CN102093470A - 组氨酸-脯氨酸环二肽的液相合成法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物化学领域，具体涉及一种活性肽类物质组氨酸-脯氨酸环二肽（Cyclo(His-Pro)，简称CHP）的制备方法。过程主要有氨基全保护的组氨酸的合成、线性二肽的合成、环二肽合成等步骤。是以组氨酸为原料，包括二碳酸二叔丁酯与组氨酸的反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N（α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸与L-脯氨酰胺反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽、N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽经过脱保护环合反应得到组氨酸-脯氨酸环二肽等步骤。本发明所述方法具有简化工艺、降低成本、减少工时、安全操作的优良效果，能够制备高纯度、高活性的组氨酸-脯氨酸环二肽产品。
Description
技术领域
本发明属生物化学领域，具体涉及一种活性肽类物质组氨酸-脯氨酸环二肽（Cyclo(His-Pro)，简称CHP）的制备方法。
背景技术
CHP为内源性环状二肽，广泛存在人及动物的体液和组织中，具有多方面的生物学活性，包括对抗乙醇的麻醉、降温及降低脑中cAMP水平的作用，对治疗酒精依赖综合症和糖尿病有一定的作用。其体内合成由促甲状腺素释放激素（TRH）经焦谷氨酸氨肽酶水解，脱去焦谷氨酸后环化而成。由于其结构中的组氨酸和脯氨酸都带有杂环结构，形成环状二肽结构更为复杂，给体外合成CHP带来很大的困难，本发明采用的液相法生产工艺可以提供一种有效的体外合成方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简化、成本降低、工时减少、操作安全的组氨酸-氨酸环二液相合成方法。
本发明是一种液相化学合成法，过程主要有氨基全保护的组氨酸的合成、线性二肽的合成、环二肽合成等步骤。是以组氨酸为原料，通过二碳酸二叔丁酯与组氨酸的反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N（α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸；N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸与L-脯氨酰胺反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽；N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽经过脱保护环合反应得到组氨酸-脯氨酸环二肽。应用本专利所述方法，还可以合成其它的线性二肽或环二肽。
具体工艺步骤如下：
（1）取15克～25克L-组氨酸悬浮于35～70毫升水中，然后加入70～140毫升的四氢呋喃；在-5℃～5℃条件下，加入50～60克二碳酸二叔丁酯；然后在-5℃～5℃条件下，以0.10～0.20ml/min的速度滴加35～70毫升的10%～20%碳酸钾水溶液，边滴加边搅拌，滴加完毕后继续搅拌20～50分钟；自然升温至室温，反应12～24小时；减压去除四氢呋喃，水相用40～80毫升***提取两次，然后用70～140毫升饱和硫酸氢钾溶液调节pH＝1～5；将此反应液用乙酸乙酯提取三次，合并提取液，加无水硫酸镁干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸白色粉末。
（2）取30克～40克得到的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸悬浮于150～300毫升四氢呋喃中，加入15～25克N,N'-羰基二咪唑，搅拌使其全部溶解；搅拌反应20～40分钟后，在-5℃～5℃条件下加入10～20克的L-脯氨酰胺，加完后，继续搅拌20～50分钟，自然升温至室温，反应12～24小时；减压去除四氢呋喃，将水相用40～80毫升乙酸乙酯提取五次，合并提取液，然后用0.3%～0.6%（v/v）的浓盐酸/饱和食盐水溶液75毫升～150毫升洗涤五次，有机相中加无水硫酸镁干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽粉末。
（3）在带有温度计、pH电极、回流冷凝管、加热搅拌装置的容器中，将所得到的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽分散于30毫升～60毫升水中，升温搅拌，在95℃～105℃条件下，滴加浓盐酸调节pH＝3～7，保温反应10～20小时，HPLC监测原料消耗完毕后，加入活性炭0.5克～5.0克保温搅拌1～3小时，然后热过滤，减压浓缩，甲醇溶解，分散于冰***中，过滤后得到本专利所述的组氨酸-脯氨酸环二肽产品。
附图说明
图1是本专利制备的组氨酸-脯氨酸环二肽的HPLC谱图。具体的分析条件包括：进样量为5微升；检测时间为30min；检测波长为220 nm；色谱柱型号为Discovery C18 column（250×4.6mm I.D.）；流速为1.0 mL/min；流动性Buffer A为 0.10%TFA+H2O；流动相Buffer B为 0.10%TFA+CH3CN；梯度洗脱条件为0.1-50%B in 0-15 minutes。检测结果显示：CHP的保留时间在3.67583min，峰高是1124.59mV，峰面积为4388.59mV. sec，面积百分比为100%。
具体的实施方式
实施例1：N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸的合成
取19克L-组氨酸悬浮于56毫升水中，然后加入112毫升的四氢呋喃；在0℃条件下，加入60克二碳酸二叔丁酯；然后在0℃条件下，以0.15ml/min的速度滴加56毫升的13%碳酸钾水溶液，边滴加边搅拌，滴加完毕后继续搅拌30分钟，自然升温至室温，反应22小时后，减压去除四氢呋喃，水相用47毫升***提取两次，然后用119毫升饱和硫酸氢钾溶液调节pH＝1～2，将此反应液用乙酸乙酯47毫升提取三次，合并提取液，加无水硫酸镁28克干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸白色粉末约36克。
实施例2：N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽的合成
取36克得到的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸悬浮于200毫升四氢呋喃中，加入16克N,N'-羰基二咪唑，搅拌使其全部溶解，搅拌反应30分钟后，在0℃条件下加入12克的L-脯氨酰胺，加完后，继续搅拌30分钟，自然升温至室温，反应20小时后，减压去除四氢呋喃，将水相用50毫升乙酸乙酯提取五次，合并提取液，然后用0.5%（v/v）的浓盐酸/饱和食盐水溶液100毫升洗涤五次，有机相中加无水硫酸镁10克干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽粉末约18克。
实施例3：组氨酸-脯氨酸环二肽的合成
在带有温度计、pH电极、回流冷凝管、加热搅拌装置的容器中，将所得到的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽分散于50毫升水中，升温搅拌，在100℃条件下，滴加浓盐酸15.8克保持pH＝6.5，保温反应16小时，HPLC监测原料消耗完毕后，加入活性炭0.5克保温搅拌1小时，然后热过滤，减压浓缩，用50毫升甲醇溶解，分散于500毫升冰***中，过滤、干燥后得到组氨酸-脯氨酸环二肽产品约15.3克。
Claims (4)
1.组氨酸-脯氨酸环二肽的制备方法，其包括如下步骤：
（1） 通过二碳酸二叔丁酯与组氨酸的反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸；
（2） N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸与L-脯氨酰胺反应得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽；
（3） N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽经过脱保护、环合反应得到组氨酸-脯氨酸环二肽。
2.如权利要求1所述的组氨酸-脯氨酸环二肽的制备方法，其特征在于：取15克～25克L-组氨酸悬浮于35～70毫升水中，然后加入70～140毫升的四氢呋喃；在-5℃～5℃条件下，加入50～60克二碳酸二叔丁酯；然后在-5℃～5℃条件下，以0.10～0.20ml/min的速度滴加35～70毫升的10%～20%碳酸钾水溶液，边滴加边搅拌，滴加完毕，继续搅拌20～50分钟；自然升温至室温，反应12～24小时；减压去除四氢呋喃，水相用40～80毫升***提取两次，然后用70～140毫升饱和硫酸氢钾溶液调节pH＝1～5；将此反应液用乙酸乙酯提取三次，合并提取液，加无水硫酸镁干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸白色粉末。
3.如权利要求1所述的组氨酸-脯氨酸环二肽的制备方法，其特征在于：取30克～40克得到的N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸悬浮于150～300毫升四氢呋喃中，加入15～25克N,N'-羰基二咪唑，搅拌使其全部溶解；搅拌反应20～40分钟后，在-5℃～5℃条件下加入10～20克的L-脯氨酰胺，加完后，继续搅拌20～50分钟，自然升温至室温，反应12～24小时；减压去除四氢呋喃，将水相用40～80毫升乙酸乙酯提取五次，合并提取液，然后用0.3%～0.6%（v/v）的浓盐酸/饱和食盐水溶液75毫升～150毫升洗涤五次，有机相中加无水硫酸镁干燥，减压除去乙酸乙酯，即得到N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽粉末。
4.如权利要求1所述的组氨酸-脯氨酸环二肽的制备方法，其特征在于：将N(im)-叔丁氧羰基-N(α)-叔丁氧羰基-L-组氨酸-L-脯氨酰胺线性二肽分散于30毫升～60毫升水中，升温搅拌，在95℃～105℃条件下，滴加浓盐酸调节pH＝3～7，保温反应10～20小时，HPLC监测原料消耗完毕后，加入活性炭0.5克～5.0克保温搅拌1～3小时，然后热过滤，减压浓缩，甲醇溶解，分散于冰***中，过滤后得到组氨酸-脯氨酸环二肽产品。
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