CN102240399B

CN102240399B - 鳜传染性脾肾坏死病毒（isknv）orf093蛋白的应用

Info

Publication number: CN102240399B
Application number: CN 201110191339
Authority: CN
Inventors: 付小哲; 吴淑勤; 李宁求; 石存斌; 潘厚军
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2011-07-09
Filing date: 2011-07-09
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-07-09
Also published as: CN102240399A

Abstract

本发明公开了鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。本发明的鳜ISKNVORF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，保护率超过45%，可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。

Description

鳜传染性脾肾坏死病毒（ ISKNV ） ORF093 蛋白的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白的应用。

背景技术

鳜(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一，由传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）引起的鳜鱼虹彩病毒病是鳜鱼养殖的主要疫病，导致鳜死亡率接近100％，成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。长期以来，对于鳜病毒病的防治一直没有有效的药物，而且抗生素、化药等防治疾病弊端众多，如病原耐药性、环境污染、食品安全问题等。因此作为符合环境友好和可持续发展战略的病害控制措施，疫苗、抗血清等生物制剂正成为国际现代水产养殖业的标准生产规范和研究开发的前沿热点领域。因此，研制与发展鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及治疗制剂对防治鳜鱼虹彩病毒病具有战略意义，寻找新的疫苗候选抗原及抗病毒血清是当今鳜鱼虹彩病毒病研究的重点之一。

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是虹彩病毒科肿大细胞属的代表种，为细胞质内寄生的具囊膜二十面体病毒，直径为150nm，含有双链DNA，基因组由111,362个碱基组成，包括125个预测开放读码框ORF（open reading frames），鳜鱼是其主要感染宿主。目前控制病毒性疾病主要有两种手段：接种疫苗和使用抗病毒药物。在鳜虹彩病毒病疫苗研究方面，潘厚军等采用灭活组织浆疫苗对其进行防治，在室内和田间实验效果较好，但是由于疫苗材料来源于病鳜内脏组织，受季节和数量上的限制，推广应用有一定的困难。由于基因工程疫苗不受上述条件的限制，成为研制鳜ISKNV疫苗的一个理想的方法。2004年，张敏等进行了ISKNV主衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP) 的原核表达，采用免疫印记的方法初步确定了重组MCP蛋白与ISKNV MCP蛋白有相同的抗原特性，为ISKNV重组亚单位疫苗的研制提供了思路。2009年，付小哲等对重组MCP蛋白的免疫原性进行了初步研究，发现重组MCP蛋白有较好的免疫原性，可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答。在其他虹彩病毒病疫苗研制方面，日本的研究人员研制出抗真鲷虹彩病毒（RSIV）细胞灭活疫苗，免疫保护率在75%以上，是亚洲地区唯一成功进行商业化生产和应用鱼类病毒性疾病的疫苗。日本研究人员还对RSIV核酸疫苗（ORF380R，ORF 569R）进行了研究，结果显示重组核酸疫苗能够产生45~60%左右的免疫保护。Park等根据ORF055构建了条石鲷虹彩病毒（RBIV）核酸疫苗，结果显示免疫真鲷血清在BF-2细胞上对病毒具有一定的中和作用，但尚无免疫保护数据。在抗血清等抗病毒药物方面尚无相关研究。

到目前为止，还没有出现以ISKNV ORF093基因作为疫苗前体及其抗血清制剂的研究报道。

发明内容

本发明提供了鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗及药物中的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用。

优选的，所述（ISKNV）ORF093蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明具有以下有益效果：

鳜ISKNV ORF093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，由ORF093重组蛋白制备的抗血清对鳜虹彩病毒病也有较好的中和效果。制备的ORF093重组核酸疫苗免疫鳜鱼30天后，保护率超过45%，由ORF093重组蛋白制备的兔抗血清对ISKNV也有较强的中和作用，中和液注射鳜鱼28天后，相对存活率超过56%。因此，鳜ISKNV ORF093蛋白可以开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。

附图说明

图1是ISKNV ORF093基因的PCR扩增图，其中M为maker，1为ISKNV ORF093基因；

图2是SDS-PAGE分析ISKNV ORF093重组融合蛋白的表达图，其中1为蛋白marker，2为pET32a(+)空载，3为诱导表达上清，4为诱导表达前菌体，5、6为诱导表达后菌体总蛋白；

图3是SDS-PAGE分析ISKNV ORF093重组融合蛋白的纯化图，其中1为蛋白marker，2为 pET32a(+)空载，3为纯化后的重组蛋白，4为表达重组蛋白包涵体；

图4是重组质粒pET32a-093表达产物的western- bloting分析图，其中1为pET32a(+)空载，2为ORF093重组蛋白，3为预染蛋白marker；

图5是免疫斑点检测ISKNV图，其中1为鳜脑细胞，2为细胞培养的ISKNV。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1

1 鳜ISKNV ORF093重组蛋白在大肠杆菌中的原核表达

1.1 根据GenBank中传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）[NC_003494] ORF093序列（SEQ ID NO:1）设计引物，并引入酶切位点（以下划线标注）。引物序列如下：

P1：【5`- CGGAATTCATGAATAAAACGC -3'】（SEQ ID NO：3），引入EcoRⅠ酶切位点；

P2：【5'- CGGAAGCTTTTAAACATGGCGTC -3'】（SEQ ID NO：4），引入HindⅢ酶切位点。

1.2 以本实验室自保存的鳜ISKNV基因组为模板进行PCR扩增，25μL PCR反应体系包含：10×buffer（含Mg2+）2.5μL，4×dNTP（10mmol/L）0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，DNA 1.0μL，无菌双蒸水补足。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45S，50℃复性45S，72℃延伸30S，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果显示，在900bp左右出现亮带，片段大小与预期927bp基本相符（见图1），将目的产物进行胶回收纯化，送至测序公司测序，序列见SEQ ID NO:1。

1.3 将纯化后的ISKNV ORF093 PCR产物及提取的原核表达质粒pET32a（+），分别用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。pET32a（+）的酶切体系为：10×NEB Buffer 5μL，100×BSA 0.5μL，EcoRⅠ（20U/μL）1μL，HindⅢ（20U/μL）1μL，pET32a（+）15μL（7μg/μL），灭菌双蒸水补足50μL。ORF093 PCR产物酶切体系为：10×NEB Buffer 5μL，100×BSA 0.5μL，EcoRⅠ（20U/μL）1μL，HindⅢ（20U/μL）1μL，ORF09340μL（2.5μg/μL），灭菌双蒸水补足50μL。将酶切产物进行胶回收纯化。

1.4 将纯化后的PCR产物和pET32a(＋)质粒16℃连接过夜，连接体系为：pET32a(＋) (9ng/μL) 3.0μL，ORF093 5.0μL（7ng/μL），T4 DNA ligase (5U/μL) 1.0μL，2×Rapid Ligation Buffer 1.0μL。

1.5 将连接反应液5μL加入100μL DH5α感受态细胞（Takara, Japan）中，轻轻旋转离心管以混匀，置冰浴30min后，将感受态细胞置于42℃水浴热激90S，然后快速转到冰浴中冷却3min。再向每个离心管中加入900μL灭菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min（转速200rpm/min）。吸取100μL已转化的感受态细胞涂布LB平板（含amp 50μg/mL），37℃正置培养30min后，倒置培养16h。

1.6 挑取白色菌落，接种于3mL加Amp（终浓度50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养过夜。吸取1mL菌液转入1.5mL离心管中，送至测序公司测序，鉴定重组表达载体pET32a-ORF093是否正确构建，序列见SEQ ID NO:1。

1.7 吸取含有鉴定正确的pET32a-ORF093 DH5α菌液30μL加到3 mL含有Amp （终浓度50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜。采用质粒提取试剂盒（OMEGA, USA）提取重组质粒pET32a-ORF093。取2μL重组质粒加入100μL BL21(DE3)感受态细胞（Takara, Japan）中进行转化，后续实验方法见步骤1.5。

1.8 挑取白色菌落，接种于3ml加Amp（终浓度50μg/ mL）LB培养基中，37℃震荡过夜，按1%的接种量再次接种于含有Amp培养基中继续培养至OD值为0.6，加入IPTG（终浓度为1mmol/L），37℃诱导表达4h。

1.9 收集菌体进行SDS-PAGE分析。配制15%的分离胶和5%的浓缩胶。吸取20μl菌液，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后100℃水浴5min，吸取20μl样品加入点样孔中，120V电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳，将凝胶置于新配的考马斯亮蓝染色液中，染色1h，回收考马斯亮蓝染色液，加入脱色液室温下摇动脱色，直至背景颜色完全脱去。结果显示在约36KD处有一条特异性表达带，与预期大小相符（见图2），其氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

1.10 融合蛋白按照Bugbuster His Bind Purfification Kit（NOVAGEN,Canada）说明书进行纯化。

1.11 将纯化好的蛋白溶液装入透析袋，4℃依次用透析液1、2、3、4、5进行透析，透析时间依次为2h、2h、3h、3h、15h（过夜）。再将透析好的蛋白溶液用PEG20000进行浓缩。吸出透析好的样品溶液，12000rpm离心10min ，取10μl上清进行SDS-PAGE分析（见图3），方法见步骤1.9。

透析液1：50 mM Tris-Cl (pH8.5)， 4 mM Urea ，5mM EDTA，

5mMß-巯基乙醇，20% 甘油；

透析液2：50 mM Tris-Cl (pH8.5)， 2 mM Urea ，2.5mM EDTA，

2.5mMß-巯基乙醇，20% 甘油；

透析液3：50 mM Tris-Cl (pH8.5)，1 mM Urea，1mM EDTA，

1mMß-巯基乙醇，20% 甘油；

透析液4：50 mM Tris-Cl (pH8.5)，0.5 mM Urea，5mM EDTA，

0.5mMß-巯基乙醇，20% 甘油；

透析液5：50 mM Tris-Cl (pH8.5)，20% 甘油。

2 抗重组 ORF093 融合蛋白多克隆抗体的制备

2.1 将复性后的ORF093重组蛋白浓度调整为2mg/mL，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化。

2.2 取新西兰白兔2只，一只注射ORF093重组蛋白，一只注射PBS（pH7.4）。注射前，从耳静脉取1ml血制备血清，作为对照。

2.3 首次免疫采用皮下多点注射方式进行，每只注射2ml。免疫15天后进行加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量为初次免疫的2/3。以后每隔7天加强免疫一次，免疫剂量为初次免疫的2/3。每次加强免疫前均由耳静脉取血1ml，ELISA检测抗体效价。

2.4 待效价达到所需效价时，割断兔颈动脉放血。50mL离心管收集全血，室温静置1h，待其凝固后，放置4℃冰箱过夜。4℃下5000rmp离心10min，取上清即血清。在血清中加入0.05%叠氮钠，小管分装后-20℃保存。

3 免疫印记分析抗重组 ORF093 融合蛋白多克隆抗体

3.1 将纯化后的重组ORF093融合蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，方法见步骤1.9。

3.2 电泳完毕后，将凝胶上分离的蛋白转移到硝酸纤维素滤膜（NC膜）上，在80mA的电流下转移4h，丽春红染色观察转移情况。

3.3 用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭无关蛋白的潜在结合位点，室温摇床孵育1h。

3.4 弃封闭液，立即加入抗重组ORF093 融合蛋白多克隆抗体和新的封闭液（1:100），4℃孵育1h。

3.5 转移掉封闭液，用PBS漂洗3次，10min/次。最后用TBS漂洗1次，10min。

3.6 取2μL辣根酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)稀释于10mL溶解液中（5%脱脂奶粉，50mM Tris-Cl，pH7.5，150mM NaCl）（1:5000），将膜浸泡于此液中，排除袋里气泡，然后密闭袋口，摇床上轻摇，37℃1h。

3.7 去掉辣根过氧化物酶溶液，TBS漂洗3次，10min/次。漂洗后的膜移入干净培养皿，按膜面积加入0.1mL/cm2的底物溶液（DAB）与H₂O₂混合液（10mL底物溶液加入10μL 30%H₂O₂液，混匀后立即使用）。

3.8 室温轻摇，仔细观察蛋白带的生色反应，一旦蛋白带的颜色深度达到要求（约2-3min），即用水稍为漂洗，将滤膜转移到装PBS的培养皿中，终止反应。结果显示，抗血清能与重组蛋白发生反应，并显示出一条相应大小的蛋白条带（见图4）。

4. 免疫斑点分析 抗重组 ORF093 融合蛋白多克隆抗体

4.1 将鳜脑细胞传瓶至25cm²的细胞培养瓶，待细胞形成汇合的单层后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入约1ml的ISKNV病毒滤液，27℃约1h 进行病毒吸附。吸出感染上清，加入细胞维持液（L-15添加5%的FBS），置27℃细胞培养箱培养5天。

4.2 将ISKNV的细胞培养物，反复冻溶3次后，40000rpm/min离心，沉淀用TE缓冲液溶解，未感染的鳜脑细胞也经同样处理。

4.3 将5μL溶解的沉淀点在硝酸纤维素滤膜上，设鳜脑细胞做阴性对照。60℃烘干1h，用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭，室温摇床孵育1h。以后操作均与免疫印迹分析相同，方法见步骤3.5~3.8。结果显示，ISKNV的细胞样品处有明显的斑点出现，而鳜脑细胞对照则没有斑点（见图5），说明重组ORF093抗血清可以和ISKNV反应，重组ORF093有与ISKNV ORF093相似的抗原特性。

5. 鳜 ISKNV 与抗重组 ORF093 融合蛋白多克隆抗体 中和试验

5.1 实验鳜鱼（购自广东省佛山市荷塘镇三根养殖场），体质量40-50g，在充气及流水养殖池内暂养2周。从中随机挑取20尾，经镜检观察寄生虫、肝脏分离细菌、PCR检测ISKNV全部阴性，确认健康后用于实验。实验期间水温27～31℃，每天投喂饵料鱼(鲮鱼)，攻毒后改为每隔3天投喂一次饵料鱼。

5.2 取具有典型鳜病毒病症状的鳜鱼脾和头肾，经PCR检测为ISKNV阳性后，以1：10质量体积比加PBS冰浴匀浆，4℃ 4 000r/min离心30min，取上清经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，加入青霉素和链霉素至1000 UI/ml，4℃冰箱中保存。取病毒滤液接种于胰蛋白胨琼脂培养基上，培养温度为30℃，48h后，观察培养基上无细菌生长，此病毒滤液用于中和试验。

5.3 将实验鳜鱼随机分为3个实验组，分别为093组、阳性对照组、阴性对照组，每组30尾，每个组设一个平行对照组。将制备好的兔抗重组ORF093融合蛋白血清与病毒滤液按1：1比例混合，4℃放置过夜（12小时左右），次日腹腔注射093组鱼体；阳性对照组腹腔注射病毒滤液；阴性对照组腹腔注射PBS（pH7.4）。各组的注射体积均为200μL/尾。观察28天，每天记录发病情况。结果显示（见表1），28天后，093组、阳性对照组、阴性对照组各组的平均累积死亡率分别为43.3%、100%、0，093组的相对保护率为56.7%，说明制备的抗重组ORF093 融合蛋白多克隆抗体对ISKNV具有较好的中和效果，可以用来制备防治鳜虹彩病毒病的药物制剂。

实施例 2

1. ISKNV ORF093 真核表达载体的构建

P3:【5’-ATGGTACCA TGGTTTCGAGTGCACTGCT-3’】（SEQ ID NO：5），引入KpnⅠ酶切位点；

P4:【5’-ATGAATTCTTAGGCCATAATGCCGCG -3’】（SEQ ID NO：6），引入EcoRⅠ酶切位点。

1.2 以pET32a- ORF 093质粒为模板进行PCR扩增，25μL PCR反应体系包含：10×buffer（含Mg2+）2.5μL，4×dNTP（10mmol/L）0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，DNA 1.0μL，无菌双蒸水补足。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45S，68℃复性45S，72℃延伸30S，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，结果显示，在900bp左右出现亮带，片段大小与预期927bp基本相符（见图1），将目的产物进行胶回收纯化，送至测序公司测序。序列见SEQ ID NO:1。

1.3 将纯化后的ISKNV ORF093 PCR产物及提取的真核表达质粒pcDNA3.1+，分别用KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。pcDNA3.1+的酶切体系为：10×NEB Buffer 5μL，100×BSA 0.5μL，EcoRⅠ（20U/μL）1μL，HindⅢ（20U/μL）1μL，pcDNA3.1+ 20μL（5μg/μL），灭菌双蒸水补足50μL。ORF093PCR产物的酶切体系为：10×NEB Buffer 5μL，100×BSA 0.5μL，EcoRⅠ（20U/μL）1μL，HindⅢ（20U/μL）1μL，ORF093 10μL（10μg/μL），灭菌双蒸水补足50μL。将酶切产物进行胶回收纯化。

1.4 将纯化后的PCR产物和pcDNA3.1+质粒16℃连接过夜，连接体系为：pcDNA3.1+ 5μL(10ng/μL)，ORF093 8μL（10ng/μL），T4 DNA ligase (5U/μL) 2μL，2×Rapid Ligation Buffer 2.0μL。

1.5 将连接反应液10μL加入100μL DH5α感受态细胞（Takara, Japan）中，轻轻旋转离心管以混匀，置冰浴30min后，将感受态细胞置于42℃水浴热激90S，然后快速转到冰浴中冷却3min。再向每个离心管中加入900μL灭菌的LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45min（转速200rpm/min）。吸取100μL已转化的感受态细胞涂布LB平板（含amp 50μg/mL），37℃正置培养30min后，倒置培养16h。

1.6 挑取白色菌落，接种于3mL加Amp（终浓度50μg/mL）的LB液体培养基中，37℃ 200rpm培养过夜。吸取1mL菌液转入1.5mL离心管中，送至测序公司测序，鉴定重组表达载体pcDNA093是否正确构建。序列见SEQ ID NO:1。

2 . ISKNV ORF093 核酸疫苗 免疫保护试验

2.1 实验鱼的准备见实施例1步骤5.1。

2.2 将实验鳜鱼随机分为2个实验组，分别为093组、对照组，每组30尾。其中093组背肌注射pcDNA093（20μg/尾），对照组背肌注射Tris-Cl（50mmol/L，pH8.5）。各组的注射体积均为50μL/尾。

2.3 病毒液制备方法见实施例1步骤5.2。

2.4 免疫后30天，背肌注射病毒液100μL，连续观察15d，每天早晚观察记录各组鱼的死亡情况。取死亡鱼的脾、肾进行ISKNV的PCR检测，对肝、脾、肾、脑进行细菌分离，以确定死因，并计算相对免疫保护率（Relative percentage survival，RPS）。结果显示（见表2），093组的相对保护率为45.3％，说明ORF093蛋白有较好的免疫原性，可以作为制备鳜虹彩病毒病疫苗的候选抗原。

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF093蛋白的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> 传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）

<400> 1

atgatttcga gtgcactgct gacgaccaag acgagcttca ggcacgtcga gacccccgcg 60

acgtacctgc caaagataca ccgcggacct cgaccgcagc catcgagtac actgaggcca 120

caacgagtgc atgtcgatat ggtggcagaa gctaagagag tggcggctgt ggaccatgtc 180

gcactccaac accccaacta cgccaaggtg tctgtgcaca cagaagccag gccgactgtg 240

acactggacg tgctggccac tgtggacatt gagctgcctg gacgtaacgg catcctcctt 300

ggtgatcgcg ctacagtaca cggcggcatt cccgtgacat cgcatggaaa taaacccttt 360

acggatggcg tcaagtttgc cgacattgga caccagctca ctgcggggca tgaggccagt 420

aacaaacaac tattctctag gcatgctatg cccatgggac cgcccgctgt gccggagagt 480

gtcatgccag gtagccgcat tacccccgtc ggcaccggcg ttgtgtacac tgctccagac 540

ggtgtgcgtc gagcctccca ccgatcttcg ctgggcgcgg ccaagtactt gtctgacaat 600

gccgttgcga cgggccacag tgcacccggc gtggtgagcc gcaacacggt gaagaggccg 660

gaccatgtca agacgtctat agccatgata gggcggacaa acacgtctag ggtagcggca 720

ccatcagaca gcaatcgcat cggacaagct acacagccgc atgtacgggc gtatacacag 780

caaccaacac gggccgacgc gcacaccatg cccacaaccg gctcaatgca cactgataca 840

cagaggccgg tggtcatctc aggcggcatg acgaccgttc ccatggccca tggacagtcc 900

ttcgagggac gcggcattat ggcctaa 927

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<400> 2

Met Ile Ser Ser Ala Leu Leu Thr Thr Lys Thr Ser Phe Arg His Val

1 5 10 15

Glu Thr Pro Ala Thr Tyr Leu Pro Lys Ile His Arg Gly Pro Arg Pro

20 25 30

Gln Pro Ser Ser Thr Leu Arg Pro Gln Arg Val His Val Asp Met Val

35 40 45

Ala Glu Ala Lys Arg Val Ala Ala Val Asp His Val Ala Leu Gln His

50 55 60

Pro Asn Tyr Ala Lys Val Ser Val His Thr Glu Ala Arg Pro Thr Val

65 70 75 80

Thr Leu Asp Val Leu Ala Thr Val Asp Ile Glu Leu Pro Gly Arg Asn

85 90 95

Gly Ile Leu Leu Gly Asp Arg Ala Thr Val His Gly Gly Ile Pro Val

100 105 110

Thr Ser His Gly Asn Lys Pro Phe Thr Asp Gly Val Lys Phe Ala Asp

115 120 125

Ile Gly His Gln Leu Thr Ala Gly His Glu Ala Ser Asn Lys Gln Leu

130 135 140

Phe Ser Arg His Ala Met Pro Met Gly Pro Pro Ala Val Pro Glu Ser

145 150 155 160

Val Met Pro Gly Ser Arg Ile Thr Pro Val Gly Thr Gly Val Val Tyr

165 170 175

Thr Ala Pro Asp Gly Val Arg Arg Ala Ser His Arg Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Ala Ala Lys Tyr Leu Ser Asp Asn Ala Val Ala Thr Gly His Ser Ala

195 200 205

Pro Gly Val Val Ser Arg Asn Thr Val Lys Arg Pro Asp His Val Lys

210 215 220

Thr Ser Ile Ala Met Ile Gly Arg Thr Asn Thr Ser Arg Val Ala Ala

225 230 235 240

Pro Ser Asp Ser Asn Arg Ile Gly Gln Ala Thr Gln Pro His Val Arg

245 250 255

Ala Tyr Thr Gln Gln Pro Thr Arg Ala Asp Ala His Thr Met Pro Thr

260 265 270

Thr Gly Ser Met His Thr Asp Thr Gln Arg Pro Val Val Ile Ser Gly

275 280 285

Gly Met Thr Thr Val Pro Met Ala His Gly Gln Ser Phe Glu Gly Arg

290 295 300

Gly Ile Met Ala

305

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

cggaattcat gaataaaacg c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

cggaagcttt taaacatggc gtc 23

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

atggtaccat ggtttcgagt gcactgct 28

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

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Claims

1.鳜传染性脾肾坏死病毒 ORF093蛋白在制备预防鳜传染性脾肾坏死病毒病疫苗或药物中的应用，所述鳜传染性脾肾坏死病毒 ORF093蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。