CN104877019A - 鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制备方法和应用 - Google Patents

鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种A1S_1523的重组蛋白及其制备方法和应用，该重组蛋白包含A1S_1523成熟肽，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

Description

鲍曼不动杆菌假定蛋白A1S_1523的蛋白及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及鲍曼不动杆菌假定蛋白A1S_1523蛋白及制备方法和应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanni i)是一种常见的非发酵革兰阴性杆菌，在自然界中广泛存在，可正常定植于人体皮肤表面及腔道内，为条件致病菌，主要可导致肺炎、血流感染、皮肤及软组织感染、心内膜炎以及脑膜炎等。随着其耐药菌株检出率的逐年增高，鲍曼不动杆菌在全球范围内已成为一种重要的病原菌，据美国NHSN(Nat ional Healthcare Safety Network)的报告，2009至2010年间，其监测到的各类院内感染分离到的鲍曼不动杆菌菌株中，多重耐药(MDR)株占到了65％。我国CHINET细菌耐药监测网数据显示，2010年我国10个省市的14家教学医院中，临床分离的鲍曼不动杆菌占所有革兰阴性杆菌的16.11％，位列第三。此外，鲍曼不动杆菌也是军人作战中受到战创伤相关感染的重要致病菌，美军在***、科威特以及阿富汗参加战斗的伤员中有很高的检出率。
由于鲍曼不动杆菌耐药性逐年增强，普通抗生素对它的治疗作用已不明显，找到新的治疗方案或新型有效药物来对抗鲍曼不动杆菌的感染，特别是多重耐药鲍曼不动杆菌的感染已成为刻不容缓的任务。介于新的抗生素发展缓慢，而且鲍曼不动杆菌耐药性适应迅速，许多微生物研究学者开始尝试利用鲍曼不动杆菌全菌外膜外膜囊泡或外膜蛋白的免疫原性，诱导机体产生抗鲍曼不动杆菌免疫，从与抗生素完全不同的角度，寻求有效的对抗耐药鲍曼不动杆菌的新手段。
目前，多个研究已经证明:灭活全菌外膜蛋白外膜蛋白囊泡和外膜具有良好的免疫原性和抗原性，他们免疫小鼠的能抵抗鲍曼不动杆菌的感染和侵袭，但从安全性等方面综合考虑，外膜蛋白比全菌更为安全，因此，外膜蛋白可能是抗鲍曼不动杆菌的最佳候选抗原之一。
发明内容
本发明提供一种鲍曼不动杆菌假定蛋白A1S_1523重组蛋白，该重组蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全，可以直接与佐剂配合使用，用于制备抗鲍曼不动杆菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。
本发明利用反向疫苗学筛选出一种假定蛋白A1S_1523，该蛋白由196个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其DNA序列如SEQ ID NO.6所示。利用生物信息学对A1S_1523蛋白进行结构功能分析，发现A1S_1523是一种分泌蛋白，由1-21位氨基酸组成的信号肽引导分泌至胞外(附图6所示)。本发明利用A1S_1523蛋白的成熟肽，设计一种亚单位疫苗。
本发明的技术方案具体如下：
鲍曼不动杆菌A1S_1523重组蛋白，包含A1S_1523成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述A1S_1523蛋白的N端。
所述重组蛋白的氨基酸序列还包括在SEQ ID NO.1的氨基端和/或羧基端缺失、替代、和/或添加了1－20个氨基酸残基的具有免疫原性的变体，该变体与所述氨基酸序列具有至少80％的同一性。
该重组蛋白由融合表达并酶切后在权利要求1所述的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。
编码A1S_1523重组蛋白的多核苷酸。
A1S_1523重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)设计PCR的引物如下：
正向引物
5'-CGCGGATCCGACTATAAAATGATCCAACACA-3'
BamHⅠ
反向引物
5'-TTATGCGGCCGCTTATTTTTTAGCTGCACTAGCC-3'
NotⅠ
2)使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码A1S_1523蛋白目的基因片段；
3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；
4)诱导转化后的宿主菌表达A1S_1523重组蛋白；
5)纯化重组蛋白。
表达载体或宿主细胞，包含编码A1S_1523重组蛋白的多核苷酸或宿主细胞。
所述载体是pGEX-6P-2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XL1-Blue。
抗A1S_1523蛋白的抗体。
本发明所述A1S_1523重组蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。以及
A1S_15230重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
本发明采用基因工程技术克隆表达此保护性抗原A1S_1523重组蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。A1S_1523重组蛋白可以直接与佐剂(如Al(OH)3佐剂、AlPO4佐剂、MF59、AS03、AS04、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂等)配合使用，优选AlPO4佐剂用于肌肉注射免疫。
本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下6个优点：
1.A1S_1523蛋白及从A1S_1523蛋白均未用于重组亚单位疫苗领域，能够有效激发机体引起保护性免疫应答，从而抵御鲍曼不动杆菌致死性感染；
2.A1S_1523蛋白的表达质粒在原核表达***(大肠杆菌)中诱导表达，表达量高，质量安全可控；
3.选择pGEX-6p-2表达载体，A1S_1523重组蛋白以融合蛋白形式表达，最大限度保持了其原有的空间构象；
4.所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；
5.A1S_1523融合蛋白表达率约为30％，纯化后的A1S_1523融合蛋白纯度大于95％；
6.A1S_1523融合蛋白能够诱导动物产生特异性的抗体。
利用本发明A1S_1523融合蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组单价亚单位疫苗具有良好的抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。
为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
附图说明
图1是A1S_1523基因片段的PCR扩增结果，其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道1-2：A1S_1523基基因片段(540bp)的PCR扩增产物；
图2为表达载体pGEX-6p-2-A1S_1523的酶切鉴定结果：其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道4-6：重组表达质粒pGEX-6p-2-A1S_1523经酶切后的鉴定结果，其中泳道4-6均表示酶切后分离的片段4000bp和540bp；
图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果：其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：1号重组工程菌在16℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白；泳道2：1号重组工程菌在30℃下诱导表达后，在上清中获得的融合蛋白。
图4表示1号重组工程菌在30℃下诱导表达后获得的融合蛋白，其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：酶切后，非特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上的融合蛋白(a)、特异性结合在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上的酶(b)和GST标签(b)、目的蛋白(c)；泳道2：酶切后，获取的目的蛋白(箭头所示)；泳道3：酶切前，获取的含A1S_1523-GST融合蛋白(箭头所示)；
图5表示纯化后的目的蛋白，其中，泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：纯化后，获取1号重组工程菌表达的A1S_1523重组蛋白；泳道2：纯化后，获取2号重组工程菌表达的A1S_1523重组蛋白；
图6利用在线信号肽分析软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/对A1S_1523蛋白信号肽预测结果图，结果表明1-21氨基酸为信号肽序列；
图7重组表达载体测序后与假定蛋白的DNA序列对比结果，结果表明DNA序列与理论完全一致。
具体实施方式
本发明所使用的菌株与各种试剂如下：
1.菌株
鲍曼不动杆菌17978国际标准株由美国ACTT提供；
2.试剂
质粒pGEX-6p-2(购于GE公司)、pET-22b(购于Novagen公司)和大肠杆菌菌株XL-1blue(购于普如汀公司)由申请人微生物教研室保存；
primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、DNA Ligat ion Mix、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品；
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；
细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。
实施例1：鲍曼不动杆菌A1S_1523蛋白的克隆
1.首先根据鲍曼不动杆菌17978标准株A1S_1523氨基酸序列，应用生物信息软件进行结构分析，分析结果参见附图6，从而确定需要扩增的A1S_1523蛋白的基因片段。
2.根据分析结果，采用PCR方法以鲍曼不动杆菌17978全基因组为模板扩增A1S_1523蛋白的基因片段，扩增步骤如下：
1)设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO.7-8(下划线示酶切位点碱基序列)
正向引物PA1S1523B1：SEQ ID NO.7
5'-CGCGGATCCGACTATAAAATGATCCAACACA-3'
BamHⅠ
反向引物PA1S1523N2：SEQ ID NO.8
5'-TTATGCGGCCGCTTATTTTTTAGCTGCACTAGCC-3'
NotⅠ
本实施例将编码SEQ ID NO.1所示A1S_1523蛋白氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2作为目的基因片段进行PCR扩增。
2)-80℃冷冻库中取出保存的鲍曼不动杆菌17978菌株涂布于专用LB固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提全基因组。
3)以鲍曼不动杆菌17978全基因组DNA为模板PCR扩增A1S_1523蛋白基因片段
PCR体系：
PCR扩增反应条件98℃预变性40s，94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果如图1所示。
4)使用凝胶回收试剂盒回收A1S_1523PCR产物。
3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下：
1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和A1S_1523PCR产物
酶切反应体系：
37℃酶切3h。
2)使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。
3)连接和转化
通过紫外分光光度计测定目的基因酶切回收产物核酸浓度：58ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：48ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1：2-10，设计以下连接反应体系。
连接反应体系：
混匀，16℃连接1h。
4)从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600ulLB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。
各管以5000rpm室温离心5min.，弃去400ul上清，再重悬菌体，取100μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5)pGEX-6p-2/A1S_1523阳性重组质粒的筛选、鉴定
①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；
双酶切反应体系：
37℃酶切2h；
④1％的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2所示，可见泳道1-4样品为构建成功的pGEX-6p-2/A1S_1523重组质粒；
⑤pGEX-6p-2/A1S_1523重组质粒送往北京华大基因公司测序，测序结果比对结果如图7所示，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。
实施例2：鲍曼不动杆菌-17978A1S_1523蛋白在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定
1.目的蛋白诱导表达
1)取双酶切鉴定正确的两个重组工程菌种pGEX-6P-2-A1S_1523/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp抗性的TB培养基中，100rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液2ml加入18mL Amp抗性的TB培养基中(余下的菌液保存在4℃冰箱中备用)，37℃培养2-3h，转速250rpm，二次活化至OD600为0.8-1.2时，加入IPTG 4.4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，16℃过夜诱导表达。
2)将诱导表达后的菌液取出，以1000rpm离心2min，弃去上清，加入1mLPBS缓冲液混匀，超声裂解3min，再4℃14000rpm离心15min,收集上清。
2.处理上清
取谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中，4℃旋转过夜结合(或室温结合1h)。在4℃下以5000rpm离心3min后，使用PBS-0.25％吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B加入5μl 5×蛋白质上样缓冲液，加入处理5min，10000rpm离心2min。
3.SDS-PAGE电泳，将5％浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10％分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。
4.将处理好的上清样品分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80V电泳30min，再调至200V，电泳45min后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像***下观察结果，结果如图3所示，PGEX-6P-2-A1S_1523/XL-1blue有在30℃、16℃条件下均能表达出分子量大小约为100kDa的含有GST标签的A1S_1523蛋白，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白在各诱导温度条件均为可溶性蛋白，在16℃与30℃表达量均很高。挑选的两个重组工程菌(1#，2#)无显著差异。
实施例3：A1S_1523蛋白抗原的制备
1.放大培养获取蛋白
取保存在-80℃冰箱中的pGEX-6P-2-A1S_1523/XL-1blue菌种(1#，2#)分别接种于LB氨苄抗性平板，37℃培养过夜；挑取单菌落接种于100ml LB氨苄抗性培养基，37℃，200rpm培养过夜；将活化的100ml菌液加入到2L含Amp抗性的LB培养基中进行二次活化，37℃培养3-4h至OD600为1.2时，加入420μl IPTG(终浓度为200μM)置于30℃摇床中诱导3h后，6000rpm离心5min收集菌体,再加80ml PBS重悬菌体后，将菌液进行超声裂解30min，同上离心收集上清与4ml谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B结合；获得大量的含有GST标签的A1S_1523融合蛋白。
2.使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取A1S_1523重组蛋白
向余下约4ml已结合目的蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B中加入4ml PBS和120μL PreScission protease(PP酶)，4℃垂直旋转酶切过夜，离心吸取上清后，分别用2ml PBS洗涤2次，取10μL样品变性处理后，上样10μL进行SDS-PAGE蛋白电泳，在成像***下观察结果，酶切后获得A1S_1523蛋白分子量在19kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，1号重组工程菌表达蛋白及初步纯化电泳结果如图4所示，泳道1表示酶切后，出现的三种物质，a:未完全切开的融合蛋白；b:GST标签及酶；c:在上清获取的目的蛋白；泳道2表示酶切后，第一次洗涤凝胶珠获取的目的蛋白；泳道3表示酶切前融合蛋白。
3.取1号及2号重组工程菌表达蛋白经酶切后的上清(含目的蛋白)，进一步用Sephadex G25置换缓冲液，将目的蛋白保存于组氨酸缓冲液中(10μm组氨酸，pH6.0)。结果如图5所示。
4.BCA法测定1号蛋白浓度，浓度为0.8mg/mL。
实施例4：感染用鲍曼不动杆菌(国际标准株17978)标准定量曲线的建立
将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光***下测定各菌液的在600nm处的吸光度(OD600)，并取各个稀释度的菌液100μl涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。
结果：标准曲线公式为Y＝3.012X+0.0051(109CFU/ml)，相关系数为0.9998。
实施例5：脓毒血症动物模型的构建
1.将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释(或浓缩)为2.0×109CFU/mL、2.1×109CFU/mL、4×109CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过腹腔注射6-8周龄、体重为18-20g的BALB/C小鼠(100μl/只)进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；
2、感染后计时在每隔24h(观察7天)采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样100μl涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75％酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于1mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取100μl均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。
结果显示于表1：
表1 鲍曼不动杆菌-17978感染剂量与致死剂量的确定
2.0×108CFU剂量组7天内小鼠死亡率为0；2.2×108CFU剂量组48h内小鼠死亡率为20％；4.2×108CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90％；由此可见鲍曼不动杆菌-17978感染剂量为2.2×108CFU，亚致死剂量为4.2×108CFU。
3.鲍曼不动杆菌-17978感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：
感染后肺中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到2.0×104CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后肾脏中细菌的在24h时达到峰值，最大定植量达到1.0×103CFU/ml，在48h时肺中细菌量开始减少，到72h时肺中未检测出细菌；感染后血液、脾、心脏、肝脏中定植的细菌均未检测到；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。
以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为鲍曼不动杆菌单个亚单位疫苗和鲍曼不动杆菌亚单位融合疫苗的成功研制及鲍曼不动杆菌感染的发病机制的研究奠定了基础。
实施例6：免疫动物及抗体的检测
1.免疫动物
1)首次免疫，将A1S_1523蛋白抗原与AlPO4佐剂物理混合，用蛋白保存液将抗原浓度调节为200μg/ml，并置于4℃旋转吸附过夜制成疫苗；用5号半型针头，双侧腹股沟注射，每只BALB/C小鼠注射量为150μl，并设置阴性对照组(Al(OH)3佐剂组)和空白对照组(蛋白保存液组)；
2)第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；
3)第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量与首次免疫的相同，免疫途径同上；
2.第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后IgG体液应答水平。
1)制备液体
①包被液的配制：称取NaHCO31.6g，Na2CO32.9g，溶于1L ddH2O，用PH计将pH调至9.6；
②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；
③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH2O，再加入500μl Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；
⑤显色液(TMB)，为天根公司产品；
⑥终止液(2M H2SO4)的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O中。
2)ELISA检测A1S_1523重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价
①用包被液将纯化后的A1S_1523重组蛋白稀释为10μg/mL；
②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μl/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍；
③封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；
④将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000等倍比稀释；
⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；
⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；
⑦加入稀释抗体工作液，100μl/孔，置于37℃孵育箱45min，洗涤三遍，空干；
⑧加入底物显色液(TMB)100μl/孔，室温避光反应5min；
⑨加入终止液(2M H2SO4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；
⑩结果判断：A样品A阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清)。
结果：检测A1S_1523蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:128000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90％，免疫后第14天的抗体阳性率达到100％；说明本发明构建的A1S_1523重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例7：通过免疫小鼠确定A1S_1523重组蛋白免疫动物的攻毒保护
同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，腹腔注射鲍曼不动杆菌-17978活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为4×108CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。
表2
表2显示：为动物免疫试验(每次实验为10只小鼠)结果，表中结果显示阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率均为10％，A1S_1523重组蛋白辅以Al(OH)3佐剂组的平均免疫保护率为50％。
因此，本发明的A1S_1523重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对鲍曼不动杆菌-17978感染起到免疫保护性作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防鲍曼不动杆菌的感染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (12)

1.一种鲍曼不动杆菌A1S_1523重组蛋白，其特征在于：包含A1S_1523成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白通过标签蛋白GST融合表达，所述标签蛋白融合于所述A1S_1523蛋白的N端。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列还包括在SEQ ID NO.1的氨基端和/或羧基端缺失、替代、和/或添加了1－20个氨基酸残基的具有免疫原性的变体，该变体与所述氨基酸序列具有至少80％的同一性。
5.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：该重组蛋白由融合表达并酶切后在权利要求1所述的氨基端加入GPLGS五个氨基酸形成。
6.编码权利要求1所述的A1S_1523重组蛋白的多核苷酸。
7.权利要求1所述的A1S_1523重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计PCR的引物如下：
正向引物
5'-CGCGGATCCGACTATAAAATGATCCAACACA-3'
BamHⅠ
反向引物
5'-TTATGCGGCCGCTTATTTTTTAGCTGCACTAGCC-3'
NotⅠ
2)使用步骤1)设计的引物通过PCR扩增出编码A1S_1523蛋白目的基因片段；
3)步骤2)所得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；
4)诱导转化后的宿主菌表达A1S_1523重组蛋白；
5)纯化重组蛋白。
8.一种表达载体或宿主细胞，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白的多核苷酸或宿主细胞。
9.根据权利要求7所述的载体或宿主细胞，其特征在于：所述载体是pGEX-6P-2表达载体；所述宿主细胞是大肠杆菌，所述大肠杆菌是XL1-Blue。
10.抗权利要求1所述的A1S_1523蛋白的抗体。
11.权利要求1所述的A1S_1523重组蛋白在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。
12.权利要求1所述的A1S_1523重组蛋白在制备鲍曼不动杆菌检测试剂盒中的应用。
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