CN108660082B

CN108660082B - 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用

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Publication number: CN108660082B
Application number: CN201810623511.7A
Authority: CN
Inventors: 曹飞; 朱华结; 朱奡; 刘云凤
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2018-06-15
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2038-06-15
Also published as: CN108660082A

Abstract

本发明提供了一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用，所述海洋曲霉为曲霉（Aspergillus sp.）ZA‑01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCC No.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述化合物的结构式为

，其中，R独立地为OH或OAc。通过发酵培养曲霉（Aspergillus sp.）ZA‑01菌株，并从发酵产物中分离得到上述化合物，经验证，本发明化合物对多种病原菌具有较强抑制活性，可将其制成抗菌剂，具有广泛的应用前景。

Description

一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用

技术领域

本发明涉及海洋天然药物化学领域，具体地说涉及一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用。

背景技术

海洋约占地球总表面积的71％，其蕴含了丰富多样的生物资源，是人类进行药物研发的宝贵资源库。自20世纪40年代以来，以头孢菌素、阿糖胞苷和ET-743为代表的多种海洋来源药物被成功运用到临床上。海洋来源真菌微生物资源因为其代谢产物丰富和可重复发酵等优点成为海洋药物最重要的来源之一，其中，以海洋真菌来源的氧杂蒽醌类化合物为代表的抗肿瘤活性化合物已经成为现代海洋药物研究的重要课题。

目前，已报道的海洋真菌来源氧杂蒽醌类化合物的种类有限，且对其抗菌活性研究较少，目前尚未有关于本发明氧杂蒽醌类化合物及其抗多种病原菌活性的报道。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法，以解决现有技术中海洋真菌来源氧杂蒽醌类化合物的种类及抗菌活性有限的问题。

本发明的目的之二就是提供一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物在制备抗菌剂中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种海洋曲霉，所述海洋曲霉为曲霉(Aspergillus sp.)ZA-01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCC No.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

1.样品来源

海洋曲霉ZA-01菌株分离自海洋沉淀物，所述海洋沉淀物样品于2015年6月采自河北省沧州市黄骅港海域。海底沉淀物样品采集后，立刻放于–20℃冰箱中保存，并送往实验室进行后续真菌的分离工作。

2.真菌的分离

2.1培养基的选择

(1)PDA培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，琼脂20g，水1000mL。分离真菌时加25μg/mL硫酸链霉素，25μg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长。

(2)无盐PDA培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。分离真菌时加25μg/mL硫酸链霉素，25μg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长(无盐PDA与加盐PDA对比)。

(3)孟加拉红培养基

马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，孟加拉红(rose Bengal)33mg(抑制生长快的霉菌蔓延生长)，琼脂20g，水1000mL。

2.2真菌的分离、纯化

将上述海洋沉淀物样品置于无菌玻璃器中，加入1mL无菌水调至黏稠状。取出0.1mL上述液体用无菌水分别稀释10倍、100倍、1000倍，得到4个浓度梯度的匀浆液，用无菌移液管分别取0.2mL各浓度匀浆液分别加入PDA、无盐PDA、孟加拉红培养基中，用涂布器涂匀。每个浓度梯度分别做三个平行。用封口膜封好，并写上编号。以上分离实验均在无菌条件下进行。

将上述加入样品的培养基分别放入28℃恒温箱，倒置培养。一般培养5–8d便有菌落或者菌丝体从培养基或者组织小块边缘长出来(细菌生长快，2–3d就有菌落生长出来)。用接种针挑取菌落或者菌丝体尖端，移至新的平板上，经几次分离纯化后，可获得真菌纯菌株。真菌分离工作一般进行35d。前两周每天检查一次，以后每隔3–4d检查一次。一旦发现有新的菌落或菌丝体长出，应马上将其转接到新的平板上。

3、菌株的筛选

采用活性筛选结合化学筛选的方法来筛选目标菌株。通过对菌株进行小规模发酵(2瓶)，获得粗浸膏，对粗浸膏进行抗菌活性测试，将对致病菌的抑制活性作为筛选目标菌株的考察因素之一；且对粗浸膏进行HPLC指纹图谱分析，将次级代谢产物量作为筛选目标菌株的考察因素之二，最终确定抑菌活性高且次级代谢产物丰富的菌株ZA-01为目标菌株，并对其进行鉴定。

4、菌株的鉴定

在PDA培养基平板上培养3-7d，生长至最佳状态的真菌，用灭菌枪头挑取单菌落上少量菌丝至装有50μL Lysis buffer(裂解液)的EP管中，于80℃水浴锅中热变性15min，然后8000rpm离心1min，取3μL上清液即为PCR反应的模板DNA。

用于扩增和测序的引物为ITS1和ITS4，上下引物序列为：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC

PCR反应体系为40μL体系，包括：

扩增条件为：

扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液样，5V/cm电压，上样5μL电泳检测，DNA Marker指示分子量，凝胶成像仪观察并照相。将PCR扩增产物送北京三博远志公司进行测序，并最终鉴定为曲霉(Aspergillus sp.)。

一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物，所述化合物的结构式为

其中，R独立地为OH或OAc。

所述化合物为

一种上述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将上述的曲霉(Aspergillus sp.)ZA-01菌株接种于菌种培养基中进行菌种培养；

(2)菌种培养完成后，将其接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵物；

(3)用乙酸乙酯对发酵物进行萃取2–4次，合并乙酸乙酯萃取液后减压浓缩得到粗浸膏；

(4)对所得粗浸膏进行色谱分离即得所述氧杂蒽醌类化合物，所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

步骤(1)中所述菌种培养基为：葡萄糖1.0–10wt％、酵母膏0.1–4.0wt％、蛋白胨0.2–4.0wt％、琼脂1.0–6.0wt％、粗海盐3.0–10wt％，其余为水；菌种培养温度为15–35℃，培养时间为3–10天。

步骤(2)中每单位份的所述发酵培养基包括大米60–150g、NaNO₃ 0.1–0.6g、KH₂PO₄0.05–0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.02–0.1g、NaCl 0.02–0.1g、FeSO₄ 0.01–0.05g、蔗糖2–6g、水50–150mL；发酵培养条件为在15–35℃下静置培养20–50天。

步骤(4)中所述正相硅胶柱色谱分离为：先采用固定相为100～200目硅胶，流动相为15–25vol％乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，洗脱体积为3-5个柱体积，将所得洗脱液浓缩后再采用固定相为200～300目硅胶，流动相为65–75vol％二氯甲烷/甲醇混合溶液进行洗脱，洗脱体积为2-3个柱体积。

步骤(4)中所述反相硅胶柱色谱分离采用的固定相为C₁₈硅胶，流动相为60–70vol％甲醇/水混合溶液，洗脱体积为2-3个柱体积。

步骤(4)中所述凝胶柱色谱分离的固定相为sephadex LH-20，流动相为二氯甲烷，洗脱体积为3-5个柱体积。

步骤(4)中所述高效液相色谱分离中采用的色谱柱为半制备C₁₈色谱柱，XBridgeOBD，5μm，10×250mm，流动相为75–80vol％的甲醇/水混合溶液；和半制备硅胶色谱柱，Viridis^TM Silica 2-Ethylpyridine，5μm，10×250mm，流动相为80–85vol％石油醚/乙醇混合溶液。

一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂以上述的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分。

一种海洋曲霉来源的上述氧杂蒽醌类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)引起的细菌性疾病的药物中的应用。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。

本发明由海洋真菌ZA-01菌株发酵获得氧杂蒽醌类化合物7和8，其对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)具有较好的抑制活性，可用作抗菌剂，应用前景广阔。

具体实施方式

实施例1

(1)海洋真菌ZA-01菌种的培养

海洋真菌ZA-01的菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0wt％、酵母膏0.1wt％、蛋白胨0.2wt％、琼脂1.0wt％、粗海盐3.0wt％，其余为水，使用时制成试管斜面，海洋真菌ZA-01菌株在28℃下培养3天。

(2)海洋真菌ZA-01的发酵培养

海洋真菌ZA-01的发酵培养所用的发酵培养基为每个1000mL锥形瓶中含有大米60g、NaNO₃ 0.1g、KH₂PO₄ 0.05g、MgSO₄·7H₂O 0.02g、NaCl 0.02g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖2g、水50mL，菌株于28℃静置发酵培养28天，得发酵物；共使用80个1000mL锥形瓶发酵。

(3)氧杂蒽醌类化合物的分离分析

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相为15vol％乙酸乙酯/石油醚混合溶液，洗脱5个柱体积，洗脱液浓缩后再次进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相为65vol％的二氯甲烷/甲醇混合溶液，洗脱2个柱体积。

洗脱液浓缩后进行反相硅胶柱色谱分离，固定相优选为C₁₈硅胶，流动相优选为60vol％甲醇/水混合溶液，洗脱3个柱体积。洗脱液浓缩后进行Sephadex LH20凝胶柱色谱分离，流动相：二氯甲烷，洗脱3个柱体积，洗脱液浓缩后进行高效液相色谱分离，固定相：半制备C₁₈色谱柱，XBridge OBD,5μm,10×250mm，流动相为75vol％的甲醇/水混合溶液，和半制备硅胶色谱柱，Viridis^TM Silica 2-Ethylpyridine,5μm,10×250mm，流动相为80vol％的石油醚/乙醇混合溶液，制备分离得到化合物1(15.0mg)、化合物2(4.5mg)、3(5.0mg)、4(5.2mg)、5(5.0mg)、6(4.5mg)、7(5.0mg)、8(4.7mg)，其结构确证数据分别如下：

化合物1

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰-97(c 0.1,MeOH)；IR(KBr)ν_max3445,2929,2355,1635,1591,1475,1246,1065,895cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600Hz)δ:12.97(1H,brs,1-OH),7.66(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.24(1H,s,H-5),6.89(1H,brs,H-25),6.82(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.10(1H,brs,H-14),4.80(1H,s,Ha-22),4.75(1H,s,Hb-22),4.54(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.31(1H,dd,J＝10.8,2.4Hz,Hb-19),3.45(1H,brs,H-15),3.28(1H,s,14-OCH₃),2.73(1H,brs,15-OH),2.71(1H,brs,H-20),2.35(3H,s,H-24),2.07(3H,s,25-OAc),1.88(3H,s,H-23),1.40(3H,s,H-18),1.25(3H,s,H-17).¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ:183.0(C,C-13),170.0(C,25-COOCH₃),161.7(C,C-1),152.2(C,C-10),151.5(C,C-11),150.2(C,C-7),141.5(C,C-21),137.6(C,C-6),135.3(CH,C-3),120.2(CH,C-5),116.3(C,C-12),115.2(C,C-8),115.0(C,C-4),112.7(CH₂,C-22),110.4(CH,C-2),109.0(C,C-9),78.3(CH,C-15),76.2(CH,C-14),72.9(C,C-16),65.4(CH,C-25),63.8(CH₂,C-19),56.6(CH₃,14-OCH₃),42.5(CH,C-20),26.5(CH₃,C-18),26.5(CH₃,C-17),22.3(CH₃,C-23),21.2(CH₃,25-COOCH₃ ),17.2(CH₃,C-24)HRESIMS m/z 535.1935([M+Na]⁺,C₂₈H₃₂O₉Na；calc.535.1939).

化合物2

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-120(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3442,2929,2358,1639,1593,1471,1242,1072,894cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600MHz)δ:12.71(1H,brs,1-OH),7.72(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.21(1H,s,H-5),6.86(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.40(1H,brs,H-25),5.13(1H,d,J＝2.4Hz,H-14),4.94(3H,d,J＝2.4Hz,25-OAc),4.78(1H,s,Ha-22),4.56(1H,s,Hb-22),4.43(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.35(1H,dd,J＝10.8,2.4Hz,Hb-19),3.46(1H,brs,H-15),3.29(1H,s,14-OCH₃),2.95(1H,brs,15-OH),2.72(1H,brs,H-20),2.35(3H,s,H-24),1.84(3H,s,H-23),1.42(3H,s,H-18),1.25(3H,s,H-17).¹³C NMR(CDCl₃,150MHz)δ:184.2(C,C-13),161.5(C,C-1),152.4(C,C-10),151.7(C,C-11),149.6(C,C-7),142.5(C,C-21),138.6(C,C-6),135.9(CH,C-3),121.2(CH,C-8),119.0(C,C-5),116.9(C,C-12),115.5(C,C-4),112.2(CH₂,C-22),110.5(CH,C-2),108.9(C,C-9),78.2(CH,C-15),76.2(CH,C-14),72.9(C,C-16),65.4(CH₂,C-19),63.1(CH,C-25),56.6(CH₃,14-OCH₃),44.8(CH,C-20),26.5(CH₃,C-17),26.5(CH₃,C-18),22.5(CH₃,C-23),17.3(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 493.1839([M+Na]⁺,C₂₆H₃₀O₉Na；calc.493.1833).

化合物3

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-107(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3419,2966,2358,1737,1733,1473,1238,1020,829cm^–1；¹H NMR(DMSO-d₆,600Hz)δ:12.78(1H,brs,1-OH),7.82(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.50(1H,s,H-5),6.81(1H,brs,H-25),6.77(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.47(1H,d,J＝2.8Hz,H-14),5.19(1H,d,J＝5.4Hz,14-OH),4.79(1H,s,Ha-22),4.61(1H,s,Hb-22),4.56(1H,brd,J＝11.4Hz,Ha-19),4.55(1H,brs,16-OH),4.44(1H,brd,J＝7.2Hz,14-OCH₃),4.20(1H,dd,J＝11.4,2.4Hz,Hb-19),3.27(1H,brd,J＝7.2Hz,H-15),2.68(1H,brs,H-20),2.31(3H,s,H-24),1.99(1H,s,25-OH),1.81(3H,s,H-23),1.28(3H,s,H-18),1.21(3H,s,H-17).¹³C NMR(DMSO-d₆,150Hz)δ:183.1(C,C-13),169.3(C,25-COOCH3),159.6(C,C-1),151.4(C,C-10),150.5(C,C-11),149.9(C,C-7),141.8(C,C-21),137.6(C,C-6),135.8(CH,C-3),122.3(CH,C-4),120.7(C,C-5),115.5(C,C-12),114.7(C,C-8),112.6(CH₂,C-22),109.2(CH,C-2),108.1(C,C-9),78.0(CH,C-15),72.7(CH,C-16),65.3(C,C-14),64.8(CH,C-25),63.5(CH2,C-19),41.7(CH,C-20),27.5(CH₃,C-18),26.2(CH₃,C-17),22.1(CH₃,C-23),21.0(CH₃,25-COOCH₃ ),16.9(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 521.1784([M+Na]⁺,C₂₇H₃₀O₉Na；calc.521.1782).

化合物4

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝+39(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3421,2964,2356,1726,1718,1475,1236,1016,835cm^–1；¹H NMR(DMSO-d₆,600Hz)δ:12.84(1H,brs,1-OH),7.83(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.40(1H,s,H-5),6.78(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.81(1H,brs,H-25),5.48(1H,brs,H-14),5.26(1H,d,J＝3.6Hz,25-OH),5.17(1H,d,J＝3.6Hz,14-OH),4.74(1H,s,Ha-22),4.55(1H,s,Hb-22),4.54(1H,brs,16-OH),4.46(1H,brs,J＝11.4Hz,Ha-19),4.46(1H,brd,J＝6.6Hz,15-OH),4.34(1H,dd,J＝11.4,2.4Hz,Hb-19),3.27(1H,brd,J＝6.6Hz,H-15),2.51(1H,brs,H-20),2.29(3H,s,H-24),1.78(3H,s,H-23),1.29(3H,s,H-18),1.22(3H,s,H-17).¹³C NMR(DMSO-d₆,150Hz)δ:183.4(C,C-13),159.6(C,C-1),151.1(C,C-10),150.5(C,C-11),148.7(C,C-7),142.8(C,C-21),137.2(C,C-6),135.6(CH,C-3),122.2(CH,C-4),121.0(C,C-8),119.1(C,C-5),115.8(C,C-12),111.9(CH₂,C-22),109.0(CH,C-2),108.1(C,C-9),78.0(CH,C-15),72.7(CH,C-16),65.2(C,C-14),63.5(CH₂,C-19),60.9(CH,C-25),44.4(CH,C-20),27.5(CH₃,C-18),26.2(CH₃,C-17),22.4(CH₃,C-23),16.9(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 457.1857([M+H]⁺,C₂₅H₂₉O₈；calc.457.1857).

化合物5

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-92(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3432,2926,2357,1662,1587,1465,1236,1064,847cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600Hz)δ:12.97(1H,brs,1-OH),7.59(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.24(1H,s,H-5),6.88(1H,brs,H-25),6.77(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.41(1H,d,J＝1.8Hz,H-14),5.00(1H,d,J＝2.4Hz,H-15),4.80(1H,s,Ha-22),4.74(1H,s,Hb-22),4.54(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.32(1H,dd,J＝10.8,3.0Hz,Hb-19),3.34(3H,s,14-OCH₃),2.72(1H,brs,H-20),2.36(3H,s,H-24),2.10(3H,s,25-COOCH₃),1.92(3H,s,15-COOCH₃),1.88(3H,s,H-23),1.56(3H,s,H-18),1.22(3H,s,H-17).¹³C NMR(CDCl₃,150Hz)δ:183.0(C,C-13),170.2(C,15-COOCH3),170.1(C,25-COOCH3),162.0(C,C-1),152.2(C,C-10),151.5(C,C-11),150.3(C,C-7),141.6(C,C-21),137.6(C,C-6),134.1(C,C-3),120.3(CH,C-5),116.5(C,C-12),115.1(C,C-8),113.4(C,C-4),112.7(CH₂,C-22),110.0(CH,C-2),109.1(C,C-9),77.0(CH,C-15),76.4(CH,C-14),72.7(C,C-16),65.4(CH,C-25),63.8(CH₂,C-19),57.1(CH₃,14-OCH3),42.5(CH,C-20),27.9(CH₃,C-18),26.9(CH₃,C-17),22.4(CH₃,C-23),21.3(CH₃,25-COOCH₃ ),20.5(CH₃,15-COOCH₃ ),17.3(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 577.2048([M+Na]⁺,C₃₀H₃₄O₁₀Na；calc.577.2044).

化合物6

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-73(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3434,2929,2354,1665,1587,1466,1232,1069,852cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600Hz)δ:12.74(1H,brs,1-OH),7.65(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.22(1H,s,H-5),6.82(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.42(1H,d,J＝1.2Hz,H-14),5.40(1H,brs,H-25),5.02(1H,d,J＝2.4Hz,H-15),4.86(1H,d,J＝3.0Hz,25-OH),4.78(1H,s Ha-22),4.55(1H,s,Hb-22),4.43(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.36(1H,dd,J＝10.8,3.0Hz,Hb-19),3.34(3H,s,14-OCH₃),2.73(1H,brs,H-20),2.37(3H,s,H-24),1.91(3H,s,15-COOCH₃),1.84(3H,s,H-23),1.56(3H,s,H-18),1.22(3H,s,H-17).¹³C NMR(CDCl₃,150Hz)δ:184.2(C,C-13),170.2(C,25-COOCH₃),161.8(C,C-1),152.4(C,C-10),151.7(C,C-11),149.7(C,C-7),142.6(C,C-21),138.6(C,C-6),134.6(C,C-3),121.2(CH,C-8),119.1(C,C-5),117.0(C,C-12),113.8(C,C-4),112.2(CH₂,C-22),110.1(CH,C-2),109.0(C,C-25),57.1(CH₃,14-OCH₃),44.8(CH,C-20),27.9(CH₃,C-18),26.9(CH₃,C-17),22.5(CH₃,C-23),20.4(CH₃,15-COOCH₃ ),17.4(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 535.1939([M+Na]⁺,C₂₈H₃₂O₉Na；cacl.535.1939).

化合物7

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-56(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3446,2972,2368,1733,1645,1471,1249,1029,831cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600Hz)δ:13.00(1H,brs,1-OH),7.73(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.24(1H,s,H-5),6.90(1H,brs,H-25),6.79(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.28(1H,brs,H-14),4.85(1H,s,Ha-22),4.82(2H,s,H-17),4.77(1H,s,Hb-22),4.55(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.27(1H,dd,J＝10.8,2.4Hz,Hb-19),4.27(1H,d,J＝8.4Hz,H-15)2.76(1H,brs,14-OH),2.72(1H,brs,H-20),2.52(1H,brs,15-OH),2.35(3H,s,H-24),2.08(3H,s,25-COOCH₃ ),1.89(3H,s,H-23),1.82(3H,s,H-18).¹³C NMR(CDCl₃,150Hz)δ:183.1(C,C-13),170.0(C,25-COOCH₃),161.7(C,C-1),152.0(C,C-10),151.6(C,C-11),150.3(C,C-7),143.4(C,C-16),141.4(C,C-21),137.7(C,C-6),134.5(CH,C-3),120.2(CH,C-5),117.7(C,C-4),116.3(C,C-12),115.0(C,C-8),113.7(CH₂,C-17),112.8(CH₂,C-22),110.3(CH,C-2),108.2(C,C-9),79.1(CH,C-15),68.8(CH,C-14),65.5(CH,C-25),63.8(CH₂,C-19),42.5(CH,C-20),22.4(CH₃,C-23),21.2(CH₃,25-COOCH₃ ),18.6(CH₃,C-18),17.3(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 503.1667([M+Na]⁺,C₂₇H₂₈O₈Na；calc.503.1676).

化合物8

黄色无定型粉末；[α]_D ²⁰＝-113(c 0.1,CH₃OH)；IR(KBr)ν_max 3431,2972,2352,1733,1637,1471,1249,1054,817cm^–1；¹H NMR(CDCl₃,600Hz)δ:12.70(1H,brs,1-OH),7.76(1H,d,J＝8.4Hz,H-3),7.20(1H,s,H-5),6.79(1H,d,J＝8.4Hz,H-2),5.41(1H,brs,H-25),5.28(1H,brs,H-14),4.99(1H,d,J＝8.4Hz,25-OH),4.83(1H,s,Ha-22),4.82(2H,s,H-17),4.60(1H,s,Hb-22),4.41(1H,brd,J＝10.8Hz,Ha-19),4.33(1H,dd,J＝10.8,2.4Hz,Hb-19),4.26(1H,d,J＝5.4Hz,H-15),2.94(1H,brs,14-OH),2.73(1H,brd,J＝2.4Hz,H-20),2.59(1H,brs,15-OH),2.35(3H,s,H-24),1.86(3H,s,H-23),1.83(3H,s,H-18).¹³C NMR(CDCl₃,150Hz)δ:184.3(C,C-13),161.4(C,C-1),152.1(C,C-10),151.8(C,C-11),149.8(C,C-7),143.3(C,C-16),142.5(C,C-21),138.7(C,C-6)135.0(CH,C-3),121.4(C,C-8),118.9(CH,C-5),118.2(C,C-4),116.8(C,C-12),113.7(CH₂,C-17),112.3(C,C-22),110.3(CH,C-2),108.7(C,C-9),79.1(CH,C-15),68.8(CH,C-14),64.8(CH₂,C-19),63.3(CH,C-25),45.0(CH,C-20),22.5(CH₃,C-23),18.6(CH₃,C-18),17.4(CH₃,C-24).HRESIMS m/z 461.1569([M+Na]⁺,C₂₅H₂₆O₇Na；cacl.461.1571).

实施例2

(1)海洋真菌ZA-01菌种的培养

海洋真菌ZA-01的菌种培养所用的培养基含葡萄糖10wt％、酵母膏4.0wt％、蛋白胨4.0wt％、琼脂6.0wt％、粗海盐10wt％，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在35℃下培养5天。

(2)海洋真菌ZA-01的发酵培养

海洋真菌ZA-01的发酵培养所用的发酵培养基为每个1000mL锥形瓶中含有大米150g、NaNO₃ 0.6g、KH₂PO₄ 0.2g、MgSO₄·7H2O 0.01g、NaCl 0.1g、FeSO₄ 0.05g、蔗糖6g、水150mL，菌株于35℃静置发酵培养45天，得发酵物。

(3)氧杂蒽醌类化合物的分离分析

取步骤(2)所得的发酵物，用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩得到粗浸膏，先进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：100～200目硅胶，流动相为25vol％乙酸乙酯/石油醚混合溶液，洗脱3个柱体积，洗脱液浓缩后再次进行正相硅胶柱色谱分离，固定相：200～300目硅胶，流动相为75vol％二氯甲烷/甲醇混合溶剂，洗脱3个柱体积。

洗脱液浓缩后进行反相硅胶柱色谱分离，固定相优选为C₁₈硅胶，流动相优选为70vol％甲醇/水混合溶液，洗脱2个柱体积，洗脱液浓缩后进行Sephadex LH20凝胶柱色谱分离，流动相：二氯甲烷，洗脱5个柱体积，洗脱液浓缩后进行高效液相色谱分离，固定相：半制备C₁₈色谱柱，XBridge OBD,5μm,10×250mm，流动相为80vol％甲醇/水混合溶液，和半制备硅胶色谱柱，Viridis^TM Silica 2-Ethylpyridine,5μm,10×250mm，流动相为85vol％的石油醚/乙醇混合溶液，制备分离得到化合物1-8，其结构确证数据与实施例1一致。

实施例1和2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离、高效液相手性色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。

所得氧杂蒽醌类化合物的抗肿瘤活性

(1)抗肿瘤活性测试

采用MTT方法对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)、胃癌细胞(MGC-803)、***细胞(HeLa)和肺上皮癌细胞(A-549)的体外抑制活性进行测试。

(2)活性测试方法

按细胞生长速率，将一定数量处于对数生长期的细胞以90μL/孔的浓度接种于96孔培养板内，培养24h后加入待测样品10μL/孔，对每个细胞株，每个浓度梯度均做三个平行。细胞在37℃、5％CO₂条件下培养48h后，加MTT(Sigma)液5mg/mL，用生理盐水配置20μL/孔；继续培养4h后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/L HCl)50μL/孔，置于CO₂培养箱中过夜。然后用酶标仪测OD 570值。阿霉素作为阳性对照药。

(3)活性测试结果

试验结果显示，化合物1能选择性的抑制肺上皮癌细胞(A-549)的生长，化合物3、6对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)、胃癌细胞(MGC-803)、***细胞(HeLa)和肺上皮癌细胞(A-549)均有较强的抑制作用，抑制肿瘤细胞株的IC₅₀值(μM)见表1。

表1：

所得氧杂蒽醌类化合物的抗菌活性

(1)抗菌活性测试

采用梯度稀释方法对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)进行活性测试。

(2)活性测试方法

在无菌超净工作台内，取适量细菌菌种液体培养液加入空白培养液中进行稀释，稀释度一般为1:1000或1:500。用无菌的移液枪(枪头经过灭菌处理)取稀释的液体菌种198μL加入到96孔板上，在第一个孔内加入2μL待测样品(DMSO配置的粗提物或者单体化合物溶液)，用移液枪依次做二倍稀释至第8个浓度梯度，稀释完毕后震荡混匀，37℃培养18h–22h，用酶标仪(630nm)测定吸光度，获得样品的最小抑菌浓度(MIC)。DMSO的最终浓度保持在1％。每个样品浓度设定三个平行样，另外设定空白对照、阴性对照(DMSO)和阳性对照(环丙沙星)。

(3)活性测试结果

试验结果显示，化合物1-6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)有弱的抑制活性，其MIC值均为20.0μg/mL。化合物7和8对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、炭疽杆菌(Bacillus anthraci)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)有强的抑制活性，化合物7对四株病原菌抑制MIC值分别为0.78μg/mL，12.5μg/mL，6.13μg/mL和6.13μg/mL,化合物8对四株病原菌抑制MIC值分别为6.13μg/mL，12.5μg/mL，6.13μg/mL和6.13μg/mL，阳性对照环丙沙星对四株病原菌抑制MIC值分别为0.19μg/mL，1.56μg/mL，3.13μg/mL和1.56μg/mL。实验表明，本发明的含4位异戊烯化且14,15-二羟基化的氧杂蒽醌类化合物对多种病原菌具有抑制活性，可将其制成抗菌剂，具有广泛的应用前景。

Claims

1.一种海洋曲霉，其特征是，所述海洋曲霉为曲霉（Aspergillus sp.）ZA-01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCC No.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物，其特征是，所述化合物的结构式为

其中，R独立地为OH或OAc。

3.一种权利要求2所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的曲霉（Aspergillus sp.）ZA-01菌株接种于菌种培养基中进行菌种培养；

（2）菌种培养完成后，将其接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵物；

（3）用乙酸乙酯对发酵物进行萃取2–4次，合并乙酸乙酯萃取液后减压浓缩得到粗浸膏；

（4）对所得粗浸膏进行色谱分离即得所述氧杂蒽醌类化合物，所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。

4.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述菌种培养基为：葡萄糖1.0–10wt%、酵母膏0.1–4.0wt%、蛋白胨0.2–4.0wt%、琼脂1.0–6.0wt%、粗海盐3.0–10wt%，其余为水；菌种培养温度为15–35℃，培养时间为3–10天。

5.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（2）中每单位份的所述发酵培养基包括大米60–150 g、NaNO₃ 0.1–0.6 g、KH₂PO₄ 0.05–0.2g、MgSO₄•7H₂O 0.02–0.1 g、NaCl 0.02–0.1 g、FeSO₄0.01–0.05 g、蔗糖2–6 g、水50–150mL；发酵培养条件为在15–35℃下静置培养20–50天。

6.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（4）中所述正相硅胶柱色谱分离为：先采用固定相为100~200目硅胶，流动相为15–25vol%乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，洗脱体积为3−5个柱体积，将所得洗脱液浓缩后再采用固定相为200~300目硅胶，流动相为65–75vol%二氯甲烷/甲醇混合溶液进行洗脱，洗脱体积为2−3个柱体积。

7.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（4）中所述反相硅胶柱色谱分离采用的固定相为C₁₈硅胶，流动相为60–70vol%甲醇/水混合溶液，洗脱体积为2−3个柱体积。

8.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（4）中所述凝胶柱色谱分离的固定相为sephadex LH-20，流动相为二氯甲烷，洗脱体积为3−5个柱体积。

9.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（4）中所述高效液相色谱分离中采用的色谱柱为半制备C₁₈色谱柱，XBridge OBD，5μm，10 ×250 mm，流动相为75–80vol%的甲醇/水混合溶液；和半制备硅胶色谱柱，Viridis^TM Silica2-Ethylpyridine，5μm，10 × 250 mm，流动相为80–85vol%石油醚/乙醇混合溶液。

10.一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物在制备抗菌剂中的应用，其特征是，所述抗菌剂以权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分，所述抗菌剂用于抗溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）、炭疽杆菌（Bacillus anthraci）、伤寒沙门菌（Salmonella typhi）和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）。