CN102154306B - 密码子优化的猪cd40l基因及表达其编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及密码子优化的猪CD40L基因，该基因符合昆虫细胞密码子偏嗜性，适合在杆状病毒***中进行表达，表达出的猪CD40L分子生物活性高，能够增强机体的免疫应答能力。本发明还提供所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及密码子优化的猪CD40L基因及表达其编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法，属于基因工程领域。
背景技术：
猪CD40L分子是肿瘤坏死因子受体CD40分子的配体，主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞表面。天然的CD40L分子以两种形式存在，即为可溶型和跨膜型，当前研究较深入的为跨膜型CD40L。
猪CD40L分子为一个Ⅱ型跨膜糖蛋白，全长cDNA编码261个氨基酸残基(AA)，其中氨基未端22个AA组成CD40L分子的胞浆段，紧接的23个AA构成跨膜段，羧基端的216个AA组成CD40L的胞外段。猪CD40L cDNA的编码蛋白约28kDa。
猪CD40L与其受体CD40分子在机体免疫应答中起到至关重要的作用，对调节体液免疫和细胞免疫反应具有枢纽作用。CD40L与CD40相结合参与B淋巴细胞的发育分化以及免疫球蛋白的类型转换；促进T淋巴细胞的激发和定向活化；参与抗原递呈细胞的分化和功能调节。
诸多资料表明，CD40L可作为一种新型的免疫增强剂调节动物机体免疫应答，因此建立一种猪的CD40L表达体系，为进一步实验研究奠定基础。
大肠杆菌表达***具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养操作简单，转化转导效率高，生长繁殖快周期短，抗污染能力强，成本低廉，可以快速大规模生产目的蛋白等优点，表达的外缘蛋白能够占到细菌总蛋白的30％。因此大肠杆菌表达***在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
编码氨基酸的密码子具有简并性，而每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。目的基因的表达受到多方面因素的影响，如遗传密码的偏嗜性、目的蛋白的结构，表达***选择的表达条件等，其中根据表达宿主的密码子偏好性对目的基因进行优化，能够大大提高表达宿主的表达效率，从而提高目的蛋白的表达量。
发明内容
本发明的目的是提供密码子优化的猪CD40L基因，符合昆虫细胞密码子偏嗜性，适合在杆状病毒***中进行表达。同时，还提供表达该基因编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法。
本分明提供一种密码子优化的猪CD40L基因，包括SEQ ID NO：3所示的序列。所述密码子优化的猪CD40L基因，其序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。
本发明提供表达上述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法：
(1)将所述基因与质粒pFast Dual相连，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化入DH10Bac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DH10Bac；
(3)将所述重组DH10Bac转染Sf-9细胞获得重组杆状病毒。
所述重组杆状病毒表达的猪CD40L蛋白经SDS-PAGE电泳，图谱上出现分子量约为28kD的蛋白；Western-blot试验显示：在28kD左右出现能够与兔抗猪CD40L多克隆抗体结合的特异性条带。
本发明提供密码子优化的猪CD40L基因，符合昆虫细胞密码子偏嗜性，适合在杆状病毒***中进行表达，表达出的猪CD40L分子生物活性高，能够增强机体的免疫应答能力。
附图说明
图1是RT-PCR产物的电泳图
其中，1-RT-PCR产物，2-分子量2000bp的标准Marker
图2是载体pMD-PCD40L的酶切鉴定电泳图
其中，1-分子量2000bp的标准Marker，2-PMD-PCD40L重组载体的酶切产物；
图3是载体pET-PCD40L的酶切鉴定电泳图
其中，1-分子量2000bp的标准Marker，2-pET-PCD40L的酶切产物；
图4是表达蛋白的SDS-PAGE电泳图
其中，1-蛋白标准Marker，2～5-诱导时间分别为3、4、5、6h时表达蛋白，6-诱导菌超声后上清，7-诱导菌超声后沉淀，8-纯化的重组蛋白；
图5是不同浓度IPTG诱导后，表达蛋白的SDS-PAGE电泳图
其中，1-蛋白标准Marker，2～6-IPTG诱导浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM；
图6是sCD40L基因的PCR产物电泳图
其中，1、2-PCR产物，3-分子量2000bp的标准Marker
图7表示重组穿梭载体的鉴定电泳图
其中，1-阴性对照，2-分子量为15000的DNA标准Marker，3-Bac-PCD40L重组载体基因，4-Bac-LZsCD40L重组载体基因，5-Bac-MLZsCD40L重组载体基因；图8表示重组杆状病毒PCR鉴定电泳图
其中，1-DNA标准Marker，2-Bac-PCD40L重组杆状病毒，3-Bac-LZsCD40L重组重组杆状病毒，4-Bac-MLZsCD40L重组杆状病毒，5-空载体重组杆状病毒；图9重组杆状病毒表达蛋白SDS-PAGE电泳图
其中，1-蛋白质标准Marker，2-PCD40L重组杆状病毒表达蛋白，3-LZsCD40L重组重组杆状病毒表达蛋白，4-MLZsCD40L重组杆状病毒表达蛋白，5-为空载体重组杆状病毒表达蛋白；
图10表示重组杆状病毒表达蛋白WesternBlot鉴定
其中，1-为蛋白质标准预染Marker，2-MLZsCD40L重组杆状病毒表达蛋白，3-LZsCD40L重组杆状病毒表达蛋白，4-PCD40L重组杆状病毒表达蛋白。
具体实施方式
实施例1 猪CD40L目的基因的克隆与密码子优化
(1)猪CD40L目的基因的克隆
本发明构建的猪CD40L表达体系，以NCBI核酸数据库收录、编号为AB040443的CD40L为引物设计的模板进行引物设计P1、P2：
P1：actagtgcaccgccgcctggataa
P2：aagcttttacagcttcagcaggccgaagc
分离获得健康猪外周血淋巴细胞，以含有白介素2(IL-2)、体积浓度为10％小牛血清的RPMI1640培养液培养3d后，以终浓度10ug/ml的ConA刺激培养10h后提取总RNA。通过RT-PCR方法扩增猪CD40L基因：
以P2为引物，以总RNA为模板，经反转录反应获得cDNA。反转录过程如下，将下列试剂加入无RNA酶的离心管中：总RNA模板4μL、dNTPs(2.5mM)1μL、P2引物1μL、H2O 7μL，将上述离心管65℃加热5min后迅速置冰盒上冷却2min，低转速离心后加入5×buffer 4μL、RNA酶抑制剂(20IU/μl)1μL、0.1M DDT 1μL、M-MLV反转录酶1μL，使总体积为20μL。将上述组分混合后，于37℃温浴50min后，72℃放置15min灭活M-MLV反转录酶，立即置冰上冷却，至此就获得了cDNA，置于-20℃保存备用。
猪CD40L基因的获得：PCR扩增反应体系如下：cDNA(反转录反应的产物)5μL、MgCl2(25mM)3μL、dNTPs(2.5mM)4μL、10×Ex PCR buffer 5μL、Ex Taq酶0.5μL、P11μL、P21μL，用ddH2O30.5μL补加至总体积50μL。将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，反应的参数为：94℃预变性5min；PCR循环为：94℃ 1min，51℃退火1min，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min。全部反应结束后，取5μL PCR产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，如图1所示，猪CD40L基因大小约为786bp。
使用TaKaRa公司的连接试剂盒将纯化的PCR产物与pMD18T载体连接，具体操作依照试剂盒说明书，反应体系如下：纯化的PCR产物4.5μL、pMD18-T载体0.5μL、solution Ⅰ5.0μL，总体积为10.0μL。瞬时离心混匀，置于16℃连接过夜(连接作用时间为16h左右)；连接产物直接用于转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。挑取转化单菌落接种LB培养液，37℃摇荡培养过夜。
按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取上述转化后的大肠杆菌DH5a中的质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切反应体系为30ul，具体组分如下：重组质粒5μL、dd H2O 20μL、10×K Buffer 3μL、BamH Ⅰ1μL、Hind Ⅲ1μL，总体系为30μL。瞬时离心混匀后37℃酶切反应4h，取10μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的重组质粒命名为pMD-CD40L。鉴定正确的阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测得的基因序列如SEQ ID NO：1所示，此序列即为猪CD40L基因序列。
(2)猪CD40L基因的优化
密码子优化的猪CD40L基因：根据大肠杆菌和昆虫细胞密码子使用偏好性，使用Mac Vector 7.2软件分析猪CD40L基因(SEQ ID NO：1)，找出其使用密码子偏好与大肠杆菌及昆虫细胞密码子使用偏好不同的密码子位点。在不改变氨基酸序列的前提下，选择大肠杆菌和昆虫细胞使用频率均较高的密码子。利用TakaRa MutanBEST Kit进行多次定点突变操作，操作步骤依照试剂盒说明书进行，得到密码子优化后的猪CD40L基因命名为pCD40L。
将PCD40L基因与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌DH5a中，酶切结果如图2所示，DNA序列大小约为786bp，测得的序列如SEQ ID NO：2所示，获得的载体质粒命名为pMD-pCD40L。
实施例1中所用到的试剂分别购自：ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA纯化试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自大连宝生物公司；淋巴细胞分离液、饱和平衡酚(pH8.0)，购自上海生物工程有限公司；酵母提取物、蛋白胨购自OXOID公司；RPMI1640培养液购自普飞生物公司；Trizol试剂购自Invitrigen公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。
实施例2兔抗猪CD40L多克隆抗体的制备
(一)猪CD40L目的基因原核表达
1.pET-PCD40L表达载体的构建
以质粒小量提取试剂盒分别提取PMD-PCD40L载体质粒、pET32a表达载体质粒，用限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ对PMD-PCD40L质粒和空的pET32a(+)载体分别进行双酶切，酶切反应体系为30ul，具体组分如下：质粒5μL、ddH2O 20μL、10×K Buffer 3μL、BamHⅠ1μL、HindⅢ1μL。酶切后进行琼脂糖电泳分离目的基因片段。胶回收试剂盒分别回收PCD40L目的片段、pET32a质粒片段，DNA T4连接酶连接反应，构建pET-PCD40L重组载体。连接产物转入宿主菌大肠杆菌BL21：取连接产物10ul转化感受态BL21100ul，轻轻混匀内容物，冰浴30min；42℃热休克90s；立刻冰浴3min，加入800ul无抗生素的LB培养液37℃振荡45min，用无菌玻璃涂布器均匀涂布菌液于整个含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃倒置培养10-14h。
2.pET-PCD40L重组表达载体的鉴定纯化
挑取步骤1培养后的白色单菌落接种于4mlLB液体培养液中，37℃振荡14h。质粒小量提取试剂盒提取质粒pET-PCD40L，进行双酶切鉴定(酶切体系同上)并进行琼脂糖电泳。电泳图如图3所示，证明pET-PCD40L表达载体构建成功。获得的菌命名为CD40L/BL21。
3.猪CD40L分子的诱导表达
将新鲜CD40L/BL21菌液接种于LB培养液(含氨苄青霉素100ug/ml)，摇菌至OD值约0.6，加入终浓度为1m mol的IPTG诱导，于诱导后2、3、4、5、6h分别取出1ml菌液检测目的蛋白表达水平。结果如图4所示，在诱导后6h表达量最高。
将新鲜CD40L/BL21菌液接种于LB培养液摇菌至OD值约0.6，分别加入终浓度为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM的IPTG，诱导后6h收获菌液检测目的蛋白表达水平。结果如图5所示，不同IPTG诱导浓度表达量相差不大，故选用0.1mM的IPTG诱导。
将新鲜CD40L/BL21菌液接种于500ml的LB培养液，菌体浓度达OD值0.6后，以终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达6h收获菌液。12,000rpm低温离心收获菌体，以Binding buffer重悬，反复冻融3次后超声破碎。高速离心，收获上清液及沉淀，分别取少量做SDS-PAGE，结果：细胞超声裂解后的上清液中无目的蛋白，而沉淀即包涵体中有目的蛋白存在，见图4。将沉淀洗涤三次后溶于8M尿素中。经镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白，见图4。
(二)免疫获得兔抗猪CD40L多克隆抗体
选择体重为2.5-3.0kg的家兔两只，采用本实施例中步骤(一)纯化获得的目的蛋白为免疫原，每次按200mg纯化的目的蛋白/只，免疫家兔。免疫前耳静脉采血取阴性血清。
基础免疫：无菌注射器吸入4mL(含400mg目的蛋白)免疫原及等量体积(4ml)的完全弗氏佐剂于10ml离心管中，抽吸处理使之形成粘稠乳剂。4℃过夜乳化液不分层即符合免疫要求。家兔足垫部皮下免疫。4周后200mg免疫原/只(目的蛋白与不完全弗氏佐剂的体积比为1∶1)乳化液进行加强免疫，6周后同等剂量再次免疫。最后一次免疫两周后心脏采血，制备兔抗猪CD40L血清(即阳性血清)，其中含有兔抗猪CD40L多克隆抗体。通过间接ELISA方法证明家兔产生高水平兔抗猪CD40L多克隆抗体，抗体水平达到1∶10000以上，见表1所示。
表1 间接ELISA法检测兔免疫血清抗体效价结果
实施例2中所用试剂来源：T4DNA连接酶、DNA 2000Marker、DNA纯化试剂盒、限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自大连宝生物公司；酵母提取物、蛋白胨购自OXOID公司；四甲基乙烯二胺(TEMED)购自Promega公司；Tris平衡酚(pH8.0)购自上海生物工程有限公司；His Bind Purification Kit购自Novagen公司；DAB显色试剂盒购自南京生兴生物公司；酶标羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白分子量Marker、IPTG购自创瑞生物公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。
实施例3真核表达穿梭载体的构建
将测序正确的基因序列用DNASTAR生物学软件分析，确定猪PCD40L基因的胞内区、跨膜区和胞外区，确定有生物学作用的可溶性CD40L(sCD40L)基因序列的位置为139至786间基因序列。并依此序列设计引物。由Primer Premier 5.0生物软件设计引物，上下游引物分别加入SpeⅠ、HindⅢ酶切位点，引物序列见P3(SEQ ID NO：8)和P4(SEQ ID NO：9)。
上游引物P3：5′-ACTAGTCACCGCCGCCTGGATAA
下游引物P4：5′-AAGCTTTTACAGCTTCAGCAGGCCGAAGC
以质粒pMD-PCD40L为模板，PCR扩增sCD40L基因。具体组分为：模板pMD-CD40L 1μL、MgCl2(25mM)3μL、dNTPs(2.5mM)4μL、10×Ex Buffer 5μL、ExTaq酶0.5μL、P31μL、P41μL、ddH2O 34.5μL，总体积为50μL。将上述反应体系混匀后进行PCR扩增，反应的循环参数为：94℃预变性5min，PCR循环为94℃ 45s，54℃退火45s，72℃ 45s，35个循环后，72℃延伸10min。全部反应结束后，取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。如图6所示，目的DNA序列大小约为649bp。
鉴定正确(PCR产物电泳图如图6)的重组质粒命名为pMD-sCD40L。将筛选出的阳性重组菌送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测得的序列如SEQ ID NO：3所示。
人工合成蜂毒素信号肽(M)和亮氨酸拉链(LZ)，基因序列见SEQ ID NO：4，并串联到质粒pUC57中，得到重组质粒pUC57-MLZ。人工合成的基因序列5’端含BamHⅠ酶切位点，3’端含SpeⅠ酶切位点。在蜂毒素信号肽和亮氨酸拉链之间加入EcoRⅠ酶切位点。重组质粒pUC57-MLZ由金思特科技(南京)有限公司合成。
质粒pFast Dual、pMD-PCD40L分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，酶切后进行琼脂糖电泳。分别用胶回收试剂盒回收pFast Dual质粒片段、PCD40L目的片段，然后用DNAT4连接酶将两个片段连接起来，连接产物转入感受态大肠杆菌DH10Bac，构建重组质粒pFast Dual-PCD40L。酶切反应、胶回收过程及连接反应具体步骤同实施例1。载体质粒pFast Dual环状序列中BamHⅠ、HindⅢ酶切位点间***优化后的基因片段PCD40L，即SEQ ID NO：2。
质粒pFast Dual、pMD-sCD40L分别用SpeⅠ、HindⅢ双酶切，酶切后进行琼脂糖电泳，胶回收试剂盒分别回收pFastDual质粒片段、sCD40L基因片段，DNAT4连接酶进行连接。连接产物转化感受态DH10Bac，构建质粒pFast Dual-sCD40L。酶切反应、胶回收过程及连接反应具体步骤同实施例1。
质粒pFast Dual-sCD40L、pUC57-MLZ分别用EcoRⅠ、SpeⅠ双酶切，酶切后进行琼脂糖电泳，胶回收试剂盒分别回收pFast Dual-sCD40L载体片段、LZ基因片段，DNAT4连接酶进行连接。连接产物转化感受态DH10Bac，构建重组质粒pFastDual-LZsCD40L。酶切反应、胶回收过程及连接反应具体步骤同实施例1。载体质粒pFastDual环状序列中EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点间***含亮氨酸拉链的sCD40L基因(LZsCD40L，即SEQ ID NO：4)。
质粒pFast Dual-sCD40L、pUC57-Mlz分别用BamHⅠ、SpeⅠ双酶切，酶切后进行琼脂糖电泳，胶回收试剂盒分别回收Mlz基因片段、pFast Dual-sCD40L载体片段，DNAT4连接酶进行连接。连接产物转化感受态DH10Bac，构建重组质粒pFastDual-MlzsCD40L。酶切反应、胶回收过程及连接反应具体步骤同实施例1。载体质粒pFastDual环状序列中BamHⅠ、HindⅢ酶切位点间***含蜂毒素信号肽及亮氨酸拉链的sCD40L基因(MLZsCD40L，即SEQ ID NO：5)。
CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH10Bac。将重组质粒pFast Dual-MLZsCD40L、pFastDual-LZsCD40L、pFast Dual-PCD40L分别转化入DH10Bac，通过含卡那霉素/四环素/庆大霉素/X-Gal/IPTG/LB固体培养基筛选(蓝白斑筛选)，挑取白斑菌落于含卡那霉素/四环素/庆大霉素的LB培养液中过夜培养，反复划线纯化三代后，分别获得DH10Bac-MLZsCD40L，DH10Bac-LZsCD40L和DH10Bac-PCD40L，提取穿梭载体重组Bacmid DNA：Bac-MLZsCD40L、Bac-LZsCD40L、DH10Bac-PCD40L，提取步骤参照OMEGA公司的BAC/PAC DNA Isolation Kit说明书。通过M13/PUC通用引物对所提取的rBacmid进行PCR鉴定。
M13/PUC(上)：GTTTTCCCAGTCACGAC
M13/PUC(下)：CAGGAAACAGCTATGAC
PCR鉴定的反应体系：重组Bacmid DNA 1μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPs(25mM)4μL，Mg2+(25mM)3μL，M13/PUC(上)1μL，M13/PUC(下)1μL，Ex Taq 1μL，ddH2O 34μL，总反应体系50μL；反应条件：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min，30循环；72℃维持10min。PCR鉴定时设立以阴性对照(与空载体pfast Dual基因重组的Bacmid DNA为模板)。电泳图如图7所示，泳道1为阴性对照，约为2500bp；泳道2为DNA标准Marker泳道3为Bac-CD40L重组载体基因，约为2700bp；泳道4为Bac-LZsCD40L重组载体基因2750bp；泳道5为Bac-MLZsCD40L重组载体基因，约为2800bp。电泳结果证明成功构建重组载体。
实施例3中所用试剂来源：DNA Marker DL 2000、15000，λ-HandⅢ异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)，T4DNA连接酶，ExTaq DNA聚合酶，DNA胶回收试剂盒，限制性核酸内切酶，质粒小提试剂盒购自大连TaKaRa公司；蛋白Marker购自创瑞生物公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。
实施例4重组杆状病毒的制备、鉴定
分别以空的DH10Bac，含空载体的DH10Bac-pFast，含重组载体的DH10Bac-MLZsCD40L、DH 10Bac-LZsCD40L、DH 10Bac-PCD40L转染Sf-9细胞获得P1代重组杆状病毒，扩增病毒至P3代，获得重组杆状病毒Bac-MLZsCD40L、Bac-LZsCD40L、Bac-PCD40L。提取重组杆状病毒DNA并进行PCR鉴定，提取步骤参照OMEGA公司的BAC/PAC DNA Isolation Kit说明书。电泳图如图8所示，泳道1为DNA标准Marker；泳道2、3、4分别为Bac-PCD40L、Bac-LZsCD40L、Bac-MLZsCD40重组杆状病毒基因组PCR结果；泳道5为空载体重组杆状病毒。PCR结果证实重组穿梭质粒载体成功克隆入杆状病毒基因组中。
Sf-9细胞生长至对数期时，加入P3代重组杆状病毒，27℃培养72h，病毒感染病变明显时收集细胞，PBS洗涤三遍后采用SDS-PAGE检测鉴定重组蛋白的。SDS-PAGE结果如图9所示，在28kD左右可看出重组杆状病毒有目的蛋白表达。通过实施例2所制兔抗猪CD40L多克隆抗体进行Western-blot试验，结果如图10所示，在28kD左右出现单一特异性条带，说明杆状病毒表达的猪CD40L重组蛋白具有特异性。
实施例4中所用脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司。
Claims (7)
1.一种密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种密码子优化的猪CD40L基因，其特征在于其序列如SEQ ID NO：5所示。
4.一种表达权利要求1所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法：
(1)将所述基因与质粒pFast Dual相连，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化入DH10Bac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DH10Bac；
(3)将所述重组DH10Bac转染sf-9细胞获得重组杆状病毒。
5.一种表达权利要求2所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法：
(1)将所述基因与质粒pFast Dual相连，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化入DH10Bac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DH10Bac
(3)将所述重组DH10Bac转染sf-9细胞获得重组杆状病毒。
6.一种表达权利要求3所述基因编码的猪CD40L蛋白的重组杆状病毒的制备方法：
(1)将所述基因与质粒pFast Dual相连，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化入DH10Bac，通过蓝白斑筛选获得卡那霉素、四环素、庆大霉素抗性的重组DH10Bac；
(3)将所述重组DH10Bac转染sf-9细胞获得重组杆状病毒。
7.根据权利要求4或5或6所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于所述重组杆状病毒表达的猪CD40L蛋白经SDS-PAGE电泳，图谱上出现分子量约为28kD的蛋白；经Western-blot试验，显示：在28kD左右出现能够与兔抗猪CD40L多克隆抗体结合的特异性条带。
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| Fischer K P et al.Identification and characterization of functional CD154 In the Pekin duck.《Developmental and Comparative Immunology》.2007,第31卷(第1期),全文. * |
| 沈维娜等.CD40、CD40L和sCD40在B细胞恶性血液肿瘤中的作用.《上海交通大学学报医学版》.2009,(第10期),全文. * |
| 赵振国等.人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达.《第四军医大学学报》.2006,第27卷(第7期),全文. * |
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