CN102675433A - 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No：3或在SEQID NO：3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQID NO：3具有相同或相似功能的序列。本发明还公开了构建所述重组蛋白的表达载体、转化宿主菌而制备该重组蛋白的方法，以及所述重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及相关检测试剂盒中的用途。本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IsdB2蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。

Description

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB活性片段IsdB2重组蛋白、及其制备方法和应用。 

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、***部及肠道的革兰阳性菌,通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。 

在国外，2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2008年中国细菌耐药性检测协作网（CHINET）检测结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55.9%，最高为77.5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63.9%，最高 为86.5%，而2006年MRSA的平均检出率为64.6%，最高达92.5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。 

目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入Ⅲ期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。 

由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA、IsdB、肠毒素、TSST-1、α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。 

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA一个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。 

利用生物信息学对IsdB进行结构功能分析，发现IsdB是两次跨膜蛋白，由胞外区以及跨膜区组成。由于IsdB是的细胞壁锚定蛋白，因此其捕获血红蛋白主要由胞外区的蛋白质发挥作用。这为设计亚单位疫苗提供了理论基础。 

亚单位疫苗是去除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，但保留有效免疫原成分的新型疫苗。然而，亚单位疫苗由于具有诸多局限 性，例如其在受体内引起的免疫反应较多是短暂性的，不能引起长期有效的免疫性，因此选择的合适的免疫原成分就成为需要解决的重大问题。 

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。 

鉴于IsdB蛋白为两次跨膜蛋白，其胞外区对应34~628的氨基酸序列，并且其捕获血红蛋白主要由胞外区的蛋白质发挥作用，为了在最大限度上保持IsdB的结构和功能不发生较大的变化，本发明同时截短IsdB（SEQ IDNO：1）氨基端1~33个氨基酸和羧基端的1~23个氨基酸后对IsdB活性片段进行克隆、表达和保护性免疫的评价，将IsdB截短后的片段命名为IsdB2。 

本发明所述活性片段IsdB2包含IsdB蛋白的胞外区，其氨基酸序列为为SEQ ID NO：3或在SEQ ID NO：3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQ ID NO：3具有相同或相似功能的序列；优选地，所述活性片段的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，即所示序列的氨基端和羧基端分别缺失33和23个氨基酸后所获得的示于SEQ ID NO：4的序列，即同时截短IsdB（SEQ ID NO：1）氨基端33个氨基酸和羧基端的23个氨基酸后获得的序列。 

本发明还提供一种用于表达IsdB2重组蛋白的重组表达载体，其包含编码所述IsdB2重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。 

所述编码IsdB2重组蛋白的核苷酸序列可以是SEQ ID NO：4或在SEQ ID NO：4的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO：3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列；优选地，所述核苷酸序列为编码SEQ ID NO：3氨基酸序列的SEQ ID NO：4。 

本发明优选采用pGEX-6p-2载体来构建重组表达载体，表达IsdB2重 组蛋白，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体，其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。 

因此，本发明还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。 

本发明还提供一种表达IsdB2重组蛋白的方法，其包含以下步骤：1）根据编码IsdB2重组蛋白的核酸序列设计正向引物isdB2-F和反向引物isdB2-R；2）使用步骤1）设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码IsdB2重组蛋白的基因片段；3）将步骤2）所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；以及4）诱导转化后的宿主菌表达IsdB2重组蛋白。 

本发明设计的正向引物和反向引物的优选核苷酸序列分别示于SEQID NO：5和SEQ ID NO：6。 

所使用的宿主菌优选大肠杆菌XL1bule。 

本发明还提供一种IsdB2重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。 

本发明还提供一种IsdB2重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。 

本发明采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IsdB2蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。IsdB2重组蛋白可以直接与佐剂（如Al(OH)₃佐剂、MF59、AS0₃、AS0₄、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等）配合使用，适用于注射免疫接种。 

本发明的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点：1）IsdB2重组蛋白表达质粒在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达；2）选择pGEX载体系列时，IsdB2重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶（GST），所表达的融合蛋白中就含有 一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；表达率约为30%，纯化出来的IsdB2重组蛋白纯度大于95%；3）IsdB2重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。 

利用本发明IsdB2重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下（肌肉）注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。 

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

附图说明

图1是IsdB2基因片段的PCR扩增结果，其中 

泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）； 

泳道1~3：目的基因片段IsdB2（1785bp）的PCR扩增产物。 

图2为表达载体pGEX-6p-2-IsdB（1785bp）的酶切鉴定结果： 

泳道M：核酸(DNA)分子量标准（Marker）； 

泳道1-6：重组表达质粒pGEX-6p-2-IsdB经酶切后的鉴定结果，其中泳道4表示酶切后分离的片段4000bp和1785bp； 

图3表示不同温度下诱导蛋白表达结果： 

泳道M：蛋白分子量标准（Marker） 

泳道1、3、5、7、9：表达载体分别在30℃、25℃、18℃、16℃、12℃下诱导表达后，在上清中获得的蛋白。 

泳道2、4、6、8：表达载体分别在30℃、25℃、18℃、16℃下诱导表达后，在沉淀中获得的蛋白。 

图4表示重组表达载体在16℃过夜诱导表达后，获得含GST标签的融合蛋白，其中 

泳道M：蛋白分子量标准（Marker）； 

泳道1、2：重组表达载体在16℃下过夜诱导表达后，在上清中获得含GST标签的融合蛋白； 

泳道3、4：重组表达载体在16℃下过夜诱导表达后，在沉淀中获得的蛋白。 

图5表示含GST标签的融合蛋白酶切结果 

泳道M：蛋白分子量标准（Marker）； 

泳道1：酶切前，含有GST标签的融合蛋白； 

泳道2：酶切后，在上清获取的目的蛋白； 

泳道3：酶切后，第一次洗涤用于结合表达蛋白的GlutathioneSepharose 4B凝胶柱（beads）获取的目的蛋白； 

泳道4：酶切后，第二次洗涤beads获取的目的蛋白； 

泳道5：酶切后，非特异性结合在beads的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。 

图6是利用在线生物信息软件对IsdB蛋白跨膜区预测结果图。 

图7是利用Porter软件对IsdB二级结构预测结果图，其中“H”表示α螺旋“E”表示β折叠“C”表示无规则卷曲“T”表示β转角。 

图8利用SWISS-MODEL软件通过同源模建在PDB数据库中寻找模板，对IsdB进行三级结构预测。 

图9利用SWISS-MODEL软件通过同源模建在PDB数据库中寻找模板，对IsdB进行三级结构预测。 

图10是重组表达载体测序后与IsdB2的核酸序列对比结果。 

具体实施方式

本发明所使用的菌株与各种试剂如下： 

1.菌株、质粒 

金黄色葡萄球菌MRSA-252国际标准株由美国ACTT提供； 

菌株XL-1blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品； 

质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品; 

质粒pET-22b为美国merck公司产品； 

2.试剂 

primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性内切酶BamHI和Not I、蛋白Marker为大连TakaRa公司产品； 

质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品； 

细菌基因组提取试剂盒、超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品； 

T4DNA Ligase为Fermentas公司产品; 

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶Glutathione Sepharose 4B为美国GE Healthcare公司产品。 

亮抑肽Leupeptin hemisulfate和胃蛋白抑制剂PepstatinA购自德国AppliCh公司； 

苯甲基磺酰氟PMSF来自上海碧云天生物技术研究所。 

本发明中所使用PBS、Tris等化学试剂均为市售的分析纯； 

本发明中所使用TB培养基、MH培养基等均为市售的生化制品。 

实施例1：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB活性片段IsdB2的克隆 

1.首先根据MRSA-252IsdB蛋白全长基因序列，应用生物信息软件进行结构分析，分析结果参见附图6-9，从而确定需要扩增的IsdB2目的基因片段。 

2.根据分析结果，采用PCR方法自MRSA-252基因组扩增IsdB2目 的基因片段，扩增步骤如下： 

1）设计PCR引物如下，分别为SEQ ID NO：5-6（下划线示酶切位点碱基序列） 

isdB2-F：SEQ ID NO：5 

5'-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAGC-3' 

BamH Ⅰ 

isdB2-R：SEQ ID NO：6 

5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC 

-3'Not Ⅰ 

本实施例将编码SEQ ID NO：4所示IsdB2氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO：3作为目的基因片段进行PCR扩增，但本领域技术人员应该理解，可以选择衍生自SEQ ID NO：2所示核苷酸序列、在其对应编码蛋白氨基酸序列（如SEQ ID NO：1所示）氨基端和羧基端分别缺失1-33和1-23个密码子后所获得的任意序列作为目的基因片段。 

2）-80℃冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252专用固体培养基上，于37℃培养过夜，再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培养基中培养8个小时，参照细菌基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。 

3）以MRSA-252全基因组DNA为模板PCR扩增IsdB2基因片段PCR体系： 

PCR扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性20s，58℃退火40s，72℃延伸2.5min，30个循环，72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，PCR扩增结果示于图1中。 

4）使用凝胶回收试剂盒回收IsdB2PCR产物。 

3.PCR产物的鉴定与克隆，步骤如下： 

1）BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和IsdB2PCR产物酶切反应体系： 

37℃酶切4h。 

2）使用超薄回收试剂盒回收pGEX-6P-2质粒和经BamH I和Not I酶切的PCR产物。 

3）连接和转化 

通过紫外分光光度计测定IsdB2酶切回收产物核酸浓度：30ng/μl，pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度：60ng/μl，根据载体与外源片段摩尔数一般比为1∶2~10，设计以下连接反应体系。 

连接反应体系： 

混匀，16℃连接1.5h。 

4）从-80℃冰箱取3管大肠杆菌XL1blue感受态细胞，第一管加入pGEX-6P-2质粒，作阳性对照；第二管加入DNA连接产物；第三管不加源DNA，作阴性对照。冰浴50min，42℃金属浴中热击90s，迅速冰浴min。加入600ul LB空白培养基，混匀，置于37℃摇床中200rp振摇1h。 

各管以5000rpm室温离心3min.，弃去300ul上清，再重悬菌体，取150μl涂布于Amp抗性LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。 

5）pGEX-6p-2/IsdB2阳性重组质粒的筛选、鉴定 

①阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞制作正确，结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落，接种于Amp抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 

②质粒抽提：参照质粒提取试剂盒说明书进行； 

③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切； 

双酶切反应体系： 

37℃酶切2h； 

④1%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果，结果如图2，可见泳道4样品为构建成功的pGEX-6p-2/IsdB2重组质粒； 

⑤pGEX-6p-2/IsdB2重组质粒送往上海英俊公司测序，测序结果比对结果示于图10，可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。 

实施例2：MRSA-252 IsdB亚单位活性片段IsdB2在原核表达***－大肠杆菌中诱导表达、纯化及表达形式的鉴定 

1.目的蛋白诱导表达 

1）取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-IsdB2/XL-1blue菌液100μL加入10mL Amp抗性的TB培养基中，80rpm 37℃过夜培养，分别取过夜培养的菌液400μL加入20mLAmp抗性的TB培养基中（余下的菌液保存在4℃冰箱中备用），37℃培养2~3h，转速200rpm，二次活化至OD600为0.6~0.8时，加入IPTG 40μL，使其终浓度为200μM，再置于摇床诱导表达30℃3h，25℃5h，18℃、16℃、12℃均为过夜诱导表达。 

2)将诱导表达后的菌液取出，以6000rpm离心15min，弃去上清，加入1mL lysis buffer混匀，超声裂解3min(超声6次30s/次)，再4℃14000rpm离心1 5min,分离上清和沉淀。 

2.处理上清 

取Glutathione Sepharose 4B 20μl，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清加入Glutathione Sepharose 4B中，4℃旋转过夜结合（或室温结合1h）。在4℃下以14000rpm离心3min后，使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次，PBS洗涤一次。向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20ul 5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心30s。 

3.处理沉淀 

在沉淀中加入500μL lysis buffer重悬菌体，取80uL重悬菌液加入20μL5×蛋白质上样buffer，煮沸5min，14000rpm离心30s。 

4.SDS-PAGE电泳，将5%浓缩胶灌入制胶版中，在加入蒸馏水将胶压平，室温放置30min使其凝固，将上层的蒸馏水倒干，再灌入12%分离胶，立即插上梳子，室温放置30min使其凝固备用。 

5.将处理好的上清和沉淀分别取10μL上样，进行SDS-PAGE电泳。电压先80v电泳30min，再调至180v，电泳1~2h后，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在呈像***下观察结果，结果示于图3，PGEX-6P-2-isdB2/XL-1blue只有在18℃、16℃、12℃条件下才能表达出分子量大小约为95kDa的含有GST标签的IsdB2，且重组蛋白均在超声裂解的上清中，因此所述重组蛋白为可溶性蛋白，且16℃下目的蛋白的表达量最高，其纯度达到95%以上。 

实施例3：IsdB2抗原的制备 

1．放大培养获取蛋白 

取保存在4℃冰箱中备用的pGEX-6P-2-isdB2/XL-1blue菌液400μL加入到20mL含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化，200rpm 37℃培养5~6h后，取8mL一次活化的菌液加入到400mL含Amp抗性的TB培养基中进行二次活化，37℃培养3~4h至OD600为0.8时，加入80Μl IPTG（终浓度为200uM）置于16℃摇床中过夜诱导后，6000rpm离心15min收集菌体,再加20mL lysis buffer重悬菌体后，将菌液进行超声裂解3min(200V)，收集上清与800μL用于结合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝胶珠（beads）结合处理；再进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果示于图4，可见在实施例中目的蛋白获得大量的表达。 

裂解液lysis buffer配方：Leupeptin 2ul、PepstatinA 10ul、Pepstetin A1.6ul、PmSF 100ul、10%Triton 1ml和PBS 10ml混合。 

2．使用酶切方法，将目的蛋白和GST标签分开，获取IsdB2目的蛋白 

向余下约800μL已结合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800μL PBS和120μL PreScission protease（PP酶），室温垂直旋转酶切5h后，离心吸取上清后，分别用800μL PBS洗涤3次，各后取10μL样品变性处理后，上样5μL进行蛋白电泳（方法同上），在呈相***下观察结果，酶切前GST融合蛋白分子量在96kDa左右，酶切下来的IsdB2蛋白分子量在70kDa左右，与预期蛋白分子量大小相符合，电泳结果示于图5，其中泳道1表示酶切前，含有GST标签的融合蛋白；泳道2表示酶切后，由于目的蛋白与结合与凝胶珠的GST标签分离，因此在上清获取的目的蛋白；泳道3表示酶切后，第一次洗涤Glutathione Sepharose 4B凝胶珠（beads）获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道4表示酶切后，第二次洗涤beads获取的非特异性结合在beads上的目的蛋白；泳道5表示酶切后，非特异性结合在beads上的目的蛋白和特异性结合在beads上的酶和GST标签。 

3.Lowry法测定蛋白含量，最高浓度为4.039mg/mL。 

实施例4：感染用金黄色葡萄球菌菌株（国际标准株MRSA-252）标准定量曲线的建立 

将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后6000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次；再将菌液进行10倍和1.25倍稀释，并在紫外分光***下测定各菌液的在600nm处的吸光度（OD600），并取各个稀释度的菌液100ul涂布于MH平板，置于37℃孵育24小时后计数菌落；根据各个平板菌落数和菌液的OD600值绘制标准定量曲线。 

结果：标准曲线公式为Y=2.3065X+0.0051（10⁹CFU/ml），相关系数为0.9999。 

实施例5：脓毒血症动物模型的构建 

1．将菌株接种于MH平板置于37℃孵育24小时；在平板上挑取单菌落，接种于MH液体培养基中，置于37℃恒温摇床中震荡培养6小时后收集菌体，并利用标准曲线公式进行定量，再将菌液稀释（或浓缩）为 2.0×10¹⁰CFU/mL、1.5×10¹⁰CFU/mL、1.25×10¹⁰CFU/mL、1.0×10¹⁰CFU/mL不同浓度组，再用各组菌液通过尾静脉注射6~8周龄、体重为18~20g的BALB/C小鼠（100μl/只）进行全身感染，同时设置生理盐水对照组，观察7天并统计各组小鼠的死亡率； 

2、感染后计时每隔24小时（至感染后7天）采用菌落计数法对细菌定植量进行检测：从各感染组和对照组中随机选取3只小鼠，利用眼球摘除法，取小鼠血样0.5~1mL，取20μL血样用180μL肝素稀释10倍后用于细菌计数，取50μL涂于平板，置于37℃，24h后计数克隆数；取完血样后将小鼠处死放入75%酒精中浸泡消毒后，取出将其四肢固定，将其解剖，取出脾、肾、肝脏，置于2mL无菌的PBS中，于洁净的玻璃匀浆器中进行匀浆，取1mL均浆按照1∶10、1∶100、1∶1000比例进行稀释；每稀释度各取100μL轻轻涂布于固体培养基上，置于37℃，培养24h，做菌落计数。 

结果显示于表1： 

表1MRSA-252最小致死剂量与亚致死剂量的确定 

2.0×10⁹CFU剂量组12小时（h）内小鼠死亡率为100%；1.5×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为90%，72h内死亡率为100%；1.25×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为80%，96h内死亡率为小鼠死亡率为90%,120h内死亡率为小鼠死亡率为100%；1.0×10⁹CFU剂量组48h内小鼠死亡率为10%，72h内死亡率为小鼠死亡率为20%,7天（d）内死亡率为小鼠死亡率为70%；由此可见MRSA-252最小致死剂量约为1.25×10⁹CFU，亚致死剂量为1.0~1.25×10⁹CFU。 

3．MRSA-252感染BALB/C小鼠后在血液和各脏器中的定植量： 

感染后血液中细菌的在48h时达到峰值，最大定植量达到8.0×10⁹CFU/ml，在72h时血液中细菌量开始减少，到96h时血液中未检测出细菌；感染后脾、肾、肝脏中定植的细菌均在72时达到峰值，最大定植量均达到8.0×10⁹CFU/ml；对照组小鼠的血液、脾、肾、肝脏中的细菌定植检测结果均为零。 

以上结果针对小鼠的生存率和血液、脾、肾、肝脏主要器官细菌定植量进行了动物模型的评价，为MRSA单个亚单位疫苗和MRSA多亚单位融合疫苗的成功研制及MRSA感染的发病机制的研究奠定了基础。 

实施例6：免疫动物及抗体的检测 

1.免疫动物 

1）首次免疫，用PBS稀释IsdB2蛋白抗原，加入浓度为1mg/mL的Al(OH)₃，调节IsdB2蛋白抗原终浓度至0.4mg/mL；用5号半型针头，双侧腹股沟、足底及背部皮下对点注射，每只BALB/C小鼠注射量为100uL，并设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组； 

2）第二次免疫，第14天进行第二次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量是首次免疫的1/2，免疫途径同上； 

3）第三次免疫，第21天进行第三次免疫，免疫组分同上，注射量蛋白抗原量与第二次免疫相同，免疫途径同上； 

2．第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA检测小鼠免疫后，IgG、IgG1、IgG2_a体液应答水平。 

1）制备液体 

①包被液的配制：称取NaHCO₃1.6g，Na₂CO₃2.9g，溶于1L ddH₂O，用PH计将pH调至9.6； 

②封闭液的配制：1g牛血清Ⅴ，溶于100mL抗体稀释液(1∶100)； 

③抗体稀释液的配制：将磷酸盐溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween20，再用PH计将pH调至7.4； 

④洗涤液的制备：称取2.42g Tris溶于1L ddH₂O，再加入500uL Tween20，再用PH计将pH调至7.4； 

⑤显色液（TMB），为天根公司产品； 

⑥终止液（2M H₂SO₄）的制备：将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mLddH₂O中。 

2）ELISA检测IsdB2重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价 

①用包被液将纯化后的IsdB2重组蛋白稀释为：1ug/mL、5ug/mL、10ug/mL； 

②包被：将重组蛋白稀释液加入酶标板，200uL/孔，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用； 

③封闭：酶标板加封闭液100uL/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍； 

④将血清进行1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000等倍比稀释； 

⑤取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100uL/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干； 

⑥将加HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体保存液，稀释1∶5000，制成抗体工作液； 

⑦加入稀释抗体工作液，100uL/孔，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干； 

⑧加入底物显色液（TMB）100uL/孔，室温避光反应5min； 

⑨加入终止液（2M H₂SO₄），立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值； 

⑩结果判断：A _样品/A_阴性值≧2.1为阳性（阴性对照为小鼠免疫前血清1∶1000倍稀释）。 

结果：检测IsdB2蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1∶256000； 免疫后第7天的抗体阳性率达到90%，免疫后第7天的抗体阳性率达到95%；说明本发明构建的IsdB亚单位活性片段IsdB2重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。 

实施例7：通过免疫小鼠确定IsdB2重组蛋白免疫动物的攻毒保护 

同实施例6的免疫方案，第三次免疫小鼠后，在第14天采用致死剂量，尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×10⁹CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。结果示于表2。 

表2 

表2显示：为四次动物免疫试验(每次实验为15~20只小鼠)结果，表中结果显示阳性对照组、阴性对照组和空白对照组的平均免疫保护率分别为38.71%、14.92%和2.98%，IsdB活性功能片段IsdB2单独蛋白组的免疫保护性为22.72%，IsdB活性片段IsdB2加Al(OH)₃佐剂组的平均免疫保护率为62.68%。 

因此，本发明的IsdB活性片段IsdB2重组蛋白具有良好的免疫原性，并且能够对MRSA-252感染起到保护作用，能够诱导机体产生免疫应答，可以例如辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。 

通过以上实施例，本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂，例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂等制备相关试剂盒，例如检测试剂盒，用于诊断是否感染金黄色葡萄菌、确定预后等。 

本领域技术人员可以将本发明IsdB2重组蛋白用于其他任何适用的用 途。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。 

序列表

序列表

 

<110>  重庆原伦生物科技有限公司、中国人民解放军第三军医大学

 

<120>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和

       应用

 

<130>  12P99139-CN

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  652

<212>  PRT

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的氨基酸序列

 

<400>  1

 

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Met Ser Asn Gly Glu Ala Lys Ala Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn

        35                  40                  45             

 

 

Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu

                85                  90                  95      

 

 

Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

            100                 105                 110        

 

 

Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

    130                 135                 140                

 

 

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

                165                 170                 175    

 

 

Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

            180                 185                 190        

 

 

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

        195                 200                 205            

 

 

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

    210                 215                 220                

 

 

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

                245                 250                 255    

 

 

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

            260                 265                 270        

 

 

Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

        275                 280                 285            

 

 

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

    290                 295                 300                

 

 

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

                325                 330                 335    

 

 

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

            340                 345                 350        

 

 

Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

        355                 360                 365            

 

 

Met Met Asp Ala Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

    370                 375                 380                

 

 

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

                405                 410                 415    

 

 

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

            420                 425                 430        

 

 

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

        435                 440                 445            

 

 

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

    450                 455                 460                

 

 

Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

465                 470                 475                 480

 

 

Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val

                485                 490                 495    

 

 

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

            500                 505                 510        

 

 

Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

        515                 520                 525            

 

 

Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser

    530                 535                 540                

 

 

Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

545                 550                 555                 560

 

 

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

                565                 570                 575    

 

 

Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

            580                 585                 590         

 

 

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

        595                 600                 605            

 

 

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser

    610                 615                 620                 

 

 

Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu Met Ala Leu Ile Ala Leu Ser Ser

625                 630                 635                 640

 

 

Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg Lys Arg Lys Asn

                645                 650        

 

 

<210>  2

<211>  1959

<212>  DNA

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的核苷酸序列

 

<400>  2

atgaacaaac agcaaaaaga atttaaatca ttttattcaa ttagaaagtc atcactaggc     60

 

gttgcatctg tagcgattag tacactttta ttattaatgt ccaatggcga agcaaaagca    120

 

gctgaagaaa caggtgttac aaatacagaa gcacaaccaa aaactgaagc agttgcaagt    180

 

ccaacaacaa caacaactga aaaagctcca gaagctaaac cagtagctaa accagtagct    240

 

aatgctgtct cagtatctaa taaagaagtt gtggccccta ctactgaaac aaaagaagct    300

 

aaagaagtta aagcagttaa agaagttaaa gcccctaagg aagcaaaaga ggaaaaacct    360

 

gcagcaaaag ctgacaacaa tacatatcct attttgaatc aggaactaag agaagcgatt    420

 

aaaaaccctg caataaaaga caaagatcat agcgcaccaa actctcgtcc aattgatttt    480

 

gaaatgaaaa agaaagatgg cactcaacag ttttatcatt atgcaagttc tgttaaacct    540

 

gctagagtta ttttcactga ttcaaaacca gaaattgaat taggattaca atcagggcaa    600

 

ttttggagaa aatttgaagt ttatgaaggt gacaaaaagt tgccaattaa attagtatca    660

 

tacgatactg ttaaagatta tgcttacatt cgcttctctg tttcaaatgg aacaaaagca    720

 

gttaaaatcg taagttcaac tcacttcaat aacaaagaag aaaaatacga ttacacatta    780

 

atggaattcg cacaaccaat ttataacagt gcagataaat tcaaaactga agaagattat    840

 

aaagctgaaa aattattagc gccatataaa aaagcgaaaa cactagaaag acaagtttat    900

 

gaattaaata aaattcaaga taaacttcct gaaaaattga aagctgaata caagaagaaa    960

 

ttagaagaga cgaaaaaagc tttagatgaa caagtgaaat ccgcgataac tgaattccaa   1020

 

aatgtacaac caacaaatga aaaaatgacc gatttacaag atacaaaata tgttgtttat   1080

 

gaaagtgttg agaataacga atctatgatg gatgcttttg ttaaacaccc tattaaaaca   1140

 

ggtatgctta atggcaaaaa atatatggta atggaaacta ctaatgacga ttactggaaa   1200

 

gatttcatgg ttgaaggtca acgtgttaga acaattagca aagatgctaa aaataacact   1260

 

agaacgatta tcttcccata tgttgaaggt aaaactctat atgatgctat cgttaaagtt   1320

 

cacgtaaaaa cgattgatta tgatggacaa taccatgtca gaatcgttga taaagaagca   1380

 

tttactaaag ccaatgccga taaaactaat aaaaaggaac aacaagacaa ctcagctaag   1440

 

aaggaaacta ctccagctat gcctagcaaa ccaacaacac cacctgttga aaaagaatca   1500

 

caaaaacaag acagccaaaa agatgacaat aaacaatcac caagtgttga aaaagaaaat   1560

 

gacgcatcta gtgagtcagg taaagacaaa atgcctgtta caaaaccagc taaagctgaa   1620

 

gtagaatcaa gtagtacaac tccaactaag gtagtatcta cgactcaaaa tgttgcaaaa   1680

 

ccaacaactg cttcttcaga aacaacaaaa gatgttgttc aaacttcagc aggttctagc   1740

 

gaagcaaaag atagtgctcc attacaaaaa gcaaacatta aaaacacaaa tgatggacac   1800

 

actcaaagcc aaaataataa aaatacacaa gaaaataaag ctaaatcatt accacaaact   1860

 

ggtgaagaat ctaataaaga tatgacatta ccattaatgg cattaatagc tttaagtagt   1920

 

atcgttgcat tcgtattacc tagaaaacgt aaaaactaa                          1959

 

 

<210>  3

<211>  595

<212>  PRT

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白的氨基酸序列

 

<400>  3

 

Asn Gly Glu Ala Lys Ala Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr

            20                  25                  30         

 

 

Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala

        35                  40                  45             

 

 

Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro

                85                  90                  95     

 

 

Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys

            100                 105                 110        

 

 

Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met

        115                 120                 125            

 

 

Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val

    130                 135                 140                

 

 

Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly

                165                 170                 175    

 

 

Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr

    210                 215                 220                

 

 

Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys

                245                 250                 255    

 

 

Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln

            260                 265                 270        

 

 

Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu

        275                 280                 285            

 

 

Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu

    290                 295                 300                

 

 

Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp

305                 310                 315                 320

 

 

Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met

                325                 330                 335    

 

 

Asp Ala Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys

            340                 345                 350        

 

 

Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe

        355                 360                 365            

 

 

Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn

    370                 375                 380                

 

 

Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln

                405                 410                 415    

 

 

Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala

            420                 425                 430         

 

 

Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu

        435                 440                 445            

 

 

Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys

    450                 455                 460                 

 

 

Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro

465                 470                 475                 480

 

 

Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys

                485                 490                 495    

 

 

Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr

            500                 505                 510        

 

 

Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr

        515                 520                 525            

 

 

Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly

    530                 535                 540                

 

 

Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys

545                 550                 555                 560

 

 

Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln

                565                 570                 575    

 

 

Glu Asn Lys Ala Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys

            580                 585                 590        

 

 

Asp Met Thr

        595

 

 

<210>  4

<211>  1785

<212>  DNA

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白的核苷酸序列

 

<400>  4

aatggcgaag caaaagcagc tgaagaaaca ggtgttacaa atacagaagc acaaccaaaa     60

 

actgaagcag ttgcaagtcc aacaacaaca acaactgaaa aagctccaga agctaaacca    120

 

gtagctaaac cagtagctaa tgctgtctca gtatctaata aagaagttgt ggcccctact    180

 

actgaaacaa aagaagctaa agaagttaaa gcagttaaag aagttaaagc ccctaaggaa    240

 

gcaaaagagg aaaaacctgc agcaaaagct gacaacaata catatcctat tttgaatcag    300

 

gaactaagag aagcgattaa aaaccctgca ataaaagaca aagatcatag cgcaccaaac    360

 

tctcgtccaa ttgattttga aatgaaaaag aaagatggca ctcaacagtt ttatcattat    420

 

gcaagttctg ttaaacctgc tagagttatt ttcactgatt caaaaccaga aattgaatta    480

 

ggattacaat cagggcaatt ttggagaaaa tttgaagttt atgaaggtga caaaaagttg    540

 

ccaattaaat tagtatcata cgatactgtt aaagattatg cttacattcg cttctctgtt    600

 

tcaaatggaa caaaagcagt taaaatcgta agttcaactc acttcaataa caaagaagaa    660

 

aaatacgatt acacattaat ggaattcgca caaccaattt ataacagtgc agataaattc    720

 

aaaactgaag aagattataa agctgaaaaa ttattagcgc catataaaaa agcgaaaaca    780

 

ctagaaagac aagtttatga attaaataaa attcaagata aacttcctga aaaattgaaa    840

 

gctgaataca agaagaaatt agaagagacg aaaaaagctt tagatgaaca agtgaaatcc    900

 

gcgataactg aattccaaaa tgtacaacca acaaatgaaa aaatgaccga tttacaagat    960

 

acaaaatatg ttgtttatga aagtgttgag aataacgaat ctatgatgga tgcttttgtt   1020

 

aaacacccta ttaaaacagg tatgcttaat ggcaaaaaat atatggtaat ggaaactact   1080

 

aatgacgatt actggaaaga tttcatggtt gaaggtcaac gtgttagaac aattagcaaa   1140

 

gatgctaaaa ataacactag aacgattatc ttcccatatg ttgaaggtaa aactctatat   1200

 

gatgctatcg ttaaagttca cgtaaaaacg attgattatg atggacaata ccatgtcaga   1260

 

atcgttgata aagaagcatt tactaaagcc aatgccgata aaactaataa aaaggaacaa   1320

 

caagacaact cagctaagaa ggaaactact ccagctatgc ctagcaaacc aacaacacca   1380

 

cctgttgaaa aagaatcaca aaaacaagac agccaaaaag atgacaataa acaatcacca   1440

 

agtgttgaaa aagaaaatga cgcatctagt gagtcaggta aagacaaaat gcctgttaca   1500

 

aaaccagcta aagctgaagt agaatcaagt agtacaactc caactaaggt agtatctacg   1560

 

actcaaaatg ttgcaaaacc aacaactgct tcttcagaaa caacaaaaga tgttgttcaa   1620

 

acttcagcag gttctagcga agcaaaagat agtgctccat tacaaaaagc aaacattaaa   1680

 

aacacaaatg atggacacac tcaaagccaa aataataaaa atacacaaga aaataaagct   1740

 

aaatcattac cacaaactgg tgaagaatct aataaagata tgaca                   1785

 

 

<210>  5

<211>  32

<212>  DNA

<213>  扩增IsdB2重组蛋白的基因序列的正向引物

 

<400>  5

cgcggatcca tgaatggcga agcaaaagca gc                                   32

 

 

<210>  6

<211>  45

<212>  DNA

<213>  扩增IsdB2重组蛋白的基因序列的反向引物

 

<400>  6

ttttcctttt gcggccgcct atgtcatatc tttattagat tcttc                     45

 

 

序列表

 

<110>  重庆原伦生物科技有限公司、中国人民解放军第三军医大学

 

<120>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌IsdB蛋白活性片段的重组蛋白、及其制备方法和

       应用

 

<130>  12P99139-CN

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  652

<212>  PRT

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的氨基酸序列

 

<400>  1

 

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

1               5                   10                  15     

 

 

Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Met Ser Asn Gly Glu Ala Lys Ala Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn

        35                  40                  45             

 

 

Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr

    50                  55                  60                 

 

 

Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu

                85                  90                  95      

 

 

Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

            100                 105                 110        

 

 

Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr

        115                 120                 125            

 

 

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

    130                 135                 140                

 

 

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

                165                 170                 175    

 

 

Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

            180                 185                 190        

 

 

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

        195                 200                 205            

 

 

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

    210                 215                 220                

 

 

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

                245                 250                 255    

 

 

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

            260                 265                 270        

 

 

Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

        275                 280                 285            

 

 

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

    290                 295                 300                

 

 

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

305                 310                 315                 320

 

 

Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

                325                 330                 335    

 

 

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

            340                 345                 350        

 

 

Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

        355                 360                 365            

 

 

Met Met Asp Ala Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

    370                 375                 380                

 

 

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

                405                 410                 415    

 

 

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

            420                 425                 430        

 

 

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

        435                 440                 445            

 

 

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

    450                 455                 460                

 

 

Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

465                 470                 475                 480

 

 

Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val

                485                 490                 495    

 

 

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

            500                 505                 510        

 

 

Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

        515                 520                 525            

 

 

Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser

    530                 535                 540                

 

 

Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

545                 550                 555                 560

 

 

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

                565                 570                 575    

 

 

Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

            580                 585                 590         

 

 

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

        595                 600                 605            

 

 

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser

    610                 615                 620                 

 

 

Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu Met Ala Leu Ile Ala Leu Ser Ser

625                 630                 635                 640

 

 

Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg Lys Arg Lys Asn

                645                 650        

 

 

<210>  2

<211>  1959

<212>  DNA

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的核苷酸序列

 

<400>  2

atgaacaaac agcaaaaaga atttaaatca ttttattcaa ttagaaagtc atcactaggc     60

 

gttgcatctg tagcgattag tacactttta ttattaatgt ccaatggcga agcaaaagca    120

 

gctgaagaaa caggtgttac aaatacagaa gcacaaccaa aaactgaagc agttgcaagt    180

 

ccaacaacaa caacaactga aaaagctcca gaagctaaac cagtagctaa accagtagct    240

 

aatgctgtct cagtatctaa taaagaagtt gtggccccta ctactgaaac aaaagaagct    300

 

aaagaagtta aagcagttaa agaagttaaa gcccctaagg aagcaaaaga ggaaaaacct    360

 

gcagcaaaag ctgacaacaa tacatatcct attttgaatc aggaactaag agaagcgatt    420

 

aaaaaccctg caataaaaga caaagatcat agcgcaccaa actctcgtcc aattgatttt    480

 

gaaatgaaaa agaaagatgg cactcaacag ttttatcatt atgcaagttc tgttaaacct    540

 

gctagagtta ttttcactga ttcaaaacca gaaattgaat taggattaca atcagggcaa    600

 

ttttggagaa aatttgaagt ttatgaaggt gacaaaaagt tgccaattaa attagtatca    660

 

tacgatactg ttaaagatta tgcttacatt cgcttctctg tttcaaatgg aacaaaagca    720

 

gttaaaatcg taagttcaac tcacttcaat aacaaagaag aaaaatacga ttacacatta    780

 

atggaattcg cacaaccaat ttataacagt gcagataaat tcaaaactga agaagattat    840

 

aaagctgaaa aattattagc gccatataaa aaagcgaaaa cactagaaag acaagtttat    900

 

gaattaaata aaattcaaga taaacttcct gaaaaattga aagctgaata caagaagaaa    960

 

ttagaagaga cgaaaaaagc tttagatgaa caagtgaaat ccgcgataac tgaattccaa   1020

 

aatgtacaac caacaaatga aaaaatgacc gatttacaag atacaaaata tgttgtttat   1080

 

gaaagtgttg agaataacga atctatgatg gatgcttttg ttaaacaccc tattaaaaca   1140

 

ggtatgctta atggcaaaaa atatatggta atggaaacta ctaatgacga ttactggaaa   1200

 

gatttcatgg ttgaaggtca acgtgttaga acaattagca aagatgctaa aaataacact   1260

 

agaacgatta tcttcccata tgttgaaggt aaaactctat atgatgctat cgttaaagtt   1320

 

cacgtaaaaa cgattgatta tgatggacaa taccatgtca gaatcgttga taaagaagca   1380

 

tttactaaag ccaatgccga taaaactaat aaaaaggaac aacaagacaa ctcagctaag   1440

 

aaggaaacta ctccagctat gcctagcaaa ccaacaacac cacctgttga aaaagaatca   1500

 

caaaaacaag acagccaaaa agatgacaat aaacaatcac caagtgttga aaaagaaaat   1560

 

gacgcatcta gtgagtcagg taaagacaaa atgcctgtta caaaaccagc taaagctgaa   1620

 

gtagaatcaa gtagtacaac tccaactaag gtagtatcta cgactcaaaa tgttgcaaaa   1680

 

ccaacaactg cttcttcaga aacaacaaaa gatgttgttc aaacttcagc aggttctagc   1740

 

gaagcaaaag atagtgctcc attacaaaaa gcaaacatta aaaacacaaa tgatggacac   1800

 

actcaaagcc aaaataataa aaatacacaa gaaaataaag ctaaatcatt accacaaact   1860

 

ggtgaagaat ctaataaaga tatgacatta ccattaatgg cattaatagc tttaagtagt   1920

 

atcgttgcat tcgtattacc tagaaaacgt aaaaactaa                          1959

 

 

<210>  3

<211>  595

<212>  PRT

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白的氨基酸序列

 

<400>  3

 

Asn Gly Glu Ala Lys Ala Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr

            20                  25                  30         

 

 

Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala

        35                  40                  45             

 

 

Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro

                85                  90                  95     

 

 

Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys

            100                 105                 110        

 

 

Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met

        115                 120                 125            

 

 

Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val

    130                 135                 140                

 

 

Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly

                165                 170                 175    

 

 

Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp

            180                 185                 190        

 

 

Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys

        195                 200                 205            

 

 

Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr

    210                 215                 220                

 

 

Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys

                245                 250                 255    

 

 

Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln

            260                 265                 270        

 

 

Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu

        275                 280                 285            

 

 

Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu

    290                 295                 300                

 

 

Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp

305                 310                 315                 320

 

 

Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met

                325                 330                 335    

 

 

Asp Ala Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys

            340                 345                 350        

 

 

Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe

        355                 360                 365            

 

 

Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn

    370                 375                 380                

 

 

Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr

385                 390                 395                 400

 

 

Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln

                405                 410                 415    

 

 

Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala

            420                 425                 430         

 

 

Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu

        435                 440                 445            

 

 

Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys

    450                 455                 460                 

 

 

Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro

465                 470                 475                 480

 

 

Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys

                485                 490                 495    

 

 

Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr

            500                 505                 510        

 

 

Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr

        515                 520                 525            

 

 

Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly

    530                 535                 540                

 

 

Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys

545                 550                 555                 560

 

 

Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln

                565                 570                 575    

 

 

Glu Asn Lys Ala Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys

            580                 585                 590        

 

 

Asp Met Thr

        595

 

 

<210>  4

<211>  1785

<212>  DNA

<213>  耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白的核苷酸序列

 

<400>  4

aatggcgaag caaaagcagc tgaagaaaca ggtgttacaa atacagaagc acaaccaaaa     60

 

actgaagcag ttgcaagtcc aacaacaaca acaactgaaa aagctccaga agctaaacca    120

 

gtagctaaac cagtagctaa tgctgtctca gtatctaata aagaagttgt ggcccctact    180

 

actgaaacaa aagaagctaa agaagttaaa gcagttaaag aagttaaagc ccctaaggaa    240

 

gcaaaagagg aaaaacctgc agcaaaagct gacaacaata catatcctat tttgaatcag    300

 

gaactaagag aagcgattaa aaaccctgca ataaaagaca aagatcatag cgcaccaaac    360

 

tctcgtccaa ttgattttga aatgaaaaag aaagatggca ctcaacagtt ttatcattat    420

 

gcaagttctg ttaaacctgc tagagttatt ttcactgatt caaaaccaga aattgaatta    480

 

ggattacaat cagggcaatt ttggagaaaa tttgaagttt atgaaggtga caaaaagttg    540

 

ccaattaaat tagtatcata cgatactgtt aaagattatg cttacattcg cttctctgtt    600

 

tcaaatggaa caaaagcagt taaaatcgta agttcaactc acttcaataa caaagaagaa    660

 

aaatacgatt acacattaat ggaattcgca caaccaattt ataacagtgc agataaattc    720

 

aaaactgaag aagattataa agctgaaaaa ttattagcgc catataaaaa agcgaaaaca    780

 

ctagaaagac aagtttatga attaaataaa attcaagata aacttcctga aaaattgaaa    840

 

gctgaataca agaagaaatt agaagagacg aaaaaagctt tagatgaaca agtgaaatcc    900

 

gcgataactg aattccaaaa tgtacaacca acaaatgaaa aaatgaccga tttacaagat    960

 

acaaaatatg ttgtttatga aagtgttgag aataacgaat ctatgatgga tgcttttgtt   1020

 

aaacacccta ttaaaacagg tatgcttaat ggcaaaaaat atatggtaat ggaaactact   1080

 

aatgacgatt actggaaaga tttcatggtt gaaggtcaac gtgttagaac aattagcaaa   1140

 

gatgctaaaa ataacactag aacgattatc ttcccatatg ttgaaggtaa aactctatat   1200

 

gatgctatcg ttaaagttca cgtaaaaacg attgattatg atggacaata ccatgtcaga   1260

 

atcgttgata aagaagcatt tactaaagcc aatgccgata aaactaataa aaaggaacaa   1320

 

caagacaact cagctaagaa ggaaactact ccagctatgc ctagcaaacc aacaacacca   1380

 

cctgttgaaa aagaatcaca aaaacaagac agccaaaaag atgacaataa acaatcacca   1440

 

agtgttgaaa aagaaaatga cgcatctagt gagtcaggta aagacaaaat gcctgttaca   1500

 

aaaccagcta aagctgaagt agaatcaagt agtacaactc caactaaggt agtatctacg   1560

 

actcaaaatg ttgcaaaacc aacaactgct tcttcagaaa caacaaaaga tgttgttcaa   1620

 

acttcagcag gttctagcga agcaaaagat agtgctccat tacaaaaagc aaacattaaa   1680

 

aacacaaatg atggacacac tcaaagccaa aataataaaa atacacaaga aaataaagct   1740

 

aaatcattac cacaaactgg tgaagaatct aataaagata tgaca                   1785

 

 

<210>  5

<211>  32

<212>  DNA

<213>  扩增IsdB2重组蛋白的基因序列的正向引物

 

<400>  5

cgcggatcca tgaatggcga agcaaaagca gc                                   32

 

 

<210>  6

<211>  45

<212>  DNA

<213>  扩增IsdB2重组蛋白的基因序列的反向引物

 

<400>  6

ttttcctttt gcggccgcct atgtcatatc tttattagat tcttc                     45

 

 

Claims (9)

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB的活性片段IsdB2重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3或在SEQ ID NO： 3的氨基端和/或羧基端添加或缺失若干个氨基酸后得到的与SEQ ID NO：3具有相同或相似功能的序列。

2.一种权利要求1所述IsdB2重组蛋白的重组表达载体，其特征在于，包含编码所述IsdB2重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：4或在SEQ ID NO：4的一端或两端添加或缺失若干个核苷酸后得到的编码与SEQ ID NO：3所示蛋白具有相同或相似功能蛋白的序列。

4.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体序列为pGEX-6p-2载体序列。

5.一种宿主菌，其特征在于，导入有权利要求2所述的重组表达载体。

6.一种表达权利要求1所述IsdB2重组蛋白的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）根据编码IsdB2重组蛋白的核酸序列设计正向引物和反向引物；

2）使用步骤1）设计的正向引物和反向引物，通过PCR扩增出编码IsdB2重组蛋白的基因片段；

3）将步骤2）所获得的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；以及

4）诱导转化后的宿主菌表达IsdB2重组蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1）中所设计的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

8.权利要求1所述的IsdB2重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。

9.权利要求1所述的IsdB2重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。

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