-脯)二肽具有细胞周期期抑制活性(韩冰，李文欣，崔承彬，等.黄直丝链霉菌18522生产的环二肽类细胞周期抑制剂.沈阳药科大学学报,2015,(2):108-110)；环(异亮-脯)二肽对鳗弧菌具有较好的抑制活性(艾峰，许强芝，杨妤，等.东海微生物中6种环二肽类天然活性物质的分离和鉴定.第二军医大学学报,2006,27(1):22-24.)；环(丙-缬)二肽能激活AHL感应器、诱导生物发光(Holden M,Ram N R,Stead P,et al.Quorum-sensing cross talk:isolation and chemicalcharacterization of cyclic dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and othergram-negative bacteria.Molecular Microbiology,1999,33(6):1254-1266.)。

综上所述，本发明所述的4种环二肽在药物开发中有一定的潜在应用。

Claims (4)

1.一种环二肽类化合物的制备方法，其特征在于所述方法是将桔青霉(Penicilliumcitrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养5～7d后，再在25～30℃下静置4～5d，培养液经分离纯化，获得环二肽类化合物；所述环二肽类化合物为甘-脯环二肽、丙-脯环二肽、异亮-脯环二肽和丙-缬环二肽；所述钴离子以氯化钴的形式加入，所述氯化钴在发酵培养基中的终浓度为1～2g/L；所述发酵培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏1～2g/L，溶剂为体积比1:1～2的人工海水与蒸馏水混合液，pH 6～7；所述每升人工海水组成为：NaCl 24.48g，Na₂SO₄3.917g，KCl 0.664g，KBr 0.096g，SrCl₂ 0.024g，MgCl·6H₂O 4.981g，CaCl₂·H₂O 1.102g，NaHCO₃ 0.192g，H₃BO₃ 0.026g，NaF 0.004g，用蒸馏水定容至1L。

2.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法，其特征在于所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/L，溶剂为体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液，pH 7.0。

3.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法，其特征在于所述桔青霉MNP12010101在发酵培养前先进行斜面培养和种子培养：

(1)斜面培养：将桔青霉MNP12010101接种至斜面培养基，于25～30℃培养48～60h，获得斜面菌种孢子；所述的斜面培养基组成为：马铃薯150～250g/L，葡萄糖15～30g/L，琼脂18～20g/L，溶剂为人工海水，pH自然；所述人工海水组成同发酵培养基中人工海水组成；

(2)种子培养：将桔青霉MNP12010101经斜面活化培养的菌种孢子接种于种子培养基中，于25～30℃、150～250r/min振荡条件下培养36～48h，得种子液；所述的种子培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏1～2g/L，溶剂为体积比1:1～2的人工海水与蒸馏水混合液，pH 6～7；所述人工海水组成同发酵培养基中人工海水组成。

4.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法，其特征在于所述从培养液分离纯化获得环二肽类化合物的方法为：

(1)将培养液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3～5遍，合并萃取液，于45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物；滤饼用甲醇浸泡12～24h，再于25℃、100KHz超声提取30～60min，二次过滤除去菌体，二次滤液于50℃减压蒸馏除去甲醇和水分，所得二次膏状物用甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次于50℃减压蒸馏除去甲醇，反复1～3次，获得菌体提取物，合并发酵液提取物和菌体提取物，即为发酵总浸膏；

(2)将步骤(1)制备的发酵总浸膏用甲醇溶解后采用AB-8大孔吸附树脂进行分离，先用2倍柱体积的纯水淋洗，再分别用2倍柱体积的体积浓度为20％、40％、60％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液f1、流出液f2和流出液f3，减压浓缩至膏状，获得膏状物F1、膏状物F2和膏状物F3；

(3)将步骤(2)中膏状物F1用甲醇溶解后进行MCI层析分离，分别用2个柱体积的体积浓度10％和体积浓度20％的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液f4和流出液f5，流出液f4减压浓缩后获得的膏状物F4用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度11％的甲醇水溶液为流动相，收集主峰的流出液，蒸干溶剂后，即得甘-脯环二肽；流出液f5减压浓缩后获得的膏状物F5用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度19％的甲醇水溶液为流动相，收集2个主峰流出液，蒸干溶剂后，即得丙-脯环二肽和异亮-脯环二肽；

(4)将步骤(2)中膏状物F3用甲醇溶解后采用MCI层析柱分离，用体积浓度45％的乙醇水溶液洗脱，收集流出液f6浓缩后获得的膏状物F6用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化，以体积浓度47％的甲醇水溶液为流动相，收集主峰流出液，蒸干溶剂后，即得丙-缬环二肽。