CN102977214B - 用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）疫苗的重组蛋白hf2及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组融合蛋白HF2，该蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）与纤维连接蛋白结合蛋白(FNBA)片段组成，其中，Hla与FNBA通过连接肽融合。该蛋白可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。本发明采用基因工程技术重组表达此融合蛋白，不仅表达量高便于分离纯化而且高效安全。动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

Description

用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗的重组蛋白HF2及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与纤连蛋白结合蛋白A活性片段的重组蛋白HF2，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌能导致人体产生广泛的疾病，如菌血症，心内膜炎，毛囊炎，疔，疖，痈，脓疱病，蜂窝(组)织炎，葡萄状菌病，毒性休克综合症，中枢***感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及关节感染，呼吸***感染等，给人类健康带来极大的威胁。而由于该菌的多重抗生素耐药性使得局面更加难以控制，治疗手段的选择越来越少。

免疫学手段被寄以厚望用以控制金黄色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球的感染及传播。免疫策略可以分为主动免疫与被动免疫，被动免疫用靶向金黄色葡萄球菌的抗体进行，主动免疫通过选择合适的抗原促使机体产生免疫反应。合适的多糖及多肽都可以作为抗原构成疫苗的有效组分。如多糖CP5，CP8被Nabi公司用作疫苗组分；蛋白IsdB被Merck公司用作疫苗组分。

Hla是一个在大多数临床分离株上都表达的穿孔形成毒素。它与多种疾病有关如肺炎，败血症关节炎及脑脓疮等。Hla单体约33kDa，以七聚体形式发挥功能，每个单体的第110-150氨基酸互相靠拢在磷脂双分子层上形成孔。随后导致细胞膜破坏，胞内离子渗出等。其毒性很强，在很低浓度情况下即可致病。因此，诱导机体产生高效抗Hla抗体应是控制金黄色葡萄球菌感染的一个重要方面。我们在此发明中将突变后无毒的Hla（H35L）作为疫苗的候选组分之一。

纤维连接蛋白结合蛋白（FNBA）是一表面相关多功能受体，特异可逆结合于人纤维连接蛋白，fibrin,fibrinogen等。该结合在机体手术及受伤情况下使细菌有效粘附，随之侵入定植。FNBP为一929个氨基酸约106kDa的酸性蛋白。诱导机体产生其抗体可以阻止SA粘附于人组织，进而阻止感染。由于FNBA分子量大，难于用重组工程菌进行完整蛋白的表达，我们将FNBA成熟肽第464-904氨基酸作为候选疫苗之一。

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与纤连蛋白结合蛋白A活性片段的重组融合重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。本发明采用基因工程技术重组表达所述融合蛋白，不仅表达量高便于分离纯化而且高效安全。动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

重组融合蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）与纤维连接蛋白结合蛋白(FNBA)片段组成，其中，Hla与FNBA通过连接肽融合。所述重组融合蛋白具有Hla-Linker-FNBA的结构特点，简称HF2；具有SEQ ID NO:1的DNA序列及SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

所述连接肽为Linker，该连接肽为-(Linker)n-，其中Linker为GGGGS或GGSGG或YAPVDV，n为1-4，优选Linker为GGGGS，n为1。

所述Hla为第110-150缺失的突变体Hla(delta 110-150)及Hla(H35L,delta110-150)的金黄色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla。

所述Hla优选第110-150缺失的突变体Hla(H35L,delta110-150)的金黄色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述FNBA为金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白膜外区，具体地指金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白膜外区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

上述的重组融合蛋白的制备方法蛋白，包括以下步骤：

1）全基因合成以获得编码Hla(H35L delta110-150)的DNA序列；

2）用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所示的正向和反向引物，扩增出重组融合蛋白的Hla部分；

3）用核酸序列如DNA序列为SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物，从MRSA基因组扩增出重组融合蛋白的FNBA部分；

4）以Hla及FNBA做模板，用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物扩增出重组融合蛋白HF2片段；

5）将所获得的HF2基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌，诱导转化后的宿主菌表达HF2重组蛋白；

6）纯化重组蛋白。

表达HF2重组蛋白的表达载体，其包含编码所述HF2重组蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:2。

所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体，优选为pGex-6P-2。

表达上述表达载体的宿主菌。所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列，本发明优选采用pGEX-6p-2载体来构建重组表达载体，表达重组蛋白HF2，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。

上所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

上述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。

鉴于Hla有极强的毒性，本发明在其活性位点H35进行了突变，用Leu替代，即Hla(H35L)。为了进一步降低Hla的分子量同时尽量原蛋白结构，本发明将能形成穿孔结构的第110-150位氨基酸去除，即形成Hla(H35L delta110-150)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

FnBA蛋白为两次跨膜蛋白，其胞外区对应28-943的氨基酸序列，并且其粘附主要由胞外区的蛋白质发挥作用，为了在最大限度上保持FNBA的结构和功能不发生较大的变化，本发明用成熟肽第464-904氨基酸，即FNBA2，其序列为SEQ ID NO:6，与Hla(H35L delta110-150)用短肽GGGGS连接，形成最后的融合蛋白命名HF2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。

本发明采用基因工程技术克隆表达此重组融合蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。HF2重组蛋白可直接与佐剂（如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等）配合使用，适用于注射免疫接种。

我们根据金黄色葡萄球菌基因组学及蛋白质组学的最新成果，确定构建基于alpha溶血素（Hla）及纤维连接蛋白结合蛋白(FNBPA)的疫苗。

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点：

1）HF2重组蛋白表达质粒在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达；

2）选择pGEX载体系列时，HF2重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的HF2重组蛋白纯度大于95%；

3）HF2重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。

利用本发明HF2重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

附图说明

图1是HF2基因片段的PCR扩增结果，其中

泳道1：目的基因片段HF2(2.1kb)；

泳道2：核酸(DNA)分子量标准（Marker）

图2为表达载体pGEX-6p-2-HF2的酶切鉴定结果：

泳道1：核酸(DNA)分子量标准（Marker）；

泳道2：重组表达质粒pGEX-6p-2-HF2经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段为4.8kbp和2.1kb；

图3HF2蛋白纯化结果

泳道1：蛋白分子量标准（Marker）；

泳道2：HF2蛋白

图4重组表达载体测序后与HF2的核酸序列比对结果。

具体实施方式

本发明所使用的菌株与各种试剂如下：

1.菌株

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ATCC提供；

2.试剂

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品、大肠杆菌菌株XL-1blue为美国安捷伦公司产品，均为申请人微生物教研室保存。

primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白Marker、T4连接酶solution I为大连TakaRa公司产品；

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品；

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品；

PreScission protease、谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。

实施例1：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Hla(H35L delta110-150)的DNA序列由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

实施例2：用PCR方法扩增用于构建HF2的H部分。

1.考虑到H段的连接肽SEQ ID NO:3，设计如下引物从合成的DNA序列上克隆H基因：

SEQ ID NO:7gcggatccat ggcagattct gatattaata ttaa(下划线示酶切位点BamHI)

SEQ ID NO:8aactaagctg ccaccgccac catttgtcat ttc

2．PCR克隆基因

PCR体系：

模板(100ng/μl)	0.5μl
		SEQ ID NO:7(50μM)	1μl
SEQ ID NO:8(50μM)	1μl
		Primerstar Taq酶	0.5μl
dNTP	4μl
		5X Buffer	10μl
灭菌双蒸水	33μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

使用凝胶回收试剂盒回收H基因产物。

实施例3：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A活性片段FNBA2活性片段（F2）的克隆

1.首先根据MRSA-252FnBA蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，确定需要扩增的FnBA1目的基因片段。

2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增FnBA1目的基因片段，扩增步骤如下：

1）设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：9-10

SEQ ID NO:9ggtggcggtg gcagcttagt tttatatagt aataaagc

SEQ ID NO:10ttttcctttt gcggccgcct aacctttgtt tgttgattct tctc（下划线示酶切位点NotI）

2）-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。

3）以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增FNBA2基因片段

PCR体系：

模板(239.5ng/μl)	2.5μl
		SEQ ID NO:9(50μM)	1μl
SEQ ID NO:10(50μM)	1μl
		Primerstar Taq酶	0.5μl
dNTP	4μl
		5X Buffer	10μl
灭菌双蒸水	31μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件98℃预变性5min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸1min30s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

4）使用凝胶回收试剂盒回收FNBA2PCR产物。

实施例4：HF2基因的克隆

PCR体系：

模板H+F2	2μl
		SEQ ID NO:7(50μM)	1μl
SEQ ID NO:10(50μM)	1μl
		Primerstar Taq酶	0.5μl
dNTP	4μl
		5X Buffer	10μl
灭菌双蒸水	31.5μl
		总体积	50μl

PCR扩增反应条件98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸2min30s，30个循环，72℃完全延伸6min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

使用凝胶回收试剂盒回收HF2产物，结果如附图1。

实施例5：重组HF2基因克隆的构建

1.BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和FnBA1PCR产物

酶切反应体系：

BamH I	3μl
		Not I	3μl
10×K Buffer	3μl
		0.1%BSA	6μl
Product	45μl

总体积

60μl

37℃酶切2h。

2.使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。

3.连接和转化

通过紫外分光光度计测定HF2酶切回收产物核酸浓度：15ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl。

连接反应体系：

Solution I	5μl
		HF2酶切回收产物	4μl
PGEX-6P-2酶切回收产物	2μl
		总体积	10μl

混匀，16℃连接1h。

从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中220rp振摇1h。

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300μl上清，再重悬菌体，取200μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。

4.pGEX-6p-2/HF2阳性重组质粒的筛选、鉴定

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行；

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切；

双酶切反应体系：

BamH I	0.5μl
		Not I	0.5μl
10×K Buffer	0.5μl
		0.1%BSA	1μl
重组质粒	7.5μl
		总体积	10μl

37℃酶切2h；

④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道2样品为构建成功的pGEX-6p-2-HF2重组质粒；

⑤pGEX-6p-2-HF2重组质粒送往大连TaKaRa公司测序，测序结果为CQS5997，与预期序列SEQ ID NO:5比对结果示于图4，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。

实施例6：重组融合蛋白HF2在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定

1.目的蛋白诱导表达

1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-HF2/XL-1blue菌液100μL加入10mLAmp抗性的TB培养基中，80rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2~3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.8-1.0时，加入IPTG 4μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，25℃5h，16℃过夜诱导表达。

2)将诱导表达后的菌液取出，以12000rpm离心5min，弃去上清，加入1mLlysis buffer混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。

2.处理上清

取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的GlutathioneSepharose 4B加入20μL 2×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。

3.处理沉淀

在沉淀中加入500μL lysis buffer重悬菌体，取80μL重悬菌液加入20μL 5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心3min。

4.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入10%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。

5.将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1~2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像***下观察结果，PGEX-6P-2-HF2/XL-1blue在16℃、25℃、30℃均为可溶性蛋白，且无明显差异。

实施例7：HF2抗原的制备

1．放大培养获取蛋白

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-HF2/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5~6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37℃培养3~4h至OD600为1.0时，加入80μL IPTG（终浓度为200μM）置于16℃摇床中过夜诱导后，12000rpm离心15min收集菌体,再加20mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶珠（beads）结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳。

2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取HF2FnBA1目的蛋白

向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease（PP酶），室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳（方法同上），在呈相***下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在96kDa左右，酶切下来的HF2蛋白分子量在95-130kDa之间，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。

3.BCA法测定蛋白含量，最高浓度为1.5mg/mL。

实施例8：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光***下测定各菌液的在600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100μL涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（10⁹CFU/ml），相关系数为0.9999。

实施例9：脓毒血症动物模型的构建

1．将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6~8周龄、体重为18~20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率；

2、感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5~1mL，取20μL血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均浆按照1:10、1:100、1:1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。

结果显示于表1：

表1MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h内死亡率为小鼠死亡率为90%,120h内死亡率为小鼠死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%,7天（d）内死亡率为小鼠死亡率为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为1.0~1.25×10⁹CFU。

3．MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量：

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为MRSA单个亚单位疫苗和MRSA多亚单位融合疫苗的成功研制及MRSA感染的发病机制的研究奠定了基础。

实施例10：免疫动物及抗体的检测

1.免疫动物

1）首次免疫，用PBS稀释HF2蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100μL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组；

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上；

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上；

2．第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2_a体液应答水平。

1）制备液体

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6；

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1:100)；

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500μL Tween 20，再用PH计将pH调至7.4；

⑤显色液（TMB），为天根公司产品；

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH₂O中。

2）ELISA检测FnBA1重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

①用包被液将纯化后的HF2重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL；

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200μL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

③封闭：酶标板加封闭液100μL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

④将血清进行1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000等倍比稀释；

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1：5000，制成抗体工作液；

⑦加入稀释抗体工作液，100μL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

⑧加入底物显色液（TMB）100μL/孔，室温避光反应5min；

⑨加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值；

⑩结果判断：A_样品/A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释）。

结果：检测HF2蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000；免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，说明本发明构建的HF2重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。

实施例11：通过免疫小鼠确定HF2重组蛋白免疫动物的攻毒保护

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。

表2HF2重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

表2显示：阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为15%和20%，重组融合蛋白HF2加Al(OH)₃佐剂组的平均免疫保护率为80%。因此，本发明的HF2重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。

本领域技术人员可以将本发明HF2重组蛋白用于其他任何适用的用途。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (15)

1.一种重组蛋白HF2，其特征在于：该蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）与纤维连接蛋白结合蛋白(FNBA)片段组成，其中，Hla 与FNBA通过连接肽融合，该重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白HF2，其特征在于，所述连接肽为Linker，该连接肽为-(Linker)n-，其中Linker为GGGGS或GGSGG或YAPVDV，n为1-4 。

3. 根据权利要求2所述的重组蛋白HF2，其特征在于，所述连接肽Linker为GGGGS，n为1。

4.根据权利要求1所述的重组蛋白HF2，其特征在于，所述Hla为第110-150缺失的突变Hla(H35L, delta110-150)。

5.根据权利要求4述的重组蛋白HF2，其特征在于：所述Hla为第110-150缺失的突变体Hla(H35L, delta110-150)的金黄色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其DNA序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求1所述的重组蛋白HF2，其特征在于：所述FNBA为金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白膜外区，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.权利要求1-6任一所述的重组蛋白HF2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）全基因合成以获得编码Hla(H35L delta110-150)的DNA序列；

2）用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所示的正向和反向引物，扩增出Hla；

3）用核酸序列如DNA序列为SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物，从MRSA基因组扩增出FNBA；

4）以Hla及FNBA做模板，用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物扩增出重组融合蛋白HF2片段；

5）将所获得的HF2基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌，诱导转化后的宿主菌表达HF2重组蛋白；

6）纯化重组蛋白。

8.一种表达载体，其特征在于：包含编码权利要求1所述重组蛋白HF2的核酸序列。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pGex-6P-2。

11.一种表达如权利要求8-10任一所述表达载体的宿主菌。

12.根据权利要求11所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue、BL21系列或HMS174系列。

13.根据权利要求12所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XL1-blue。

14.权利要求1所述的重组蛋白HF2在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

15.权利要求1所述的重组蛋白HF2在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。

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