CN114716413B - 一种大型海藻中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大型海藻中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化方法，本发明将活性追踪法和环二肽化合物的薄层原位化学法相结合，建立裙带菜中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化工艺，不仅可填补国内外裙带菜环二肽类抑藻活性化合物分离纯化的研究空白，具有较高的理论价值，而且能为裙带菜在赤潮微藻生物防控中的应用奠定实验基础，还能为大型海藻环二肽类化合物的纯化制备提供理论依据，具有重要的应用价值。

Description

一种大型海藻中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化方法

技术领域

本发明属于海洋生化工程领域，具体涉及一种大型海藻中抑制赤潮微藻的环二肽类化合物的分离纯化方法。

背景技术

裙带菜(Undaria pinnatifida)是一种大型褐藻，在我国资源丰富，分布于山东、福建、浙江、辽宁等沿海地区。报道指出，裙带菜中含有抑制米氏凯伦藻生长的抑藻活性物质，然而，这些抑藻活性物质尚未被鉴定。前期研究中，我们采用化合物鉴定试验和红外光谱测定，初步确定裙带菜提取物中很可能含有环二肽类物质。迄今为止，国内外尚未见裙带菜中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化研究。本发明专利能填补国内外相应领域的研究空白。

环二肽类化合物是由2个氨基酸缩合而成，其骨架具有稳定的六元环结构，广泛存在于自然界中，例如，动植物、酵母、原生生物、真菌和海洋生物等。研究表明，环二肽类化合物具有抗菌、抗污、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和细胞间信号介导作用等生理活性，还可作为植物生长调节剂、免疫抑制剂和免疫增强剂。近年来，环二肽类化合物因其分子多样性和众多活性等特点引起了研究者们的极大兴趣。然而，环二肽类化合物的生物活性方面研究还不够全面和完善，抑藻活性研究很少。目前，海洋生物中环二肽类化合物的研究主要集中在海洋微生物，大型海藻中环二肽类化合物的研究报道很少，仅在石莼(Ulvalactuca)中发现环(脯-甘)二肽、环(丝-脯)二肽和环(苏-脯)二肽，从浒苔(Ulvaprolifera)和江蓠(Gracilaria lemaneiformis)中分别纯化到环(脯-甘)二肽和环(丝-脯)二肽，此2种环二肽具有明显的抑藻活性。本发明将活性追踪法和环二肽化合物的薄层原位化学法相结合，建立裙带菜中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化工艺，不仅可填补国内外裙带菜环二肽类抑藻活性化合物分离纯化的研究空白，具有较高的理论价值，而且能为裙带菜在赤潮微藻生物防控中的应用奠定实验基础，还能为大型海藻环二肽类化合物的纯化制备提供理论依据，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是建立裙带菜中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化工艺。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种大型海藻中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：

(1)裙带菜干粉末加入无水甲醇，20℃下浸提24h后，获得浸提液。反复浸提2次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到浸膏。此浸膏加入50％甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置4h，离心、过滤，弃去沉淀，收集上清液；

(2)往上清液中加入乙酸乙酯，萃取3次。上层减压蒸干，获得乙酸乙酯组分(组分A)。下层减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次，上层和下层分别减压蒸干，获得正丁醇组分(组分B)和蒸馏水组分(组分C)。上述3种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液。采用原位薄层层析法，经茚三酮喷雾显色，检测出组分A含有环肽类化合物；

(3)此组分采用硅胶柱层析进行分离，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，得到4个组分，F1、F2、F3和F4。此4个组分均呈现出环肽类化合物的阳性反应；

(4)将此4个组分再次进行硅胶柱层析分离，组分F1再分为组分F11、F12、F13和F14；组分F2再分为组分F21、F22和F23；组分F3再分为组分F31；组分F4依次再分为F41、F42、F43和F44。抑藻活性检测表明，上述12个再分组分中，F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻的生长表现出强烈的抑制作用。4个再分组分中，F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应；

(5)将F23和F43分别采用Sephadex LH-20凝胶柱层析进行纯化，最终，得到2个样品F231和F431。经结构鉴定，样品F231和F431分别是环(丙氨酸-色氨酸)和环(脯氨酸-丙氨酸)，均为环二肽类化合物。

附图说明

图1为12个再分组分对米氏凯伦藻和球形棕囊藻的生长抑制率；

图2为4个再分组分(F22、F23、F43和F44)对米氏凯伦藻和球形棕囊藻生长的影响；

图3为裙带菜环二肽类抑藻活性化合物分离纯化工艺；

图4为环(丙氨酸-色氨酸)和环(脯氨酸-丙氨酸)结构。

具体实施方式

裙带菜干品粉碎成0.3mm粉末，加入无水甲醇，采用20℃下浸提24h后，反复浸提2次，合并浸提液。经过滤和减压蒸干，制备到浸膏。此浸膏加入50％甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置4h，离心、过滤，弃去沉淀，保留上清液。往上清液中加入乙酸乙酯，萃取3次。上层40℃下减压蒸干，获得乙酸乙酯组分(组分A)。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次。萃取完成后，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得正丁醇组分(组分B)和蒸馏水组分(组分C)。上述3种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液。将待测样品分别点样在相同规格的2块硅胶G板上(板1和板2)，以氯仿/甲醇(9:1，体积比，下同)为展开剂。展开结束后，挥发掉溶剂，板1放置，板2悬于底部加有1.5mL浓盐酸的密闭的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高温玻璃缸)，随后放置于110℃烘箱内，加热水解1.5h。冷却后，取出板2，盐酸挥发掉后，将板1和板2同时喷洒0.2％茚三酮丙酮试剂，用电吹风加热3min，在板1无斑点，在板2呈现黄色或***斑点，为环肽类化合物的阳性反应。3个组分中，仅组分A呈现了环肽类化合物的阳性反应。组分A采用硅胶(200-300目)柱层析进行分离，依次采用二氯甲烷/甲醇(98:2)、二氯甲烷/甲醇(95:5)、二氯甲烷/甲醇(90:10)和二氯甲烷/甲醇(80:20)进行洗脱，洗脱体积为2倍柱体积，得到4种馏分F1、F2、F3和F4。所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶薄层层析检测，此4个组分均呈现出环肽类化合物的阳性反应。采用硅胶柱层析，分别对上述4种馏分F1、F2、F3和F4进行再次分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(98:2)，馏分F1分离为4个再分组分，F11、F12、F13和F14；以二氯甲烷/甲醇(95:5)为洗脱剂，组分F2分离为3个再分组分，F21、F22和F23；以二氯甲烷/甲醇(8:1)为洗脱剂时，组分F3分离为1个再分组分F31；以二氯甲烷/甲醇(8:1)为洗脱剂时，组分F4分离成4个再分组分，F41、F42、F43和F44。对此12个再分组分进行抑藻活性检测，结果表明，它们中再分组分F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻产生了明显的生长抑制作用。第4d，浓度为50μg/mL时，此4个再分组分对2种赤潮微藻的生长抑制率在55％以上。环肽检测表明，再分组分F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应。此2个组分分别进行Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，均以甲醇作为洗脱液，最终分离到2个样品F231和F431。结构鉴定表明，样品F231为环(丙氨酸-色氨酸)，F431为环(脯氨酸-丙氨酸)。

实施例1

称取裙带菜干粉末2000g，加入5L无水甲醇，室温(15-20℃)浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液(浸提共3次)。经过滤和减压蒸干，制备到浸膏200g。向此浸膏中加入50％甲醇水溶液300mL，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液280mL。加入乙酸乙酯萃取3次(140mL、70mL和70mL)。上层(乙酸乙酯层)合并收集后，40℃下减压蒸干，获得20.2g组分A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次(140mL、70mL和70mL)，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得10.3g组分B和8.10g组分C。上述3种组分各称取10mg，分别溶解于1mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行环肽类化合物检测。将待测样品分别点样在相同规格的2块硅胶G板上(板1和板2)，以氯仿/甲醇(9:1，体积比，下同)为展开剂。展开结束后，挥发掉溶剂，板1放置，板2悬于底部加有1.5mL浓盐酸的密闭的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高温玻璃缸)，随后放置于110℃烘箱内，加热水解1.5h。冷却后，取出板2，盐酸挥发掉后，将板1和板2同时喷洒0.2％茚三酮丙酮试剂，用电吹风加热3min，组分A在板1无斑点，在板2呈现了多个***斑点，为环肽类化合物的阳性反应，其余组分均未呈现阳性反应。组分A采用硅胶柱层析(40cm×5.0cm，100-200目)进行分离，依次采用二氯甲烷/甲醇(98:2)、二氯甲烷/甲醇(95:5)、二氯甲烷/甲醇(90:10)和二氯甲烷/甲醇(80:20)进行洗脱，每种洗脱剂洗脱2倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。经洗脱，得到4种馏分F1、F2、F3和F4。所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶薄层层析检测，它们均呈现出环肽类化合物的阳性反应。在此基础上，采用硅胶柱层析(40cm×2.5cm，200-300目)，分别对上述4种馏分F1、F2、F3和F4进行再次分离。洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(98:2)，馏分F1分离为4个再分组分，F11、F12、F13和F14；以二氯甲烷/甲醇(95:5)为洗脱剂，组分F2分离为3个再分组分，F21、F22和F23；以二氯甲烷/甲醇(8:1)为洗脱剂时，组分F3分离为1个再分组分F31；洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(8:1)，组分F4分离成4个再分组分，F41、F42、F43和F44。此12个再分组分抑藻活性检测表明，再分组分F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻产生了明显的生长抑制作用。第4d，浓度为50μg/mL时，它们对2种赤潮微藻的生长抑制率在55％以上。环肽化合物检测表明，再分组分F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应。此2个组分分别进行Sephadex LH-20凝胶柱层析(40cm×2.0cm)分离，均以甲醇作为洗脱液，最终分离到2个样品F231(0.016g)和F431(0.045g)。结构鉴定表明，样品F231为环(丙氨酸-色氨酸)，F431为环(脯氨酸-丙氨酸)。

实施例2

称取裙带菜干粉末3500g，加入9L无水甲醇，室温(15-20℃)浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液(浸提共3次)。经过滤和减压蒸干，制备到浸膏428.6g。向此浸膏中加入50％甲醇水溶液500mL，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液480mL。加入乙酸乙酯萃取3次(240mL、120mL和120mL)。上层(乙酸乙酯层)合并收集后，40℃下减压蒸干，获得93.5g组分A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次(240mL、120mL和120mL)，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得18.5g组分B和9.03g组分C。上述3种组分各称取10mg，分别溶解于1mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行环肽类化合物检测。将待测样品分别点样在相同规格的2块硅胶G板上(板1和板2)，以氯仿/甲醇(9:1，体积比，下同)为展开剂。展开结束后，挥发掉溶剂，板1放置，板2悬于底部加有1.5mL浓盐酸的密闭的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高温玻璃缸)，随后放置于110℃烘箱内，加热水解1.5h。冷却后，取出板2，盐酸挥发掉后，将板1和板2同时喷洒0.2％茚三酮丙酮试剂，用电吹风加热3min，组分A在板1无斑点，在板2呈现了多个***斑点，为环肽类化合物的阳性反应，其余组分均未呈现阳性反应。组分A采用硅胶柱层析(40cm×5.0cm，100-200目)进行分离，依次采用二氯甲烷/甲醇(98:2)、二氯甲烷/甲醇(95:5)、二氯甲烷/甲醇(90:10)和二氯甲烷/甲醇(80:20)进行洗脱，每种洗脱剂洗脱2倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。经洗脱，得到4种馏分F1、F2、F3和F4。所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶薄层层析检测，它们均呈现出环肽类化合物的阳性反应。在此基础上，采用硅胶柱层析(40cm×2.5cm，200-300目)，分别对上述4种馏分F1、F2、F3和F4进行再次分离。洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(98:2)，馏分F1分离为4个再分组分，F11、F12、F13和F14；以二氯甲烷/甲醇(95:5)为洗脱剂，组分F2分离为3个再分组分，F21、F22和F23；以二氯甲烷/甲醇(8:1)为洗脱剂时，组分F3分离为1个再分组分F31；洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(8:1)，组分F4分离成4个再分组分，F41、F42、F43和F44。此12个再分组分抑藻活性检测表明，再分组分F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻产生了明显的生长抑制作用。第4d，浓度为50μg/mL时，它们对2种赤潮微藻的生长抑制率超过55％。环肽化合物检测表明，再分组分F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应。此2个组分分别进行Sephadex LH-20凝胶柱层析(40cm×2.0cm)分离，均以甲醇作为洗脱液，最终分离到2个样品F231(0.029g)和F431(0.061g)。结构鉴定表明，样品F231为环(丙氨酸-色氨酸)，F431为环(脯氨酸-丙氨酸)。

实施例3

称取裙带菜干粉末5000g，加入15L无水甲醇，室温(15-20℃)浸提12h后，浸提液倒出。再次加入新鲜无水甲醇，在上述相同条件下浸提。重复2次后，合并浸提液(浸提共3次)。经过滤和减压蒸干，制备到浸膏805.1g。向此浸膏中加入50％甲醇水溶液1000mL，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，获得上清液980mL。加入乙酸乙酯萃取3次(490mL、245mL和245mL)。上层(乙酸乙酯层)合并收集后，40℃下减压蒸干，获得171.4g组分A。下层40℃下减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取3次(490mL、245mL和245mL)，上层和下层均在60℃下减压蒸干，分别获得30.9g组分B和10.7g组分C。上述3种组分各称取10mg，分别溶解于1mL无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液，进行环肽类化合物检测。将待测样品分别点样在相同规格的2块硅胶G板上(板1和板2)，以氯仿/甲醇(9:1，体积比，下同)为展开剂。展开结束后，挥发掉溶剂，板1放置，板2悬于底部加有1.5mL浓盐酸的密闭的磨口玻璃缸中(耐酸和耐高温玻璃缸)，随后放置于110℃烘箱内，加热水解1.5h。冷却后，取出板2，盐酸挥发掉后，将板1和板2同时喷洒0.2％茚三酮丙酮试剂，用电吹风加热3min，组分A在板1无斑点，在板2呈现了多个***斑点，为环肽类化合物的阳性反应，其余组分均未呈现阳性反应。组分A采用硅胶柱层析(40cm×5.0cm，100-200目)进行分离，依次采用二氯甲烷/甲醇(98:2)、二氯甲烷/甲醇(95:5)、二氯甲烷/甲醇(90:10)和二氯甲烷/甲醇(80:20)进行洗脱，每种洗脱剂洗脱2倍柱体积后，换用下一种洗脱剂。经洗脱，得到4种馏分F1、F2、F3和F4。所得馏分40℃下减压浓缩，经硅胶薄层层析检测，它们均呈现出环肽类化合物的阳性反应。在此基础上，采用硅胶柱层析(40cm×2.5cm，200-300目)，分别对上述4种馏分F1、F2、F3和F4进行再次分离。洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(98:2)，馏分F1分离为4个再分组分，F11、F12、F13和F14；以二氯甲烷/甲醇(95:5)为洗脱剂，组分F2分离为3个再分组分，F21、F22和F23；以二氯甲烷/甲醇(8:1)为洗脱剂时，组分F3分离为1个再分组分F31；洗脱剂为二氯甲烷/甲醇(8:1)，组分F4分离成4个再分组分，F41、F42、F43和F44。此12个再分组分抑藻活性检测表明，再分组分F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻产生了明显的生长抑制作用。第4d，浓度为50μg/mL时，它们对2种赤潮微藻的生长抑制率在56％以上。环肽化合物检测表明，再分组分F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应。此2个组分分别进行Sephadex LH-20凝胶柱层析(40cm×2.0cm)分离，均以甲醇作为洗脱液，最终分离到2个样品F231(0.043g)和F431(0.083g)。结构鉴定表明，样品F231为环(丙氨酸-色氨酸)，F431为环(脯氨酸-丙氨酸)。

Claims (1)

1.一种大型海藻中环二肽类抑藻活性化合物的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：

(1)裙带菜干粉末加入无水甲醇，20℃下浸提24h后，获得浸提液；反复浸提2次，合并浸提液；经过滤和减压蒸干，制备到浸膏，此浸膏加入50％甲醇水溶液，充分振荡，4℃下静置4h，离心、过滤，弃去沉淀，收集上清液；

(2)往步骤(1)中制备的上清液中加入乙酸乙酯，萃取；上层减压蒸干，获得乙酸乙酯组分A；下层减压蒸发除出乙酸乙酯后，加入正丁醇萃取，上层和下层分别减压蒸干，获得正丁醇组分B和蒸馏水组分C；上述3种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到3种甲醇溶液；采用原位薄层层析法，经茚三酮喷雾显色，检测出组分A含有环肽类化合物；

(3)此组分采用硅胶柱层析进行分离，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，得到4个组分，分别为F1、F2、F3和F4；所述4个组分均呈现出环肽类化合物的阳性反应；

(4)将步骤(3)中所述的4个组分再次进行硅胶柱层析分离，组分F1再分为组分F11、F12、F13和F14；组分F2再分为组分F21、F22和F23；组分F3再分为组分F31；组分F4依次再分为F41、F42、F43和F44；抑藻活性检测表明，上述12个再分组分中，F22、F23、F43和F44对米氏凯伦藻和球形棕囊藻的生长表现出强烈的抑制作用；4个再分组分中，F23和F43呈现了环肽类化合物的阳性反应；

(5)将F23和F43分别采用Sephadex LH-20凝胶柱层析进行纯化，最终，得到2个样品F231和F431；样品F231和F431分别是环(丙氨酸-色氨酸)和环(脯氨酸-丙氨酸)。

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