CN110079623A - 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 - Google Patents
一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110079623A CN110079623A CN201910445920.7A CN201910445920A CN110079623A CN 110079623 A CN110079623 A CN 110079623A CN 201910445920 A CN201910445920 A CN 201910445920A CN 110079623 A CN110079623 A CN 110079623A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acinetobacter bauamnnii
- virulence
- detection method
- control pipe
- conditions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 title claims abstract description 104
- 230000001018 virulence Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 63
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 40
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 31
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 28
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 28
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 15
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 claims description 7
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 6
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 18
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 abstract description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 description 2
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- MCHZKGNHFPNZDP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethane-1,1,1-triol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC(O)(O)O MCHZKGNHFPNZDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 208000031650 Surgical Wound Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000009470 Ventilator-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical group C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方，属于生物检测技术领域。以鲍曼不动杆菌内一段特异性序列作为标志物，该特异性序列存在于鲍曼不动杆菌内一段包括19个开放读码框的基因序列中，而该段包括19个开放读码框的基因序列为高毒力的鲍曼不动杆菌特有的；再以标志物特异性序列设计引物，最后基于聚合酶链反应，完成对鲍曼不动杆菌的高毒力或低毒力的定性检测，以弥补现有技术中鲍曼不动杆菌检测方法只能鉴定鲍曼不动杆菌的存在，无法准确、定性的区分各个菌株不同毒力等问题，从而保证了鲍曼不动杆菌毒力的检测标志物、检测方法的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，尤其涉及一种适用于鲍曼不动杆菌毒力为高毒力或低毒力的定性检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、***、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。由于鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药率（尤其是碳青霉烯类抗生素）有逐年增加的趋势，因而引起临床医生和微生物学者的密切关注。鲍曼不动杆菌感染的病人多为老年、危重疾病、机体抵抗力弱以及长期使用广谱抗生素的患者。
鲍曼不动杆菌的各个菌株之间存在毒力上的差异，而高毒力的菌株感染常常导致病人死亡率高，而目前临床上只能通过生化反应或者质谱技术鉴定鲍曼不动杆菌的存在，而无法有效区别各个菌株之间的毒力差异，因此，给临床医生的参考价值十分有限。
国家知识产权局于2016年07月27日公开了一种公开号为CN105803041A，名称为“一种鲍曼不动杆菌荚膜染色试剂盒及检测方法”的专利文献，其中，公开了：所述检测方法包括：鲍曼不动杆菌与刚果红染液及黏附剂混合后推制薄片,采用刚果红染色法对鲍曼不动杆菌荚膜进行染色，该发明建立了一套简便、快速、可行的鲍曼不动杆菌毒力快速评估方法，可以实现对临床分离鲍曼不动杆菌荚膜生成情况进行检测，以评估该菌株毒力和治疗难易程度，为临床治疗方案的选择提供了参考。该专利文献中提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜染色试剂盒及检测方法，可进行鲍曼不动杆菌毒力快速评估，其基于染色法，属于形态学检测。
发明内容
发明人在研究中发现，高毒力的鲍曼不动杆菌基因组中含有一段包括19个开放读码框的基因序列，而该基因序列中含有一段独有的特异性序列，以该特异性序列为靶标（即靶多核苷酸），设计引物，因此，基于这一研究结果，将该特异性序列作为生物标志物并应用于检测鲍曼不动杆菌的毒力的方法中。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提出了一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法。在本技术方案中，以特异性序列为标志物，同时以标志物设计引物，再基于聚合酶链反应，完成对鲍曼不动杆菌毒力为高毒力及低毒力的定性检测，以弥补现有技术中鲍曼不动杆菌检测方法只能鉴定鲍曼不动杆菌的存在，无法准确、定性的区分各个菌株不同毒力等问题。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
鲍曼不动杆菌内一段特异性序列作为生物标志物在检测高毒力鲍曼不动杆菌的方法中的应用，所述特异性序列存在于鲍曼不动杆菌内一段包括19个开放读码框的基因序列中；所述特异性序列经检测为阳性，则判断鲍曼不动杆菌毒力为高毒力；反之，所述特异性序列经检测为阴性，则判断鲍曼不动杆菌毒力为低毒力；
所述包括19个开放读码框的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
所述特异性序列如SEQ ID NO.2所示。
一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，包括如下步骤：
S1：取至少四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管，配制20µL的PCR扩增体系；其中，
阳性对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL阳性对照；
阴性对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL阴性对照；
实验管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL灭菌水；
S2：将经步骤S1所得的PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增，扩增反应的条件为：
在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在57～63℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持；
S3：将经步骤S2扩增反应后的产物分别进行电泳，观测91bp处是否出现条带，并作结果分析。若阳性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，以及阴性对照管扩增反应后的产物和空白对照管扩增反应后的产物对应均不出现条带，则判断实验成功，然后，得实验样本结果；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应不出现条带，或者阴性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，或者空白对照管扩增反应后的产物对应出现条带，则判断实验不成功，则需重新实验，直至实验成功，得实验样本结果。
进一步的，在S1中，所述待检测的鲍曼不动杆菌样品来于：将待检测的鲍曼不动杆菌接种于培养基中，直至培养OD600nm为0.6～0.8，取培养液为待检测的鲍曼不动杆菌样品。同时，在步骤S1中，所述鲍曼不动杆菌培养液中的待检测的鲍曼不动杆菌样品已经生化反应或质谱进行鉴定，且所述的生化反应或质谱的鉴定技术为现有成熟技术；所涉及的接种、培养及菌浓度检测等，为成熟的现有技术，比如：参考《临床细菌学实验室操作指南，于岩岩等译》。
进一步的，所述PCR反应液包括耐热DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、氯化镁溶液、氯化钾溶液、曲拉通溶液、甲酰胺溶液以及脱氧核糖核苷三磷酸。
进一步的，在所述20µL 的PCR扩增体系中，耐热DNA聚合酶浓度为5U/uL、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。
进一步的，所述上游引物序列为：5’-TTGAGAAGCTAAATTATGGCTCG-3’，下游引物序列为：5’-GATAGCACAGAAATCCATAAAGGAA-3’。
进一步的，在所述20µL的PCR扩增体系中，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5umol/L；上游引物和下游引物用于扩增特异性序列SEQ ID NO.2。
进一步的，所述阳性对照为经全基因组测序确定含有生物标志物且动物实验呈高致死率的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸。
进一步的，所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有生物标志物且动物实验呈非致死性的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸。
进一步的，所述耐热DNA聚合酶优选为Taq聚合酶。
所述PCR仪为现有成熟技术，例如：东胜龙ETC811。
所述电泳为现有成熟技术，例如：琼脂糖凝胶电泳。
在本技术方案中，配制PCR扩增体系时，阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管中对应加入PCR反应液的量一致，对应加入上游引物的量一致，对应加入下游引物的量一致，以及对应加入阳性对照、阴性对照、待检测的鲍曼不动杆菌样品与灭菌水四者之间的量一致。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
1）本发明以一段包括19个开放读码框的基因序列中的特异性序列为标志物，再基于聚合酶链反应，完成对鲍曼不动杆菌毒力为高毒力或低毒力的定性检测，以弥补现有技术中鲍曼不动杆菌检测方法只能鉴定鲍曼不动杆菌的存在，无法准确、定性的区分各个菌株不同毒力等问题；
2）本发明设计原理合理，结果判断较容易，准确性高。本发明人应用比较基因组学方法，从高毒力的鲍曼不动杆菌基因组中筛选一段包括19个开放读码框的基因片段，该基因片段的存在与鲍曼不动杆菌的毒力相关，因此，基于该基因片段中的特有序列而设计了若干特异性引物，经优化，筛选出扩增效果极佳的用于靶多核苷酸扩增的引物，即最终限定为非特异性反应较小的上游引物及下游引物，以保证PCR扩增体系反应为较小的非特异性反应；最终，以聚合酶链反应，定性检测出鲍曼不动杆菌为高毒力或低毒力，并具有较高的特异性；
3）在本发明的检测方法中，基于配制PCR扩增体系，然后进行扩增反应，在特定温度、特定时间以及特定循环次数等条件限制下，保证了较小的非特异性反应。同时，在PCR扩增体系配制中，向实验管中直接加入待检测的鲍曼不动杆菌培养液（样品），使得检测过程简单、快速，仅需1～2h，即可完成对鲍曼不动杆菌的高毒力或低毒力的定性检测，耗时短，适用性强；
4）在本发明的检测方法中，依次加入PCR反应液、上游引物、下游引物及鲍曼不动杆菌培养液，由于各物质溶液存在较大的体积差异，而以该顺序加入，一方面保障实验的方便操作性；另一方面由于较小体积的溶液不易加入至空PCR管中，从而导致假阴性，故，间接的提高高毒力及低毒力的鲍曼不动杆菌的检测准确性。
附图说明
图1为本发明中检测方法的流程图；
图2为PCR反应后，扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后的结果，其中，泳道M：核酸(DNA)分子量标准 (Marker)；泳道1：阴性对照管的PCR扩增产物；泳道2：阳性对照管的PCR扩增产物；泳道3：空白对照管的PCR扩增产物；泳道4-9：实验管（样本）的PCR扩增产物；
图3为高毒力的鲍曼不动杆菌生物标志物的阳性样本、阴性样本在C57BL/6小鼠体内的致死率比较。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实例中，所述一个临床分离株对应一个病例，比如：62株临床分离株对应62例感染鲍曼不动杆菌的病人。并且，样本的具体数量是以最大限度的能力设置。
实施例1
一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,包括如下步骤：
S1：取四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管，配制20 uL 的PCR扩增体系；其中，
阳性对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL阳性对照；
阴性对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL阴性对照；
实验管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL灭菌水；
所述上游引物序列为：5’-TTGAGAAGCTAAATTATGGCTCG-3’，
所述下游引物序列是：5’-GATAGCACAGAAATCCATAAAGGAA-3’；
S2：将经步骤S1所得的PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增，扩增反应的条件为：
在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在60℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持；
S3：将经步骤S2扩增反应后的产物分别进行电泳，观测91bp处是否出现条带，并作结果分析。若阳性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，以及阴性对照管扩增反应后的产物和空白对照管扩增反应后的产物对应均不出现条带，则判断实验成功，然后，得实验样本结果；
若阳性对照管扩增反应后的产物对应不出现条带，或者阴性对照管扩增反应后的产物对应出现条带，或者空白对照管扩增反应后的产物对应出现条带，则判断实验不成功，则需重新实验，直至实验成功，得实验样本结果。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例区别在于：
在步骤S1中的配制PCR扩增体系时，取六个PCR管，并分别编号为阳性对照管（一个）、阴性对照管（一个）、实验管（三个）及空白对照管（一个）；PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入15uL PCR反应液、1.5uL上游引物、1.5uL下游引物及2uL阳性对照；
阴性对照管中加入15uL PCR反应液、1.5uL上游引物、1.5uL下游引物及2uL阴性对照；
实验管中加入15uL PCR反应液、1.5uL上游引物、1.5uL下游引物及2uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入15uL PCR反应液、1.5uL上游引物、1.5uL下游引物及2uL灭菌水；
在步骤S2扩增反应中，在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在57℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。
实施例3
在实施例1-2的基础上，本实施例区别在于：
在步骤S1中的配制PCR扩增体系时，取八个PCR管，并分别编号为阳性对照管（一个）、阴性对照管（一个）、实验管（五个）及空白对照管（一个）；PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入18uL PCR反应液、0.5uL上游引物、0.5uL下游引物及1uL阳性对照；
阴性对照管中加入18uL PCR反应液、0.5uL上游引物、0.5uL下游引物及1uL阴性对照；
实验管中加入18uL PCR反应液、0.5uL上游引物、0.5uL下游引物及1uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入18uL PCR反应液、0.5uL上游引物、0.5uL下游引物及1uL灭菌水；
在步骤S2扩增反应中，在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在63℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。
实施例4
在实施例1-3的基础上，本实施例区别在于：
在步骤S1中的配制PCR扩增体系时，取十三个PCR管，并分别编号为阳性对照管（两个）、阴性对照管（两个）、实验管（七个）及空白对照管（两个）；PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入17uL PCR反应液、0.8uL上游引物、0.8uL下游引物及1.4uL阳性对照；
阴性对照管中加入17uL PCR反应液、0.8uL上游引物、0.8uL下游引物及1.4uL阴性对照；
实验管中加入17uL PCR反应液、0.8uL上游引物、0.8uL下游引物及1.4uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入17uL PCR反应液、0.8uL上游引物、0.8uL下游引物及1.4uL灭菌水；
在步骤S2扩增反应中，在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在61℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。
实施例5
在实施例1-4的基础上，更进一步的：
在S1中，所述待检测的鲍曼不动杆菌样品来于：将待检测的鲍曼不动杆菌接种于培养基中，直至培养OD600nm为0.6，取培养液为待检测的鲍曼不动杆菌样品。同时，在步骤S1中，所述鲍曼不动杆菌培养液中的待检测的鲍曼不动杆菌样品已经生化反应或质谱进行鉴定，且所述的生化反应或质谱的鉴定技术为现有成熟技术；所涉及的接种、培养及菌浓度检测等，为成熟的现有技术，比如：参考《临床细菌学实验室操作指南，于岩岩等译》。
实施例6
在实施例5的基础上，本实施例区别在于：
所涉及OD600nm为0.8。
实施例7
在实施例5-6的基础上，本实施例区别在于：
所涉及OD600nm为0.7。
实施例8
在实施例1-7的基础上，更进一步的：
在所述20µL 的PCR扩增体系中，所述PCR反应液包括耐热DNA聚合酶浓度为5U/uL、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。
实施例9
在实施例8的基础上，更进一步的：
在所述20µL 的PCR扩增体系中，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5umol/L。
实施例10
在实施例9的基础上，更进一步的：
所述阳性对照为经全基因组测序确定含有生物标志物且动物实验呈高致死率的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有生物标志物且动物实验呈非致死性的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；
所述生物标志物为鲍曼不动杆菌内一段特异性序列，且该特异性序列存在于鲍曼不动杆菌内一段包括19个开放读码框的基因序列中，包括19个开放读码框的基因序列如SEQ IDNO.1所示，特异性序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例11
在实施例10的基础上，更进一步的：
所述耐热DNA聚合酶包括Taq聚合酶。
实施例12
生物标志物与鲍曼不动杆菌的高毒力的关联性验证。
一、应用Spine软件对不同毒力的鲍曼不动杆菌全基因组序列进行比较，筛选出一段位于染色体上、且为高毒力的鲍曼不动杆菌特有的包括19个开放读码框的基因序列（如SEQ ID NO.1所示），以该基因序列中一段特异性序列为标志物；
二、使用Harvest软件包里的Parsnp软件将62株临床分离株的全基因组序列与高毒力的鲍曼不动杆菌标志物序列进行比对，判定是否有标志物的存在；
三、设计原理
高毒力的鲍曼不动杆菌标志物阳性样本死亡率明显高于阴性样本死亡率（如下表1所示），且其结果具有统计学意义（卡方检验，p<0.01）。
采用比较基因组学方法，筛选出一段高毒力的鲍曼不动杆菌标志物基因序列中特有的一段序列（如SEQ ID NO.2所示），并针对该序列设计特异性引物。在此基础上，提供一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法（如图1所示）。
四、基于聚合酶链反应，检测方法包括如下步骤：
1）取样
将待检测的鲍曼不动杆菌接种于培养基中，直至培养OD600nm为0.7，取培养液为待检测的鲍曼不动杆菌样品；
2）配制PCR扩增体系
取九个PCR管，并分别编号为阳性对照管(一个)、阴性对照管(一个)、实验管(六个)及空白对照管(一个)；配制PCR扩增体系为20µL，其中，
阳性对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL阳性对照；
阴性对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL阴性对照；
实验管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL经步骤1）所得待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入17uL PCR反应液、1uL上游引物、1uL下游引物及1uL灭菌水；
3)扩增反应
将经步骤2）配制PCR扩增体系后的各PCR管在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪（东胜龙ETC811）中扩增，扩增反应的条件如下表2所示；
。
PCR反应液包括Taq聚合酶、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、氯化镁溶液、氯化钾溶液、曲拉通溶液、甲酰胺溶液以及脱氧核糖核苷三磷酸；在20µL 的PCR扩增体系中，Taq聚合酶浓度为5U/uL、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。
上游引物序列为：5’-TTGAGAAGCTAAATTATGGCTCG-3’，下游引物序列是：5’-GATAGCACAGAAATCCATAAAGGAA-3’；在20µL PCR扩增体系中，上游引物及下游引物浓度均为0.5umol/L。
五、判断与结果分析
PCR扩增反应后，将各PCR反应产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，91bp处出现条带为阳性（如图2所示）。在62株经全基因组测序验证的鲍曼不动杆菌临床分离株中，含有高毒力的鲍曼不动杆菌标志物的样本结果均为阳性；不含有高毒力的鲍曼不动杆菌标志物的样本结果均为阴性。
六、验证高毒力的鲍曼不动杆菌标志物检测阳性与毒力之间的关联
利用鲍曼不动杆菌肺炎感染模型，以验证高毒力的鲍曼不动杆菌标志物阳性样本的毒力。
具体的，随机选取3例鲍曼不动杆菌生物标志物阳性样本以及4例鲍曼不动杆菌生物标志物阴性样本，以2.5×108 CFU的菌量经气管感染6～8 周的C57BL/6小鼠，7天后观察存活率，结果如图3所示，结果表明：经生物标志物阳性样本感染2天，小鼠存活率为0，死亡率为100%；经生物标志物阴性样本感染7天，小鼠存活率为50%，死亡率为50%，同时，经log-rank检验，死亡率存在显著性差异（p<0.0001）。并得出高毒力的鲍曼不动杆菌标志物阳性菌株感染小鼠后呈现高死亡率，表明该菌株毒力为高毒力。
更进一步的，对来自安徽的鲍曼不动杆菌的临床分离菌株进行检测，验证了用于定性检测鲍曼不动杆菌毒力为高毒力的标志物、引物、检测方法的应用价值。结果显示：高毒力的鲍曼不动杆菌标志物阳性样本死亡率明显高于与阴性样本死亡率（如表3所示），其结果均具有统计学意义（卡方检验，p<0.01）。
本发明第一方面示出一段位于染色体上、且为高毒力的鲍曼不动杆菌特有的包括19个开放读码框的基因序列（如SEQ ID NO.1所示）；
第二方面示出该基因序列（如SEQ ID NO.1所示）中一段特异性序列（如SEQ ID NO.2所示）为标志物，并基于该特异性序列设计特异性引物；
第三方面示出一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，在通常情况下，鲍曼不动杆菌毒力较弱，临床医生无法准确判断病人是否使用抗生素，而本发明能够迅速、准确地检测鲍曼不动杆菌为高毒力还是低毒力，因此，该本技术方案对鲍曼不动杆菌感染病人的治疗方案制定具有重要的参考意义。
以上所述的仅是本发明的一般实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离高毒力的鲍曼不动杆菌标志物序列、特异性引物等的前提下，还可以开发出若干其他方法和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法
<130> 2019.5.24
<141> 2019-05-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18813
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 1
atgtctacag atattcaatt aaatttaatt ggcagaacac aagagctttt tgttgatgat 60
attcaacaat ggaataataa gttaatcgaa attgtttcct catcgaagtt tttagtttta 120
ggtggggcgg ggtctattgg ccaagcagtt gttaaagaaa tttttaaacg taatcctaag 180
aaactacacg ttgttgatat ttcggaaaat aatctaacag aagttgttcg tgatattcgt 240
agctcgtttg gctatatcga tggtgatttc caaacatttg cactagatat tggctctgct 300
gagtatgatg catatattca gaatgatggt gattttgact acgttttaaa tctttctgct 360
ttgaagcatg tacgtagtga aaaagatcca tttacattaa tgcgaatgat tcatgtcaat 420
attttgaata ctgaaaaaac gattcagcag tctattgaaa aaggcgtgaa gaagtatttc 480
tgtgtttcaa cagataaagc tgctaaccct gtaaatatga tgggtggctc aaaacgtatt 540
atggaaatgt tccttatgcg tcaaagtcag catattgata tttccacggc tcgttttgcg 600
aatgttgcat tttcagatgg ttctttatta catggtttta atcaacgtat tcagaaaaac 660
cagccaattg ctgcgccaaa tgatattcgc cgttatttcg ttactccaaa agagtcaggt 720
gagttgtgcc tcatgtcttg tttactaggt gagaatagag atattttctt ccctaagctt 780
agcgagcact tacacctcat tacttttgct gatattgcag tcaaatatct taataacctt 840
ggatatgagc cgtatttgtg tgagtctgag gatgaagcgc gtagcttaat tcagactttg 900
ccaaaacaag gaaaatggcc ttgtttattt gctggaagca caactacggg tgagaaagat 960
tttgaagagt tctttaccga taatgaaact ttagatatgc aacgttttaa taatttaggt 1020
gttattaaaa acgaactaaa tgttgaagaa gacaagttgc atgtatttga agaaaaaatt 1080
catgcaatgc tttcaaataa gcagtggaat aaagaagaaa ttgttgatct atttaactat 1140
atgatgccta actttggaca caaagaaaca ggtttatatt tagatgggaa aatgtaatgg 1200
atacttctaa atttaatcag tttgtacgag atatttatca taccaataat tttattccat 1260
tacatgaacc tcgttttctt ggtaatgaaa agaaatatgt attagatacg attgatagta 1320
cttttgtctc tagtgttggt gcatatgtaa atgacttcga agcaaaagtt caacaattta 1380
caggttgtac taaagccatt gcgactgtta atggaacagc tgcattacat attgctcttt 1440
tactagctgg tgtaaagcgc gacgatattg taatcacgca agcgctgact tttgtcgcaa 1500
cctgtaatgc cttgtcttat attggtgcgg aaccattatt tattgatgtt tcattgaaga 1560
cactcggttt gtgcccaaag gcattagacg cttatttgca agaaaatgct tttattgatg 1620
accaaggtgt atgtaaacac aaagcaacta ataaacgtat ttctgcaatc gttccaatgc 1680
atacatttgg tcatcctgtt gaaattgatg agcttcaaca ggtcgtaacc aagtggaata 1740
ttgcattagt tgaagacgct gctgaaagtt taggttctta ctacaaaggt aaacataccg 1800
gaacttttgg tctagtttca acacttagct ttaacggaaa taaagtcatc actacaggcg 1860
gcggcggtat ggtcttgtgt caagatgagg aacttggcat aagagcgaag cacattacga 1920
caactgcaaa aataccgcat ccttatgagt tttatcatga tgaaaatggt tttaactacc 1980
gtttaccaaa tttgaatgct gccttaggtt gtgcacaaat ggaaggcttg gaaggtttcc 2040
ttgctaaaaa gcgtgattta gctcagcaat atcaagattt ctttaaagat agtgatattt 2100
catttgttgt ggaacctgaa gactgccgat ctaactattg gttaaatgcc attgtttgca 2160
aagataaagc ccaacgagat ttgattttgg atgaaaccaa ttcaaataag gtgatgactc 2220
gcccaatctg gactttaatg accagattgc caatgtacca aactgcatta caaggcgatt 2280
taactaactc attatggttg gaagaaagag ttgtaaatat tccaagttca gttcctctgg 2340
agtaataaga atgaaaaaaa tagccgtttt tacaggaact cgagctgaat atggtttgct 2400
gtattggtta atgcgagata ttcagcaaga tccagagcta gaattacaaa ttctagctac 2460
ggctatgcat tattcatctg agcacggtga aacttggaaa actattgttc aagatggttt 2520
cgaaattacc gaatcggtag aaatgctact gtcatctgat acatcgtccg ctgttgtgaa 2580
atcaatgggt gtgggcttac ttggatttgc agatgcattg aaacgtatgc aacctgattt 2640
attagttgtt ttgggtgatc gtttcgaagc tttggcagtg acgcaggctg ctttaatcat 2700
gcatattcct gttgcacatt tgcacggtgg tgaaatcact gaaggtgcat atgacgaatc 2760
aattcgtcat gcgatcacca aaatgtctaa tatccatttt gctgcagcag aagaatacaa 2820
aaaacgaatt attcagttag gcgagcaacc agaaaaagta tttaatgtcg gcgcactagg 2880
cttagatcat atccagcgta caacatttaa aaatattgca gaattgagtg aattatatga 2940
ttttgatttt tcaaaaccat attttctcat tacttatcat cctgaaacta atctactaga 3000
agaaaatgtt gcacctttat ttgatgcact taagcaaata aaagatgtca attttgtctt 3060
tagttatcca aatgcagata atggtaatac taacattgtg aaagcaatgc ttgatttaaa 3120
agcacagttg ccagatcgtg tattgcttgt aaagagtttt ggtattcaaa actatttaag 3180
tgttttgaaa aatgctttag caatggtggg taattcttca agtggtctat cagaagctcc 3240
agcattacag gtaccaacag taaatattgg tgatcgtcaa aaaggacgct tacgttgtga 3300
gtctatactt gatgttagat tagacgaaag tgaaatttta gaagcattgc aaaaagcaat 3360
taatttccca gacgatgaat tgagtaaagt tgttccacca ttagggttag gcaatacttc 3420
tcagaaaata attgaactta ttaaaacgac ggattttaaa aagaaggcac cattttatga 3480
tctttaatca agacgaaatt tatgtcattg cagaaattgg tgtaaatcat aatggctctg 3540
tagagttagc aaaagagctt attttaaaag ccaaagaatg cggtgcgaat gctgtcaaat 3600
ttcaaacatt taaagcagat agtttattat ctgatcaaac tgaaatggct gcatatcaaa 3660
aagaaaatac tagttctagt caaagccaat tagagcttgt aaaaagttta gagctcactt 3720
atgagcagac agaagaaata cagaaatttt gtgatgagca tcaaattact tttatttcaa 3780
cgccgtttga ctctgatagt ttgaagttct tggtgaatga gatcgatgta ccttacttga 3840
aagtatcatc tgctgatatt tcaaatttac cgtttctcta tgaaattgca tgttcaaaaa 3900
agcatgtcat tttatctaca ggaacagcta gcctaggtga tattgaacaa gcattatcag 3960
tatttgcttt tgttatcgat aagggaacgg aagttcgacc atctcagcag ttatttagag 4020
aagcttattc taaaatttca gtacgtaaac agttgaaaga acaggtttct atcttacact 4080
gtgtaactca atatccggca ttatttgaag aaagtaatct taaagccatt tcaaccttaa 4140
aaaatgtatt tgatttggca acagggtttt ctgatcatac gcttgatgaa tacgcggcgg 4200
ttattggtgt aagtcttggt gctcgcattt tcgaaaagca tattacatta gataaaacga 4260
tggctggccc agaccatgca gcatcaatgg aaccagatga atttaagcat tatgtcgaaa 4320
ttttgcataa aacatatgca gctttgggcg atggtattaa atttatgcta gagcaagaga 4380
gcgataacta ttacctagta cgtcgtagta ttgtggctaa aacagatatt gcggaagggg 4440
agctgttaac ctctgacaat gtcacaacaa aacgagcagg tcgcgtttgt ttagaaccaa 4500
ataagtattg ggatgttgtt ggtacaaaag caaaacgtag ctttaaaaag aacgatttta 4560
ttgaaattta aatgaaaaaa ctggcgattt ttggttcagg tggctttgca aaagagctag 4620
tagatttagc aatagatcaa ggctaccgcc atatattttt tttagaaaga aatgccaaag 4680
atggtgacac cctacttggc ttccccattt tgccagaatc agcaatatcg acattaacgg 4740
atacggtata tgcgataggt gttgctgatc caaagattcg taaaaaaata tatgaagctt 4800
atcccgattt accttatccc aatttgattc attctcaatc atcacttggc tatggcattc 4860
gagagttgct agaacatagt aaaggtgtgg taattgcggc tggagcgaga attacaaatt 4920
catgtcgttt tggtcatttt attatagtaa gttttaacag cacaattggg cacgactgta 4980
ttctagaaaa ctacgtttct gtcatgccag gtgttaatgt gtctggttgt attcatttga 5040
agcaaggcac ttacattgga acaaatgctg ctattttgcc gggcaaaagt ccagagcaat 5100
tgaaatattt aggtgaaaac tccgttatag gcgcgggtgc tgtggttgtg aaacatacgg 5160
aaccgaataa ggtctatatt ggatcacctg ctaaggaatt aagtcgtgac tagagatgtt 5220
aataatataa ttttgcataa aaatgattca attttgaaag cattagagct acttgattta 5280
tatgctttaa gaattgtttt ggtcgttgat gatcacaatc aattgatcgg aagtattaca 5340
gacggtgata ttcgtagagg gcttttaaaa ggccaagatg tgcatgcagc tgttgaaaca 5400
atcatgcata ctaaccctta tagtattgaa gaaggtagct taaataaccg ccagattttt 5460
gagatcatgc gtgaaaaaag ttatctggca ttaccagtaa ttaaaaataa tcagctagtt 5520
aatatcatta cgcttgatga tttgattcgt aaaaaacgta aagaaaatcc agtttttatt 5580
atggctggag gatttggaac acgtttacgt cctttaacag atacatgccc aaaaccaatg 5640
ttacctgttg gtggtaagcc tttactagaa accattatct caagctttaa aaatcaaggc 5700
ttttataaat tttatatttc tactcactat ttaccagaag tgattaatga gcattttggt 5760
aatggtgaga agtttgacgt acagattcaa tatgtacatg aaactgatcc gcttggaact 5820
ggcggtgcat tgagtttatt gccagcatca gatattaaat tgccattcat tgtgattaat 5880
ggtgatgtac taacaaacat gaattttgaa aaattattgg actttcatga aaagcgcgaa 5940
gctattgcaa cgatgtgcgt gagagaattc caatatcaaa ttccttatgg cgtagttaac 6000
tctgaagata atgtaataca aagcatgact gaaaaaccaa gttatttctt tgatattaat 6060
acaggtattt atgtcatttc ccctgaattg ttggcacaag ttaatgcaca gtttattggt 6120
atgccgacta tcttagaaca gcaaatggaa aagaaaaata aagtcttaag ctatccttta 6180
catgaatatt ggctcgacat cggtcatatg gaagactata accgtgcgca aaaagatatt 6240
catatgttgg gtctagaata atatgaaaaa tattgctgtt attggtttag gtaatattgc 6300
tacccgacat cgtcgtaacc ttaaaatgct ttttcctgaa gcaaaattaa ttgtgatgtc 6360
tgctagtggc cgtattccta aagagccagt gactgatagc gatcatatag cagaaagtgt 6420
tgatgaaatt attcagttgc aagttcagtt tgcaataatt gcctcaccag ctccttttca 6480
tgcccaacat gcactaccac ttattaaagc aggtatccct gtattaatag aaaaaccagt 6540
atcagttacc cagacagatg ctcaagcttt aattgatgca gaagcccagt ataagacacc 6600
tgtagcagta ggttactgtt tgcgctattt accttcagcg cagcaagtac gacaaatgat 6660
acaagagggt gtcattggaa acttatataa tgcatttatt gaaattggtc agtatttacc 6720
agattggcga cctaccaagg attatcgcga aacagtatct gctaaaactg aattgggggg 6780
aggagtccta ttagagctga gtcacgagtt agattatgct caatggattt taggttcgct 6840
tactcctaaa tatgtcgttt tacgtgcttc agaagagctc ggtttagaag tcgaggataa 6900
tgccgatctt ttaatgacaa cagcgaaagg agctgttgta aatatccact tagatttttt 6960
gcagcgtaaa gcacatcgta aatgtcgttt tattggcagt gaaggatgta ttgagtggga 7020
tttaattcga aatgaagttg tgcttattaa ggctaaagag caacaagaaa tttatagcgc 7080
ccctgagtgg gataaaaatc aaatgtattt agaaatggtt accgatttta ttaaaaaaat 7140
aaacggacag ccaaaccaat ctataagtct gcaagaagct gaaagaacag taggcctgat 7200
tgtagagatg aaagaatttg tgacgaaaga atgagactgc ttatatgaga aattttgcat 7260
ttatttttgc tagaggcggc tctaaaggtt tacctggaaa aaatattaaa ccattggcag 7320
gaaaaccgtt attacaatat tcaattgata ccgctttagc atcggatttg attgaacaag 7380
tttttgtttc aacagatgat caggctattg cacaagtcgc tatagaaggt ggagcaattc 7440
ttatagagcg acctgctgaa ctagcaactg atcaaagtcc agaatggttg tcttggcgtc 7500
atgcagttga gtgggcaact gagcactatg gctcatttga tgggtttgtt agtttacctg 7560
caactagtcc attacgtagc caagaggatg tagaggctgc gattttaaaa agacaagcag 7620
agacagctga tatttgtatt gcagttacac ccgcaagtcg cagtccttat ttcaatatgg 7680
ttaagtacaa tgaggctggt tttgttgagc ttgtcaatca gcctgaaggt gaagtatcac 7740
gccgtcaaga tgctcccaaa gtttttgata ttacaacagt agtttatgcg acaacgcctg 7800
agtttgtatt aaatagctat ggtttatttt cagggaaagt tgcgagtatt gaagtaccaa 7860
aagcaagagc tgtagatatt gatgatattt acgattttcg tttagctgaa gctattatta 7920
aaggtgaata attgatgcaa aatttattac agaataaaac ctttttagta gctggtgccg 7980
gtgggttatt aggcacgcgt ttagtggcgg ctatattaga acaaggtgca aaagttattg 8040
cagctgatat aaaccttgaa tctatggcaa ctcgattaag tagtgtagga gttaatacta 8100
caaacgaaaa gttatcgttg gtttccttag atgtaacaaa tgaaacaagt gtaaagttat 8160
ttttttcaac agatcttaaa attgatgggg ctgttaatac aacataccca cggaataaga 8220
cttatggttc gcattttttt gatgtgactc ttgaaagctt taatgagaac ttatcactac 8280
atttaggtag tatgtttttg tttactcagc aatgtgccaa atattttacg caataccaga 8340
ctcctttttc gcttgtaaat atctcatcta tttatggagt agtggctcca aaatttgata 8400
tttataacaa cacgaaaatg accatgcctg ttgagtatgc tgcaattaaa tcagcaacac 8460
tccatttaaa caaatacaca gttgcttatg tcaacgacag ccgattccgc attaattgtg 8520
taagtccagg tggtatcttt gatcatcaac ctgaaccatt tttagaagca tataagagcc 8580
atacccatgg agctggtatg ttagatgtta cagaaatcat aggttcagtt ttattcttac 8640
tttctgaaca atcaagatat gtaacaggtc aaaatattat tgtcgatgat ggcttttcaa 8700
tataacttaa ttatgagtaa tatatatata ggtgattggt aatatgaata ttattaataa 8760
tatagttgta aaattttttt taacaatagt tttttatata atattcctat taactttaga 8820
tatttttcct aataaacacc tttttgctat tttttcattt agtgtttatt tgttaaatag 8880
accaacattt attttatcac ctcggaatat gatatttata tattatttct tgtggtttgg 8940
tttggcacct atatttgcgg atagatataa ttatttagat tattctgata atatagttta 9000
taaatcttat gtttatttgt cttcaagttt tataactatg atattagttt ctatgtgtat 9060
agaaactaaa tacgaaaaaa agttttcttt tataaaagtt gattatagta atgtaagaat 9120
cgatggtaaa aaactaactt ttacttttat atttagtttt cttttttttc ttttgtattt 9180
atttaatact ggaggattta gttactggat agcaaatatt gatcgagctt ttttgactag 9240
gcaaggggca ggagtatact atttaggctt ttcattgttt ttccccgtat ttatattttt 9300
tactagattt aagtataaaa atttaatttt attaagtaca ttaagtttat tagtgatagc 9360
tttaagtcca tttataggta gtaaacaaaa aattatttat tgttttttat tactgttttc 9420
ttccttaatt ttgagaagaa agttgacact aagtaattct ttaatgattg gcttgcccac 9480
aatcttttta tttgtattag ggaattattt tagaaatgtt tcatggatga cattaagcga 9540
tgttgcttca tattcattta attattttga tactttagat tctttattgc tatttttata 9600
taacagacat tacccatttg aaattatgtc agtaggactc cctttaaata aaattgttaa 9660
tttatataca ggtggcgatg aattttttga tgtaagtgca tattatacta atatatactt 9720
tcctgatgct tggaatatac gagcaacagt acaatttcct gtggaagtag atttattttt 9780
aagttttggt ttttgggtgg gattaattcc tttaggaatt tttgttggaa tatattcatt 9840
aattttcatt aaaatgttat ctagtgaaaa aattgtatat ggttttatat ggtttaattt 9900
atttttctat ttgttaagtc acatgcgtgg tggattattt atttggacgg atttatattt 9960
atatccttat cttattttag tatattttct ttttaaagag gttaaagtta atgtgcctaa 10020
aaaataagaa atatgaaatt ataaaaaaag ctattgaaaa tgaaatttca gtagataatt 10080
atctttttga gaagctaaat tatggctcga aaaagctatc tattttcaaa atgctacgat 10140
tcaaagataa aattccttta tggatttctg tgctatcttc tattttaata ccaatttatt 10200
ttgctattga attttttgtt ttttttggaa ggagtagaaa tacatcaaat cttgaaaatg 10260
atcaatattt tttatctttt tctaactctc caaaagtaat tgcaatttat gaagaatatg 10320
cttctgatat agagtttttg caatgtatta ataataaagt ttattgtttt gttggctatt 10380
taagtcctct agttatcctg aagagtttta ttcattcaat tatactttac tttaaaatga 10440
tattttttgt taatattaaa tattatttac acttaacagc aatttttgaa ttaattttat 10500
tttatgaatt tgttattgta ttaaataaaa gaaatataaa taaaatatgt gtggtaaatc 10560
attatgatag gtggttaact gttttgtcaa atattggtaa ttttgatatt gagataatac 10620
agcatggaat tttaacagaa aattatgttg ttaagcataa aataccaaat atttcttttt 10680
taaaagtttt tgataaatct caattgagta tttttctaaa aaatatatta gagggtatac 10740
ctaataaaat tgattatatg aaaattagtt tagatatcaa cttttctgat aaatgtgaag 10800
tattgataat tagtaatcca ttttttataa atcaggaact gttattatat aaattcttga 10860
aagataaagg gattaaagtt ttttttagac ctcatccact ttatattaat gaagaaataa 10920
aaagtgtagt tgaaaatgat gagttatgtt taggaaaaag atttccatat cctaacgttt 10980
gcttatgtaa tgagtctact ttgggtaaag aatatgaagc aatgggtttt aaagtattat 11040
ggtggaatca aaatacagat tttcataaga tatggaattt agttaataat gcgtaatttt 11100
attttatatg gtttagcttc tgcttttaat agaggtggag tttttcttat actcccttta 11160
ctagctgctt tactttcagt tgtagattac ggtaaatttt ctctctatat gacagtagtt 11220
caacttttag tgccgctaat aagtctaaat atttctttat tggtgggtag ggaaatttac 11280
gaaaaaccta ttgtagttaa aagctttgtt gtactattta atagattttc tatttttaca 11340
ataatagttt tttttacttt aaattttttt attagaaata ttattttatt gattttaatt 11400
tatacctttt tggaagctat ttttttggtg aattctacat atattcgctt taagtatggt 11460
gcagatcaat ttttctatgt ttgttttttt aaaattttta ttctttcttt tttattagga 11520
agtttcttta tctatgataa gcagataata gtatcaataa aaaatcttat catgatcttt 11580
tctttttcta atttatcaat tgtatattat cttgtaaaga cctctttttc tttcagtttt 11640
aagagaatgt ttgtaattat aagcaactat aagagtatgc tacttttttc tattgggtta 11700
ttacctcata cactttctca atgggtaagt tcaagttcag accgtttttt tgtcaaactt 11760
tatacaaatg atatagaact agggtactac tcattttcat actctctggc tgctatattt 11820
atgattgtaa atagttcatt agctctcgga atacctcaat tatgtgttaa aaattttatt 11880
tattttaatt ccaaaaaatt ttactcaata ttcttttcac tagtgtcaat cttatgggtt 11940
ctatttttaa ttatttatat tgggatatta tattattttt cagacaagta tgatgttaaa 12000
tatatattta aaattggata tgtaattcta gtagggatgt attttttatc gttctattat 12060
tattattcgt cttttctttt ttatgataga gcatctaaaa agttatctta tattactttt 12120
tttgtggcag ttttaaatgt ttctctagta gtgcttctta ctcctttgtt tggtatacta 12180
ggtactgcct tcagtacatt aatatcctat ttaatatatg ttttaatgtc ctataaacat 12240
gcaagtgtta attatacggt aactaatttg tatgctcctt tatctttcat agtaattatt 12300
tcagtatcta tatttgtttt tttatacttc tttaaaatag gtggtgtgag ttatgtttaa 12360
aaataaggtt ttattaatta ctggtggtac aggatctttt ggaaatgctg tattaaaacg 12420
atttatagat agtgatttta aagaaatccg tatctttagt cgtgatgaaa aaaagcaaga 12480
tgatatgcgc aagaaatatc aatcagctaa gcttaaattt tatatagggg atgttcgaga 12540
ttttaattct gttttaaatg taactagagg tgttgattat atttttcatg ctgcagcact 12600
taagcaggtt ccttcttgcg aattttatcc aatggaagct gttaaaacaa atgtgttggg 12660
gacagaaaat ttattagaag cagccattca aaacaatgtt acaagggtag tttgcttaag 12720
cacagataaa gctgtatatc ctattaatgc aatgggcatt tctaaagcca tgatggaaaa 12780
agttatggtc gcaaagtcac gtaacctaga aggcttagat acagttattt gtggcactcg 12840
ttatggcaat gtgatggctt cccgtggttc tgtgattcca ttgtttgttg atcaaatacg 12900
tattggtaaa tctattacaa taacagatcc gaatatgaca cgttttatga tgactttgga 12960
agatgcggta gacttagttc tctatgcttt cgagcatggt gaaaacgggg atatttttgt 13020
acaaaaagca cctgcggcta ctattgatac tttagctaga gctattactc aattattaga 13080
taaacctgaa catccaattc atattattgg tactcgccat ggagaaaaag cttatgaggc 13140
tttattaagt cgtgaagaaa aagcatgtgc cgaagatctc ggtgattatt tccgtgtacc 13200
agcagaccaa cgcgacttga actacgaaaa gtatgtagaa gatggtgatt taaaaattac 13260
tgagttcgaa gattacaact cacataacac cactcgtcta gatgtagagg gtatgaaaca 13320
attattgctt aaactagatt ttgttcgcgc attaacaaga ggcgaatata tttcaccaga 13380
ggcgtaagca tgaaagtttt agttaccggt tctaatggtt ttattgcaaa aaactttatt 13440
cagtttttat cagagaaggc tgaagttgag attttaaaaa ctcatcgtga aacaacagat 13500
caagagttag agcaatcagt tcttgcttcg gactggattg tgcatttagc gggtgtgaat 13560
cgccctttaa atgaaagtga atttgcggaa ggcaatacca ctttaacaga aaagatcagt 13620
caaattttgc agcaagcaaa taagaaaaca cctgttatct tatcgtcttc tattcaggtc 13680
gagcgtgata acccctatgg taaaagtaag ctaggtggag agcaggcact ggtcactctt 13740
catcaagcag aaggtaatcc ggtttatatt tgccgtttag ccaacgtttt tggtaaatgg 13800
tcacgcccta attataactc tgcagttgca actttttgcc ataatgttgc aaatgatttg 13860
cccttacaaa ttcatgatga aaatgctgtg attcgtcttg tttatgtcga tgatgtagtt 13920
gaaacattct ggaatattct gaatgggcaa caagttgaac aaattttcca agtcgaacct 13980
gaatatcaaa ttaccgtagg tgatttggct aaagttttaa atggctttaa agcatcaaga 14040
gatacactta ttaccgaccg tgtgggaaca ggtcttactc gtgcacttta ttcaacttat 14100
ttgagttttt taaagcctga gcaattcgat tacagtgttc caaaatatgg tgatgctcgc 14160
ggtgtattcg ttgaaatgct gaaaacccca gatgcagggc aattttctta ctttactgct 14220
catccaggaa ttacccgtgg tggtcattat caccatacaa aaactgaaaa gttccttgtt 14280
attaagggta aggcattatt taagtttaag catgttgtaa caggtgaatt ttatgagctt 14340
gaaacacaag gcgatgaacc acgaattgta gaaacggtgc ctggttggac acatgatatt 14400
actaacatcg gtgatgatga gatggtggta atgctatggg caaatgaaat ttttgatcgt 14460
gataagccag atacttatgc gatgccaata acaaattaag agtatagatt tgtgaaaaag 14520
ttaaagttaa tgacagtggt gggcacacgt ccagaaatta tccgtttgtc ttgtgtaatg 14580
gctgcgtgtg atgaatattt tgaccatatt attgttcata ctggtcaaaa ctatgactat 14640
gaattgaatg aaattttctt tactgatttg ggtatccgta aacctgacca tttcttaaat 14700
gcagctggtg cgacaggtgc agaaacgatt ggtaatgtaa ttattgcggt tgataagatt 14760
ttagatgaag tgcaacctga agctttactt gttttagggg acacaaacag ttgtatggca 14820
gtattacctg caaaacgtcg taaaattcca actttccaca tggaagctgg aaaccgttgt 14880
tttgatatgc gagttcctga agaaattaac cgccgaattg tcgatcatac ggctgatatt 14940
aatttaactt acagtacgat tgcccgcgat tatttattgg cagaaggttt accagctgac 15000
ttagtaatca aaacgggtag tccaatgttt gaggtacttc accattacaa agcaaaaata 15060
gaagcttctg atgttcttga gcgtttaaat ttaaaagagc atgaatactt tattgttagt 15120
gctcatcgtg aagaaaacat taactcagat cagaacttct tagatttggt tgaaatgtta 15180
aatgcagttg cagagcgata tcagtaccct gtgattgtat cgacacatcc tcgtacgcgt 15240
aaacgtattg aagagttaaa tattgatttt catcctttga ttcaattatt aaaaccactc 15300
ggttttagtg actacaacaa gttacagctt tcagcaaaag cggcattgtc tgatagtgga 15360
acgattaacg aagaatcatc aatcttgaat ttccctgcac ttaatttgcg tcaagcacat 15420
gagcgtccag aaggaatgga agaagcggct gtaatgatgg taggtttgaa agccgaacgc 15480
attttacaag gtttggcaat tttagaaggt caaactagag gcgaaaatcg tcttttgcgt 15540
ttagttgaag actacagtat gccaaatgtg agtgaaaaag ttgtgcgtat cattatgagt 15600
tacacagatt atgtaaatcg agtgatttgg aagaagtatt gaggttaagg cagtgaagaa 15660
gaaggtctat ttaatcacgg aatattatca tccatatcaa aatacgacag gttacttgtt 15720
aggaaaattg tatgacacct tgaatgtaca aagtgatata gaccttgttc ttattgcaaa 15780
agaggataca aactgtcctc aacatgcaaa tgcacacttt attaaagcta aaaagccaaa 15840
taaggcaagt ttgtttaaaa gatttttata tgaactaatt atcgctttta gttttttaat 15900
gaagactttg caagtagtga aaaaggatag tatcgttttt acaggtacga ctcctatttt 15960
actgcttttt gttttattta ttattaaaaa gtttctaaat tttagatgga tattattagt 16020
ccatgatgta tttcccgaaa atttagcagc tgctaaaatt ttaaaaaaag atcatttttt 16080
atttaaaatc ttaaaaagct tatttgatag gatttatgca agtgctgatg aggtgattgt 16140
cattggcaaa gatatgaaag agttagtaca tcaaaaaacg catcaaagta acaatattac 16200
tgtagtgcag aattggattg actcatctga tattggtaca gagcctaaaa ctaataaccg 16260
aattttacaa gaattgaact ggttggatag tgaaactacg atttttcaat tcttcggtaa 16320
tattggtcgt gtacaaggcg tagaaaatat tctgcatgct attcagaaaa tgaaatatgc 16380
acatttggca aaattcattt ttattggtga tggtgcatat gttgctcgtc ttaaagagca 16440
aatacagtct ttgggatctc aaaatattct ttattatgga tctttagatc agaaagaaaa 16500
aacaactggt ttaaatgcgt gtgatgttgc attgattact ttggctgatg ggatgttagg 16560
tttaggggtt cctagtaaat cttatttttc tatggcggca gataagcctt tgctagcaat 16620
tatggatagg gagtcagaag tagcagatat gattaatact catcatatcg gttgggtagt 16680
cccacctaat aatgaagagg ctttggcaaa acaacttgat gaaattgtgt tagcaaaata 16740
ctgctatgca ttcaattcat caagagaagt attaaatgaa ttttattcag aaaaagtagc 16800
aatgagtaaa attctaaata ttattagaaa atttacttaa gaatttaatt tttaaaatga 16860
atatcttgat tacaggaagt agtggttttg ttggttcata cttatgtgaa tattttacga 16920
caatgccaga atatagtgtt ctggctcaaa ctcgtaaaaa tacacaaaag ttaagtaatg 16980
atataaagac tataactttt gatataaatg atgatctaac ttctttggac ttgagctcat 17040
tagatgtcat tgtgcattgt gctgggcgtg ctcatattat gaaggaagtt gaaagtgatc 17100
cactatctat ttatagaaaa gtaaatgtag aaggaacact gaatttagct aaaaaagcag 17160
ctaaagctgg tgtaaaatga tttatattta tgagtagtat taaagtaaat ggtgaagtga 17220
gtgatcaagt accttttact cctcatgata atattataaa tattaaagat ccttatggat 17280
tatcaaaata tgaagctgaa caatctctat taaatttagc gcaaaactcg atgatggagg 17340
tggtcattat tcgcccagct ttaatctatg ggccaaatgt taaggcaaat tttaaaagta 17400
tgatcaatct ggcggctaaa ggaattcctt tgcctgttgg atgcctcgat aataaaagaa 17460
gtatggtcag tatttataat ttaagcgatt tcattaatat ttgtttatca catcctttag 17520
caaaaaatca ggctttttta attagtgatc aagacgatat aacagttaaa gaattattta 17580
cgaagttagc taaagttcag ggtagaaatc ttattgctgt gcctatacct aaagtattaa 17640
ttaatttttt aactaaactt cttaataaga gtgctgtcgc ttcaagactt tgttctgtat 17700
tgatcgttga cacctcaaag aatatagaac tattaggatg gagagctcct tttagctttg 17760
atgagagctt aaaattgatg ttcaaaaagt aataggtttg atatgaatgt tattatatct 17820
ttcatcattc tttttcttat ttcttttgta ttaactttta gtgttcgaaa atatgcttta 17880
agaaaaaata ttattgattt acctaacttt agaagttcac atatgaagcc cacaccacgt 17940
ggtggtggag tagcaatagt gataagtgtt ctaatggctt tattatatag ctatatatct 18000
cagtttataa gtttgaatga ttttttcatt atagggggga gttgtttgct tattgctctc 18060
cttggttttt gtgatgatca tgctcatatc aattctatgt tgcgcttaag tattcatttt 18120
attactgcaa catttatcgt atttagttta aatggctttg cccaagtctc tgtttttaat 18180
aatttaaact taggtttttt taccaacatt cttgctattc tttttctggt ttggatgctt 18240
aatttatata actttatgga tggtattaat ggtattgcaa gtatcgaagc aatatcagtc 18300
ggactaagtc tagctttatt atacagttgg tatgacatca ataattttat attacttgca 18360
atcacttcta ttgtctgtgg ttttctcgta tggaattttc caaaagctaa aatctttatg 18420
ggagatgtag gtagtagttt tttaggtttt ttattcgcta tattagcttt atatgcttta 18480
aaaatagact ttaagttatt tctagcttgg atcatttgtc taggggtttt tatagtagat 18540
gcaaccttta caattataag gagaatacta agaggggaga aaatatatca agctcatcga 18600
agccacgctt atcaatacgc tgctaggtat tttgatagtc atacacccgt aactttagca 18660
gttttaatca ttaatcttat atggctctta ccttgtgcat tttttgtatt aaataaagca 18720
atttctccat tagtcggttt aataatcgca tattttcctt taataatttt agctatttat 18780
tttaatgcag gacagttaga acataaaact taa 18813
<210> 2
<211> 1086
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 2
atgtgcctaa aaaataagaa atatgaaatt ataaaaaaag ctattgaaaa tgaaatttca 60
gtagataatt atctttttga gaagctaaat tatggctcga aaaagctatc tattttcaaa 120
atgctacgat tcaaagataa aattccttta tggatttctg tgctatcttc tattttaata 180
ccaatttatt ttgctattga attttttgtt ttttttggaa ggagtagaaa tacatcaaat 240
cttgaaaatg atcaatattt tttatctttt tctaactctc caaaagtaat tgcaatttat 300
gaagaatatg cttctgatat agagtttttg caatgtatta ataataaagt ttattgtttt 360
gttggctatt taagtcctct agttatcctg aagagtttta ttcattcaat tatactttac 420
tttaaaatga tattttttgt taatattaaa tattatttac acttaacagc aatttttgaa 480
ttaattttat tttatgaatt tgttattgta ttaaataaaa gaaatataaa taaaatatgt 540
gtggtaaatc attatgatag gtggttaact gttttgtcaa atattggtaa ttttgatatt 600
gagataatac agcatggaat tttaacagaa aattatgttg ttaagcataa aataccaaat 660
atttcttttt taaaagtttt tgataaatct caattgagta tttttctaaa aaatatatta 720
gagggtatac ctaataaaat tgattatatg aaaattagtt tagatatcaa cttttctgat 780
aaatgtgaag tattgataat tagtaatcca ttttttataa atcaggaact gttattatat 840
aaattcttga aagataaagg gattaaagtt ttttttagac ctcatccact ttatattaat 900
gaagaaataa aaagtgtagt tgaaaatgat gagttatgtt taggaaaaag atttccatat 960
cctaacgttt gcttatgtaa tgagtctact ttgggtaaag aatatgaagc aatgggtttt 1020
aaagtattat ggtggaatca aaatacagat tttcataaga tatggaattt agttaataat 1080
gcgtaa 1086
Claims (8)
1.一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,其特征在于，包括如下步骤：
S1：取至少四个PCR管，并分别编号为阳性对照管、阴性对照管、实验管及空白对照管，配制20µL 的PCR扩增体系；其中，
阳性对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL阳性对照；
阴性对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL阴性对照；
实验管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL待检测的鲍曼不动杆菌样品；
空白对照管中加入15～18uL PCR反应液、0.5～1.5uL上游引物、0.5～1.5uL下游引物及1～2uL灭菌水；
所述上游引物序列为：5’-TTGAGAAGCTAAATTATGGCTCG-3’，
所述下游引物序列为：5’-GATAGCACAGAAATCCATAAAGGAA-3’；
S2：将经步骤S1所得的PCR扩增体系分别在转速为3000rpm的条件下，离心30s，再放置于PCR仪中扩增；
S3：将经步骤S2扩增反应后的产物分别进行电泳，观测91bp处对应是否出现条带，并作结果分析。
2.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，其特征在于，在S1中，所述待检测的鲍曼不动杆菌样品OD600nm为0.6～0.8。
3.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，其特征在于，所述PCR反应液包括耐热DNA聚合酶、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、氯化镁溶液、氯化钾溶液、曲拉通溶液、甲酰胺溶液以及脱氧核糖核苷三磷酸。
4.根据权利要求3所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,其特征在于，在所述PCR扩增体系中，耐热DNA聚合酶浓度为5U/uL、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200mmol/L、氯化镁溶液浓度为20mmol/L、氯化钾溶液浓度为500mmol/L、曲拉通溶液体积比为0.2%、甲酰胺溶液体积比为10%以及脱氧核糖核苷三磷酸浓度为10mmol/L。
5.根据权利要求1或4所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法，其特征在于，在所述PCR扩增体系中，所述上游引物及下游引物浓度均为0.5umol/L。
6.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,其特征在于，所述阳性对照为经全基因组测序确定含有生物标志物且动物实验呈高致死率的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；所述阴性对照为经全基因组测序确定不含有生物标志物且动物实验呈非致死性的临床鲍曼不动杆菌菌株核酸；
所述生物标志物为鲍曼不动杆菌内一段特异性序列，且该特异性序列存在于鲍曼不动杆菌内一段包括19个开放读码框的基因序列中，包括19个开放读码框的基因序列如SEQ IDNO.1所示，特异性序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求1或3或4所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,其特征在于，所述耐热DNA聚合酶包括Taq聚合酶。
8.根据权利要求1所述的适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法,其特征在于，扩增反应的条件为：在94℃条件下反应3min；然后35个循环，其中，包括依次在94℃条件下反应30s，在57～63℃条件下反应30s，在72℃条件下反应30s；最后，在72℃条件下反应5min，然后在4℃条件下保持。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910445920.7A CN110079623B (zh) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910445920.7A CN110079623B (zh) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110079623A true CN110079623A (zh) | 2019-08-02 |
| CN110079623B CN110079623B (zh) | 2022-11-11 |
Family
ID=67422027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910445920.7A Active CN110079623B (zh) | 2019-05-27 | 2019-05-27 | 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110079623B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111876509A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-11-03 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种检测高毒力鲍曼不动杆菌的pcr方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009059379A1 (en) * | 2007-11-07 | 2009-05-14 | Dynamic Microbials Limited | Antimicrobial compositions, formulations and uses thereof |
| CN104877019A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-09-02 | 中国人民解放军第三军医大学 | 鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制备方法和应用 |
| CN106434996A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-02-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种检测鲍曼不动杆菌dna的试剂盒及检测方法 |
| WO2017160779A2 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits to identify klebsiella strains |
| CN107338315A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于15种肺炎致病菌快速检测的试剂盒 |
-
2019
- 2019-05-27 CN CN201910445920.7A patent/CN110079623B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009059379A1 (en) * | 2007-11-07 | 2009-05-14 | Dynamic Microbials Limited | Antimicrobial compositions, formulations and uses thereof |
| CN104877019A (zh) * | 2015-04-24 | 2015-09-02 | 中国人民解放军第三军医大学 | 鲍曼不动杆菌假定蛋白a1s_1523的蛋白及制备方法和应用 |
| WO2017160779A2 (en) * | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits to identify klebsiella strains |
| CN106434996A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-02-22 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种检测鲍曼不动杆菌dna的试剂盒及检测方法 |
| CN107338315A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于15种肺炎致病菌快速检测的试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HONG-YU OU ET AL.: ""Complete genome sequence of hypervirulent and outbreak-associated Acinetobacter baumannii strain LAC-4:epidemiology, resistance genetic determinants and potential virulence factors"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| OU,H.Y. ET AL.: ""Acinetobacter baumannii LAC-4,complete geneme,CP007712.1"", 《GENBANK》 * |
| 缪应纯等: ""鲍曼不动杆菌研究进展"", 《山东化工》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111876509A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-11-03 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种检测高毒力鲍曼不动杆菌的pcr方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110079623B (zh) | 2022-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1895015B1 (en) | Method and kit for the detection of bacterial species by means of dna analysis | |
| Kee et al. | Detection of leptospiral DNA by PCR | |
| JP2002529069A (ja) | クラミジア・ニューモニエのゲノム配列 | |
| CN105018489A (zh) | 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒 | |
| CN104846097B (zh) | 幽门螺旋杆菌分型与耐药突变基因检测试剂盒 | |
| CN102947467A (zh) | 铜绿假单胞菌血清分型检测方法和试剂盒以及用于该方法和试剂盒的寡核苷酸序列 | |
| US7989170B2 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera anaplasma/ehrlichia and bartonella | |
| Zhang et al. | Genomic comparison of plant pathogenic and nonpathogenic Serratia marcescens strains by suppressive subtractive hybridization | |
| CN105018628A (zh) | 鉴别布鲁氏菌a19疫苗株与野毒株的试剂盒 | |
| KR20190002362A (ko) | 병원성 세균을 특이적으로 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN110305877B (zh) | 霞樱叶绿体基因组及其应用 | |
| WO2006121134A1 (ja) | マイコバクテリウム・カンサシ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・カンサシの検出方法 | |
| EP1795614B1 (en) | Diagnostic method and products useful therein | |
| CA2525540A1 (en) | Enterococcus antigens | |
| CN107338302A (zh) | 与陆地棉纤维长度关联的snp分子标记及其应用 | |
| CN110079623A (zh) | 一种适用于鲍曼不动杆菌毒力的检测方法 | |
| CN110157824A (zh) | 一种检测高毒力鲍曼不动杆菌的试剂盒及其使用方法 | |
| CN109337995A (zh) | 土拉杆菌及其亚种的pcr检测方法和试剂盒 | |
| CN103160587B (zh) | 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| CN104328206B (zh) | 艰难梭菌二元毒素的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒 | |
| WO2005030027A2 (en) | Salmonella detection identification | |
| KR101475033B1 (ko) | 탄화플루오르옥탄술폰산염노출에 대응하는 히드라 유전자 및 이를 이용한 수생태계 환경오염 진단 방법 | |
| CN105154438B (zh) | 对蜂房哈夫尼亚菌g5907，g5908，g5913，g5916特异的核苷酸及其应用 | |
| CN105112406B (zh) | 对蜂房哈夫尼亚菌g5897，g5898，g5900特异的核苷酸及其应用 | |
| CN108715897A (zh) | 基于特异性序列的维氏气单胞菌检测引物、试剂盒、检测方法及其开发方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20190802 Assignee: Guangzhou Saimo Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: SHENZHEN PEOPLE'S Hospital Contract record no.: X2024980005517 Denomination of invention: A detection method for the virulence of Acinetobacter baumannii Granted publication date: 20221111 License type: Common License Record date: 20240510 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Huang Wei Inventor after: Zhang Min Inventor after: Zheng Chao Inventor before: Huang Wei Inventor before: Zhang Min Inventor before: Zheng Chao Inventor before: Zou Quanming Inventor before: Zhang Jinyong |