CN104651376A - 鲍曼不动杆菌膜蛋白a1s_0851作为抗原的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用，本发明通过分析鲍曼不动杆菌基因信息，选取鲍曼不动杆菌的膜蛋白A1S_0851作为疫苗的候选抗原，通过基因工程的手段，选用pEGX-6P-2融合蛋白表达载体对A1S_0851抗原进行克隆、表达，并用表达的蛋白免疫小鼠进行抗原性评价，结果表明鲍曼不动杆菌A1S_0851基因编码的重组蛋白具有抗鲍曼不动杆菌感染的效果，是理想的鲍曼不动杆菌疫苗抗原。

Description

鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)属于奈瑟氏菌科，不动杆菌属，是一种不发酵糖类、氧化酶阴性、不能运动的革兰氏阴性杆菌。鲍曼不动杆菌广泛存在于自然界的水及土壤、医院环境及人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，为条件致病菌。鲍曼不动杆菌对温、热、紫外线及化学消毒剂均有较强的抵抗力，常规的消毒剂只能抑制其生长，不能将其杀灭，因此，鲍曼不动杆菌常藏匿于各种医疗器械及医院病房角落，对于重症患者，如老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者，以及使用各种侵入性操作和长期使用广谱抗生素治疗的患者来说，鲍曼不动杆菌可成为重要的致病菌。临床上，其主要引起肺部感染，也可引发败血症、严重软组织或伤口感染、插管相关感染、***、菌血症和继发性脑膜炎等症状。医院感染的科室分布以重症监护室为最多，其次为呼吸内科。

鲍曼不动杆菌感染有着悠久的历史，从20世纪八十年代起就有了鲍曼不动杆菌感染爆发的报道，而自美国1991年报道了耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CRAB)菌株后，各国均陆续报道了耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌，且据统计数据，其比例逐年升高。鲍曼不动杆菌的感染与耐药已经成为一个世界性难题，常呈多重耐药和泛耐药，且耐药菌在特定人群中常引起大规模爆发流行，感染患者的病死率常高达75％。2010年中国耐药检测的监测数据显示不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为30.7％，对米诺环素耐药率为31.2％，其他药物如亚胺培南、美罗培南、头孢吡肟、头孢他啶、头孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西/舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星等耐药率均在50％以上。由于耐药性及耐药机制复杂，鲍曼不动杆菌的耐药菌株引发的感染已经成为临床上非常棘手的问题。普通抗生素对它的治疗作用已不明显，鲍曼不动杆菌即将面临无抗生素可治的境地，采用疫苗来预防和控制鲍曼不动杆菌的感染，特别是对抗高度耐药鲍曼不动杆菌的感染已成为刻不容缓的任务。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用。

本发明所述技术方案如下：

1、鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用，所述膜蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851在制备疫苗中的应用，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、由鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851制备得到的鲍曼不动杆菌疫苗，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为终浓度13.5mg/mL的氢氧化铝。

优选的，所述疫苗还包括稀释液，所述稀释液pH值为6.0，由浓度为10mM的组氨酸、质量分数0.9％的NaCl和质量分数0.01％的泊洛沙姆188组成。

4、上述疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)用pH值为6.0的疫苗稀释液溶解浓度为30mg/mL的氢氧化铝佐剂，得溶液A；所述氢氧化铝佐剂与疫苗稀释液的体积比为9:1；

(2)用步骤(1)所述疫苗稀释液稀释重组蛋白A1S_0851，得蛋白浓度为0.3μg/μL的溶液B；

(3)取等体积的溶液A和溶液B于4～32℃条件下进行吸附，即得疫苗。

5、上述疫苗在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

6、鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851作为抗原免疫动物得到的抗体，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述抗体为免疫小鼠或者兔得到的IgG抗体。

本发明的有益效果在于：本发明通过分析鲍曼不动杆菌基因信息，选取鲍曼不动杆菌的膜蛋白A1S_0851作为疫苗的候选抗原，通过基因工程的手段，选用pEGX-6P-2融合蛋白表达载体对A1S_0851抗原进行克隆、表达，并用表达的重组蛋白免疫小鼠进行抗原性评价以及抗鲍曼不动杆菌感染的免疫保护性评价，结果表明鲍曼不动杆菌A1S_0851基因编码的蛋白具有抗鲍曼不动杆菌感染的效果，是理想的鲍曼不动杆菌疫苗抗原。与全菌灭活疫苗相比，由于全菌灭活疫苗外膜复合物成分比较复杂，可能含有效的保护性抗原成分，也可能存在与免疫保护无关或者副作用的成分，且制备过程难于标准化，而基因工程亚单位疫苗抗原成分明确，效果明确，副作用小，安全性高，是一种理想的疫苗形式。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1鲍曼不动杆菌A1S_0851基因PCR扩增凝胶电泳结果；其中，M泳道为marker，1泳道为A1S_0851基因PCR扩增产物。

图2pGEX-6p-2/A1S_0851重组质粒凝胶电泳鉴定结果；其中，1～4泳道为重组质粒，M泳道为marker，其中泳道3为鉴定正确的重组质粒。

图3重组工程菌pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue诱导表达重组蛋白A1S_0851结果；其中，M泳道为marker，1～3泳道依次为16、25和30℃条件下IPTG诱导处理后，破碎菌体并离心所得上清液中的重组蛋白A1S_0851；4～6则依次为16、25和30℃条件下IPTG诱导处理后，破碎菌体并离心所得沉淀中的重组蛋白A1S_0851。

图4重组工程菌pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue发酵过程中细菌的生长曲线图；整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳。

图5重组工程菌pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue发酵获得的目的蛋白鉴定结果；各泳道从左到右依次为maker、IPTG诱导1h、2h、3h、4h；由图可知，经过工程菌发酵成功获得重组A1S_0851蛋白。

图6对发酵获得的重组蛋白A1S_0851经GST琼脂糖凝胶4B亲和层析的纯化结果图，结果显示，目的蛋白纯度在95％以上，目的蛋白分子量在33kDa左右，与预期大小相符合。M：蛋白标准品，泳道1：重组蛋白A1S_0851与GST融合蛋白，泳道2为纯化后经酶切后的重组蛋白A1S_0851。

图7重组蛋白A1S_0851Q HP层析图。

图8为重组蛋白A1S_0851经Q HP层析后SDS-PAGE结果图，图中，泳道1：标准蛋白；泳道2：GST亲和PP酶切后洗脱样品；泳道3：Q HP流穿样品；泳道4：Q HP层析后样品。

图9为重组蛋白A1S_0851Q HP层析去内毒素后SDS-PAGE结果图，图中，泳道1：标准蛋白；泳道2：Q HP层析去内毒素后样品。

图10鲍曼不动杆菌攻毒后，不同浓度菌液的小鼠生存率图。

图11重组蛋白A1S_0851免疫后第14天，ELISA检测小鼠免疫后疫苗抗原特异性IgG体液应答水平，实验组滴度与氢氧化铝佐剂对照组及疫苗稀释液对照组滴度相比，均有显著差异(P<0.01)。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

鲍曼不动杆菌ATCC国际标准株ATCC 17978，由美国ATCC提供；引物由TaKaRa公司合成；宿主菌株XL1-blue大肠杆菌购于美国安捷伦公司；质粒pGEX-6p-2购于美国GEHealthcare公司；primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准(marker)、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白分子量标准(marker)、DNA连接酶均购于大连TakaRa公司；细菌基因组提取试剂盒购于天根公司；质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于美国Omega公司；氨苄西林、卡那霉素购自华北制药股份有限公司；谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B购自美国GEHealthcare公司；高压匀质机APV-1000购自丹麦An Invernsys Group；BALB/C小鼠购自北京华阜康公司；氢氧化铝佐剂购自美国GENERAL CHEMICAL公司；药用级组氨酸购自美国Merck公司；药用级泊洛沙姆188购自美国Merck公司，无热原。

试剂配制：

5×蛋白质上样缓冲液由以下组分组成：pH6.8，250mM Tris-HCl 10％(W/V)，SDS 0.5％(W/V)，溴酚蓝50％(V/V)，甘油5％(W/V)，其余为β-巯基乙醇；

LB液体培养基：氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L pH值至7.4±0.2；

LB固体培养基：LB液体培养基加入琼脂糖至终浓度为15g/L；高压灭菌后依次取约10mL倒入无菌培养皿中，冷却后关盖标记保存；

1000×氨苄西林钠溶液(Amp+)：配制氨苄西林钠溶液100mg/mL，0.22μm无菌过滤器过滤，用时按1：1000加入；

1mol/L IPTG：配制IPTG 238.3g/L，0.22μ无菌过滤器过滤；

LB固体培养基(Amp+)：LB固体培养基，高压灭菌后冷却到40℃左右加入Amp+至终浓度100μg/mL，依次取约10mL倒入无菌培养皿中，冷却后关盖标记保存；

10mM PBS：取KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，加水至1000mL，此时pH值为7.4；

20mM PB缓冲液：取KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加水至1000mL，此时pH值为7.0；

pH6.0的疫苗稀释液：由组氨酸、NaCl和泊洛沙姆188组成，将三组分共溶于水即可；各组分的终浓度为组氨酸10mM，NaCl质量分数为0.9％，泊洛沙姆188质量分数为0.01％。

实施例1表达A1S_0851蛋白的pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue重组工程菌的构建

1、A1S_0851序列引物的设计与合成

根据Gene Bank收录的鲍曼不动杆菌的A1S_0851基因(Genbank ID号：4916977)信息，A1S_0851基因核苷酸序列全长975bp，共324个氨基酸。使用SignalP 4.1Server进行信号肽预测，1-30个氨基酸为信号肽。采用Primer Premier5.0软件对去除信号肽的保守区域设计引物如下，通过该引物扩增鲍曼不动杆菌基因组，获得A1S_0851基因长度为894bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，蛋白为299个氨基酸，氨基酸序列见SEQ ID NO.2。

PCR克隆引物：

PA1S0851B1：5’-cgcgg atccg atatt gactc agtcc gtgcg-3’(SEQ ID NO.3)；

PA1S0851N2：5’-ttatg cggcc gctta aattg atgtc ttttc ggc-3’(SEQ ID NO.4)。

2、基因组DNA的提取

挑取鲍曼不动杆菌保种液，分别接种于无抗生素和含氨苄西林的LB平板中，37℃培养12h，无抗生素的平板长出大量菌落，含氨苄西林的平板无菌落长出。挑取无抗性平板上的单菌落接种于10mL的LB培养基中，并于37℃，80rpm振荡培养12h，最后采用细菌基因组提取试剂盒，按照试剂盒说明书的说明提取细菌基因组。

3、PCR扩增鲍曼不动杆菌A1S_0851基因

PCR体系：模板为ATCC17978基因组DNA 2μL，引物PA1S0851B1(10μM)1μL，PA1S0851N2(10μM)1μL，primeSTAR HS DNA聚合酶0.25μL，dNTP 4μL，5×Buffer 10μL，灭菌双蒸水31.75μL，总体积50μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性10s；60℃退火，30s；72℃延伸1.5min，30个循环；72℃完全延伸10min。反应完毕后使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果如图1，PCR扩增出大小约为900bp的基因片段，与预期相符。

4、凝胶回收A1S_0851PCR产物

配制1％的回收琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖移入三角瓶中，加入1×TAE核酸电泳缓冲溶液100mL，轻轻摇匀后放入微波炉中加热；待琼脂糖完全溶化后，加入核酸染料EB 8μL，轻轻摇匀，将溶液倒入制胶槽，用枪头去掉气泡，插上梳子，待胶凝固后即可上样电泳。

目的基因上样量50μL，120V电泳20min分离DNA片段。电泳完毕，紫外照射条件下切下目的条带并装入1.5mL离心管中。用DNA凝胶回收试剂盒进行DNA回收，操作步骤按说明书进行，具体如下：

DNA回收：加入400μL PB溶液，于57℃孵育7min至胶完全融化，将DNA凝胶融解物到吸附柱中，室温10000g离心1min；弃滤液，将吸附柱放回收集管中加300μL PB溶液到柱内，室温10000g离心1min；弃滤液，将吸附柱放回收集管中加入700μL无水乙醇稀释过的Wash Buffer，室温12000g离心1min；弃滤液，再次加入700μL无水乙醇稀释过的Wash Buffer，室温12000g离心1min；弃滤液，空管13000g离心2min；将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，室温放置5min，再加入30μL灭菌水，放置2min后13000g离心2min洗脱DNA，收集洗脱液，置于-20℃保存。1％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化的A1S_0851PCR产物。

5、pGEX-6p-2质粒的提取

三线法将pGEX-6P-2/XL1blue大肠杆菌接种于Amp LB平板，置于37℃培养12h。挑取平板上的单菌落接种于10mL含氨苄西林的LB培养液中，置于37℃，250rpm振荡培养8h。用EP管取菌液，1.5mL/支，用于提取质粒。用OMEGA质粒提取试剂盒进行pGEX-6p-2质粒提取，操作步骤按说明书进行，具体如下：

质粒提取：取菌液12000g离心2min，弃去上清液收集菌体，菌体中加入250μL SolutionI(已加入RNase A)并重悬，然后加入250μL Solution II，颠倒混匀，然后加入350μL Solution III，颠倒混匀，室温放置5min，13000g离心10min；离心完毕后将上清液转入HiBind DNA MiniColumns收集管中，室温10000g离心1min；弃去收集管中滤液，加入500μL Buffer HB，室温10000g离心1min；弃滤液，加入700μL含乙醇的Wash Buffer，室温13000g离心1min；重复用含乙醇的Wash Buffer洗涤；洗涤完毕后弃滤液，室温13000g离心2min。将柱子放入1.5mL灭菌EP管中，65℃放置5min，待乙醇挥发完后加入80μL 65℃预热的EB到柱内滤膜上，室温放置3min，13000g离心2min洗脱，收集洗脱液，-80℃保存质粒备用。1％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的PGEX-6质粒。

6、重组原核表达质粒的构建及重组工程菌的筛选、鉴定

(1)双酶切和回收：分别对pGEX-6P-2质粒和A1S_0851PCR纯化产物进行BamH I和Not I双酶切，酶切反应体系为：BamH I 2μL，Not I 2μL，10×K Buffer 2μL，0.1％(w/w)BSA4μL，质粒或PCR纯化产物30μL，总体积40μL；37℃条件下酶切3h，酶切后胶回收PGEX-6P-2质粒和A1S_0851的酶切产物。

(2)连接：回收后将PGEX-6P-2质粒和A1S_0851的酶切产物进行连接。连接反应体系为：Solution I 5μL，A1S_0851酶切回收产物4.5μL，PGEX-6P-2酶切回收产物0.5μL，总体积10μL。将各组分混匀后于16℃条件下连接2h。

(3)转化：取连接产物10μL加入到100μL XL1-blue感受态中，冰浴45min后，42℃热击90s，然后再迅速冰浴2min；冰浴完毕后加入600uL LB空白培养基，混匀并置于37℃，220rpm振荡培养1h；培养完毕后于4000rpm离心5min.，弃去200μL上清液，重悬菌体，并取200μL涂布于氨苄西林抗性LB平板上，将平板倒置于37℃培养箱中培养12h。

感受态的制备(CaCl₂法)：在LB平板上用接种环挑取新复苏的XL1blue单菌落，接种于10mL LB液体培养基中，37℃，100rpm振荡培养12h；取培养后的菌液0.8mL加入到50mLLB液体培养基中，于37℃，220rpm振荡培养2-3h，测定OD600为0.4～0.5；将菌液冰水浴10min后于4℃，1600g离心7min，弃去上清液收集细胞；向细胞中加入10mL，0.1mol/L的CaCl₂溶液，重悬细胞；4℃，1100g离心5min，弃去上清液收集细胞。再向细胞中加入2mL，0.1mol/L的CaCl₂溶液，重悬细胞，将制备好的感受态细胞按100μL分装至1.5mL EP管中，贮存于-80℃冰箱中。

(4)pGEX-6p-2/A1S_0851阳性重组质粒和重组工程菌的筛选、鉴定：挑取转化平板上分隔良好的4个菌落，接种于10mL氨苄西林抗性LB培养基中，37℃，100rpm振荡培养12h；取菌液用质粒提取试剂盒进行质粒提取，然后37℃酶切2h。双酶切反应体系为：BamH I 0.5μL，Not I 0.5μL，10×K Buffer 0.5μL，0.1％BSA 1μL，重组质粒8μL，总体积12.5μL。1％的琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果见图2。由图2可知，3号泳道所对应的单克隆菌为pGEX-6p-2/A1S_0851重组载体工程菌。将阳性克隆菌株的质粒送往华大基因测序，测序结果显示所构建的表达质粒中的A1S_0851基因序列与GenBank公布的核酸序列一致。将该重组菌命名为pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue，用于后续的疫苗制备。

实施例2重组工程菌pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue的诱导表达

取实施例1得到的目标重组工程菌株20μL加入10mL氨苄西林抗性的LB培养基中，37℃培养12h；取1mL菌液加入到19mL氨苄西林抗性的LB培养基中，37℃，250rpm振荡培养3-4h；测定菌液OD₆₀₀为1.0左右时，向菌液中加入1M IPTG 4μL，置于摇床诱导表达,转速220rpm，30℃诱导表达3h，25℃诱导表达5h，16℃诱导表达12h；将诱导后菌液取出，以12000rpm离心2min，弃去上清液后用1mL PBS重悬菌体，超声裂解2min(15％功率，超5s，停3s)；超声完毕后于4℃，14000rpm离心15min，分离上清液和沉淀；将上清液和沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳。

上清液处理：取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B 20μL，用PBS洗涤3次后，将准备好的上清液加入谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B中，20～25℃条件下结合1-2h，然后在4℃条件下14000rpm离心3min，收集结合后填料。使用PBS洗涤一次填料后，向结合后的Glutathione Sepharose 4B加入20uL PBS，5uL 5×蛋白质上样缓冲液，加热处理。

SDS-PAGE配制：

10mL，10％分离胶：双蒸水4.0mL，30％丙烯酰胺溶液3.3mL，1.5M，pH8.8的Tris-HCl2.5ml，10％SDS 0.1mL，10％过硫酸铵0.1mL，TEMED 0.004mL；

6mL，5％浓缩胶：双蒸水4.1mL，30％丙烯酰胺溶液1.0mL，1.0M，pH6.8的Tris-HCl0.75mL，10％SDS 0.06mL，10％过硫酸铵0.06mL，TEMED 0.006mL。

制胶：将5％浓缩胶灌入制胶版中，再加入蒸馏水将胶压平，20～25℃条件放置30min使胶凝固；待胶凝固后，将上层的蒸馏水倒干并灌入分离胶，立即插上梳子，20～25℃条件放置30min使分离胶凝固后备用。

电泳：将处理好的上清和沉淀分别取20μL上样，进行SDS-PAGE电泳时，先80V电泳30min，再调至180V，电泳1～2h。电泳完毕，将胶取出，置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色，再置于脱色液中振荡脱色后，在凝胶成像***下观察结果。

结果：用IPTG分别在30℃、25℃、16℃条件下对PGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1进行诱导表达，诱导结果见图3，PGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue在30℃、25℃、16℃条件下均能表达出分子量大小约为55kDa的含有GST标签的重组蛋白A1S_0851。

实施例3重组工程菌pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue的发酵

1、菌株复苏、活化与种子菌制备

(1)菌株的复苏：将pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue菌接种于含氨苄西林的LB固体培养基中，做好标记后倒置放入电热恒温培养箱中37℃培养16h。

(2)种子菌的活化：挑取形态大小均一的单菌落接种于含10mL氨苄西林的LB液体培养基中，标记后放入恒温摇床中37℃培养8h，水平转速220rpm。

(3)种子菌的制备：取活化菌按1:2000的比例接种于1L的含氨苄西林的LB培养基中，标记后放入大型恒温震荡摇床中37℃培养8h，水平转速200rpm。

(4)种子菌检测：取样2mL，紫外分光光度计测OD₆₀₀，并进行显微镜镜检。

(5)取生长状态良好的种子菌液作为发酵种子菌。

2、菌种发酵

将补料瓶、酸碱瓶、漏斗等仪器进行高压灭菌，然后校准发酵罐pH电极，将pH 7.4的TB基础培养基(磷酸二氢钾2.3g/L，十二水磷酸氢二钠13g/L，甘油10mL/L，酵母提取液24g/L，胰蛋白胨12g/L，硫酸镁1g/L)转入发酵罐内，开搅拌器，加入消泡剂到无泡沫为止，121℃灭菌30min，121℃时校准PO₂电极0％。高压灭菌程序结束后，设置初始参数，具体为发酵温度37℃，转速300rpm，pH值7.4，通气流量10L/min，校准PO₂电极100％。初始参数设置完毕后进行发酵，将1L活化菌加入15L发酵罐进行发酵，随着菌体密度的增大、耗氧的升高，当转速达800rpm后，改为纯氧与溶氧控制关联，即纯氧控制器为伺服控制器，PO₂始终控制在45％。监控pH，PO₂值，当两值都快速上升时，指示甘油消耗完，开始诱导，并加补料(即甘油(100ml/L))以使pH值至稳定状态。IPTG浓度为0.2mmol/L，诱导时间4h，诱导温度为30℃，发酵过程中，不断取样测定菌浓度，结果如表1所示：

表1 发酵过程中不同时间细菌浓度

取样时间	OD600
		诱导0h	41.1
诱导1h	42.75
		诱导3h	45.65
诱导4h	45.9

诱导4h后发酵结束，细菌生长曲线如图4所示，由图4可知，整个生长曲线比较标准，前期细菌生长较快，后期诱导时曲线较平稳。发酵结束后最终获得菌浓度OD₆₀₀达45.9，单位菌湿重35g/L。

3、发酵目的蛋白表达鉴定

(1)样品预处理：将样品离心并用PBS稀释后超声破菌，超声条件为：功率20％，10min，9s开，8s停；破碎后12000rpm离心10min，取上清液1mL加入到处理好的60μL谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B中，置垂直混合仪室温结合1h；结合完毕后于14000rpm离心1min，弃上清液，PBS洗两次，离心弃上清液后加入18μL PBS和12μL 5×上样缓冲液，100℃条件下放置5min；谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B结合蛋白处理结束后，进行12％SDS-PAGE电泳；

(2)12％SDS-PAGE电泳：样品上样量10μL，蛋白Marker上样量5μL；电泳条件为：浓缩胶电压60V，分离胶电压120V；电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液染色，脱色液脱色，凝胶成像仪扫描蛋白电泳图(图5)。

结果：由图5可知，单位目的蛋白表达量随时间的延长明显增加，4h表达量最高。pGEX-6P-2-A1S_0851/XL-1blue工程菌发酵工艺完全符合预期结果，本发明的发酵工艺可适用于大范围的工业生产应用。

实施例4重组蛋白A1S_0851的制备及纯化

1、破菌制备上清

将实施例3发酵的菌液离心收集菌体，取菌体200～500g与10mmol/L，pH7.0的PB缓冲液按重量体积比1:10的比例混匀悬浮，4℃预冷；

高压匀浆：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机(高压匀质机AH100B，ATS公司)管道，低温循环***开启预冷至1-4℃备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片进行结晶紫染色，油镜下每个视野下未破碎菌小于2个视为破菌完全(破菌率大于90％)。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶(Beckman，美国)，4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清。

2、GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化

向每升上清中加入200mL GST填料，20～25℃时结合4h以上，结合过程采用垂直旋转或搅拌的方法以促进目标蛋白与GST填料的结合。将上述结合目标蛋白的GST填料采用PBS洗涤5个体积以除去未与GST填料结合的杂蛋白。然后按每100mLGST填料加入20mL的Prescission protease酶(PP酶)，在20～25℃条件下酶切6小时后抽滤并收集滤液，获得酶切除GST标签后的目的蛋白，进行10％SDS-PAGE分析，结果如图6所示。图6所示的是重组蛋白A1S_0851经GST琼脂糖凝胶4B亲和层析的纯化结果图，结果显示，目的蛋白纯度在90％以上，目的蛋白分子量在33kDa左右，与预期大小相符合。

3、阴离子交换层析纯化

重组蛋白A1S_0851的理论等电点为4.91。因此，首先选用了GE公司常见的阴离子交换层析填料(强阴离子交换)进行精纯化，再使用G 25对精纯化后的置换缓冲液，最后使用QHP去内毒素。具体步骤依次如下：

(1)AKTA-Avant25液相色谱***(GE)，QHP填料对GST-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化后的蛋白继续进行纯化，柱规格为(Φ)2.6cm×(H)20cm，装柱体积50mL，缓冲液为：缓冲液A：20mM，pH 7.0的PBS；pH 7.0的缓冲液B：20mM PB+1M NaCl；上样流速15mL/min，洗脱流速15mL/min；洗脱时用0-100％缓冲液B洗脱5个柱体积(各洗脱程序中其余份额的缓冲液是对应的缓冲液A)。洗脱完毕后将目的蛋白各步洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分析，评价纯化效果。

图7是重组蛋白A1S_0851的QHP层析图，图8是重组蛋白A1S_0851经QHP层析后的电泳图，可以看出，纯度达到95％以上。

(2)AKTA-Avant25液相色谱***(GE)，G25层析填料置换缓冲液，柱规格为(Φ)5.0cm×(H)30cm，装柱体积500mL，缓冲液为：pH 6.0的缓冲液C：10mM His+0.3M NaCl，上样流速20mL/min，洗脱流速20mL/min。

(3)AKTA-Avant25液相色谱***(GE Healthcare)QHP层析去内毒素，柱规格(Φ)1.6cm×(H)2.5cm，装柱体积5mL，缓冲液为：pH 6.0的缓冲液C：10mM His+0.3M NaCl，缓冲液D：1M NaOH；上样流速5mL/min，洗脱流速5mL/min；洗脱程序为：先用缓冲液D在位清洗消毒5个柱体积，放置半小时后，用缓冲液C平衡***至pH为6.0，然后上样。最后收集穿透峰即目的蛋白峰。

将收集的蛋白峰进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白纯度，结果如图9显示，可以看出，通过置换缓冲液及去内毒素后，蛋白纯度仍然保持在95％以上。

实施例5重组蛋白A1S_0851疫苗的制备

鲍曼不动杆菌重组A1S_0851疫苗配制：量取氢氧化铝佐剂(30mg/mL)90μL，用pH6.0的疫苗稀释液10μL，充分混匀，得溶液A；用pH6.0的疫苗稀释液将实施例4制得的纯化后的重组蛋白A1S_0851稀释至30μg/100μL，得溶液B；取等体积的溶液A和溶液B于4℃条件下垂直混悬吸附1小时后即得。获得疫苗中氢氧化铝佐剂终浓度为13.5mg/mL，重组A1S_0851蛋白终浓度150μg/mL。

实施例6鲍曼不动杆菌脓毒血症模型的建立

菌液制备：将鲍曼不动杆菌标准株ATCC-17978用三线法接种于LB固体培养平板上，做好标记后于37℃孵箱培养12h。培养完毕后挑取生长的单菌落接种于装有20mL LB培养基的摇瓶中，做好标记后放入温控摇床，在37℃，转速为220rpm条件下培养6h。培养完毕后将菌液转入50mL离心管中5000g，4℃离心5min，并用生理盐水重悬洗涤2次。洗涤完毕，5000g，4℃离心5min，然后加入无菌生理盐水重悬。取重悬后菌液50μL加入盛有950μL无菌生理盐水的EP管中，涡旋混匀后测定OD₆₀₀，计算总的菌量。

动物模型建立：取表2各剂量菌液通过腹腔注射6～8周龄、体重为18～20g的BALB/C小鼠，每只小鼠200μL，每组5只小鼠。对照组用生理盐水代替。细菌攻毒后观察记录小鼠死亡情况，持续观察10天。观察期结束后剩余动物以CO₂吸入法安乐处死。采用Kaplan-Meier生存分析法对各组小鼠的存活时间和生存率进行统计学处理，比较不同菌液浓度间小鼠的生存是否存在统计学差异，结果见表2和图10。

表2 各组小鼠死亡率

以上结果针对小鼠的生存率进行了动物模型的评价，为鲍曼不动杆菌亚单位疫苗和多亚单位融合疫苗的成功研制及鲍曼不动杆菌感染的发病机制的研究奠定了基础。

实施例7重组A1S_0851蛋白抗原免疫性的评价

取实施例5制成的疫苗对小鼠进行免疫，免疫对象为雌性6周龄BALB/C小鼠，实验分为以下三组：疫苗稀释液组，氢氧化铝佐剂对照组，重组蛋白A1S_0851免疫组，每组30只。疫苗稀释液和氢氧化铝佐剂与实施例5相同，重组蛋白A1S_0851体系和浓度与实施例5相同。分别在0天、14天和21天股四头肌肌注免疫小鼠，每次注射量总量200μL，抗原含量为30μg/只小鼠。免疫后第14天尾静脉采血，ELISA检测小鼠免疫后疫苗特异性IgG体液应答水平。

ELISA检测方法如下：

(1)采用重组蛋白A1S_0851包被ELISA板，蛋白浓度为10μg/mL，每孔加入100μL，于4℃条件下放置12h；

(2)PBST洗涤后用5％BSA封闭液按200μL/孔4℃封闭12h；

(3)PBST洗涤后将重组蛋白A1S_0851免疫组血清用抗体稀释液稀释，起始稀释度1:500；同时用佐剂免疫组和疫苗稀释液免疫小鼠血清作对照，按1:500稀释；摇匀后将板放置于37℃温箱孵育40min；

(4)孵育结束后PBST洗涤，洗涤完毕后将HRP标记的二抗IgG用抗体稀释液1:5000倍稀释，然后取稀释后的二抗IgG按100μL/孔加入，振荡摇匀，37℃温箱孵育40min；

(5)PBST洗板4次后按100μL/孔加入TMB显色液，于暗处显色5～10min；

(6)显色结束后按50μL/孔加入2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪490nm测定各孔OD值。

以样品/样品对应的阴性值>2.1为阳性标准，以血清1:500稀释时检测结果为阳性，计算抗体阳转率，同时获得各个血清中各种特异性抗体的最高稀释度，采用各实验组抗体的几何平均滴度(GMT)作柱状图，组间差异比较采用t检验，具体操作于SPSS 13.0软件中进行。

结果：重组蛋白A1S_0851免疫后第14天，用ELISA检测小鼠免疫后抗原特异性IgG体液应答水平，结果如图11所示，重组蛋白A1S_0851免疫组几何平均滴度为42224，氢氧化铝佐剂对照组滴度为500，疫苗稀释组滴度为200。经统计学分析，重组蛋白A1S_0851免疫组抗体滴度与氢氧化铝佐剂对照组及疫苗稀释液对照组滴度相比，均有显著增高(P<0.01)。

实施例8重组蛋白A1S_0851抗原免疫保护效果评价

按实施例7所述方法进行免疫BALB/C小鼠，每组30只，在末次免疫后第14天采用致死剂量鲍曼不动杆菌ATCC-17978活菌腹腔注射进行攻毒实验，每只BALB/C小鼠注射菌液量为4×10⁸CFU，观察10天，统计各组小鼠的存活率。

攻毒保护实验结果：由表3可知，与疫苗稀释液及硫酸铝佐剂对照组相比，A1S-0851疫苗免疫后有较好的动物保护效果。

表3.重组蛋白A1S_0851免疫小鼠后的攻毒保护能力

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.鲍曼不动杆菌膜蛋白A1S_0851作为抗原的应用，其特征在于，所述膜蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851在制备疫苗中的应用，其特征在于，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.由鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851制备得到的鲍曼不动杆菌疫苗，其特征在于，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂为终浓度13.5mg/mL的氢氧化铝。

5.根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括稀释液，所述稀释液pH值为6.0，由浓度为10mM的组氨酸、质量分数0.9％的NaCl和质量分数0.01％的泊洛沙姆188组成。

6.权利要求5所述疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用pH值为6.0的疫苗稀释液溶解浓度为30mg/mL的氢氧化铝佐剂，得溶液A；所述氢氧化铝佐剂与疫苗稀释液的体积比为9:1；

(2)用步骤(1)所述疫苗稀释液稀释重组蛋白A1S_0851，得蛋白浓度为0.3μg/μL的溶液B；

(3)取等体积的溶液A和溶液B于4～32℃条件下进行吸附，即得疫苗。

7.权利要求3-5任一项所述疫苗在制备预防或治疗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

8.鲍曼不动杆菌重组蛋白A1S_0851作为抗原免疫动物得到的抗体，其特征在于，所述重组蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于，所述抗体为免疫小鼠或者兔得到的IgG抗体。