CN102304185A

CN102304185A - 预防奶牛***炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用

Info

Publication number: CN102304185A
Application number: CN201110258741A
Authority: CN
Inventors: 崔玉东; 朱战波; 迟佳琦; 宋佰芬
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-09-02
Publication date: 2012-01-04

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白SIP-TRAP及其制备方法和用途，该蛋白是将无乳链球菌的Sip基因和金黄色葡萄球菌的Trap基因连接后的融合基因***载体进行表达纯化获得的，实验表明该蛋白具有良好的免疫原性，其免疫效果优于SIP、TRAP单独免疫以及SIP和TRAP混合免疫的效果。本发明提供的SIP-TRAP蛋白可作为免疫原提高奶牛或羊对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染的抵抗力，简化了免疫操作程序，且免疫效果好。

Description

预防奶牛***炎的融合蛋白SIP-TRAP及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种无乳链球菌的SIP蛋白(Surface Immunogenic Protein)和金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白(Target of RNA III Activating Protein)的融合蛋白SIP-TRAP，以及该蛋白的制备方法和应用。

背景技术

奶牛***炎是奶牛乳腺组织炎症，由多种原因引起，但主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是危害奶牛业的最主要疾病之一。引起奶牛***炎的病原微生物有细菌、真菌、病毒等，种类繁多，不同地区流行的病原微生物种类也不同。但统计资料显示，金黄色葡萄球菌(S.aureus)和无乳链球菌(S.agalactiae)是引起奶牛***炎的两种最主要病原菌。随着这两种病原菌耐药性菌株的不断增加，传统的抗生素治疗效果越来越不尽人意。因此，近年来人们致力于研究和使用疫苗免疫方法来防制奶牛***炎。

TRAP蛋白是一个由167个氨基酸残基组成的蛋白质，在葡萄球菌中高度保守，它能够被RNAIII激活蛋白(RAP)激活。最近研究证实TRAP在葡萄球菌应激反应中发挥作用，可保护DNA免受氧化损伤、自然突变和适应性突变的影响(Balaban N，et al.1998；Kiran MD，et al.2009)。YANG等用TRAP抗体筛选噬菌体展示库，确定了一个TA21肽，并利用表达在大肠杆菌表面的TA21(FTA21)免疫小鼠，在败血症模型中，免疫小鼠100％存活，对照小鼠0％存活；在蜂窝织炎模型中，对照组全部发生S.aureus皮下损伤，免疫组仅30％皮下损伤。证明TRAP具有良好的免疫原性。本课题组研究已经证实，原核表达的TRAP融合蛋白免疫小鼠后，可使小鼠获得良好的抗金黄色葡萄球菌感染的能力。

SIP蛋白是暴露于无乳链球菌表面的、高度保守的蛋白，各型无乳链球菌菌株均能表达，相对分子量为45.5KDa。进一步研究证实，SIP蛋白能诱导交叉免疫保护作用，即用SIP重组蛋白免疫小鼠，可有效抵抗无乳链球菌I A/C、I B、II/R、III、V和VI型菌株感染(Brodeur Br，et al.2000；Martin D，et al.2002)。表明SIP蛋白是预防无乳链球菌感染的良好的疫苗候选抗原。

但到目前为止，尚未见到将TRAP蛋白和SIP蛋白进行融合表达后用于预防奶牛***炎金黄色葡萄球菌和无乳链球菌感染的研究报道。

为了能够有效地同时防治奶牛(或羊)***炎金黄色葡萄球菌和无乳链球菌感染，而且又可以简化未来疫苗制备工艺，本研究将金黄色葡萄球菌TRAP蛋白和无乳链球菌SIP蛋白融合表达，并研究了其免疫保护作用，证明其具有良好的免疫保护性。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种融合蛋白SIP-TRAP，该融合蛋白为无乳链球菌SIP蛋白与金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的融合蛋白；

本发明的第二个目的在于提供上述融合蛋白的制备方法；

本发明的第三个目的在于提供融合蛋白SIP-TRAP的用途，以克服现有技术中奶牛(或羊)***炎疫苗免疫保护效果差、保护范围窄、免疫程序复杂等问题。

本发明所提供的融合蛋白，命名为SIP-TRAP，其氨基酸序列是如下a)或b)：

a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的融合蛋白SIP-TRAP的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第114位的P替换S，将第151位的K替换Q，将第193位的S替换L，将第296位的D替换N，将第342位的T替换K，将第349位的K替换E，将第367位的A替换I，不影响其免疫原性。因此，本发明融合蛋白SIP-TRAP还包括SEQ IDNo.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与SIP-TRAP同等活性的由SIP-TRAP衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

本发明提供编码权利上述融合蛋白SIP-TRAP的基因。

融合蛋白SIP-TRAP的编码基因是如下a)或b)：

a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或

b)由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码SIP-TRAP的核苷酸序列。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明sip-trap基因还包括由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码SIP-TRAP的核苷酸序列。

本发明融合蛋白SIP-TRAP的制备方法步骤如下：

a)克隆无乳链球菌表面蛋白sip基因和金黄色葡萄球菌蛋白trap基因；

b)采用重叠引物延伸PCR，将sip和trap基因用连接序列连接起来，获得两种蛋白的融合蛋白编码基因，即sip-trap基因；

c)sip-trap基因***载体，重组载体在大肠杆菌中表达SIP-TRAP融合蛋白。

本发明克隆sip基因所用的引物序列为：

上游引物：5’-GCC

CAAGAAACAGATACGACGTGG-3’

下游引物：5’-ACCACCACTACCACTACCACTACCTTTGTTAAATGATACGTG-3’；

克隆trap基因所用的引物序列为：

上游引物：5’-GGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTGGTTATTTATATACATCTTATGGG-3’

下游引物：5’-CG

AATCTATTCTTTTATTGGGT-3’；其中下划线部分为sip下游引物与trap上游引物的重叠互补引物，方框内碱基为限制性内切酶位点。

本发明提供了一种含有融合蛋白SIP-TRAP编码基因的重组表达载体。

本发明的重组表达载体为PQE/sip-trap。

将纯化后的SIP-TRAP融合蛋白进行免疫效果试验研究。首先将表达的SIP-TRAP蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备免疫原免疫动物，然后进行抗体水平和细胞因子水平检测，并用2株无乳链球菌和3株葡萄球菌进行攻毒，检测其免疫保护作用。实验结果表明本发明的SIP-TRAP融合蛋白具有很好的免疫原性和免疫保护作用。

本发明的SIP-TRAP蛋白为无乳链球菌Sip蛋白与金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的融合蛋白，具有良好的免疫原性，特异性强，能同时抵抗来自无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的感染，提高作为疫苗的免疫保护范围，并简化了免疫程序，降低了防治成本。将该融合蛋白制备亚单位疫苗，可为我国防治奶牛(或羊)***炎提供有力保障。

附图说明

图1.为sip、trap基因PCR扩增结果，其中M：DNA marker DL2000；1：sip基因；2：trap基因；

图2.为sip-trap基因PCR扩增结果，其中M：DNA marker DL2000；1：sip-trap基因；

图3.为sip-trap基因T/A克隆鉴定结果，M：DNA marker DL2000，1：酶切鉴定结果，2：PCR鉴定结果；

图4为表达载体重组质粒pQE/sip-trap的鉴定结果，M：DNA markerDL2000，1：酶切鉴定结果，2：PCR鉴定结果；

图5为重组蛋白SIP-TRAP的表达结果，M：蛋白marker；1：IPTG诱导3h的重组菌；2：未诱导的重组菌；

图6为Western blot检测结果，M：蛋白marker；1：TRAP蛋白印迹结果；2，3：SIP-TRAP蛋白印迹结果；4：SIP蛋白印迹结果；

图7为重组蛋白TRAP、SIP、SIP-TRAP纯化结果，M：蛋白marker；1：TRAP蛋白；2：SIP蛋白；3：SIP-TRAP蛋白；

图8为图8a小鼠免疫血清TRAP IgG抗体效价变化，图8b小鼠免疫血清SIP IgG抗体效价变化；

图9为图9aIFN-γ浓度标准曲线，图9b IL-2浓度标准曲线，图9c IL-4浓度标准曲线；

图10重组蛋白免疫组及对照组小鼠血清细胞因子含量对比(M±SD)；

图11各菌株攻毒实验动物后实验动物的存活数，其中图11a为S.aureus Wood46株攻毒后存活数；图11b为S.aureus HLJ23-1株攻毒后存活数；图11c实验动物S.aureus Newman株攻毒后保护率；图11d实验动物S.agalactiae B03020株攻毒后存活数；图11e实验动物S.agalactiae 8511-10株攻毒后存活数。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 SIP-TRAP蛋白的制备

1材料

1.1菌株：金黄色葡萄球菌参考株Newman(荷兰乌特勒支大学)、Wood46(本实验室保存菌株)和HLJ855-23-1株(本实验室分离菌株)；无乳链球菌B03020株、8511-10株(本实验室分离菌株)。本实施例中所用的金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株已在文献(金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性.冯昊，朱战波，崔玉东等.生物工程学报，2009，25(8)：1180-1186)中公开；金黄色葡萄球菌HLJ855-23-1株、无乳链球菌B03020株、8511-10株已在文献(奶牛***炎多联灭活疫苗的免疫研究，朱战波，硕士论文，2004.5)中公开。

1.2载体与宿主菌：克隆载体pMD18-T vector购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司、表达载体pQE30及其受体菌大肠杆菌M15(pREP4)由本实验室保存。

1.3工具酶及其主要生化试剂：LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamH I、Sal I为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司的产品；蛋白质Marker和DNA Marker为北京全式金生物技术有限公司产品；封闭用脱脂奶粉为北京普利来基因技术有限公司产品；Tryptone及Yerst Extract为Oxoid公司产品，BHI培养基为Becton Dickinson公司产品；IPTG、氨苄青霉素、DMSO、TEMED、TMB、Tween-20、弗氏完全及不完全佐剂均为Sigma-Aldrich公司产品。

1.4试剂盒及其他：Plasmid miniprep kit购自Axygen公司；Gel DNApurification Kit购自上海化舜生物有限公司；MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒为Promega公司产品。

2方法

2.1引物的设计与合成：参照已发表的无乳链球菌sip基因和黄色葡萄球菌trap基因序列，经反复筛选，最终设计两对引物，其中下划线部分为sip下游引物与trap上游引物的重叠互补引物，并在sip上游引物5’末端加入BamH I限制性酶切位点，trap下游引物3’末端加入Sal I限制性酶切位点，见方框内碱基部分。经计算机DNAStar软件分析，具有较好的特异性。引物的核苷酸序列为：

sip：

上游引物：5’-GCC

CAAGAAACAGATACGACGTGG-3’

下游引物：5’-ACCACCACTACCACTACCACTACCTTTGTTAAATGATACGTG-3’

trap：

上游引物：5’-GGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTGGTTATTTATATACATCTTATGGG-3’

下游引物：5’-CG

AATCTATTCTTTTATTGGGT-3’

2.2PCR模板DNA的获取以无乳链球菌临床分离株8511-10株菌和金黄色葡萄球菌的Newman株为模板采用蛋白酶K法提取基因组DNA。

2.3目的基因的扩增分别以制备的基因组DNA为模板扩增sip基因与trap基因。

扩增sip PCR程序：94℃预变性5分钟，再以94℃变性50秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒进行30个循环，最后以72℃延伸10分钟。取5μL PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

扩增trap PCR程序：94℃预变性5分钟，再以94℃变性50秒，55℃退火45秒，72℃延伸50秒进行30个循环，最后以72℃延伸10分钟。取5μLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

扩增sip-trapPCR程序：各取上述PCR纯化产物1μL为模板，并且以sip上游和trap下游为引物。94℃预变性5分钟后，再以94℃变性50秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒进行30个循环，最后以72℃延伸10分钟。取5μLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2.4 sip-trap重组克隆载体的构建及鉴定将sip-trap PCR产物经电泳回收纯化后，克隆到pMD18-T载体中，经PCR、双酶切鉴定正确后，送测序正确后送上海生工测序。

2.5重组表达载体pQE/sip-trap的构建将上述酶切的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳分离之后，使用Axygen公司Gel DNA purification试剂盒进行回收SIP-TRAP片段。同时对表达载体pQE30进行相应位点的双酶切。各酶切体系均在37℃恒温水浴锅内反应3小时。将回收片段与酶切后表达载体连接，转化至M15(pREP4)中，挑取单菌落用试剂盒提取质粒，分别进行PCR和双酶切鉴定。

2.6重组菌的诱导表达将重组菌接种于5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养至OD值约为0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续在37℃振荡培养3小时，取适量菌液离心后进行SDS-PAGE分析表达情况。表达的蛋白在破碎上清中，这就使蛋白纯化较为简便，进行大量培养，准备纯化。

2.7 SDS-PAGE蛋白电泳取培养好菌液1mL，12000r/min离心1min，弃上清，在沉淀中加入90μL 1×上样缓冲液和10μL 1M DTT，吹打混匀，煮沸5min，置冰水中冷却后，取10μL进行SDS-PAGE。电泳完毕后，取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，在脱色摇床上染色1h，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，在摇床上脱色1h，待蓝色背景消失、目的条带清晰时，用清水冲洗，照相分析。

2.8重组融合蛋白的Western blot检测采用湿转印法。具体步骤按《分子克隆》进行(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译。2002年第三版，1474页)。

2.9镍颗粒纯化蛋白质SIP-TRAP重组蛋白含有6个连续His残基，可利用其能与Ni²⁺结合的特性，应用MagneHisTM蛋白纯化***进行纯化(按照产品说明书进行)，具体步骤如下：取经IPTG诱导后的重组菌12000r/min离心2min，完全弃上清，细胞沉淀置-20℃冰箱中15min；然后是重组菌重新悬浮于细胞裂解液中，室温摇床培养10～20min。按30μL/A₆₀₀的量将Ni颗粒加入到裂解菌液管中，混匀后室温摇床孵育2min；然后加入Binding/Wash Buffer，吸管混匀，用磁力平台将Ni颗粒沉于管底，吸管小心移出上清；重复3此后，加入100μL Elution Buffer，吸管混匀，室温摇床培养1～2min；重新使Ni颗粒沉于管底，吸管移出上清到另一个离心管中，于-20℃保存备用。

3结果

3.1 sip、trap基因的扩增用设计的引物分别对无乳链球菌sip基因和金黄色葡萄球菌trap基因进行PCR扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，均可见特异性DAN条带，与预期值大小(sip：1227bp、trap：495bp)相符，见图1。

3.2 sip-trap基因的扩增sip-trap基因使用重叠引物，通过重叠延伸PCR方法进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见一条特异性DNA条带，与预期值大小(1746bp)相符，见图2。

3.3 sip-trap基因T/A克隆结果将纯化的PCR产物酶切后分别连接到pMD18-T载体上，并转化到感受态细胞E.coli DH5α中，经培养后分别以疑似阳性克隆为模板，对重组克隆pMD18T-IsdB3进行PCR鉴定，得到约675bp的目的基因片段。将PCR鉴定为阳性的质粒用BamH I和Sal I双酶鉴定，分别获得预期大小的两个目的基因片段，见图3。

3.4测序所得的sip-trap基因的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，比对结果具体如下：

QETDTTWTARTVSEVKADLVKQDNKSSYTVKYGDTLSVISEAMSIDMNVLAKINNIADINLIYPETTLTVTYDQKSHTATSMKIETPATNAAGQTTATVDLKTNQVFVADQKV

LNTISEGMTPEAATTIVSPMKTYSSAPALKSKEVLA

EQAVSQVAANEQVSPAPVKSITSEVPAAKEEVKPTQTSVSQ

TTVSPASVAAETPAPVAKVAPVRTVAAPRVASAKVVTPKVETGASPEHVSAPAVPVTTTSPATDSKLQATEVKSVPVAQKAPTATPVAQPASTTNAVAAHPE

AGLQPHVAAYKEKVASTYGVNEFSTYRAGDPGDHGKGLAVDFIVGNQALGN

VAQYSTQNMAANNISYV

WQQKFYSNTNSIYGPANTWNAMPDRGGVTANHYDHVHVSFNKGSGSGSGG

突变分别位于114位：S突变为P；151位：Q突变为K；193位：L突变为S；296位：N突变为D；342位：K突变为T；349位：E突变为K；367位：I突变为A。氨基酸同源性高达98.7％以上。黑色大写英文字母为Sip的氨基酸序列；灰色背景的序列为TRAP的氨基酸序列；下划线的GSGSGSGG是Sip蛋白和TRAP蛋白的连接序列。本研究的Sip蛋白与已报道的未突变的Sip蛋白均具有良好的免疫原性。

3.5表达载体重组质粒pQE/SIP-TRAP的鉴定结果将酶切目的片段与酶切后的pQE-30相连，表达重组质粒命名pQE/SIP-TRAP，并对其进行PCR鉴定及酶切鉴定，见图4。结果，重组质粒经BamH I和Sal I双酶切的DNA片段与实际大小(3461bp及1746bp)相符。

3.6重组蛋白SIP-TRAP的表达结果重组质粒转化到M15(pREP4)大肠杆菌后，经1mM IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳检测，结果有重组质粒的M15(pREP4)的大肠杆菌可表达67kDa的融合蛋白，与理论值相符，表明该基因在M15(pREP4)中获得了表达；对诱导表达不同时间的细菌进行SDS-PAGE电泳检测，如图5。

3.7 Western blot检测结果分别以二免17d的TRAP、Sip抗血清为一抗，1∶100倍稀释；Goat anti-mouse IgG-Peroxidase为二抗，按1∶2400倍稀释，分别对TRAP、Sip、SIP-TRAP蛋白进行Western blot检测，如图3-6所示，结果表明融合表达产物能与TRAP、Sip抗血清特异性结合，如图6。

3.8重组蛋白TRAP、Sip、SIP-TRAP纯化结果重组菌pQE-trap、pET-sip、pQE/SIP-TRAP经IPTG诱导3小时后，通过MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒纯化，分别获得纯化的TRAP、Sip、SIP-TRAP融合蛋白，如图7。

实施例2 SIP-TRAP蛋白免疫保护效果研究

1材料

1.1菌株与实验动物：菌株同实施例1。免疫实验用小鼠为购自长春生物制品所的清洁级昆明系小白鼠。

1.2试剂：表达纯化过的SIP-TRAP、Sip、TRAP蛋白；弗氏完全和不完全佐剂、DMSO、TEMED、TMB、Tween-20、均为Sigma-Aldrich公司产品；羊抗鼠IgG-HRP为北京中山金桥生物技术公司产品；DAB底物显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。

2实验方法

2.1免疫原制备分别吸取等体积的纯化蛋白和弗氏佐剂于两个注射器中，在两个注射器之间连一小段输液管(长度适宜即可)，连接处要捆紧扎牢，然后互推混匀至乳化完全。取一滴滴于水中，若不扩散则认为乳化成功，置于4℃保存。

2.2动物免疫将200只健康小鼠随机分成20组，每组10只。其中对照5组，免疫15组，免疫组分别为TRAP蛋白3组、SIP蛋白2组、TRAP与SIP混合蛋白(TRAP+SIP)5组、SIP与TRAP嵌合蛋白(SIP-TRAP)5组。首次免疫后3周进行二次免疫，二次免疫后17d用所测定的小鼠绝对致死量进行攻毒，每日观察记录小鼠的死亡情况，共一周。在免疫前、一免后21d及二免后17d进行采血，每次采血3只，分离血清，-20℃保存，用于抗体水平及细胞因子检测。

2.3抗体水平检测用间接ELISA检测初免后21d及二免后17d分离的血清样本中IgG含量。具体步骤如下：Sip和TRAP抗原均以10μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃两小时，然后用PBST洗涤。每孔加100μL5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的Goat anti-Mouse IgG-Peroxidase二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL TMB显色液，室温显色10min后每孔加入50μL 2M的硫酸终止反应，测OD₄₅₀nm吸光值。分析结果。当样品OD₄₅₀值≥(阴性血清的OD₄₅₀值+3倍标准方差)时即为阳性。

2.4细胞因子检测对加强免疫17d的蛋白免疫组血清样本中的IL-2、IL-4和IFN-γ浓度进行检测。按细胞因子ELISA定量检测试剂盒的操作步骤进行。

2.5动物保护实验

(1)细菌最小致死量的确定

I.细菌计数取复苏后的金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株、HLJ23-1株和无乳链球菌B03020株、8511-10株菌分别接种于TSB和BHI液体培养基中，37℃培养12h，测定菌悬液OD值，做10倍系列稀释，每个稀释度取100μL菌液涂板计数。

II.细菌接种将每种菌株按菌数进行不同倍数稀释，每个稀释度接种5只小鼠，每只小鼠腹腔接种菌液100μL。接种后观察记录1周，根据小鼠的死亡情况计算绝对致死量。

(2)小鼠攻毒试验取对数生长期金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株、HLJ23-1株、无乳链球菌B03020株、8511-10株菌液，根据平板计数结果，用PBS离心洗涤并稀释。按测定的小鼠绝对致死量进行腹腔注射攻毒。7天后将攻毒小鼠全解剖检查其病变情况，同时无菌采取每只小鼠的肝、脾和***，进行细菌分离鉴定。

3结果

3.1血清IgG水平及变化将一免21d和二免17d的每份待检血清按1∶100倍稀释后，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠为二抗，进行间接ELISA检测，测定OD₄₅₀吸光值。每组检测3只小鼠血清，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差为阳性，结果见表1、2，TRAP抗体水平是嵌合蛋白SIP-TRAP组＞TRAP组＞Sip+TRAP组；而Sip抗体水平是Sip组＞SIP-TRAP组＞Sip+TRAP组。

表1TRAP IgG抗体水平

表2Sip IgG抗体水平

3.2免疫组及对照组鼠血清细胞因子含量对比应用羊抗鼠IL-2、IL-4及IFN-γ细胞因子ELISA定量检测试剂盒对蛋白免疫组和对照组血清中细胞因子浓度进行定量检测，按照试剂盒具体操作步骤进行ELISA检测，结果见表3。所得结果经t-检验表明重组蛋白免疫组小鼠的IL-2、IL-4及IFN-γ浓度与对照组相比差异显著(P＜0.05)。将所得数据以标准品OD₄₅₀值为纵坐标轴，以标准品的浓度为横坐标，应用Excel 2007软件绘制标准曲线见图9。根据测得样品OD值对照自动生成的标准曲线方程计算相应细胞因子的浓度，见图10。

表3免疫组及对照组小鼠血清细胞因子含量对比(M±SD)

注：*与PBS(对照)组比较，均有显著性差异(P＜0.05)。

3.3重组蛋白的免疫保护结果各免疫组及对照组实验小鼠在二免后第17d，用3×10⁸S.aureus Newan、3.5×10⁹CFUS.aureus Wood46、1×10⁹CFU S.aureus HLJ23-1和3×10⁹ S.agalactiae B03020、2×10⁹S.agalactiae 8511-10株攻毒。攻毒后连续1周观察实验动物的死亡状况。结果，Wood46株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，SIP-TRAP的保护率为80％、TRAP的保护率为50％、Sip+TRAP的保护率为30％；HLJ23-1株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，SIP-TRAP的保护率为60％、TRAP的保护率为50％、Sip+TRAP的保护率为30％；Newman株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，SIP-TRAP的保护率为80％、TRAP的保护率为70％、Sip+TRAP的保护率为50％；B03020株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，Sip和Sip+TRAP的保护率均60％、SIP-TRAP的保护率为80％；8511-10株攻毒组中，在对照小鼠全部死亡时，Sip和SIP-TRAP的保护率均80％、Sip+TRAP的保护率为60％，见图11。

对攻毒后死亡的小鼠进行剖检，结果死亡小鼠各组织器官均出现病变。表现为肝肺淤血、肿大，表面有大小不一的脓肿结节；胸腺偶见出血；脾脏肿大、坏死，在表面和切面上可见坏死灶；肾脏肿大、色淡。所分离细菌经培养和生化鉴定，与S.aureus和S.agalactiae主要特征相符，分离的细菌为攻毒菌株；而攻毒存活7天后的小鼠剖检后，未见脏器出现明显病变，且均未分离到攻毒菌株。