PT94961B - Processo para a producao de proteases mutantes - Google Patents
Processo para a producao de proteases mutantes Download PDFInfo
- Publication number
- PT94961B PT94961B PT94961A PT9496190A PT94961B PT 94961 B PT94961 B PT 94961B PT 94961 A PT94961 A PT 94961A PT 9496190 A PT9496190 A PT 9496190A PT 94961 B PT94961 B PT 94961B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- protease
- gene
- bacillus
- strain
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 152
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 37
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 34
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 89
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 102
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 75
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 26
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 16
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 claims 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 38
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 36
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 10
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 3
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710162350 Alkaline extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049190 N,N-dimethylcasein Proteins 0.000 description 1
- 244000028344 Primula vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016311 Primula vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 101150085125 apr gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- -1 of-amylases Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Mushroom Cultivation (AREA)
Description
DESCRIÇÃO
Âmbito técnico
A presente invenção refere-se a um processo para a produção de proteínas mutantes utilizando técnicas recombinantes de ADN. Mais especificamente, a invenção refere-se à produção eficaz de proteases de Bacillus de proteínas modificadas por engenharia genética utilizando uma estirpe hospedeira homóloga do Bacillus, na qual se eliminou a capacidade de produzir a protease não modificada correspondente.
Antecedentes da Invenção
Os Bacillus são muito utilizados para a produção de enzimas industrialmente importantes como por exemplo as of-amilases, proteases neutras e proteases alcalinas (ou serina), ver, por exemplo, Debabov: The industrial use of Ba1 f-
cilli em; The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, Nova Iorque, 1982.
As principais vantagens da utilização j dos Bacillus são as grandes quantidades de proteínas segregadas, a sua não produção de substâncias perigosas e a sua longa histó ria de utilização industrial segura. Várias espécies de Bacillus , foram assim aprovadas para a produção de proteínas destinadas a í
i| aplicações alimentares.
il
Paiva e col., Gene 19 (1982) 81-87, demonstraram a possibilidade da utilização de Bacillus subtilis : como hospedeiro de expressão para proteínas heterólogas, efec!i ~ ; tuando a expressão do gene de oC-amilase a partir de B. amyloliíj quefaciens em B. subtilis. Outras referências descrevendo a expressão de gene heterólogo em B. subtilis são, por exemplo, Fah nestock e Fisher, J. Bacteriol. 165 (1986) 796-804, que demonsi traram a expressão do gene da proteína A de Staphylococcus aureus; Schein e col., Biotechnology _4 (1986) 719-725, referiram i a expressão do interferão-o(2 humano; e Wang e col, Gene 69 (1988) ι 39-47, mostrando a expressão e secreção de factor-oC natriurético humano. Para assegurar a secreção adequada destas proteínas heterólogas as duas primeiras referências utilizaram a sequência de sinais de <XL-amilase e a última referência a sequência de sinal do gene de subtilicina de B. subtilis (aprE) fundida ao : gene a expressar.
' Um problema importante das estirpes de j Bacillus como hospedeiros de produção para proteínas recombinan ' tes é que eles produzem e segregam várias proteases que tendem a degradar as proteínas heterólogas produzidas. Ver, por exem! pio, Old e Primrose, Principies of Gene Manipulation 3§ ed.
: (1985) 289, Blackwell, Oxford.
No Pedido de Patente Internacional (PCT)
I
WO 89/04866 é referida a importância das proteases extra-celula res; cerca de 90% da actividade proteolítica é atribuída ã meta loprotease neutral (npr) e ã protease de serina (protease alca1 lina = apr).
ί Foram propostas várias soluções para ul ‘i trapassar este problema de degradação.
J Kawadura e Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) ϊ
442-444, referiram um mutante duplo de B. subtilis deficiente em protease extracelular neutra e alcalina. Em primeiro lugar, tornou-se o B. subtilis DB100 numa protease negativa neutra por transferência das mutações de nprR2 e de nprE18 de B. subtilis ' NT18. Posteriormente, foi apagada por conversão de gene um fraçr |: mento de 178 bp contendo uma parte da apr.
I
i. Fahnestock e Fisher, Appl. Environ. Mi|| crobiol 53 (1987) 379-384, descrevem a construção de uma estirl!
pe negativa apr de B. subtilis partindo de uma estirpe negativa ' de npr. Eles utilizaram um vector plasmídio contendo o gene apr
I] | e introduziram o gene de gato (conferindo uma resistência ao í
cloroanfenicol) quer como desactivador quer como marcador selec íj cionável. Posteriormente, o gene de apr cromossómico foi substi.
i!
i! tuído por esta construção.
; Sloma e col., J. Bacteriol. 170 (1988)
I
5557-5563, detectaram e sequenciaram um terceiro gene de protea se extra-celular (epr) de B. subtilis. O apagamento parcial des. te gene revelou que ele contribuía apenas marginalmente para a actividade extracelular da protease.
Numa inspecção mais pormenorizada das estirpes produzidas parece que nenhuma das estirpes de B. subtilis referenciadas era completamente isenta de actividade proteolítica extracelular. Assim, existe ainda uma necessidade de il estirpes aperfeiçoadas de Bacillus deficientes em protease, que i podem ser utilizadas na produção de proteínas heterólogas. Esta ; necessidade é ainda mais forte quando o objectivo é a expressão de proteases que sofreram mutação.
Em várias publicações ê descrita a produção de proteases mutantes utilizando estirpes hospedeiras de i! „
Bacillus subtilis que sao incapazes de expressar o gene de protease de tipo natural, evitando assim misturas de protease mutantes e de tipo natural.
Na publicação EP-A-0246678 (o teor deste pedido corresponde ao documento EP-A-0130756), é referido uma estirpe de B. subtilis que é incapaz de segregar a subtilisina enzimaticamente activa ou protease neutral, mas que expres^ ’ sa os genes de protease heteróloga isolados ou derivados de B.
amyloliquefaciens. A mutagénese de saturação específica de sítio
foi efectuada no gene de B. amylofiquefaciens e foram expressos os mutantes. 0 fundo negativo das estirpes hospedeiro de B. sub tilis foram obtidos apagando parcialmente um ou ambos genes de protease originais, ou por mutagenese com N-metil-N’-nitro-N-ni j trosoguanidinina (NTG). Foi ainda realçada que o hospedeiro de ί B. subtilis descrito é normalmente esporulante e que os mutan'i tes asporogenosos não são satisfatórios para a produção de proii h teinas (recombinantes).
No documento WO 86/01825 (ver Fahnestock e Fisher, acima citados) são descritas estirpes de Bacillus, em
Ií particular B. subtilis, com teores de protease extracelular rei;
j: duzidos. O gene de protease alcalina é desactivado por uma inI serção in vitro de um gene que codifica para uma proteína que confere um tratamento fenotipico no microorganismo. O vector 1’ plasmídio contendo o gene de protease desactivado por inserção i é transformado em B. subtilis e o gene desactivado substitui o ! gene nativo dos cromosomas por recombinação homóloga.
O documento WO 88/08033 refere analogos i
i de subtilisina a partir de subtilisina de Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina BPN', uma subtilisina apr de B. subtilis e uma subtilisina de B. mesentericus. Estes mutantes são obtidos por substituição de um ou mais aminoácidos em ou próximo do sí: tio de ligação do cãlcio com aminoácidos de carga negativa (por ! exemplo Asp ou Glu). Os mutantes são expressos em B. subtilis.
O documento WO/04866 refere uma estirpe de B. subtilis com uma reduzida actividade de segregação de pro tease, que foi obtido por introdução de uma mutação spoOH num mutante duplo apr npr , obtendo-se assim a estirpe asporogenosa. O mutante triplo obtido apr npr SpoOH mostrava muito baixa ac : tividade de protease segregada.
As referências acima discutidas descrevem a expressão de genes homólogos e heterólogos de B. subtilis ι e a construção de estirpes de protease negativa de B. subtilis. Parece que as estirpes de protease negativa preparados por apagamento parcial do gene da protease ou por inserção de outro ge ne no gene da protease apresentam várias desvantagens, por exem pio:
7, - O gene original pode ser reactivado. Se um gene que é homólo
go do gene do cromossoma desactivado for introduzido na célu la (por exemplo num plasmídio), a recombinação homóloga pode dar origem â reactivação do gene.
ί - 0 gene original, embora desactivado, pode conduzir à produi ção de produtos de expressão parcial, quando a região promotora estiver ainda activa. Isto constitui uma desvantagem em termos de eficiência metabólica.
! - A introdução de tratamentos fenotípicos indesejáveis, por exemplo resistência a antibióticos, dependente do gene inserido.
; - Instabilidade de plasmídio, devido a homologia entre uma sequência genómica e uma parte do plasmídio.
1 Λ ! E assim desejável apagar todas as sej i quências com homologia possível entre o cromossoma e o plasmíi dio.
Existem também desvantagens para a produção da protease alcalina, ou outros enzimas, em B. subtilis. Embora Wells e col., Nucl. Acids Res. 11, (1983) 7911-7925 mostrem que a expressão de subtilina BPN’ de B. amyloliquefaciens em B. subtilis seja possível com os seus próprios sinais de transcrição, Jacobs e col., Nucl. Acids Res. 13 (1985) 8913-8926 mostram que essa estratégia não é geralmente aplicável. Foi demonstrado que a região 5' de subtilisina Carslberg deriva da de B. licheniformes não continha sinais funcionais para a r transcrição em B. subtilis. Para conseguir uma produção conside , rável era necessário inserir um promotor de B. subtilis do gene ; em questão. É também sugerido que não apenas os processos de transcrição mas também os processos de translacção, segregação ou maturação possam ocorrer de forma menos eficaz em hospedeii _ ; ros heterõlogos, devido a uma sequência imperfeita de Shine Da_l garno ou mesmo incompatibilidade do produto do gene com o hospe deiro heterólogo.
i Os problemas de expressão acima descritos podem ser evitados quando o produto é sintetizado numa estirpe de Bacillus homóloga, em que existe garantia de elevada capacidade de produção, com alto rendimento resultando em eleva 1 dos níveis de produção.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um pro cesso para a produção de proteases que diferem em pelo menos 1 ! aminoácido da protease de tipo natural, compreendendo o referi! do processo a utilização de uma estirpe de Bacillus alcalofílij ca homóloga como hospedeiro de expressão da referida estirpe j que é incapaz de produzir a protease de tipo natural.
Ij Num dos aspectos da presente invenção j o gene de protease altamente alcalina é apagado do cromossoma,
I a estirpe negativa de protease obtida pode ser utilizada como |j hospedeiro para a expressão de proteases homólogas ou heteróloí| gas.
d íj Num outro aspecto da presente invenção ! o gene de protease altamente alcalina de cromossomas é substiI j tuido por uma copia que sofreu mutaçao deste gene.
] Também são proporcionados processos paj ra construir as novas estirpes transformadas, e vectores utilii zados para esse efeito e um processo para produzir proteases mu tantes.
Numa realização preferida dos processos mutantes eles são obtidos de forma a regular uma homologia próxima das proteases originalmente produzidas pela estirpe corres pondente.
! As estirpes preferidas são os Bacillus ! da nova espécie de PB92, seus derivados e estirpes muito parecã. I das, transformadas por um gene que codifica a protease que soi freu mutação. 0 referido gene mostra pelo menos 30%, preferível mente pelo menos 50% e mais preferivelmente pelo menos 80% de homologia com o gene de tipo natural de Bacillus PB92 que codifica a protease de serina. 0 gene é preferivelmente derivado de um gene de tipo natural e uma estirpe alcalofílica de Bacillus. As estirpes especialmente preferidas são os Bacillus alcalofíli cos asporogenosos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS • ι |
1 ~
A Figura 1 mostra a construção do plas6
mídio ρΜ5δΔ contendo partes das regiões de flanqueamento 5’ e 3' do gene de protease alcalina do Bacillus nova espécie PB92.
A Figura 2 representa esquematicamente a introdução da origem sensível ã temperatura da replicação do , plasmídio pEl94neo-l no plasmídio ρΜ5δΔ, dando origem ao plasi mídio ρΕΜ5δΔ.
A Figura 3 mostra a introdução por recombinação homóloga, do plasmídio ρΕΜ5δΔ na região do flanquea ι mento 5' do gene de protease da estirpe Bacillus PBT110.
·! A Figura 4 mostra um mapa de restrição íS simplificado das regiões que rodeiam o gene da protease elimina : do após uma recombinação ilegítima. Foram obtidas duas estirpes l' PBT125 e PBT126.
li Figura 5 é uma sequência de nucleótij: dos dos fragmentos HindIII de PBT125 (A) e PBT126 (B) .
l'
A Figura 6 mostra uma representação esquemática da introdução do gene da protease em M13 πιρίδ.
A Figura 7 mostra a sequência de nucleó J tidos do plasmídio pBHA-1.
A Figura δ mostra a introdução do gene j de protease da estirpe Bacillus PBT110 no plasmídio pBHAl.
A Figura 9 mostra a reorientação a ori' gem Fl contendo o fragmento BamHI do plasmídio que dá pBHAl-MXL de pBHAR-MXL.
ι A Figura 10 mostra a subclonação da sequência 3' de protease altamente alcalina do plasmídio pBHAR-MXL, dando origem ao plasmídio pBHARB-MXL.
i
A Figura 11 mostra a eliminação da sequência de E. coli do plasmídio pBHARB-MXL M216Q que dá origem ao plasmídio pBHB-MXL M216Q.
j A Figura 12 mostra a reorientação do ge j ne de resistência â neomicina do plasmídio pE194neo-l dando ori_ gem ao plasmídio pEl94neo-3.
A Figura 13 mostra esquematicamente a introdução de origem sensível à temperatura da replicação do plasmídio pE194neo-3 no plasmídio pBHB-MXL M216Q dando origem ’ ao plasmídio pEN^Q.
A Figura 14 mostra esquematicamente a
construção da estirpe de Bacillus estirpe PEPlll.
A Figura 15 mostra esquematicamente a construção da estirpe de Bacillus estirpe PEP211.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
As proteases de serina que são produzidas pelas estirpes que pertencem ao gene de Bacillus são habitualmente designados como proteases alcalinas. As proteases uti lizadas na presente invenção são derivadas de Bacillus alcalofi^ licos, e são assim designadas como proteases alcalinas.
Para a produção de proteases altamente alcalinas são utilizados de preferência estirpes de Bacillus a_l calofílicas como células hospedeiro. Para uma produção à larga escala são necessárias estirpes industriais. Elas são originadas de organismos que podem ser isolados do solo ou que estão disponíveis de depósitos ou de outras fontes e que são obtidas por modificação genética dessas estirpes de Bacillus. As estirpes industriais de Bacillus são definidas em EP-A-0134048. Elas são caracterizadas por serem resistentes à permuta genética, co mo por exemplo infecção ou transformação por fagos. As estirpes sao estáveis e podem ou não podem ser susceptíveis de formação de esporos. Elas são habitualmente prototrõficas e são modifica das para proporcionarem elevados rendimentos de produto de proteína endógenos, como por exemplo as enzimas alfa-amilases e vá rias proteases. 0 rendimento de um produto de proteína endógeno obtido num processo de produção industrial pode representar pele menos 5 g/1 (0,5% p/v). As estirpes industriais também segregam DNases, que resultam da degradação do ADN no meio, proporcionan do uma protecção contra a permuta genética.
É vantajoso utilizar como estirpe hospe deiro a estirpe a partir da qual o gene de protease foi originalmente isolado, dado que apenas nesse caso se pode estar segu ro de que todos os sinais necessários para expressão estão funcionais .
Uma vantagem adicional da utilização de Bacillis alcalofílicos como estirpes de produção é o risco mini, mo de contaminação com outros microorganismos, dado o pH alcal_i
no durante a fermentação.
De acordo com a presente invenção, é re ferido um processo para a eliminação de um gene que codifica pa ra a protease de Bacillus a partir do genoma de forma a que a regressão se torne impossível. A referida eliminação pode ser uma eliminação parcial (desde que as sequências deixadas nos cromossomas sejam para diminuir a recombinação homóloga com o gene da protease que codifica o plasmídio) mas mais preferivelmente o gene é completamente eliminado. A estirpe de protease negativa obtida por este processo é utilizada para a produção de protease mutantes homólogas após introdução de um vector de expressão contendo o gene que codifica esta protease mutante. É, contudo, entendido que esta estirpe de protease negativa pode também ser utilizada com vantagem para a expressão de outras proteínas quer homólogas quer heterólogas. Neste contexto consjL déramos que a expressão das proteases mutantes utilizadas como célula hospedeiro, as células em que o gene de tipo natural foi isolado, são de expressão homóloga.
Foi verificado que utilizando uma protease industrial para produzir a estirpe de Bacillus como hospe deiro para a produção dos mutantes desta protease, a elevada eficiência da produção da protease original é transferida para a protease mutante. Isto resulta numa eficiência de produção surpreendentemente superior comparada com as estirpes laboratoriais. Uma cópia de cromossomas do gene que sofreu mutação dã após expressão e secreção numa estirpe industrial um rendimento ainda superior a 50 cópias de plasmídio contendo o gene que sofreu a mutação, numa estirpe laboratorial.
Constitui um aspecto desta invenção o facto de as proteases mutantes poderem ser produzidas com eficiência por uma estirpe de Bacillus homóloga por permuta do gene dos cromossomas ou duma sua parte com o gene que sofreu a mu tação correspondente. Deste modo a capacidade de produção para a protease do tipo natural é eliminada enquanto que ao mesmo tempo se introduz uma capacidade de produção para uma protease mutante.
Como célula hospedeiro para a expressão de genes que sofreram mutação codificando para proteínas de en9 genharia modificadas, é preferível usar células em que os genes são estruturalmente expressos a um alto nível.
Noutro aspecto da presente invenção foi verificado com surpresa que os Bacillis asporogenosos podem ser utilizados para se obter um elevado nível de expressão do gene de protease.
A presente invenção também mostra (Tabe la 1) que para se obter uma elevada produção da protease altamente alcalina derivada de Bacillus PB92 em B. subtilis, é preferível inserir um promotor que é activo em B. subtilis, em frente do gene. Se as enzimas derivadas de outros Bacillis forem produzidas, a inserção de B. subtilis de um promotor activo em B. subtilis ou outros sinais de expressão podem ser necessários, o que necessita de uma fase extra.
Os Bacillis produtores de protease alta mente alcalina são taxonomicamente não muito bem classificados são geralmente referidos como estirpes de Bacillus alcalofílicos. Para a presente invenção definem-se os Bacillis alcalofíli cos como estirpes de Bacillus que crescem em condições alcalinas de pH 9-11 (Horikoshi, K. e T. Akiba, 1982, Alkalophilic microorganisms, Springer Verlag, Nova Iorque). As proteases alcalinas produzidas por esses Bacillis são também designadas como proteases altamente alcalinas. Exemplos destas estirpes de Bacillus susceptíveis de crescerem em valores de pH alcalinos são descritas em, por exemplo, Patentes Norte Americanas NQs.
723 250, Re. 30 602 e 4 480 037. Um exemplo de uma estirpe hospedeiro de Bacillus alcalofílica é o Bacillus nova espécie PB92 referido entre outros na Patente Norte Americana NQ. Re.
602. Os derivados destas estirpes de Bacillus, que foram opti. mizados para a produção de proteases são utilizados para produzir as suas proteases â escala industrial (ver EP-A-0284126).
Os produtos são utilizados em várias aplicações industriais por exemplo como aditivos em detergentes de lavandarias. Exemplos desses produtos são o Maxacal (Gist-brocades/IBIS), Savinase R (NOVO), Esperase (NOVO). Mutantes desses produtos foram descri tos no documento WO 89/06279, onde se afirma que eles são derivados de Bacillus lentus, e no Pedido de Patente Europeia pré-publicada EP-A-0328229.
De acordo com uma realização preferida da presente invenção são proporcionadas estirpes de Bacillus transformadas que produzem os mutantes descritos na patente EPI -A-0328229 e WO 89/06279, preferivelmente a uma escala industri : al.
I í De acordo com a presente invenção, é utilizada adequadamente uma estirpe de Bacillus, em particular um Bacillus alcalofílico, preferivelmente Bacillus nova espécie
I PB92. Outro grupo preferido de estirpes de Bacillus são os muJ tantes asperogenosos dos quais PBT110 e os seus derivados são I os mais preferidos. A transformação de estirpes de Bacillus al: calofílicos envolverá preferivelmente a utilização de protopla^ tos a partir das referidas estirpes. Contudo, o procedimento de transformação convencional de protoplastos descrito por Chang, S. e S.M. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115, não fun ciona para a estirpe de Bacillus alcalofílicas. Os protocolos necessários para estas estirpes foram apresentados em EP-A -0283075, que ê aqui incluída como referência.
A expressão do gene de protease mutantes em hospedeiros homólogos necessita da substituição e/ou desactivação do gene do tipo natural. Podem ser utilizados alguns processos.
(A) Um dos processos é efectuar uma clonação do gene ou de uma ' sua parte modificá-lo por mutagenese dirigida a sítios e re ! introduzir o gene (parcial) na célula num plasmídio. Por re j combinação homóloga o gene pode ser introduzido no cromosso i
ma. O resultado é uma situação em que o gene do tipo natuJ ral e o gene mutante estão localizados em pares. Após uma segunda recombinação a sequência modificada é deixada no cromossoma possuindo assim efectivamente introduzida a muta ί ção no gene do cromossoma (tal como descrito na Figura 14).
(B) Noutro processo a cópia do gene do cromossoma é desactivada por eliminação. Se a eliminação do gene é escolhida como es tratégia o fragmento do gene do cromossoma que é eliminado é preferivelmente a região completa de codificação. Após a i desactivação é levada a cópia mutante do gene desactivado *! para a célula com o vector de clonação.
• i • (C) Noutro processo a cópia do gene do cromossoma é mutageniza11 do. Em princípio é possível obter mutações (específicas) in vivo, após transformação das bactérias com oligonucleótidos que são mutagénicos. Esse processo foi utilizado com sucesso em fungos como é descrito por Moerschell e col. Proc. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988) 524-528. Se for efectuado esse processo num homólogo, preferivelmente numa estirpe de Bacillus alcalofílica homóloga, isto é considerada uma realização da invenção.
A presente invenção refere-se a estirpes de Bacillus que são conhecidas como produtores eficazes de protease. Num dos processos preferidos a região de codificação da protease altamente alcalina completa é eliminada do cromossoma. Nesta realização é utilizado um vector contendo o gene de protease alcalina incluindo as suas regiões 51 e 31. 0 gene de protease é eliminado do vector in vitro, deixando para trás as regiões de flanqueamento 51 e 3’. Este vector é levado para a estirpe de Bacillus alcalofílica. 0 vector é integrado no cromossoma através de uma recombina ção homóloga da região de flanqueamento. A recombinação exterior e a resolução conduz a uma estirpe de Bacillus possuindo um gene de protease eliminado. 0 vector utilizado é preferivelmente um plasmídio. Para tornar possível a selecção é introduzido um marcador que pode ser um plasmídio pre ferivelmente resistente a antibióticos, por exemplo resistente à neomicina. 0 vector pode preferivelmente ser escolhido para ser integrado no cromossoma e isto pode ser conseguido por introdução de uma origem indutora de replicação por exemplo uma origem sensível â temperatura como por exem pio a do pE194. 0 referido plasmídio é introduzido numa célula hospedeira homóloga. Numa condição de alta temperatura o plasmídio não é susceptível de se replicar e assim os integradores do cromossoma podem ser escolhidos para isso. Os integradores são escolhidos a altas temperaturas na presença do antibiótico relevante (por exemplo neomicina). A reso lução do plasmídio do cromossoma hospedeiro pode deixar as regiões de flanqueamento no cromossoma enquanto se remove a região de codificação. Finalmente, o mutante resultante escolhido perdeu o gene marcador seleccionável (é sensível â neomicina) e é protease negativa. A configuração final cromossó mica é determinada por análise de restrição e revelação de Southern. A patente WO 88/06623 descreve com pormenor os mecanismos de integração possíveis. 0 gene de protease, modificado pela mutagenese dirigida aos sítios, é agora introduzido na célula de protease negativa num vector de expressão adequado. É pre ciso cuidado para que o plasmídio contenha poucas ou possivelmente nenhumas sequências homólogas para o cromossoma para se evitar a instabilidade do plasmídio.
Em vez de expressar o gene de protease com a mutação de um vector é também possível integrar o gene de protease que sofreu mutação no cromossoma na estirpe negativa de protease. Isto pode ser conseguido deixando as regiões de flanqueamento do gene de protease que limitam o gene de protease que sofreu mutação no plasmídio. A introdução de um plasmídio desses pode dar origem a uma recombinação homóloga nas regi ões de flanqueamento introduzindo assim o gene de protease que sofreu mutação no cromossoma da estirpe negativa de protease. Isto é especialmente vantajoso se o plasmídio se tornar instável. A presente invenção também mostra que uma quantidade de mu tante recombinante ou de protease do tipo natural obtida é comparável ou mesmo mais elevada se for integrada uma cópia do gene no genoma e em seguida se existirem várias cópias do gene co difiçado por um plasmídio.
Numa realização ainda adicional o gene de protease altamente alcalina cromossõmica é substituído pelo gene mutante por recombinação homóloga, sem isolamento prévio de uma estirpe de protease negativa.
A protease é expressa e pode ser isolada quer de células quer do meio quando a proteína é segregada. Após recuperação da protease ela pode ser purificada e formulada para se obter uma composição detergente. Assim, no sistema de produção descrito o gene do tipo natural foi completamente elimi nado, a preparação da protease mutante é completamente livre da proteína de tipo natural.
O plasmídio pM58, construído como descri to na patente EP-A-0284126, contem um gene de protease completamente alcalina. Para se obter o plasmídio de desactivação a re13
gião de codificação do gene da protease é eliminado por uma dupla digestão de Ball/Hpal. A origem sensível à temperatura da replicação de pE194neo-l é posteriormente introduzida. A construção ρΕΜδδΔ é introduzida na estirpe de Bacillus PBT110.
j A integração pelo mecanismo designado pelo tipo de Campbell teve lugar na região de flanqueamento 51 | do gene da protease, resultando numa estirpe de protease positi j va contendo todo o vector plasmídio no seu cromossoma no sítio j da protease (tal como se mostra na Figura 3).
A selecção posterior para derivados de !, protease negativa dessa estirpe revelou duas estirpes PBT125 e j!
j PBT126, que tinham perdido o gene de protease e o marcador de , neomicina. Uma análise adicional revelou que nesta segunda fase jj tinha ocorrido uma recombinação ilegítima.
|| Dado gue as estirpes de Bacillus obtidas não apresentavam uma actividade detectável de protease elas podiam ser utilizadas para a expressão dos genes de protease al. terada. Será óbvio que ο PBT125 e ο PBT126 são apenas exemplos. Dado que a recombinação ilegítima dará origem a resultados dife rentes serã essencial determinar se o gene completo foi elimina do. Para se obterem estirpes mais específicas, podiam ter sido feitos recombinantes homólogos.
ί Os exemplos aqui apresentados descrevem j principalmente duas realizações específicas da invenção. Uma de , las e a produção de uma protease mutante codificada para plasmí dio a partir de uma estirpe de protease negativa. A outra é a produção de uma protease mutante em que o gene que sofreu a mutação foi introduzido no genoma por permuta de genes. Será obviamente óbvio para o especialista que são possíveis outras rea j lizações, por exemplo: integração cromossómica numa estirpe de protease negativa, uma cópia do gene que sofreu mutação no plass mídio e integrado no cromossoma, mais do que uma cópia do gene que sofreu a mutação localizada em pares ou em posições diferen tes no cromossoma. Os seguintes exemplos são apresentados como ilustração e não como limitação.
SECÇÃO EXPERIMENTAL
EXEMPLO 1
Construção do PLasmídio de Desactivagão ρΕΜ58Δ ί Fez-se a digestão do plasmídio ρΜ5δΔ (ver EP-A-0284126) com enzimas de restrição Bali e Hpal. Conten do o grande fragmento das sequências de flanqueamento do gene ί, de protease foi purificado (Maniatis, Molecular cloning: A Labo 'j ratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) e ligado. A mistura de ; Ligação foi transformada (Spizizen e col., J. Bacteriol. 81
I í (1961) 741-746) para Bacillus subtilis DB104 (Kawamura e Doi, ! J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) e escolhida para transforman tes resistentes à neomicina e de protease negativa em placas mí
II nimas contendo 0,4% de caseína e 20 ug/ml de neomicina.
H plasmídio ρΜ5δΔ foi isolado e caracP - ~ l terizado por analise de enzima de restrição. Tal como se mostra ;; na Figura 1 o plasmídio pM58A contem as sequências de flanqueamento do gene de protease altamente alcalina, codificando o gene para a resistência â neomicina e uma origem de Bacillus de replicação.
Para construir um plasmídio de integração contendo uma origem sensível à temperatura de replicação, ρΜ58Δ foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e BglII. O fragmento que continha as sequências de flanqueamento de protea
I se altamente alcalina foi purificado e ligada ao fragmento (purificado) Xbal/BglII de pE194neo-l (EP-A-0284126) contendo a j origem sensível à temperatura da replicação, derivada de pEl94 ' (Jordanescu e col., Plasmid (1978) 468-479), após o referido ι
fragmento ter sido purificado da forma anteriormente descrita.
A mistura de ligação foi transformada para B. subtilis DB104 e escolhida para a resistência ã neomicina (ver acima). O plasmi! dio ρΕΜ5δΔ foi isolado e caracterizado (Figura 2). Ele contem o gene resistente à neomicina, a origem sensível â temperatura da replicação de pE194 e as sequências de flanqueamento do gene de protease alcalina.
Este plasmídio ρΕΜ5δΔ foi utilizado pa ι ra transformar a estirpe de Bacillus PBT110.
EXEMPLO 2
Construção de uma Estirpe de Bacillus Alcalofílica de Protease
Negativa
A. Transformação protoplástica de Bacillus PBT110 por plasmídio ρΕΜ58Δ
A estirpe de Bacillus PBT110 é um mutan te asporagenoso de Bacillus nova espécie PB92 (Patente Norte Americana NQ. Re. 30 602) e foi obtida por procedimentos clássicos de mutação (UV). Esta estirpe foi transformada com o plasmídio ρΕΜ5δΔ semelhante ao processo descrito na Patente EP-A-0284126. Antes das experiências de integração, foi verificado por análises de enzima de restrição se os transformantes continham o plasmídio relevante.
B. Integração de ρΕΜ5δΔ no cromossoma de Bacillus PBT110
A integração de ρΕΜ5δΔ nbo cromossoma da estirpe de Bacillus PBT110 foi efectuada da forma descri ta na Patente EP-A-0284126. A escolha dos integrantes ocorreu numa concentração de neomicina de 1 pg/ml. A organização genética do integrante foi determinada por análise da enzima de restrição seguida por revelação de Southern e anã lise de hihridização e é apresentada na Figura 3. Parecia que a integração de ρΕΜ5δΔ tinha lugar através de um mecanismo designado por tipo de Campbell por recombinação homóIoga na região de flanqueamento 5' do gene de protease alca lina, resultando numa estirpe de Bacillus PBT110-INT5.
C. Selecção de estirpes de protease negativa
A estirpe de Bacillus PBT110-INT5 foi inoculada em 100 ml de caldo de soja tríptico (TSB) contendo 1 (ug/ml de neomicina e incubou-se durante 24 horas a uma temperatura de 50QC.
Após 24 horas foram inoculados 0,1 ml da cultura obtida num frasco de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio mínimo de PBT : K2HPO4, 17.42 g/1; glutamato, 13.36 g/1; sódio citrato.H2O 2 g/1; FeSO4.7H2O, 0.05 g/1;
ZnSO4.7H2O, 1 mg/1; MnSO4.H2O, 1 mg/1; CaCl2,2H2O, 10 mg/1; MgSO4.7H2O, 0.2 g/l; CuSO4.5H2O, 0.5 mg/1; H3BO3, 0.5 mg/1; Na2Mo04.2H20, 0.5 mg/1; CoC12.6H20, 0.5 mg/1; Biotina, 0.5 mg/1; sacarose, 20 g/l; (pH 8,0, esterilizado durante 20 min a 120QC). Após a esterilização foi adicionado 1 mg/1 de tiamina.
Esta cultura foi incubada a 37QC durante 4 dias. Passados 4 dias, diluiu-se 1 ml da cultura em 100 ml do mesmo meio e incubou-se durante 4 dias. Passados 4 dias. Passados 4 dias a cultura foi colocada em placas de meio mínimo PBT contendo adicionalmente 0,4% de caseína e 15 g/l de ágar. As colónias a que faltava uma protease halo detectãvel foram consideradas protease negativa e foram ensaiadas para a determinação da ausência de gene codificando a protease alcalina PBT110.
D. Caracterização das estirpes da protease negativa
As estirpes que não apresentavam um halo detectãvel nas placas de caseína descritas na secção anterior foram em primeiro lugar ensaiadas para a determinação da presença de um fenotipo sensível ã neomicina e asporogenoso. Duas estirpes, Bacillus PBT125 e PBT126, que continham a protease negativa e o fenotipo asporogenoso foram ensaiadas para a determinação da produção de protease em frascos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio de pro dução de protease, da forma descrita na Patente Norte Americana NQ. Re. 30 602. Nenhuma das estirpes produziu quantidades detectáveis de protease.
A organização genética das duas estirpes foi determinada pela anãlise de enzimas de restrição e revelação cromossómica que é representada na Fifura 4. Não ocorreu recombinação homóloga, mas sim ilegítima, resultando em duas estirpes que eliminavam completamente os genes resisten tes ã protease e â neomicina. Contudo, parecia ter sido deixado um pequeno fragmento de plasmidio no cromossoma após eliminação do gene da protease. A sequência deste fragmento foi determinada da forma seguinte. Os fragmentos de cromosso ma HindIII das estirpes PBT125 e PBT126 contendo as junções de plasmidio/cromossoma foram ligadas num vector fago M13 mpl8 (Messing e col., Nucl. Acids Res. (1981) 303-321) e transfectadas para E. Coli JM101 de acordo com o procedimen to descrito por Cohen e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69 (1972) 2110-2114. Após a propagação do fago em E. coli JM101, foi isolado ssADN (Heidecker e col., Gene 10 (1980) 69-73) .
As inserções foram sequenciadas utilizando o processo descrito por Sanger e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 6463. Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 5A e 5B, respectivamente.
EXEMPLO 3
Construção de Vectores de Produção e Mutação de Protease
A. Subclonação do gene da protease PB92 no fago M13 mp!8
Foi feita a digestão do plasmídio pM58 com Hpal e Bali. Apõs purificação do fragmento de ADN contendo o gene de protease (Maniatis, 1982) este fragmento foi ligado ao fago M13 mpl8 foi digerido com Smal. A mistura de ligação foi transfectada e E. coli JM101 (Cohen e col. supra). Após a propagação do fago em E. coli JM101, foi iso lado o dsADN de acordo com o processo descrito por Birnboim e Doly (Nucl. Acids Res. Ί_ (1979) 1513-1523) . A inserção e a sua orientação foram verificadas por análise de enzima de restrição. O vector mpl8 MXL foi utilizado para experiências de subclonação adicionais e é representada na Figura 6.
B. Subclonação do gene de protease PN92 no plasmídio pBHAl
A Figura 7 mostra a sequência de nucleó tidos do plasmídio pBHAl. Este plasmídio é derivado do sistema de vector geminai pMa/c5-8 descrito por Stanssens e col., (Nucl. Acids Res. 17 (1989) 4441-4454), em que foi in serido um promotor adicional. O plasmídio BHA1 consiste nos seguintes fragmentos:
.rf?'''' pos 11-105: bacteriófago FD, terminador;
pos 121-215: bactiriôfago FD, terminador;
pos 221-307: uma parte de plasmídio pBR322 (isto é posições
2069-2153);
i pos 313-768: bacteriófago Fl, origem de replicação isto é pos 5482-5943);
pos 772-2571: parte do plasmídio pBR322, isto ê a origem de replicação e o gene de -lactamase;
! pos 2572-2685: transposição Tn903, genoma completo; pos 2719-2772: terminador de triptofano (duplo);
ί pos 2773-3729: transposão Tn9, o gene de cloranfenicol-acetilI transferase (=cat) . Os nucleótidos na pos
3005 (A), 3038 (C), 3302 (A) e 3409 (A) diferem de sequência de codificação cat” natural. As mutações foram introduzidas para eliminar os sítios d
Ncol, Bali, EcoRT e PvuII; pos 3730-3804: sítio de clonação múltiplo;
pos 3807-7264: parte do plasmídio pUBUO (isto é a replicação e gene de resistência â canamicina, fragmento EcoRI PvuII) (McKenzie e col., Plasmid 15 (1986) 93-103 e Plasmid Γ7 (1987) 83-85);
pos 7267-7331: sítio de cloração múltipla.
! Os fragmentos foram combinados utilizan do técnicas conhecidas de clonação, por exemplo, enchimento nas extremidades com Klenow, clonação de adaptação, etc.. Todos estes dados foram derivados de Genbank National Nucleic Acid Sequence Data Bank' NIH, U.S.A.. O plasmídio pMc5-8 foi depositado com o número DSM 4566.
Antes dos procedimentos de mutação o sistema de vector geminai pBHA/C-1 foi modificado para se obter o sistema de vector geminai pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL, da forma seguinte :
1. O vector mpl8-MXL foi digerido com Kpnl e HincII. O fragmen to de ADN contendo o gene de protease foi purificado e liga do em pBHAl que foi digerido com EcoRV e Kpnl. A mistura de ligação foi transformada em E. coli JM101 (Maniatis, 1982) . j e colocado em placas LC contendo 10 g/1 de tripton, 5 g/1
N de extracto de fungo (Difco), 8 g/1 de NaCl, 25 mg/1 de tiI ]
mina, 1 g/1 de MgSO^.7H2O, 100 pg/ml de ampicilina e 20 pg/ml de neomicina pH 7.0. O plasmidio de ADN dos transformantes foi isolado (Birnboim, supra) e caracterizado por análise de enzima de restrição. Desta forma foi isolado pBHAl-MXL (ver Figura 8).
2. De modo a sequenciar as mutações introduzidas no gene da protease com um conjunto disponível de oligonucleótidos, foi necessário inverter a orientação da origem Fl comparada com o gene da protease. Isto foi efectuado da seguinte maneira : o plasmidio pBHAl-MXL foi digerido com BamHI e reli gado. A mistura de ligação foi transformada em E. coli WK6 (Maniatis, supra) e escolhida para resistência â neomicina ou ampicilina em placas LC+ contendo 10 g/1 trypton, 5 g/1 Yeast Extract (Difco), 8 g/1 NaCl, 25 mg/l thymine, 1 g/1 MgSO^.7H2O, 100 jug/ml ampicillin and 20 pg/ml neomycin pH 7.0. O ADN de plasmidio dos transformantes foi isolado (Birn boim, supra) e caracterizado por análise de enzima de restrição. Desta maneira foi isolado o pBHAR-MXL, que diferia do pBHA-MXL por a orientação da sequência de E. coli ser in vertida, (ver Figura 9).
3. Para a introdução de sequências adicionais de flanqueamento no plasmidio pBHAR-MXL, foram feitas as seguintes digestões. 0 plasmidio pM58 foi digerido com Sphl e HindIII. O plasmidio pBHAR-MXL (Figura 10) foi digerido com Sphl e HindIII.
fragmento maior foi purificado. Ambas as digestões foram ligadas e transformadas em B. subtilis DB104 e escolhidas para a resistência à neomicina e actividade de protease em placas mínimas contendo 10 pg/ml de neomicina e 0,4% de caseína. Os transformantes foram caracterizados por análise de enzima de restrição. Um destes, pBHARB-MXL (Figura 10), foi utilizado para outras experiências.
C. Mutagenese do gene PB92 no plasmidio pBHARB-MXL
A mutagénese foi efectuada com o sistema de vector geminai pBHARB-MXL/pBHCRB-MXL (Stanssens, supra) .
Foi utilizado um processo baseado na
I técnica de duplex com separação (Kramer e col., Nucl. Acids. Res. 12 (1984) 9441) e um plasmídio (fago/plasmídio híbrido) . 0 processo baseia-se essencialmente num intermediário de ADN duplex separado consistindo de uma banda separada (banda-) contendo um marcador resistente a antibióticos de tipo natural e uma banda modelo (bandat) contendo uma mutação âmbar no gene conferindo a resistência ao antibiótico. Após estabilização, o oligonucleótido mutagénico torna-se incorporado na banda separada durante a reacção de enchimen to e selagem in vitro da separação. As moléculas resultantes são utilizadas para transformar uma deficiência de repa ração de incoenrência (Mut S) hospedeira em que a ligação entre a mutação pretendida e o marcador da resistência ao antibiótico é conservada. A população de plasmídios mistos, isolados desta estirpe, é em seguida deixada segregar na e_s tirpe hospedeira negativa do supressor. Os transformantes são placados num meio contendo antibiótico, impondo assim uma selecção para a progenia derivada da banda separada.
No vector do tipo pMa o nucleõtido 3409 é alterado de G para A, enquanto que no vector tipo pMc o nucleótido 2238 é alterado de G para C, criando cõdãos de pa ragem âmbares no gene de cloranfenicol-acetil-transferase e no gene de (3-lactamase, respectivamente, tornando os refer_i dos genes inactivos.
Para efectuar a mutagénese o fragmento de ADN alvo é clonado no sítio de clonagem múltipla de pMa5-8 ou num seu derivado. É em seguida construído um duplex separado entre pMa5-8 contendo o ADN alvo e pMc5-8.
A separação de banda simples, consistindo do ADN alvo, pode ser submetida a mutagénese com um oligonucleótido mutagénico, com oligonucleótidos sintéticos longos possuindo um pequeno teor de nucleótidos incorporados, utilizando uma desincorporação química ou enzimática de nucleótidos. Para uma descrição detalhada, ver Ausubel e col., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. Nova Iorque; ou B. Perbal, 1988, A practical Guide to Molecular Cloning, 2â ed. John Wiley & Sons Inc; Nova Iorque.
D. Construção de Vectores para a Produção Industrial de Protease
Após a introdução das mutações pretendi das no plasmídio pBHARB-MXL, as sequências indesejadas de
E. coli do plasmídio foram eliminadas da forma seguinte: o plasmídio pBHARB-MXL contendo a mutação importante foi dige rido com BamHI e religado em condições diluídas. A mistura de ligação foi transformada em B. subtilis DB104 e escolhida para a resistência ã neomicina e actividade da protease em placas mínimas contendo 20 pg/ml de neomicina e 0,4% de caseína. O ADN dos transformantes foi isolado e caracteriza do por análise de enzima de restrição. Desta forma foram isolados vectores a que faltava o ADN de E. coli, que são ! adequados para a produção comercial de proteínas.
procedimento anterior é ilustrado na Figura 11, em que a mutação de M216Q é tomada como exemplo, resultando no plasmídio pBHB-MXL M216Q. M216Q, assim como M216S, S160D e N212D referidos em seguida, são proteases mu tantes de Bacillus PB92, descritas na Patente EP-A-0328229.
!
!
EXEMPLO 4 ' Transformação de Protoplastos de Bacillus PBT125 por Derivados do Plasmídio pBHB-MXL ί A estirpe Bacillus PBT125 foi transfori ί mada pelo plasmídio pBHB-MXL ou os seus plasmídios derivados contendo genes de protease mutante, segundo o procedimento de transformação de EP-A-0284126. Antes dos estudos de produção, os transformantes foram ensaiados por análise de enzima de restrição para verificar se contêm o plasmídio relevante.
EXEMPLO 5
Construção dos Vectores de Integração da Protease
A. Vector de Integração pEN^Q
O plasmídio pEl94neo-l (EP-A-0284126)
foi digerido com Sall e religado. A mistura de ligação foi transformada em B. subtilis DB104 e escolhida para resistên : cia à neomicina em placas mínimas contendo 20 ug/ml de neoi ' micina. 0 plasmídio pE194neo-3 foi isolado e ensaiado na ' presença do gene de resistência à neomicina numa orientação inversa (ver Figura 12). O plasmídio pE194neo-3 foi digerido com Hpal e BglII. O fragmento contendo a origem de repli cação sensível ã temperatura foi purificado (Maniatis, supra) .
J O plasmídio pBHB-MXL M216Q (ver Exemplo e Figura 11) foi digerido com BglII e Bali. O fragmento contendo o gene de protease foi purificado. Ambos os fragmentos foram ligados. A mistura de ligação foi transformada para B. substilis DB104 e escolhida para a actividade de í protease e resistência â neomicina como anteriormente descrito. Os transformantes foram caracterizados por digestões de enzima de restrição. Um destes, contendo o plasmídio pEN^Q, foi o escolhido (Figura 13) . Este plasmídio continha o gene de resistência à neomicina, a origem sensível à temperatura de replicação do plasmídio pE194neo-3 e a mutação M216Q no gene da protease de PB92.
B. Vector de Integração pENoS.
Da forma descrita para o vector de inte gração pEN^Q, o pEN^S foi construído utilizando pBHARB-MXL M216S como vector de partida.
I í
í EXEMPLO 6 i Construção de Estirpes de Bacillus PEP111 e PEP112 !
A. Transformação de Protoplastos de Bacillus PBT110 pelo Plasmídio pENpQ
A estirpe de Bacillus PBT110 foi transformada com o plasmídio pEN^Q como descrito em EP-A-0284126. Antes das experiências de integração, foi ensaiado por análise de enzima de restrição se os transformantes continham '1 o plasmídio importante.
•J B. Integração de pEN-^Q em cromossomas de Bacillus PBT110
As experiências de integração com o plasmídio pENgQ em cromossoma da estirpe Bacillus PBT110 fo ram efectuadas da forma descrita em EP-A-0284126. A escolha dos integrantes ocorreu para uma concentração de neomicina de 1 ug/ml a temperaturas não permitidas (50QC) para a replicação de plasmídio. Para verificar a integração de pEN^Q no cromossoma, foi isolado o ADN cromossómico de integrantes potenciais foi digerido com HindIII ou Ciai, tratado com um gel de agarose com 0,8% de ADN e revelado em nitroce lulose (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) e hibri32 dizado com P marcado com translacçao de corte de pEN^Q de ADN (Maniatis, 1982).
Demonstrou-se que a integração de pEN^Q ocorria por recombinação homóloga resultando numa estirpe (PBT11OM/Q) com dois genes de protease (um do tipo natural e um mutante M216Q) localizados em seguimento no cromossoma. Assim, a integração de pEN^Q ocorria por um mecanismo chama do de tipo Campbell como representado na Figura 14 (ver tam bém EP-A-0284126).
C. Seiecção dos recombinantes sensíveis ã neomicina [ Foram escolhidos recombinantes sensíveis à neomicina, que continham ou o gene do tipo natural ou o gene da protease mutante no cromossoma (de agora em diante i referido com outrecombinantes). O procedimento de seiecção { é semelhante ao procedimento atrás descrito no Exemplo 2C.
i
A estirpe PBT110 M/Q foi utilizada com estirpe de partida. Após se ter incubado a estirpe PBT110 M/Q em meio mínimo PBT, foi placada a cultura em placas de ! meio mínimo PBT contendo 0,4% de caseína e 15 g/l de ágar. Estas placas foram incubadas durante 48 h a 37QC e as rêplj. cas placadas em placas de infusão de Heart (HI) contendo 1 ug/ml de neomicina e sem neomicina, respectivamente. As colónias sensíveis à neomicina foram consideradas outrecombi nantes.
; D.- Caracterização de recombinantes sensíveis ã neomicina
I
Foi isolado o ADN cromossómico de outre combinantes potenciais, digeridos com Ciai ou HindIII, processadas no gel a 0,5% de agarose, reveladas com nitrocelulose (Southern, 1975) e hibridizadas com pEN~Q de translac~ 32 J çao de corte com P (Maniatis, 1982). Dado que a mutação de M216Q resulta na remoção de um sítio de Ciai, as estirpes contendo uma protease de tipo natural ou um gene de pro tease mutante, e a estirpe intermédia PBT110 M/Q podem ser facilmente distinguidas, ver Fig. 14.
Foi isolado um outrecombinante contendo o gene de protease mutante M216Q de PB92. Após se ter mostrado que tinha ocorrido uma substituição do gene de protea se do tipo natural PB92 para a protease motante PB92, o pro duto da estirpe foi caracterizado pelos seus parâmetros bio químicos (kcat, Km)/ resistência à oxidação, actividade específica e capacidade de lavagem, como descrito em EP-A-0328229. Todos os resultados eram idênticos a uma protease de controlo M216Q, indicando que o produto da estirpe tranjs formada era de facto a protease PB92 contendo a mutação M216Q. Esta estirpe transformada é designada por Bacillus PEP111.
Foram efectuadas experiências semelhantes utilizando o vector pEN^S para construir a estirpe de Bacillus PEP112, que contem a protease PB92 com a mutação M216S.
EXEMPLO 7
Construção das Estirpes de Bacillus PEP211 e PEP212
A estirpe de Bacillus PEP 111 foi trans formada com o plasmídio pEN^Q, seguindo o procedimento descrito em EP-A-0284126. Antes do procedimento de integração, ele foi analisado por análise de enzima de restrição para saber se os transformantes continham o plasmídio relevante. O procedimento de integração e a selecção de integrantes (para uma concentração de neomicina de 20 ug/ml a temperaturas não permitidas (50° • ί C) para a replicação de plasmídios foi efectuada da forma des.! crita em EP-A-0284126.
Para verificar a integração do plasmídio pEN^Q no cromossoma, o ADN cromossómico de integrantes potenciais foi isolado e digerido com HindIII, processado em géis de agarose a 0,8%, revelado em nitrocelulose (Southern e col.
I ~ 32
1979) e hibridizado com pEN3Q de translacçao marcado com P. Verificou-se que se tinha isolado uma estirpe contendo dois gej nes de protease mutantes, localizados separadamente no cromosso j mas. Esta estirpe é designada como PEP211. A sua organização cromossómica é representada na Figura 15.
! Para se obter uma estirpe análoga conII
Ií tendo dois genes de protease com a mutação M216S, transformouíí j -se a estirpe PEP112 contendo um gene mutante (M216S) apos sub_s ι tituição do gene, do gene do tipo natural, com o plasmídio : pENqS e foram seguidos os procedimentos acima descritos. Estas I J _ j expenencias resultaram numa estirpe PEP212 contendo os dois ge
I nes de protease mutante PB92 M216S localizados separadamente no i
cromossoma.
EXEMPLO 8 j Produção de Protease Mutantes
A produção de proteases mutantes foi efectuada com estirpes de Bacillus modificadas em que o gene co difica a protease que sofreu a mutação foi localizado ou num plasmídio ou no cromossoma.
Para a produção de plasmídio codificado ' foram utilizados dois tipos de estirpes, a estirpe alcalofílica de Bacillus PBT125, tal como aqui descrita, e estirpe B. subtilis DS12367, uma estirpe asporogenosa derivada de B. subtilis DB104 (Kawamura e col., J. Bacteriol. (1984) 160, 442-444). Estas estirpes foram transformadas com pBHB-MXL de plasmídios derivados. Os Bacillus PBT125 e B. subtilis DS12367, que não possuíam plasmídios codificadores de protease, foram utilizados co mo estirpes de controlo.
Para a produção com estirpes contendo . genes mutantes de protease cromossomicamente integrados, as es,ι tirpes de Bacillus PEP, tal como aqui descritas, foram as utili
zados. As estirpes de Bacillus PBT 108 e 110, contendo os genes de protease de tipo natural foram utilizadas como estirpes de controlo. A PBT108 é uma estirpe contendo dois genes de tipo na tural localizados separadamente no cromossoma, ver EP-A-0284126 ; Para PBT110, ver Exemplo 2A.
Para verificar a actividade do promotor original do gene de protease PB92 em B. subtilis, foi feita uma i construção, pBHB-MXLR, em que a orientação do gene de protease L para o promotor Hpall (Zyprian e col., DNA _5 (1986) 219-225) foi invertida, de forma a que a expressão do gene de protease é apenas dirigida pelo seu promotor original.
ί As produções foram efectuadas em frasji cos de agitação de 500 ml contendo 100 ml de meio de produção L de protease.
Quando se utilizaram estirpes de Bacil! lus alcalofílicas, as culturas foram incubadas, após inoculaI ção, durante 40 horas a 37QC num meio de produção da forma desii j crita na Patente Norte Americana N°. Re. 30 602. No caso de βει tirpes contendo plasmídios, foi adicionada neomicina (20 pg/ml).
i
Quando se utilizaram estirpes B. subti| lis DS12367, foi adicionado um meio comparável contendo 12.5 g/1 de Extracto de Levedura (Difco), 0.97 g/1 de CaCl2.6H2O,
2.25 g/1 de MgCl2.6H2O, 20 mg/1 de MnSO^.4H2O, 1 mg/1 de CoCl2· l 6H9O, 0.5 g/1 de citrato, 0.5 ml de antiespumante 5693, 6% p/p I; de maltose, e foi aplicado um tampão de fosfato 0,2 M a pH 6,8.
No caso de estirpes contendo plasmídios, foi adicionada a neomi cina (20 pg/ml).
; As culturas contendo as estirpes de B.
!
i subtilis foram incubadas durante 65 horas a 37QC. Em todos os casos os frascos de agitação foram inoculados com 0,1 ml de uma j
cultura de Caldo de Soja Tríptico contendo 20 jag/ml de neomicina de tipo relevante que tinha sido incubada durante 24 horas a 375C.
A actividade da protease foi avaliada utilizando dimetilcaseína como substrato da forma descrita por ι Lin e col., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793. As actividades * específicas mutantes da protease (EP-A-0328229) foram utiliza•I das para determinar a produção numa base de mg.
Os resultados das experiências de fermentação são resumidos na Tabela 1 seguinte.
TABELA 1
Estirpe Produção relativa Mutação de protease
PBT110 | 100% | WT |
PBT125 | 0% | - |
PBT108 | 120% | WT |
PEPlll | 100% | M216Q |
PEP112 | 100% | M216S |
PBT125 pBHB-MXL | 95-100% | WT |
PBT125 pBHB-MXL M216Q | 95-100% | M216Q |
PBT125 pBHB-MXL M216S | 95-100% | M216S |
PBT125 pBHB-MXL S160D | 95-100% | S160D |
PBT125 pBHB-MXL N212D | 95-100% | N212D |
PEP211 | 120% | M216Q |
PEP212 | 120% | M216S |
DS12367 | 0-1% | - |
DS12367 pBHB-MXLR | 4% | WT |
DS12367 pBHB-MXL | 40% | WT |
DS12367 pBHB-MXL M216Q | 40% | M216Q |
DS12367 pBHB-MXL M216S | 40% | M216S |
DS12367 pBHB-MXL S160D | 40% | S160D |
DS12367 pBHB-MXL N212D | 40% | N212D |
Todas as publicações incluindo pedidos de patente) mencionadas nesta especificação são indicadores para os especialistas a que a invenção se refere. Todas as publij ! cações são aqui incorporadas como referência na extensão em que cada publicação individual foi especificamente e individualmente mencionada como incorporada como referência.
Embora a invenção anterior tenha descri, ta com algum pormenor como ilustração e exemplo com o objectivo de clareza e de compreensão, será óbvio para os especialistas • i que podem ser feitas muitas alterações e modificações sem se • ΐ . j afastar do espírito e âmbito das reivindicações anexas.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES lã Processo para a produção de proteases l mutantes que diferem das proteases do tipo natural em pelo me! nos um aminoácido, caracterizado por compreender a utilização ' de uma estirpe de Bacillus alcalofílica homóloga como hospedeiij ro de expressão, sendo a referida estirpe incapaz de produzir a {í protease do tipo natural.is íi- 2â Processo de acordo com a reivindicaçãoI ~1, caracterizado por se empregar como hospedeiro de expressão uma estirpe de Bacillus alcalofílica negativa a protease.- 3ã Si Processo de acordo com a reivindicação j 2, caracterizado por se empregar como hospedeiro de expressão l uma estirpe de Bacillus alcalofílica negativa a protease e em que o gene de protease do tipo natural é suprimido do genoma.Processo de acordo com qualquer das rei. ί vindicações 1 a 3, caracterizado por se empregar um derivado ne ί gativo de protease de Bacillus novo especies PB92.- Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1 a 4, caracterizado por se empregar uma estirpe de ! Bacillus alcalofílica asporogénica.jj Processo de acordo com qualquer das rei.μ vindicações 1 a 5, caracterizado por se empregar um Bacillus as porogénico de que se suprimiu o gene da protease natural por re : combinação homóloga ou ilegítima.iI- 7ã Processo de acordo com qualquer das re_i vindicações 1 a 6, caracterizado por a protease mutante muito í! alcalina ser codificada por plasmídio.Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a protease muito alcalina do tipo natural ter essencialmente a sequência de aminoácidos de protease de Bacillus novo especies PB92.- 9ã Processo de acordo com as reivindicações _sí1 a 6, caracterizado por se suprimir o gene de protease muito alcalina do tipo natural do cromossoma e se inserir no genoma pelo menos uma cópia de um gene de protease muito alcalina mui tante.I- lOã I ί Processo de acordo com as reivindica' ções 1 a 6, caracterizado por se substituir o gene de protease j muito alcalina do tipo natural por pelo menos uma cópia do gene |i mutante de protease muito alcalina.I ' l· (í í - llã Processo de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado por se inserir pelo menos uma cópia de um gene mutante de protease muito alcalina no genoma e se co dificar com o plasmídio outra cópia.III i - 123 HProcesso para a obtenção de uma estirpe de Bacillus alcalofílica tendo um nivel reduzido extracelular de protease muito alcalina, caracterizado por compreender i - isolar-se um gene, incluindo as suas regiões 5' e/ou 3' nãoI codificantes que codifica uma protease muito alcalina, inserir-se o gene num vector de clonação, suprimir-se a região codificante do gene do vector de clona Ção, j - transformar-se uma estirpe de Bacillus com o vector de clo’, nação,- desenvolver-se os transformantes em condições em que a fun31 ção de replicação do vector estã inactiva, e seleccionar-se transformantes que perderam a sequência de ADN que codifica a protease alcalina.- 13ã !j. Processo de acordo com a reivindicação12, caracterizado por a mencionada estirpe de Bacillus alcalofí_ lica ser Bacillus novo especies PB92 ou um seu derivado.li li l[ ii1' i! A requerente reivindica a prioridade do ; pedido de patente europeia apresentado em 11 de Agosto de 1989, i sob o NQ. 89202117.1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP89202117 | 1989-08-11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PT94961A PT94961A (pt) | 1991-04-18 |
PT94961B true PT94961B (pt) | 1997-05-28 |
Family
ID=8202457
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT94961A PT94961B (pt) | 1989-08-11 | 1990-08-10 | Processo para a producao de proteases mutantes |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040014175A1 (pt) |
EP (1) | EP0414297B1 (pt) |
JP (1) | JP3490435B2 (pt) |
KR (1) | KR0169978B1 (pt) |
CN (1) | CN1049866A (pt) |
AT (1) | ATE144283T1 (pt) |
AU (1) | AU629970B2 (pt) |
BG (1) | BG60567B1 (pt) |
BR (1) | BR9003956A (pt) |
CA (1) | CA2023094C (pt) |
DD (1) | DD297187A5 (pt) |
DE (1) | DE69028890T2 (pt) |
DK (1) | DK0414297T3 (pt) |
ES (1) | ES2095233T3 (pt) |
FI (1) | FI110365B (pt) |
GR (1) | GR3021669T3 (pt) |
IE (1) | IE77037B1 (pt) |
PT (1) | PT94961B (pt) |
RU (1) | RU2060276C1 (pt) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4304161A1 (de) * | 1993-02-12 | 1994-08-25 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verbesserte hochalkalische Proteasen |
DK0772684T3 (da) | 1994-06-17 | 2005-12-12 | Genencor Int | Amylolytiske enzymer afledt fra B. Licheniformis alpha-amylasen med forbedrede karakteristika |
DK0894126T3 (da) * | 1996-03-27 | 2006-06-12 | Novozymes As | Alkalisk phosphatase-deficient trådformet svamp |
JP3440694B2 (ja) * | 1996-05-16 | 2003-08-25 | ライオン株式会社 | 口腔用組成物 |
GB0024554D0 (en) | 2000-10-06 | 2000-11-22 | Agrol Ltd | Ethanol production |
US8124399B2 (en) * | 2002-03-29 | 2012-02-28 | Danisco Us Inc. | Enhanced protein expression in Bacillus |
WO2006088972A2 (en) | 2005-02-16 | 2006-08-24 | The General Hospital Corporation | Use of modulatirs of compounds of tgf-beta superfamily to regulate hepcidin-mediated iron metabolism |
RU2511416C1 (ru) * | 2012-10-24 | 2014-04-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАО ВПО КФУ) | Штамм бактерий bacillus pumilus 2a-5 с низкой протеолитической активностью, повышенной активностью фосфатазы, способ его получения и применения |
RU2510821C1 (ru) * | 2012-10-24 | 2014-04-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) | Штамм бактерий bacillus pumilus мк-10 с низкой протеолитической активностью и его применение |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1234445A (pt) * | 1967-10-03 | 1971-06-03 | ||
JPS6055118B2 (ja) * | 1982-02-08 | 1985-12-03 | 昭和電工株式会社 | 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法 |
NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
AU620326B2 (en) * | 1987-02-27 | 1992-02-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
CN1056187C (zh) * | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
-
1990
- 1990-08-02 DE DE69028890T patent/DE69028890T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-02 EP EP90202109A patent/EP0414297B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-02 AT AT90202109T patent/ATE144283T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-02 DK DK90202109.6T patent/DK0414297T3/da active
- 1990-08-02 ES ES90202109T patent/ES2095233T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-08 DD DD90343328A patent/DD297187A5/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-08 BG BG92653A patent/BG60567B1/bg unknown
- 1990-08-08 FI FI903927A patent/FI110365B/fi active IP Right Grant
- 1990-08-10 CA CA002023094A patent/CA2023094C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-10 PT PT94961A patent/PT94961B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-08-10 BR BR909003956A patent/BR9003956A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-08-10 IE IE290490A patent/IE77037B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-08-10 JP JP21356290A patent/JP3490435B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-10 RU SU904830790A patent/RU2060276C1/ru active
- 1990-08-10 AU AU60961/90A patent/AU629970B2/en not_active Expired
- 1990-08-11 CN CN90107928A patent/CN1049866A/zh active Pending
- 1990-08-11 KR KR1019900012377A patent/KR0169978B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-11-14 GR GR960403043T patent/GR3021669T3/el unknown
-
2003
- 2003-05-19 US US10/442,013 patent/US20040014175A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20040014175A1 (en) | 2004-01-22 |
CA2023094A1 (en) | 1991-02-12 |
BG92653A (bg) | 1993-12-24 |
CA2023094C (en) | 2000-03-28 |
JPH03210177A (ja) | 1991-09-13 |
PT94961A (pt) | 1991-04-18 |
RU2060276C1 (ru) | 1996-05-20 |
DD297187A5 (de) | 1992-01-02 |
IE77037B1 (en) | 1997-11-19 |
FI110365B (fi) | 2002-12-31 |
KR0169978B1 (ko) | 1999-02-01 |
IE902904A1 (en) | 1991-02-27 |
EP0414297B1 (en) | 1996-10-16 |
BG60567B1 (bg) | 1995-08-28 |
GR3021669T3 (en) | 1997-02-28 |
CN1049866A (zh) | 1991-03-13 |
EP0414297A1 (en) | 1991-02-27 |
ES2095233T3 (es) | 1997-02-16 |
JP3490435B2 (ja) | 2004-01-26 |
KR910004805A (ko) | 1991-03-29 |
AU629970B2 (en) | 1992-10-15 |
FI903927A0 (fi) | 1990-08-08 |
DK0414297T3 (da) | 1997-07-07 |
DE69028890T2 (de) | 1997-02-27 |
DE69028890D1 (de) | 1996-11-21 |
AU6096190A (en) | 1991-02-14 |
BR9003956A (pt) | 1991-09-03 |
ATE144283T1 (de) | 1996-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2590247B2 (ja) | スブチリシンアナログ | |
US5093257A (en) | Hybrid prokaryotic polypeptides produced by in vivo homologous recombination | |
KR970005249B1 (ko) | 신규한 단백질 분해효소 및 세제에 있어서의 사용 | |
JP2594533B2 (ja) | 変異ザブチリシンを製造する方法 | |
JP2599946B2 (ja) | ズブチリシン類似体 | |
Podbielski et al. | Novel series of plasmid vectors for gene inactivation and expression analysis in group A streptococci (GAS) | |
US5397705A (en) | Multiply mutated subtilisins | |
HUT50877A (en) | Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms | |
HU213220B (en) | Method for enhanced production of serine protease in transformed bacillus cells and production of the transformed cells | |
PT94961B (pt) | Processo para a producao de proteases mutantes | |
JP2023500362A (ja) | バチルス属(bacillus)細胞における強化されたタンパク質産生のための組成物及び方法 | |
JP2000504590A (ja) | タンパク質の製造、同タンパク質をコードするプラスミド及びこのようなプラスミドを含有する生物 | |
US5264350A (en) | DNA sequence performing a function which is expressed in an over-production of extracellular proteins by various strains of bacillus, and vectors containing this sequence | |
EP0261009B1 (fr) | Sequence d'ADN exercant une fonction se manifestant par une surproduction de protéines exocellulaires par diverses souches de bacillus, et vecteurs contenant cette séquence | |
JP2501779B2 (ja) | アルカリプロテア―ゼの製造方法 | |
JPH01141596A (ja) | アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子系 | |
JP2006067884A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
JP2006067883A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
FR2635788A1 (fr) | Sequence d'adn comprenant la partie fonctionnelle du locus sacuh de b. subtilis, vecteurs contenant la sequence correspondante, et leur utilisation dans des procedes de production de proteines | |
FR2632320A2 (fr) | Sequence d'adn comprenant la partie fonctionnelle du locus sacu de b. subtilis, vecteurs contenant la sequence correspondante, et leur utilisation dans des procedes de production de proteines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19901108 |
|
FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19970214 |
|
PC3A | Transfer or assignment |
Free format text: 970814 GENENCOR INTERNATIONAL, INC. US |
|
MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED Effective date: 20120214 |