BG60567B1 - Метод за получаване на мутантни протеази - Google Patents

Метод за получаване на мутантни протеази Download PDF

Info

Publication number
BG60567B1
BG60567B1 BG92653A BG9265390A BG60567B1 BG 60567 B1 BG60567 B1 BG 60567B1 BG 92653 A BG92653 A BG 92653A BG 9265390 A BG9265390 A BG 9265390A BG 60567 B1 BG60567 B1 BG 60567B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
protease
gene
plasmid
bacillus
strain
Prior art date
Application number
BG92653A
Other languages
English (en)
Other versions
BG92653A (bg
Inventor
Der Iaan Johannes Van
Eekelen Christiaan Van
Original Assignee
Genencor International Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8202457&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG60567(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genencor International Inc. filed Critical Genencor International Inc.
Publication of BG92653A publication Critical patent/BG92653A/bg
Publication of BG60567B1 publication Critical patent/BG60567B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Mushroom Cultivation (AREA)

Abstract

Методът намира приложение при производството на детергентни състави. По метода се получават алкалофилни щамове васillus, които продуцират мутантна протеаза, отличаваща се най-малко с една аминокиселина от дивия тип алкална протеаза. Щамовете васillus се трансформират с плазмиден експресионен вектор, съдържащ мутантен ген на алкалната протеаза.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Изобретението се отнася до метод за получаване на мутантни протеази чрез рекомбинантни (ДНК) технологии. По-специално изобретението се отнася до ефективно получаване на протеази от Bacillus, като се използва хомоложен щам гостоприемник Bacillus, при който е елиминирана възможността да произвежда съответната немодифицирана протеаза.
ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Микроорганизмите от рода Bacillus се използват широко за производство на промишлено важни ензими катоа-амилази, неутрални протеази и алкални (или серин-протеази) виж Debabovl “The industrialuse of Bacilli”: The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, Ню Йорк, 1982.
Главните предимства от използването на Bacilli са големите количества протеин, който се секретира, липсата на продуциране на опасни вещества и на безопасното промишлено производство. Одобрени са няколко вида Bacilli за получаване на протеини, предназначени за употреба в храните.
Pavla и сътр., Gene 19 (1982) 81-87 демонстрират пригодността на Bacillus subtilis като експресионен гостоприемник за хетероложни протеини като осъществяват експресията на α-амилазния ген от B.amyloliquefaciens в B.subtilis. В други източници, описва експресията на хетероложен ген в B.subtilis, например Fahnestock и Fisher, J.Bacteriol. 165 (1986) 796-840, които посочват експресията на гена за протеин А на Stahylococcus aureus; Schein и сътр., Biotechnology 4 (1986) 719-725, се описва експресията на човешки интерферон а-2; и Wang и сътр., Gene 69 (1989) 39-47, като се показва експресирането и секретирането на атриален натриуретичен а фактор. За осигуряване на правилно секретиране на тези хетероложни протеини, първите две публикации използват последователността на сигнала аамилаза, а в последната статия - последователността на сигнала ген на субтилизина от B.subtilis (аргЕ), слят с гена, който трябва да бъде експресиран.
Главният проблем при щамовете Bacillus като производствени гостоприемници на рекомбинантни протеини е, че те продуцират и секретират различни протеази, които имат тенденция да разрушават получените хетероложни протеини. Виж например Old и Primrose “Principles of Gene Manipulation”, III издание (1985) 289, Blackwell Оксфорд.
В международна заявка за патент по PCT/WO 89/04866 се изтъква значението на екстрацелуларните протеази; около 90% от протеолитичната активност се отдават на неутралната металопротеаза (прг) и на серинпротезата (алкална протеаза = (арг).
Предлагат се различни решения за преодоляване на посочения проблем на разграждането.
Kawamura и Doi, J.Bacteriol. 160 (1984) 442-444 изтъкват един двоен мутант В. subtilis без извънклетъчна неутрална и алкална протеаза. Най-напред В. subtilis DB 100 е направен отрицателен за неутрална протеаза чрез трансфер на прг R2 и прг Е18 мутации от В. subtilis NT18. След това, фрагмент от 178 Ьр, съдържащ част от арг-гена беше отстраняван (чрез делеция)чрез генна конверсия.
В лит.източник Fahnestock и Fisher, Apl.Envir.Microliol. 53 (1987) 379-384, се описва конструирането на един арг негативен щам В. subtilis , като се започва от един прг негативен щам. Те използват плазмиден вектор, който съдържа арг гена и въвеждат cat гена (придаващ резистентност към хлорамфеникол) както като инактиватор, така и като селекционен маркер. След това хромозомният apr-ген се замества от тази конструкция.
Sloma и сътр., J.Bacteriol. 170 (1988) 5557-5563 откриват и секвенират трети екстрацелуларен протеазен ген (ерг) от В. subtilis. Частична делеция на този ген показва, че той има малък принос за извънклетъчната активност на протеаза.
При по-внимателно разглеждане на получените щамове става ясно, че никой от посочените щамове В. subtilis не е лишен напълно от извънклетъчна протеолитични активност. Поради това все още има нужда от подобрени и с липса на протеаза щамове Bacillus, които да могат да се използват при производството на хетероложни протеини. Тази нужда е дори πο-голяма, когато целта е експресия на мутантни протеази.
В някои публикации продукцията на мутантни протеази се описва при ползване на В. subtilis като щам гостоприемник, който е неспособен да експресира гена на дивия тип протеаза, избягвайки с това смесването на мутантен и див тип протеази.
В ЕР-А-0246678 (съдържанието на това описание отговаря на ЕР-А-0130756) се описва щам В. subtilis, който не може да секретира ензимно активен субтилизин или неутрална протеаза, но който експресира хетероложни протеазни гени или произхождащи от В.атуloliquefaciens. Осъществява се сайт-специфична насищаща мутагеназа върху ген на В.атуloliquefaciens и мутантите се експресират. Негативният фон на щамовете гостоприемници от В. subtilis се получава чрез частична делеция на един или друг от оригиналните протеазни гени или чрез М-метил-ЬГ-нитро-М-нитрозогуанидин (NTG) мутагенеза. Освен това се подчертава, че описаният гостоприемник В. subtilis е нормално спорулиращ и че спорогенните мутанти са незадоволителни за продукцията на (рекомбинантни) протеини.
Във WO 86/01825 (виж Fahnestock и Fisher, цит. по-горе) щамовете Bacillus, по-специално В. subtilis, са описани с понижено съдържание на извънклетъчна протеаза. Генът за алкална протеаза се инактивира чрез in vitro инсертиране на ген, кодиращ протеин, предаващ фенотипен признак на микроорганизма. Плазмидният вектор, съдържащ инсерционно инактивиран протеазен ген, се трансформира в В. subtilis и инактивираният ген замества нативния хромозомен ген чрез хомоложна рекомбинация.
Във WO 88/08033 се описват аналози на субтилозина от субтилозин на Карлсберг, субтилизин DY, субтилизин BPN’, един арг субтилизин от В. subtilis и субтилизин от B.mesentericus. Тези мутанти се получават чрез заместване на една или повече аминокиселини в или близо до сайта за свързване на калций с отрицателно заредени аминокиселини (например Asp. или Gleu). Мутанти се експресират в В. subtilis.
WO 89/04866 включва щам В. subtilis със слаба активност на секретиране на протеаза, който е получен чрез въвеждане на spoOH мутация в apr’npr’ двоен мутант, което прави щама аспорогенен. Полученият троен мутант apr’npr’spoOH показва твърде ниска активност на секретиране на протеаза.
Разгледаните по-горе публикации описват експресия на хомоложни и хетероложни гени В. subtilis и конструиране на протеазно-не5 гативни щамове В. subtilis. Явно е, че протеазнонегативните щамове, получени чрез частична делеция на протеазния ген или чрез инсерция на друг ген в протеазния ген, показват известни затруднения, посочени в следващия ред.
Оригиналаният ген може да бъде реактивиран. Ако един ген, който е хомоложен на инактивирания хромозомен ген, бъде въведен в клетката (например чрез плазмид), хомоложната рекомбинация може да доведе до реактивиране на гена.
Оригиналният ген, въпреки че е инактивиран, може да доведе до продукция на частично експресирани продукти, когато промоторният участък е още активен, това е недостатък с оглед на метаболитната ефективност.
Въвеждането на нежелани фенотипни признаци, например резистентност към антибиотици, зависещи от вкарвания ген.
Плазмидна нестабилност, дължаща се на хомоложност между геномна последователност и на част от плазмида.
Поради това е желателно да бъдат отстранени, например чрез делеция, всички последователности с възможна хомоложност между хромозомата и плазмида.
Има също и други недостатъци за производството на алкални протеази или на други ензими в В. subtilis. Въпреки, че в лит.източник Wells и сътр., Nucl.Acids Res. 11 (1983) 79117925 се посочва, че експресията на субтилизин BPN’ на B.amyloliquefaciens в В. subtilis е възможна с нейни собствени сигнали за транскрипция в лит.източник Jacobs и сътр., Nucl. Acids Res, 13 (1985) 8913-8926 се посочва, че такава стратегия не е общо приложима. Установено е, че s участъкът на гена на субтилизина на Карлсберг, произхождащ от B.licheniformis, не съдържа сигнали за транскрипция в В. subtilis. За получаване на значителна продукция е необходимо да се инсертира (вмъкне) промотор на В. subtilis пред въпросния ген. Подсказва се също, че не само транскрипционни но също и транслационни, секреционни или процеси на зреене могат да се проявят по-слабо в хетероложни гостоприемници, поради несъвършенна последователност на Shine-Dalgamo или дори несъвместимост на продукта на гена с хетеро ложния гостоприемник.
Описаните по-горе проблеми на експресията могат да бъдат избегнати, когато продуктът се синтезира в хомоложен щам Bacillus, при който са доказани способности на висока продуктивност, с висока ефективност, които способствуват за високо равнище на продукцията.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО.
Изобретението предлага метод за получаване на протеази, различаващи се най-малкото по една аминокиселина от дивия тип протеаза, като посоченият метод включва използването на хомоложен алкалофилен щам Bacillus като експресионен гостоприемник, като посоченият щам не е способен да продуцира дивия тип протеаза.
От една страна, съгласно изобретението генът на високо алкалната протеза се отстранява чрез делеция от хромозомата, като полученият протеазно негативен щам може да се използва като гостоприемник за експресия на хомоложни или хетероложни протеази.
От друга страна, съгласно изобретението генът на хромозомно високо алкалната протеаза се замества с мутантно копие на този ген.
Предлагат се също и методи за конструиране на новите трансформирани щамове, използваните за целта вектори и метод за продуциране на мутантни протеази.
При един предпочитан вариант се продуцират мутантни протеази, които показват близка хомоложност с протеазите, нормално продуцирани от съответните щамове.
Предпочитани щамове са Bacillus novo species РВ92, негови производни и близко свързани щамове, трансформирани чрез ген, кодиращ мутантна протеаза. посочените гени показват най-малко 30%, за предпочитане 50% и още повече за предпочитане най-малко 80% хомоложност с дивия тип ген на Bacillus Pl392, кодиращ серин-протеаза. За предпочитане е генът, произхождащ от гена от див тип на един алкалофилен щам Bacillus. Специално предпочитани са аспорогенни алкалофилни щамове Bacillus.
Серин-протеази, които се продуцират от щамове, спадащи към род Bacillus, се наричат обикновено алкални протеази. Протеазите, използвани в изобретението, се получават от алкалофилни Bacilli и се наричат поради това високо алкални протеази.
За продукцията на силно алкални протеази се използват като клетки-гостоприемници за предпочитане алкалофилни щамове Bacillus. За едромащабно производство са нужни индустриални щамове. Те произхождат от микроорганизми, които могат да бъдат изолирани от почвата или могат да се получат от колекции или от други източници и се получават чрез генетична модификация на такива щамове Bacillus. Дефинирани са индустриални щамове Bacillus в ЕР-А-0134048. Те се характеризират с това, че са устойчиви на генетичен обмен, като фагова инфекция или трансформация. Щамовете са стабилни и могат да са или да не са способни на спорообразуване. Те са обикновено прототрофни и модифицирани да осигуряват високи добиви от ендогенни протеинни продукти, като ензими α-амилаза и различни протеази. добивът на ендогенен протеинов продукт, получаван при промишлен производствен процес, може да възлиза до 5 g/1 (0,5% тегло/обем). Промишлените щамове секретират също ДН-ази, като в резулта се разрушава ДНК в средата, при което се създава защита срещу генетичен обмен.
За предпочитане е да се използва като щам гостоприемник щамът, от който е бил изолиран в началото протеазният ген, защото само в този случай може да е сигурно, че всички сигнали, нужни за експресията, са функционални.
Допълнително предимство от използването на алкалофилни Bacilli като производствени щамове е минималният риск от контаминация с други микроорганизми, поради алкалното pH по време на ферментацията.
Съгласно изобретението се предлага метод за делеция на гена, кодиращ протеаза в генома на Bacillus, по такъв начин, че реверсията става невъзможна. Такава делеция;ия може да е парциална делеция (доколкото останалите последователности в хромозомата са твърде къси за хомоложна рекомбинация с плазмид-кодиран протеазен ген), но е повече за предпочитане генът да бъде напълно отстранен (чрез делеция). Протеазнонегативният щам, получен по този метод, се използва за продукция на хомоложни мутантни протеази след въвеждане на експресионен вектор, пренасящ гена, кодиращ тази мутантна протеаза. Трябва обаче да се разбере, че такъв негативен по отношение на протеазата щам може да бъде използван за експресия на други протеини както хомоложни, така и хетероложни. В този контекст се счита, че експресията на мутантни протеази при използването на клетка гостоприемник, като клетката е тази, от която е изолиран генът от див тип, е хомоложна експресия.
Установено е, че чрез използване на протеаза индустриален щам Bacillus като гостоприемник за получаване на мутанти на тази протеаза високата ефективност при продукцията на оригиналната протеаза е пренесена върху мутантна протеаза. Това има като резултат по-висока ефективност на продукция в сравнение с лабораторните щамове. Едно хромозомно копие на мутиран ген дава при експресия и секреция в индустриален щам добив дори по-висок, отколкото 50 плазмидни копия, съдържащи мутирания ген в един лабораторен щам.
Един аспект на изобретението се отнася до това, че мутантни протеази могат да бъдат получавани ефективно чрез хомоложен щам Bacillus чрез подмяна на хромозомния ген или на част от него със съответния мутиран ген. По този начин се елиминира производствения капацитет за дивия тип протеаза, докато в същото време се въвежда производствения капацитет за мутантна протеаза.
Като клетка гостоприемник за експресия на мутирани гени, кодиращи модифицирани или така наречените инженерни протеини, е за предпочитане да се използват клетки, в които гените са структурно експресирани в голяма степен.
Съгласно изобретението е установено, че могат да се използват аспорогенни Bacilli за получаване на висока степен на експресия на протеазния ген.
Съгласно изобретението е установено също (таблица 1), че за получаване на силно алкална протеаза, произхождаща от Bacillus РВ92 в B.subtilis, е за предпочитане да инсертират (вмъкне) промотор, който е активен в B.subtilis, пред гена. Ако се получават ензими от други Bacilli в B.subtilis, може да е необходима инсерция на промотор, активен в B.subtilis или на други сигнали за експресия, което изисква допълнителна стъпка.
Продуциращите силно алкална протеаза Bacilli не са добре класифицирани таксономично и обикновено се отнасят към алкалофилните щамове Bacillus. За изобретението са определени алкалофилни бацили като щамове Bacillus, които растат при алкални условия при pH 9-11 (Horikoshi и T.Akiba, 1982, Alkalophilic microorgnisnas, Springer Verlag, New York. Алкалните протеази, продуцирани от такива Bacilli се наричат също силно алкални протеази. Примери за щамове Bacillus, пригодни да растат при алкално pH, са описани например в патенти на САЩ № 3,723,250, Re 30,602 и 4,480,037. Един пример за алкалофилен гостоприемников щам Bacillus е Bacillu novo species РВ92, включен в патент на САЩ Re 30,602. Производни на тези алкалофилни щамове Bacillus, които са били оптимизирани за продукция на протеаза, се използват за продуциране на техните протеази в промишлен мащаб (виж ЕР-А-0284126). Продуктите се използват в няколко промишлени приложения, например като добавка в перилни детергенти. Примери за такива продукти са Maxacai“ (Gistbrocades/IBIS), Savinase“ (NOVO). Esperase“ (NOVO). Мутанти на такива продукти са описани в патент WO 89/06279, в който се посочва, че те произхождат от щамове Bacillus lentus, и в непубликувания Европейски патент ЕЗ-А0328229.
Според един предпочитан вариант на изобретението се осигуряват трансформирани щамове Bacillus, които продуцират мутантите, описани в ЕР-А-0328229 и WO 89/06279, за предпочитане в промишлен мащаб.
Според изобретението един щам Bacillus е използван подходящо, по-специално един алкалофилен Bacillus, за предпочитане Bacillus novo species РВ92. Друга предпочитана група щамове Bacillusa са спорогенните мутанти, от които РВТ110 и неговите производни са найпредпочитани. Трансформирането на алкалофилни щамове Bacillus включва предимно използването на протопласти от същите щамове. Протоколът за конвенционална протопластна трансформация е описан в лит.източник Chang S.Cohen, Mol.Gen.Genet. 168 (1979) 111-125, като действа обаче при алкалофилни щамове Bacillus. Необходимите протоколи за тези щамове са включени в ЕР-А-0283075, който е посочен в публикация.
Експресията на гените на мутантни протеази в хомоложни гостоприемници се нуждае от заместването и/или инактивирането на дивия тип ген. Могат да бъдат използвани няколко метода.
A) Според единия метод се клонира генът или една част от него, като се модифицира чрез сайт насочена мутагенеза и се въвежда отново (частично) генът в клетката чрез плазмид. Чрез хомоложна рекомбинация генът може да бъде въведен в хромозомата, това има като резултат ситуация, при която дивият и мутантният ген са разположени тандемно. След втора рекомбинация модифицираната последователност се оставя в хромозомата, като с това ефективно се въвежда мутацията в хромозомния ген, (както е описано във фиг. 14).
Б) При друг метод хромозомното генно копие се инактивира чрез делеция. Ако делецията на гена е избрана като стратегия, фрагментът хромозомен ген, който е отстранен, трябва да е за предпочитане целият кодиращ. След инактивирането едно мутантно копие на инактивирания ген се вкарва в клетката чрез клониращ вектор.
B) При друг метод хромозомното генно копие се подлага на мутагенеза. По принцип е възможно да се получат (специфични) мутации in vivo, след трансформиране на бактерии с олигонуклеотиди, които са мутагенни. Такъв метод успешно се използва при дрожди, както е описано от Moershell и сътр., Proc.Natl.Acad Sci. САЩ 85 (1988) 524-528. Ако такъв метод се използва при хомоложен, за предпочитане хомоложен алкалофилен щам Bacillus, това е вариантът на настоящото изобретение.
Изобретението се отнася до щамове Bacillus, които са известни като ефективни производители на протеаза. При един от предпочитаните методи пълният участък, кодира силно алкална протеаза, се отстранява от хромозомата. При този вариант се използва вектор, съдържащ гена на алкалната протеаза, вкл. неговите 5' и 3' краища. Протеазният ген се отстранява от вектора in vitro, оставяйки след себе си 5' и 3' обграждащите последователности. Този вектор се внася в алкалофилния щам Bacillus. Векторът се интегрира в хромозомата чрез хомоложна рекомбинация в обграждащата област. Външна рекомбинация и разрешаване водят до щам Bacillus, при който е отстранен чрез делеция протеазният ген. Използваният вектор е за предпочитане плазмид. За да се направи възможно селекционирането, се въвежда селекционен маркер в плазмида, за предпочитане резистентност към антибиотик например резистентност към неомицин. За предпочитане векторът може да бъде интегриран селективно в хромозомата и това може да бъде постигнато чрез въвеждане на индуцируемо начало на репликация, например температурно чувствително начало като това от рЕ194. Споменатият плазмид се въвежда в хомоложната клетка гостоприемник. При условия на висока температура плазмидът не е в състояние да се реплицира, така че интегрираните съставки в хромозомата могат да бъдат избрани. Съставките се селекционират при висока температура в присъствие на релевантния антибиотик (например неомицин). Отделянето на плазмида от хромозомата на гостоприемника може да остави обграждащите участъци в хромозомата като отстрани кодираща област. Накрая полученият мутант, селекциониран поради загуба на селекционния маркерен ген, чувствителен към неомицин, и е протеазно негативен. Крайната хромозомна конфигурация е определена чрез рестрикционен анализ и Sautheru behing. WO 88/06623 описва подробно възможните механизми на интеграция. Протеазният ген, модифициран чрез сайт насочена мутагенеза, се въвежда сега в протеазно негативна клетка чрез подходящ експресионен вектор. Обръща се внимание, плазмидът да носи къси или за предпочитане без последователности, хомоложни на хромозомата, за да се избегне плазмидна нестабилност.
Вместо експресия на мутиралия протеазен ген от един вектор възможно е също да се интегрира мутираният протеазен ген в хромозомата на протеазно негативния щам. Това може да се постигне, като се оставят страничните (обграждащи) области на протеазния ген да обграждат мутирания протеазен ген в плазмида. Въвеждането на такъв плазмид може да даде начало на хомоложна рекомбинация в обграждащите области и с това въвеждането на мутирания протеазен ген в хромозомата на протеазно негативния щам. Това е изключително полезно, ако плазмидът се окаже нестабилен. Съгласно изобретението количеството на рекомбинантната мутантна или получена от див тип протеаза е сравнимо или дори по-високо, ако едно копие на гена се интегрира в генома и ако има няколко копия на гена, кодирани от плазмид.
В друг вариант на изпълнение хромозомният силно алкален протеазен ген се замества от мутантен ген чрез хомоложна рекомбинация, без предварително изолиране на протеазно негативния щам.
Протеазата се експресира и може да бъде изолирана или от клетките, или от средата, след секреция на протеини. След получаване на протезата тя може да бъде пречистена и формувана в детергентен състав. Тъй като в описаната производствена система гена от див тип е напълно отстранен (чрез делеция), полученият препарат от мутантна протеаза е напълно свободен от дивия тип протеаза.
Плазмид рМ58, конструиран както е описано в ЕР-А-0284126, съдържа гена на високо алкалната протеаза. За получаване на инактивирания плазмид, кодиращата област на протеазния ген се отстранява чрез делеция чрез Bal(I)Hpa I двойно смилане. След това се въвежда температурно чувствителното начало на репликацията от рЕ194пео-1. Въвежда се конструкта рЕМ58 Δ в щам Bacillus РВТ110.
Интегрирането чрез така наречения Campbele-тип механизъм се осъществява в 5' крайната област на протеазния ген, с което се получава протеазно позитивен щам, носещ целия плазмиден вектор в своята хромозома в протеазния локус, както е посочено на фиг. 3.
Последваща селекция за протеазно негативни производни на този щам дава два щама РВТ125 и РВТ126, които са загубили протеазния ген и маркера за неомицин. Следващ анализ посочва, че при тази втора стъпка се е появила илегитимна рекомбинация.
Тъй като получените щамове Bacillus не показват откриваема протеазна активност, те могат да бъдат използвани за експресия на променени протеазни гени. Съгласно изобретението РВТ125 и РВТ126 са само примери. Тъй като илегитимната рекомбинация дава различни резултати, важно е да се определи дали е отстранен целия ген. За получаване на по-специфични щамове, би трябвало да се получат хомоложни рекомбинанти.
Посочените примери описват главно два специфични варианта на изобретението. Единият вариант се отнася до продукцията на плазмидно кодирана мутантна протеаза от протеазно негативен щам. Другият вариант се отнася до продукцията на мутантна протеаза, при което мутираният ген се въвежда в генома чрез обмен на ген. Възможни са и други варианти, например хромозомно интегриране в протеазно негативен щам, едно мутирано генно копие както върху плазмид, така и интегрирано в хромозомата, повече от едно копие на мутирания ген, разположени тандемно или в различни положения в хромозомата. Следващите примери поясняват без да ограничават изобретението.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ.
Фигура 1 представлява конструкцията на плазмида рМ58 Δ, съдържащ части от 5' и 3'. Крайните участъци на гена на алкалната протеаза от Bacillus novf sp.PB92.
Фигура 2 - схематично въвеждане на температурно чувствителното начало на репликация от плазмид рЕ194 пео-1 в плазмид рМ58 Δ, даващ плазмид рЕМ58 .
Фигура 3 - въвеждането чрез хомоложна рекомбинация на плазмид рЕМ58 в 5' крайния участък на протеазния ген на щам Bacillus РВТ110.
Фигура 4 - опростена рестрикционна карта на областите, ограждащи отстранения чрез делеция протеазен ген след илегитимна рекомбинация. получени са два щама РВ125 и РВТ126.
Фигура 5 - нуклеотидната последователност на Hind III фрагменти на РВТ125 (А) и РВТ126 (В).
Фигура 6 - схематично представя въвеждането на протеазния ген в М13 шр18.
фигура 7 - нуклеотидната последователност на плазмид рВНА-1.
Фигура 8 - въвеждането на протеазния ген на щам Bacillus РВТ110 в плазмида ppBHAl.
Фигура 9 - преориентирането на Fl ori, съдържащ BamHAI - Фрагмент от pBHAl-MXL, като се получава плазмид peHAR-MXL.
Фигура 10 - субклонирането на 3' последователността на силно алкалните протеази на плазмид pBHAR-MXL, даващ плазмид pBHARL-MXL.
Фигура 11 - отстраняването чрез деле ция на последователността на E.coli от плазмид pBHARB-MXL М2160, даващ плазмид pBHB-MXL, М216 Q.
Фигура 12 - преориентирането на гена за резистентност към неомицин в плазмид рЕ 194 пео-3.
Фигура 13 - схематично въвеждането на температурно чувствителното начало на репликация от плазмид рЕ194пео-3 в плазмид pBHB-MXL, даващ плазмид pEN3Q.
Фигура 14 - схематично конструирането на щам Bacillus щам РЕР111.
Фигура 15 - схематично конструкцията на щам Bacillus РЕР211.
Пример 1. Конструиране на инактивационен плазмид рЕМ58 Δ.
Плазмид рМ 58 (виж ЕР-А-0284126) се смила с рестрикционни ензими Bali и Hpai. Големият фрагмент, съдържащ част от крайната последователност на протеазния ген се пречиства (Maniatis, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982) и лигира. Лигационната смес се трансформира (Spizgigzen и сътр., J.Bacteriol 81 (1961) 741-746) към Bisubtilis DB 104 ‘Kawamura и Doi, J.Bacteriol. 160 (1984) 442-444) и се селекционира за резистентност към неомицина и за протеазно негативни трансформанти върху малки плаки, съдържащи 0,4% казеин и 20 pg/ml неомицин.
Плазмид рМ58 Δ се изолира и охарактеризира чрез рестрикционен ензимен анализ. Както е посочено на фигура 1, плазмиди ρΜ58Δ съдържат крайните последователности на гена на силно алкалната протеаза, генът, кодиращ за резистентност към неомицин и началото на репликация на Bacillus.
За конструиране на интеграционен плазмид, съдържащ температурно чувствително начало на репликация, рМ58 Δ се смила с рестрикционни ензими Xbai и Bglii. Фрагментът, съдържащ обграждащата последователност на силно алкалната протеаза, се пречиства и лигира до (пречистен) Xbai/Bglii фрагмент на рЕ194 пео-1 (ЕР-А-0284126), съдържащ температурно чувствителното начало на репликация, произхождащ от рЕ194 (Jordanescu и сътр., Plasmid 1 (1978) 468-479), след като посоченият фрагмент се пречисти, както е описано по-горе. Лигиращата смес се трансформира в B.subtilis DB104 и се селекционира за резистентност към неомицин (виж по-горе). Плазмид рЕМ58 Асе изолира и охарактеризира (фигура 2). Той съ държа гена за резистентност към неомицин, температурно чувствителното начало на репликация от рЕ 194 и обграждащата последователност на гена на алкалната протеаза.
Този плазмид рЕМ58 Δ се използва за трансформиране на Bacillus щам РВТ110.
Пример 2. Конструиране на протеазно негативен алкалофилен щам Bacillus.
A) Протопластна трансформация на Bacillus РВТ110 с плазмид рЕ58 Δ. Bacillus щам РВТ110 е аспорогенен мутант на Bacillus novo species РВ92 (Патент САЩ № Re 30,602) и е получен чрез класическа (UV) мутационна процедура, този щам се трансформира с плазмид рЕМ58 подобно на метода, описан в ЕРА-0284126. Преди експериментите за интегриране се проверява чрез рестрикционен ензимен анализ дали трансфорантите съдържат подходящия плазмид.
Б) Интегриране на рЕ58 Δ в хромозомата на Bacillus РВТ110. Интегрирането на рЕМ58 в хромозомата на Bacillus щам РВТ110 се извършва, както е описано в ЕР-А-0284126. Селекциониране за интегранти се осъществява при концентрация на неомицин 1 gg/ml. Генетичната организация на интегранта се определя чрез рестрикционен ензимен анализ, последван от Soutem blotting и хибридизационен анализ, както е посочено на фиг. 3. Интегрирането на рЕМ58 става чрез така наречените Campbell тип механизъм чрез хомоложна рекомбинация в 5' крайния участък на гена на алкалната протеаза, при което се получава Bacillus yd; PBT110-INTS.
B) Селекциониране на протеазно негативни щамове.
Bacillus щам PBT110-INTS се инокулира в 100 ml трипсин соева среда (TSB), съдържащ 1 g/ml неомицин и се инкубира 24 h при 50°С.
След 24 h 0,1 ml от получената култура се инокулира в 500 ml колба за разклащане, съдържаща 100 ml РВТ минимална среда: К2НРО4 17,42 g/Ι, глутамат 13,36 g/Ι; натриев цитрат.Н20 2 g/1; FeSO4.7H20 0,05 g/1; ZnSO4.7H20 1 mg/1; MnSO4.H20 1 mg/1; CaC1.2H20 10 mg/1; MgSO4.7H20 0,2 g/1; CuSO4.5H20 0,5 mg/1; H3BO3 05 mg/1; NaMo04.2H20 0,5 mg/1; CoCl2.6H20 0,5 mg/1; биотин 0,5 mg/1, захароза 20 g/1; (pH 8,0, стерилизира се 20 минути при 120°С). След стерилизацията се добавя 1 mg/1 тиамин.
Културата се инкубира 4 дни при 37°С. След 4 дни, 1 ml от културата се разрежда в 100 ml от същата среда и се инкубира за 4 дни. След 4 дни културата се нанася върху РВТ блюда с минимална среда, съдържаща допълнително 0,4% казеин и 15 g/1 arap. Колонии, при които липсва откриваемо протеазно петно, се разглеждат като протеазен минус и се проверяват за липса на гена, кодиращи РВТ110 алкална протеаза.
Г) Охарактеризиране на протеазно негативни щамове.
Щамове, които не проявяват откриваемо петно върху блюдата с казеин, описани в предходната точка, се изпитват най-напред за наличност на чувствителност към неомицин и за аспорогенен фенотип. Bacillus РВТ 125 и РВТ 126, които съдържат протеазно негативен и аспорогенен фенотип, се изпитват за продукция на протеаза в колби за разклащане от 500 ml, съдържащи 100 ml среда за продукция на протеаза, както е описано в патент на US № Re 30,602. Никой щам не продуцира откриваеми количества протеаза.
Генетичната организация на двата щама се определя чрез рестрикционен ензимен анализ и хромозомен blotting и това е посочено на фигура 4. Осъществила се е не хомоложна, а илегитимна рекомбинация, при което се получават два щама с напълно отстранени гени за протеаза и за резистентност към неомицин. Все пак е останал малък плазмиден фрагмент в хромозомата след отстраняването на гена на протеазата. Последователността на този фрагмент се определя, както следва. Хромозомните Hind III фрагменти на щамове РВТ125 и РВТ 126, съдържащи плазмида хромозомните свързвания се лигират във фагов вектор М13 тр 18 (Messing и сътр. Nucl. Acids Res. 9 (1981) 303-321 и се трансфектират върху E.coli JM101 съгласно процедурата, описана от Cohen и сътр. Proc.Natl. Acad.Sci, САЩ 69 (1972) 2110-2114. След размножаване на фага в E.coli JM101 се изолира SSDHK (Heidecker и сътр. Gene 10 (1980) 69-73).
Инсъртите се секвенират по метода, описан от Sanger и сътр., Proc. Natl.Acad.Sci 74 (1977) 6463. Резултатите са посочени съответно на фигури 5А и 5В.
Пример 3. Конструиране на векторите за продукция на протеаза и за мутации.
А) Субклониране на РВ92 протеазния ген във фаг М13 тр18.
Плазмид рМ58 се смила с Hpai и Bali. След пречистване на ДНК фрагмента, съдържащ протеазния ген (Maniatis, 1982) този фрагмент се лигира във фаг М13 шр!8, който се смила с Smal. Сместа за лигиране се трансфектира в E.coli JM101 (Cohen и сътр., виж по-горе). След размножаване на фага в E.coli JM101, се изолира ds ДНК по метода, описан от Bimboim и Doly (Nucl Acids Res. Ί (1979) 1513-1523). Инсъртът и неговата ориентация се проверяват чрез рестрикционен ензимен нализ. Векторът mpl8 MXL се използва за следващите експерименти на субклониране и това е посочено на фигура 6.
Б) Субклониране на РВ92 протеазен ген в плазмид pBHAl
Фигура 7 показва нуклеотидната последователност на плазмид pBHAl. Този плазмид произхожда от двойна векторна система рМа/ с5-8, описана от Stanssens и сътр., (Nucl-Acids Res. 17 (1989) 4441-4454), в която е вкаран един допълнителен промотор. Плазмидът ВНА1 се състои от следните фрагменти:
pos 111-105: бактериофаг FD, краен pos 121-215: бактериофаг FD, краен pos 221-307: част от плазмид pBR322 (позиции 2069-2153);
pos 313-768: бактериофаг F1, начало на репликация (виж pos 5482-5943;
pos 772-2571: част от плазмид pBR322, именно началото на репликация и β-лактамазния ген;
pos 2572-2685: Транспозон Тп903, цялия геном;
pos 2719-2772: триптофанов терминатор (двоен);
pos 2773-3729: транспозон Тп9, хлорамфеникол-ацетил-трансферазен (cat) ген. Нуклеотидите от pos 3005 (А), 3038 (С), 3302 (А) и 3409 (А) се различават от дивия тип cat кодираща последователност. Мутациите се въвеждат, за да се елиминират Ncoi, Bali, EcoRi и Pvu II сайтовете;
pos 3730-3804: мултиплен клониращ сайт;
pos 3807-7164: част от плазмид PUB110 (именно репликационната функция и гена за резистентност към канамицин, EcoRi-Pvu II фрагмент) (McKenzie и сътр., Plasmid 15 (1986) 93-103 и plasmid 17 (1987) 83-85);
pos 7267-7331: мултиклониращ сайт.
Фрагментите се комбинират, като се използват известни методи на клониране, например запълване на лепливите краища с Klenow, клониране с адаптор и др. Всичките данни са получени от GenbanK“ National Nucleic Acid Sequence Data Bank’NIH, САЩ.
Плазмид pMc5-8 е депозиран като DSM 4566.
Преди процеса на мутация двойната векторна система рВНА/С-1 се модифицира, за да се получи двойна векторна система pBHARBMXL/pBHCRB-MXL, както следва:
1. Вектор mpl8-MXL се смила с Kpni и Hindi. ДНК фрагментът, съдържащ протеазния ген, се пречиства и лигира в pBHAl, който се смила с EcoRV и Kpni. Лигационната смес се трансформира в E.coli JM101 (Maniatis, 1982), като се посяват върху LC+ блюда, съдържащи 10 g/Ι триптон, 5 g/Ι екстракт от дрожди (Difco), 8 g/I натриев хлорид, 25 mg/1 тиамин, 1 g/1 MgSO4.7H20, 100 pg/ml ампицилин и 20pg/ml неомицин pH 7,0. Плазмидната ДНК на трансформантите се изолира (Bimboim, виж по-горе) и охарактеризиран чрез рестрикционен ензимен анализ. По този начин се изолира рВНА-1-MXL (виж фигура 8).
2. С оглед да се секвенират мутациите, въведени в протеазния ген с наличен набор олигонуклеотиди, е необходимо да се обърне ориентацията на F1-началото, спрямо протеазния ген. Това се осъществява по следния начин. Плазмидът pBHAl-MXL се смила с BamHI и повторно се лигира. Лигационната смес се трансформира в E.coli WK6 (Maniatis, виж по-горе), като се селекционират за резистентност към неомицин или ампицилин върху LC* блюда, съдържащи 10 g/Ι триптон, 5 g/Ι дрождев екстракт (Difco), 8 g/Ι натриев хлорид, 25 mg/1 тиамин, 1 g/1 MgSO4.7H20, 100 pg/ml ампицилин и 20 pg/ml неомицин pH 7,0. Плазмидната ДНК на трансформантите се изолира (Bimboim, виж по-горе) и охарактеризира чрез рестрикционен ензимен анализ. По този начин се изолира pBHAR-MXL, който се различава от рВНАMXL по това, че ориентацията на последователността от E.coli е обратна (виж фиг. 9).
3. За въвеждането на допълнителни крайни последователности в плазмид pBHAR-MXL, се извършват следните смилания със Sph I и Hind III. Плазмид pBHAR-MXL (фигура 10) се смила със SpH I и Hind III. По-големият фрагмент се пречиства. Двата продукта на сми лането се лигират и трансформират в В.Subtilis DB104, като се селекционират според резистентност към неомицин и протеазна активност върху минимални блюда, съдържащи 10 g/1 неомицин и 0,4% казеин. Трансформантите се охарактеризират чрез рестрикционен ензимен анализ. Един от тях, pBHARB-MXL (фигура 10) се използва за следващи опити.
В) Мутагенез на РВ92 гена в плазмид pBHARB-MXL. Мутагенезът се извършва с двойна векторна система pBHARB-MXL/ pBHCRB-MXL (Stanssens, виж по-горе).
Използва се метод, базиран на подхода gapped-duplex (Kramer и сътр., Nucl.Acids Res. 12 (1984) 9441) и един плазмид (фаг/хибриден плазмид). По същество методът почива на междинна gapped-duplex ДНК, състояща се от единичен участък (- верига), съдържаща маркер за дивия тип резистентност към антибиотици и двуверижен участък (+ верига) , носеща amber-мутация в гена, придаващ резистентност към антибиотик. След хибридизация мутагенният олигонуклеотид се инкорпорира в едноверижния участък in vitro по време на реакцията на запълване на празнината и на слепване. Получените молекули се използват за трансформиране на недостатъчно поправен (Muts) гостоприемник, в който връзката между желаната мутация и маркера за резистентност към антибиотик е запазена. Смесената плазмидна популация, изолирана от този щам, се оставя да се раздели на супресор-негативен щам гостоприемник. Трансформантите се посяват върху съдържаща антибиотик среда, като с това се предлага селекциониране на потомство, получено от веригата с празнини.
В рМа тип вектор нуклеотидът 3409 се променя от G на А, докато в рМс тип вектор нуклеотидът 2238 се променя от G на С, създавайки amber-стопкодони, съответно в хлорамфеникол-ацетилтрансферазния ген и в βлактамазния ген, като посочените гени стават неактивни.
За извършване на мутагенеза ДНК фрагментът мишена се клонира в сайта за мултиплено клониране на рМа5-8 или на негово производно. Тогава се конструира единичендвоен (дуплекс) участък между рМа5-8, съдържащ ДНК фрагмента мишена и рМс5-8.
Едноверижната празнина, състояща се от ДНк-мишена, може да бъде подложена на мутагенеза с мутагенен олигонуклеотид, с дълги синтетични олигонуклеотиди с ниско равнище на неправилно включени нуклеотиди, при използване на химическо или ензиматично неправилно включване на нуклеотиди. За подробно описание виж Ausubel и сътр., 1987, Current Protocols in Molecula Biology, New York или B.Perbal, 1988, Apractical Guide to Molecular Cloning, II ed., New York.
Г) Конструиране на вектори за продукция на индустриална протеаза.
След въвеждане на желаната мутация/ ии в плазмид pBHARB-MXL нежеланите последователности на E.coli от плазмид се отстраняват чрез делеция, както следва: плазмид PBHARB-MXL, съдържащ съответната мутация, се смила с BamHi и повторно се лигира в условия на разреждане. Лигационната смес се трансформира в B.subtilis DB104, който се селекционира за резистентност към неомицинова и протеазна активност върху минимални блюда, съдържащи 20 pg/ml неомицин и 0,4% казеин. ДНК на трансфермантите се изолира и охарактеризира чрез рестрикционен ензимен анализ.; По този начин се изолират вектори с липсваща от ДНК E.coli, които са подходящи за търговско производство на протеини.
Описаната процедура е пояснена на фигура 11, като мутацията M216Q е посочена като пример, при което се получава плазмид pBHB-MXL M216Q. M216Q а също M216S, S160D и N212D посочени по-нататък, са мутантни протеази от Bacillus РВ92, описан в ЕРА-0328229.
Пример 4.
Протопластна трансформация на Bacillus РВТ125 чрез производни на плазма рВНВMXL.
Bacillus щам РВТ125 се трансформира с плазмид pBHB-MXL или плазмиди, получени от него, съдържащ мутантни протеазни гени, последвано от процедура на трансформиране, описана в ЕР-А-0284126. Преди да се изследват за продуктивност, трансформантите се проверяват чрез рестрикционен анализ дали съдържат подходящия плазмид.
Пример 5. Конструиране на протеазни интеграционни вектори.
А) Интеграционен вектор ρΕΝ30. Плазмид рЕ194 пео-1 (ЕР-А-0284126) се смила със Sall и се религира. Лигационната смес се трансформира в B.subtilis DB104 и се селекционира за резистентност към неомицин върху вини блюда, съдържащи 20 pg/ml неомицин. Плазмид рЕ194 пео-3 се изолира и се изследва за наличност на ген за резистентност към неомицин при обратното ориентиране (виж фигура 12). Плазмид рЕ194 пео-3 се смила с Hpal и BgHI. Пречиства се фрагментът, съдържащ температурно чувствителното начало на репликация (Maniatis, виж по-горе).
Плазмид pBHB-MXL M216Q (виж пример 3 и фигура 11) се смила с Bglll и Ball. Пречиства се фрагментът, съдържащ протеазния ген. Двата фрагмента се лигират. Лигационната смес се трансформира в B.subtilis DB104 и се селекционира за протеазна активност и резистентност към неомицин, както е описано погоре. Трансформантите се охарактеризират чрез смилане с рестрикционни ензими. Един от тях, съдържащ плазмид pEN3Q, се селекционира (фигура 13). Този плазмид съдържа гена за резистентност към неомицин, t.s. началото на репликация от плазмид рЕ194пео-3 и M216Q мутацията в РВ92 протеазния ген.
Б) Интеграционен вектор pEN3S. По същия начин, както е описано за интеграционен вектор pEN3Q, се конструира PEN3S при използването на pBHARB-MXL като изходен вектор.
Пример 6. Конструиране на Bacillus щамове РЕР111 и РЕР112.
А) Протопласт на трансформиране на Bacillus РВТ110 с плазмид pEN3Q. Щам Bacillus РВТ110 се трансформира с плазмид pEN3Q, както е описано в ЕР-А-0284126. Преди експериментите за интегриране се проверява чрез рестрикционен ензимен анализ дали трансформантите съдържат подходящия плазмид.
Б) Интегриране на pEN3Q в Bacillus РВТ110 хромозомата. Експериментите за интеграция с плазмид pEN3Q в хромозомата на Bacillus щам РВТ110 се извършват, както е описано в ЕР-А-0284126. Селекция на интегранти се осъществява при концентрация на неомицин 1 pg/ml при недопустима температура (50°С) за репликация на плазмид. За преценяване интеграцията на pEN3Q в хромозомата се изолира хромозомна ДНК от потенциалните интегранти, смила се с Hind III или Clal, нанася се върху 0,8% ДНК-агарозен гел и се подлага на beoHing върху нитроцелулозна мембрана (Soutpm, J.Mol.Biol. 98 (1975) 503517), след което се хибридизира с 32Р беляза на nick транслирана pEN3Q ДНК (Maniatis, 1982).
Става ясно, че интегрирането на pEN3Q се осъществява чрез хомоложна рекомбинация, при което се получава щам (PBT110M/Q), с два протеазни гена (един див тип и един мутантен M126Q), разположени тандемно в хромозомата. Интегрирането на pEN3Q се получава чрез така наречения Камбел-тип механизъм, както е посочено на фигура 14 (виж също ЕР-А-0284126).
В) Селекциониране на чувствителни на неомицин рекомбинанти.
Селекционират се чувствителни към неомицин рекомбинанти, които съдържат или див тип или мутантен протеазен ген в хромозомата (наричани след това “външни-рекомбинанти”). Процедурата на селекциониране е подобна на процедурата, описана по-горе в пример 2С.
Като изходен щам се използва щамът РВТ110 М/Q. След като щам РВТ110 М/Q се инкубира в РВТ минимална среда, културата се посява върху минимална среда в блюда, съдържаща 0,4% казеин и 15 g/1 arap. Тези блюда се инкубират 48 h при 37°С и се прави препечатка върху сърдечна инфузия (HI) в блюда, съдържащи 1 pg/ml неомицин и съответно без неомицин. Чувствителните към неомицин колонии се разглеждат като външни-рекомбинанти.
Г) Охарактеризиране на чувствителните към неомицин рекомбинанти.
Хромозомната ДНК на потенциалните външни-рекомбинанти се изолира, смила се с Clal или Hindlll, нанася се върху 1,5% агарозен тел, ДНК се пренася върху нитроцелулозна мембрана (Southern, 1975) и се хибридизира с белязан с 32Р nick-транслирана pEN3Q (Maniatis, 1982). Тъй като в резултат на мутация M216Q се получава отстраняване на Clal сайта, щамовете, съдържащи див тип протеаза или мутантен протеазен ген, и междинния щам РВТ110 М/Q, лесно могат да бъдат различени (виж фигура 14).
Изолира се външен-рекомбинат, съдържащ M216Q мутантния протеазен ген на РВ92. След доказване, че е настъпило генното заместване на РВ92 див тип протеаза с РВ92 мутантна протеаза, продуктът на щама се охарактеризира по неговите биохимични параметри (Ки(, Кв), по резистентност на окисляване, специфична активност и миещи качества, както е описа но в ЕР-А-0328229. Всички резултати са еднакви с тези на контролна протеаза M216Q, което показва че продуктът на трансформирания щам е действително РВ92 протеазата, съдържаща M216Q мутацията. Този трансформиран щам е наречен Bacillus РЕР111.
Подобни експерименти се извършват и при използване на вектор PEN3S за конструиране на Bacillus щам РЕР112, който съдържа РВ92 протеазата с мутация M216S.
Пример 7. Конструиране на Bacillus щамове РЕР211 и РЕР212. Щам Bacillus РЕР111 се трансформира с плазмид PEN3Q, според процедурата, описана в ЕР-А-0284126. Преди процедурата на интегриране се изследва чрез рестрикционен ензимен анализ дали трансформантите съдържат подходящия плазмид. Интеграционната процедура и селекционирането на интегрантите (при концентрация на неомицин от 20 pg/ml и недопустима температура (50°С) за плазмидна репликация) се извършват, както е описано в ЕР-А-0284126.
За да се прецени интегрирането на плазмид pEN3Q в хромозомата, се изолират хромозомна ДНК от потенциалните интегранти и се смила с Hind III, нанася се върху 0,8% агарозни гелове, провежда се blotting върху нитроцелулозна мембрана (Southern и сътр., 1979) и се хибридизира с белязан с 32Р nick-транслиран pEN3Q. Установява се, че се изолира един щам, съдържащ два мутанта (M216Q)PB92 протеазни гени, разположени поотделно върху хромозомата. Този щам се нарича РЕР211. Неговата хромозомна организация е посочена на фигура 15.
За получаване на аналогичен щам, съдържащ два протеазни гена с мутация M216S, щам РЕР212, съдържащ един мутантен ген (M212S) след генно заместване на дивия тип ген, се трансформира с плазмид pEN3Q и се следват процедурите, както е описано по-горе. В резултат на тези експерименти е получен щам РЕР212, съдържащ два отделно разположени РВ92 мутантни M216S протеазни гена върху хромозомата.
Пример 8. Получаване на мутантни протеази. Получаването на протеазни мутанти се извършва с трансформирани щамове Bacillus, в които мутантният кодиращ протеаза ген е разположен или върху плазмид или върху хромозомата.
За плазмидно кодирана продукция се из ползват два типа щамове, алкалофилен щам Bacillus РВТ125 съгласно изобретението и B.subtilis щам DS 12367, един аспорогенен щам, получен от B.subtilis DB104 (Kawamura и сътр. J.Bacteriol. 160, 1984) 442-444). Тези щамове се трансформират с pBHB-MXL производни плазмиди. Bacillus РВТ125 и B.subtilis DS 12367, които не съдържат кодиращи протеаза плазмиди, се използват като контролни щамове.
За продукция със щамове, съдържащи интергирани в хромозомата мутантни протеазни гени, се използват Bacillus PEP щамове, както е описано тук. Щамове Bacillus РВТ 108 и 110, съдържащи дивия тип протеазни гени, се използват като контролни щамове. РВТ 108 е щам, съдържащ два див тип гени, разположени поотделно върху хромозомата (виж ЕРА-0284126). За РВТ110 виж пример 2А.
За преценяване активността на изходния промотор на РВ92 протеазния ген в B.subtilis, се изработва конструкт pBHB-MXLR, в който ориентацията на протеазния ген спрямо Hpall промотора (Zyprian и сътр., DNA 5 (1986) 219-225) е обърната обратно, така че експресията на протеазния ген е само насочена от нейния изходен промотор.
Получаването се осъществява в колби от 500 ml, съдържащи 100 ml среда за продукция на протеаза.
При използване на алкалофилни щамове Bacillus след инокулиране, културите се инкубират за 40 h при 37°С в производствена среда, както е описано в патент на US Re 30 5 602. В случай на щамове, съдържащи плазмид, се добавя неомицин (2- μg/ml). При използване на щамове B.subtilis DS 12367, се използва сравнителна среда, съдържаща 12,5 g/1 дрождев екстракт (Difco) 0,97 g/1 СаС12.6Н20, 2,25 g/1 MgCl2.6H20, 20 mg/1 MnSO4.4H20, 1 mg/1 CoCl2.6H20, 0,5 g/1 цитрат, 0,5 ml противоразпенващо средство 5693,6% обем/обем малтоза, 0,2 М фосфатен буфер pH 6,8. В случай на щамове, съдържащи плазмид се добавя неомицин (20pg/ml).
Култури, съдържащи щамове B.subtilis, се инкубират 65 h при 37°С. Във всички случаи колбите се инокулират с 0,1 ml култура с трипсинова соева среда с 20 pg/ml неомицин, съдържаща подходящия щам, който е бил инокулиран 24 Н при 37°С.
Протеазната активност се изследва при използване на диметилказеин като субстрат, както е описано от Lin и сътр., J.Biol.Chem. 244 (1969) 789-793. Специфичните активности на протеазните мутанти (ЕР-А-0328229) се използват за определяне продукцията на база милиграм.
Резултатите от ферментационните експерименти са обобщени в следната таблица 1.
Таблица 1
Щам Относителна продукция на протеаза Мутация
РВТ110 100% WT
РВТ125 0% -
РВТ108 120% WT
РЕР111 100% M216Q
РЕР112 100% M216S
РВТ 125 pBHB-MXL 5-100% WT
РВТ125 pBHB-MXL M216Q 95-100% M216Q
РВТ125 pBHB-MXL M216S 95-100% M216S
РВТ125 pBHB-MXL S160D 95-100% S160D
PBT125 pBHB-MXL N212D 95-100% N212D
PEP211 120% M216Q
PEP212 120% M216S
DS12367 0-1% -
DS12367 pBHB-MXLR 4% WT
Таблица 1 (продължение)
DS12367 pBHB-MXL 40% WT
DS12367 pBHB-MXL M216Q 40% M216Q
DS12367 pBHB-MXL M216S 40% M216S
DS 12367 pBHB-MXL S160D 40% S160D
DS12367 pBHB-MXL N212D 40% N212D
Описаните примери и данни поясняват изобретението, без да го ограничават.

Claims (21)

  1. Патентни претенции
    1. Метод за получаване на протеази, различаващи се най-малко по една аминокиселина от див тип протеаза, характеризиращ се с това, че се използва хомоложен алкалофилен щам Bacillus като експресионен гостоприемник, който е неспособен да продуцира див тип протеаза.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва като експресионен гостоприемник един протеазно негативен алкалофилен щам Bacillus.
  3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че се използва като експресионен гостоприемник протеазно негативен алкалофилен щам Bacillus, при което гена на дивия тип протеаза се отстранява от генома.
  4. 4. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че се използва един протеазно негативен щам, производен на Bacillus novo species РВ92.
  5. 5. Метод съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризиращ се с това, че се използва аспорогенен алкалофилен щам Bacillus.
  6. 6. Метод съгласно всяка от претенциите от 1 до 5, характеризиращ се с това, че се използва аспорогенен Bacillus, от който е отстранен генът на дивия тип протеаза чрез хомоложна или илегитимна рекомбинация.
  7. 7. Метод съгласно всяка от претенциите от 1 до 6, характеризиращ се с това, че мутантната силно алкална протеаза е кодирана плазмидно.
  8. 8. Метод съгласно претенциите 1, 2 или 3, характеризиращ се с това, че дивият тип силно алкална протеаза има по същество ами- нокиселинната последователност на протеазата на Bacillus novo species РВ92.
  9. 9. Метод съгласно претенции от 1 до 6, характеризиращ се с това, че генът на дивия тип силно алкална протеаза, е отстранен от хромозомата и е вкарано в генома най-малко едно копие на мутанта на гена на силно алкалната протеаза.
  10. 10. Метод съгласно претенциите от 1 до 6, характеризиращ се с това, че гена на дивия тип силно алкална протеаза е заместен от наймалко едно копие на гена на мутантната високо алкална протеаза.
  11. 11. Метод съгласно претенции 9 или 10, характеризиращ се с това, че най-малко едно копие на гена на мутантна силно алкална протеаза е включено в генома, а друго копие е с плазмидно кодиране.
  12. 12. Метод за получаване на алкалофилен щам Bacillus с понижено съдържание на извънклетъчна силно алкална протеаза, характеризиращ се с това, че се изолира ген, вкл. 5' и/или 3' некодиращата му област, кодиращ за силно алкална протеаза, който се инсертира в клониращ вектор, след което се отстранява кодиращата област на гена на клониращия вектор, и който се трансформира щам Bacillus, като трансформантите се култивират при условия, при които репликативната способност на вектора е неактивна и се селекционира трансформантите, които са загубили ДНК последователността, кодираща за алкалната протеаза.
  13. 13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че алкалофилният щам Bacillus е Bacillus novo species РВ92 или производен на него.
  14. 14. Алкалофилен щам Bacillus, продуцент на алкална протеаза, трансформиран с . ..JiSAi:. .' J·. ' ? ’ЗЖЖ плазмиден експресионен вектор, съдържащ мутантен ген на алкална протеаза.
  15. 15. Щам Bacillus съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че алкалофилният щам Bacillus е производен на Bacillus novo species РВ92, получен чрез хомоложна или илегитимна рекомбинация.
  16. 16. Силно алкална протеаза без примеси от див тип силно алкална протеаза, различаваща се по най-малко една аминокиселина от дивия тип протеаза, продуцирана от щам Bacillus, имаща най-малко едно копие на мутантния ген и без нито едно копие на дивия тип ген, даващ активна протеаза.
  17. 17. Силно алкална протеаза съгласно претенция 16, характеризираща се с това, че е получена от алкалофилен щам Bacillus.
  18. 18. Силно алкална протеаза съгласно претенциите 16 или 17, характеризираща се с това, че мутантният ген се намира върху плазмид и/или в генома.
  19. 19. Детергентен състав, характеризиращ 5 се с това, че съдържа като активна съставка една или повече алкални протеази съгласно всяка една от претенциите от 16 до 18.
  20. 20. Приложение на една или повече силно алкални протеази съгласно всяка една от претенциите от 16 до 18, характеризираща се с това, че се използва в детергентен състав.
  21. 21. Приложение на една или повече мутанА силно алкални протеази съгласно всяка една от претенциите от 16 до 18, характеризираща се с това, че се използва в перилния процес.
BG92653A 1989-08-11 1990-08-08 Метод за получаване на мутантни протеази BG60567B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP89202117 1989-08-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG92653A BG92653A (bg) 1993-12-24
BG60567B1 true BG60567B1 (bg) 1995-08-28

Family

ID=8202457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG92653A BG60567B1 (bg) 1989-08-11 1990-08-08 Метод за получаване на мутантни протеази

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20040014175A1 (bg)
EP (1) EP0414297B1 (bg)
JP (1) JP3490435B2 (bg)
KR (1) KR0169978B1 (bg)
CN (1) CN1049866A (bg)
AT (1) ATE144283T1 (bg)
AU (1) AU629970B2 (bg)
BG (1) BG60567B1 (bg)
BR (1) BR9003956A (bg)
CA (1) CA2023094C (bg)
DD (1) DD297187A5 (bg)
DE (1) DE69028890T2 (bg)
DK (1) DK0414297T3 (bg)
ES (1) ES2095233T3 (bg)
FI (1) FI110365B (bg)
GR (1) GR3021669T3 (bg)
IE (1) IE77037B1 (bg)
PT (1) PT94961B (bg)
RU (1) RU2060276C1 (bg)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4304161A1 (de) * 1993-02-12 1994-08-25 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verbesserte hochalkalische Proteasen
DK0772684T3 (da) 1994-06-17 2005-12-12 Genencor Int Amylolytiske enzymer afledt fra B. Licheniformis alpha-amylasen med forbedrede karakteristika
DK0894126T3 (da) * 1996-03-27 2006-06-12 Novozymes As Alkalisk phosphatase-deficient trådformet svamp
JP3440694B2 (ja) * 1996-05-16 2003-08-25 ライオン株式会社 口腔用組成物
GB0024554D0 (en) 2000-10-06 2000-11-22 Agrol Ltd Ethanol production
US8124399B2 (en) * 2002-03-29 2012-02-28 Danisco Us Inc. Enhanced protein expression in Bacillus
WO2006088972A2 (en) 2005-02-16 2006-08-24 The General Hospital Corporation Use of modulatirs of compounds of tgf-beta superfamily to regulate hepcidin-mediated iron metabolism
RU2511416C1 (ru) * 2012-10-24 2014-04-10 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАО ВПО КФУ) Штамм бактерий bacillus pumilus 2a-5 с низкой протеолитической активностью, повышенной активностью фосфатазы, способ его получения и применения
RU2510821C1 (ru) * 2012-10-24 2014-04-10 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет" (ФГАОУ ВПО КФУ) Штамм бактерий bacillus pumilus мк-10 с низкой протеолитической активностью и его применение

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1234445A (bg) * 1967-10-03 1971-06-03
JPS6055118B2 (ja) * 1982-02-08 1985-12-03 昭和電工株式会社 新規な細菌アルカリプロテア−ゼ及びその製造方法
NZ208612A (en) * 1983-06-24 1991-09-25 Genentech Inc Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
AU620326B2 (en) * 1987-02-27 1992-02-20 Dsm Ip Assets B.V. Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms
EP0479396B1 (en) * 1987-02-27 1999-06-09 Genencor International, Inc. Transformation of alkalophilic bacillus strains
CN1056187C (zh) * 1988-02-11 2000-09-06 金克克国际有限公司 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20040014175A1 (en) 2004-01-22
CA2023094A1 (en) 1991-02-12
BG92653A (bg) 1993-12-24
CA2023094C (en) 2000-03-28
JPH03210177A (ja) 1991-09-13
PT94961A (pt) 1991-04-18
RU2060276C1 (ru) 1996-05-20
DD297187A5 (de) 1992-01-02
IE77037B1 (en) 1997-11-19
FI110365B (fi) 2002-12-31
KR0169978B1 (ko) 1999-02-01
IE902904A1 (en) 1991-02-27
EP0414297B1 (en) 1996-10-16
PT94961B (pt) 1997-05-28
GR3021669T3 (en) 1997-02-28
CN1049866A (zh) 1991-03-13
EP0414297A1 (en) 1991-02-27
ES2095233T3 (es) 1997-02-16
JP3490435B2 (ja) 2004-01-26
KR910004805A (ko) 1991-03-29
AU629970B2 (en) 1992-10-15
FI903927A0 (fi) 1990-08-08
DK0414297T3 (da) 1997-07-07
DE69028890T2 (de) 1997-02-27
DE69028890D1 (de) 1996-11-21
AU6096190A (en) 1991-02-14
BR9003956A (pt) 1991-09-03
ATE144283T1 (de) 1996-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2590247B2 (ja) スブチリシンアナログ
JP2599946B2 (ja) ズブチリシン類似体
JP3026567B2 (ja) 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現
US5352604A (en) Alkaline proteolytic enzyme and method of production
JP2594533B2 (ja) 変異ザブチリシンを製造する方法
EP0398539B1 (en) Multiply mutated subtilisins
US5093257A (en) Hybrid prokaryotic polypeptides produced by in vivo homologous recombination
RU2091487C1 (ru) Способ получения штамма bacillus, содержащего две копии последовательности днк, кодирующей фермент с гидролазной активностью
JP2001514529A (ja) プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸
WO1997003185A1 (en) Production of proteins using bacillus incapable of sporulation
BG60567B1 (bg) Метод за получаване на мутантни протеази
JP2501779B2 (ja) アルカリプロテア―ゼの製造方法
JPH01141596A (ja) アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子系
JPS62500215A (ja) 細胞外プロテア−ゼレベルが低下したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株