具体实施方式
下面将对本发明内容具体说明,但本发明的范围不限于以下具体实施方式和实施例。
本发明基于现有技术,提供一种重组的金黄色葡萄球菌锰离子转运蛋白MntC,其可应用于制备金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒,所述MntC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该蛋白的第6-290位氨基酸基于野生MntC蛋白的优化,第1-5位氨基酸(GPLGS,SEQ ID NO.6)为来自表达载体的修饰的氨基酸,这5个氨基酸的编码序列优选为gggcccctgggatcc(SEQ ID NO.7)。
在另一方面,本发明提供编码所述MntC蛋白的核苷酸序列。在已知蛋白质氨基酸序列的情况下,本领域技术人员完全可以根据需要设计合适的编码所述氨基酸序列的核苷酸序列,并使其表达。在一种优选的实施方式中,所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在另一方面,本发明提供一种用于表达MntC重组蛋白的重组表达载体,所述表达载体包含编码所述MntC重组蛋白的核苷酸序列以及载体序列。优选地,所述表达载体是pGEX或pET系列载体;更优选地,所述表达载体是pGEX-6p-2载体。pGEX系列载体的图谱如图35所示。
本发明优选采用的pGEX-6p-2载体其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST),所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签,此标签是蛋白纯化的标记。与其它融合载体相比,pGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入,从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。
在另一方面,本发明还提供一种表达本发明的MntC重组蛋白的宿主,包括本发明的重组表达载体。所述宿主可以是本领域技术人员已知的任何表达细胞,优选地,所述宿主是大肠杆菌XL1-Blue。
在另一方面,本发明还提供一种制备MntC重组蛋白的方法,所述方法可以是化学合成法或核苷酸表达法。本领域技术人员根据MntC重组蛋白的序列和本领域常识完全可以知道如何制备本发明的MntC重组蛋白。
在一种优选的实施方式中,本发明的制备MntC重组蛋白的方法包括以下步骤:
1)根据野生MntC蛋白的编码序列(SEQ ID NO.5)设计正向引物和反向引物;优选地,所述正向引物如SEQ ID NO.3所示,所述反向引物如SEQ ID NO.4所示;
2)使用步骤1)设计的正向引物和反向引物,通过PCR扩增出编码MntC蛋白的基因片段;对MntC蛋白的密码子进行优化,具体为,将MntC蛋白编码序列(SEQ ID NO.5)的第9位密码子(编码Leu)优化为CTG,第13、14位密码子(编码Thr)优化为ACC,第27、65、282位密码子(编码Gly)优化为GGT,第214个密码子(编码Arg)优化为CGT;
3)将步骤2)获得的基因片段克隆至表达载体,然后转化至宿主菌;
4)诱导转化后的宿主菌表达MntC重组蛋白。
优选地,所述表达载体是pGEX-6p-2,所述宿主菌是大肠杆菌XL1-Blue。
在另一方面,本发明还提供一种MntC宿主的发酵工艺。
所述工艺包括将一定量的种子菌接种于含有甘油和一定溶氧量的发酵培养基中,经诱导剂诱导一定时间而表达重组蛋白。
优选地,所述工艺涉及培养基、种子菌接种量、培养基中的甘油量、溶氧量、诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间几方面因素。其中,所述培养基可以是动物源性TB、动物源性M9、植物源性TB、植物源性M9,优选为动物源性TB;所述种子菌的接种量是5%~15%,优选为10%;所述甘油量为5-15ml/L培养基,优选为10ml/L培养基;所述溶氧量是25%~65%,优选为45%;所述诱导剂可以是乳糖或IPTG,优选为IPTG;所述诱导剂的浓度是0.1~1mM,优选为0.2mM;所述诱导温度为16~37℃,优选为30℃;所述诱导时间为1~6小时,优选为5小时。
在所述发酵工艺的一种具体实施方式中,基础培养基选用动物源性TB培养基,其中甘油量是10ml/L;发酵开始时,种子菌的接种量比例是10%;在发酵过程中溶氧浓度保持在45%;诱导时,温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。
在另一方面,本发明还提供一种在发酵MntC宿主后纯化MntC重组蛋白的工艺,包括依次进行的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析、阳离子交换层析、脱盐、脱内毒素。在优选实施方案中,进行亲和层析之前,需要对基因工程菌破菌,以将蛋白从菌体中释放出来。优选地,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析结合PP酶酶切;所述阳离子交换层析是MMC层析;所述脱盐使用G25柱;所述脱内毒素使用Q HP柱层析。
优选地,所述MMC层析使用的缓冲液包括:缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188,pH6.0;缓冲液B:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+1M NaCl,pH6.0;MMC:上样流速为12ml/min;洗脱流速为12ml/min;洗脱程序:0-100%B,5-10个柱体积进行梯度洗脱,优选7个柱体积(CV);上样样品电导小于10ms/cm。
在另一方面,发明还提供MntC重组蛋白在制备用于检测、预防或治疗SA感染的生物制品中的应用。优选地,所述生物制品为疫苗。本领域技术人员根据现有技术内容可以毫无疑义地知道如何应用该MntC重组蛋白。
在另一方面,本发明还提供由本发明的MntC重组蛋白免疫产生的抗体,所述抗体为多克隆抗体,可以用于与SA相关的疾病的检测、预防和治疗,或用于制备相应的生物制品。
在另一方面,本发明还提供一种包含本发明MntC蛋白的组合物或试剂盒。这样的组合物可以是试剂、药物(如疫苗),用于预防、检测或治疗SA感染。这样的试剂盒可以是检测试剂盒或治疗试剂盒等本领域已知的任何形式试剂盒。
本发明的基因工程重组蛋白的表达及基本特性包括:
1)MntC重组蛋白表达质粒在原核表达***—大肠杆菌中诱导表达;
2)选择pGEX-6p-2载体时,MntC重组蛋白以融合蛋白形式表达;所表达的融合蛋白中含有一个GST标签,此标签就成为蛋白纯化的标记,使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入,从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性;纯化出来的MntC重组蛋白纯度大于95%;
3)MntC重组蛋白均能够诱导机体产生特异性的保护性抗体。
本发明的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种,激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实,所述基因工程重组亚单位疫苗具有良好的抗SA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础,同时为疫苗、治疗性抗体和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的意义。
本部分中所使用的菌株与各种试剂如下:
1.菌株
金黄色葡萄球菌ATCC国际标准株MRSA-252由美国ATCC提供;
菌株XL1-blue大肠杆菌为美国安捷伦公司产品。
2.质粒
质粒pGEX-6p-2为美国GE Healthcare公司产品。
3.试剂
primeSTAR HS DNA聚合酶、DNA分子量标准、限制性内切酶BamH I和Not I、蛋白分子量标准、DNA连接酶为大连TakaRa公司产品;
质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国Omega公司产品;
MH培养基:购自北京奥博星生物技术有限责任公司(牛肉粉2.0g,可溶性淀粉1.5g,酸水解酪蛋白17.5g),加水至1L,pH值7.4±0.2;
MH平板:MH培养基加入琼脂糖至终浓度为1.5g/100mL;
PBS(磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g(国产分析纯),磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g(国产分析纯),氯化钠(NaCl)8.0g(国产分析纯),氯化钾(KCl)0.2g,加水至1000mL,pH7.4);
20mM PB缓冲液:磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g,磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.9g,氯化钾(KCl)0.2g,加水至1000mL,pH7.0;
氨苄西林、卡那霉素(华北制药);
5×蛋白质上样缓冲液(250mM Tris-HCl(pH6.8),10%(W/V)SDS,0.5%(W/V)溴酚蓝,50%(V/V)甘油,5%(W/V)β-巯基乙醇);
谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(美国GE Healthcare公司);
磷酸铝佐剂:美国GENERAL CHEMICAL公司(20mg/ml);
疫苗稀释液(组氨酸(美国Merck公司,药用级)10mM、NaCl0.9%(四川科伦,注射用生理盐水)、泊洛沙姆188(美国Merck公司,药用级)0.01%、pH6.0),无热原;
琼脂粉、吐温-20等其余试剂均为国内市场购买。
实施例1:编码MntC的密码子优化及表达载体和表达工程菌的构建
根据大肠杆菌密码偏好性对MRSA-252基因组(GI:49240382)编码MntC的基因SAR0641进行密码优化,具体如下:
将野生型MntC蛋白编码序列(SEQ ID NO.5)的第9位密码子(编码Leu)优化为CTG,第13、14位密码子(编码Thr)优化为ACC,第27、65、282位密码子(编码Gly)优化为GGT,第214个密码子(编码Arg)优化为CGT,得到优化后的核苷酸序列(SEQ ID NO.2),该序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第6~290位所示。
将优化好的序列交由上海捷瑞生物技术有限公司进行全基因合成,以BamHI和NotI为首尾酶切位点连接入pGEX-6P-2,构成pGEX-6p-2-MntC(r)表达质粒,转化XL1-Blue菌株。
实施例2:野生MntC表达载体及表达菌的构建
1、取MRSA-252菌株涂布于MH琼脂平板(Mueller-Hinton Agar,北京奥博星生物技术有限责任公司,LOT:02-051)复苏,37℃需氧培养过夜。挑取单个菌落接种1000ml MH(Mueller-Hinton,北京奥博星生物技术有限责任公司,LOT:02-052)液体培养基,37℃需氧210rpm振荡培养7h,抽提MRSA基因组。
2、用步骤1提取的基因组为模板,扩增MntC目的基因片段,扩增步骤如下:
1)设计PCR引物如下,分别为(下划线示酶切位点碱基序列)
正向引物:PMNTCBAMHI1(SEQ ID NO.3:
5'-CTGGGATCCAGCAGTGATAAGTCAAATGCAAAC-3';
BamHI
反向引物:PMNTCNOTI2(SEQ ID NO.4):
5'-ATGCGGCCGCCTTATTATTTCATGCTTCCGTG-3';
NotⅠ
2)PCR体系:
3)PCR扩增反应条件98℃变性10s,62℃退火30s,72℃延伸1min30s,30个循环,72℃完全延伸7min。反应完毕后使用1.5%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果,PCR扩增结果示于图1中。
4)使用凝胶回收试剂盒回收MntC PCR产物。
3、PCR产物的鉴定与克隆,步骤如下:
1)BamH I和Not I酶切pGEX-6P-2质粒和MntC PCR产物,酶切反应体系:
37℃酶切2h。
2)回收经BamH I和Not I酶切的pGEX-6P-2质粒和PCR产物。
3)连接和转化:
连接反应体系:
通过紫外分光光度计测定MntC酶切回收产物核酸浓度为43ng/μl,pGEX-6P-2酶切回收产物核酸浓度为55ng/μl,根据载体与外源片段摩尔数一般比为1:2~10,设计以下连接反应体系:
混匀,16℃连接2h。
4)取3管大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,第一管加入pGEX-6P-2质粒,作阳性对照;第二管加入DNA连接产物;第三管不加外源DNA,作阴性对照。冰浴30min,42℃金属浴中热击90s,迅速冰浴2min。加入600μl LB空白培养基,混匀,置于37℃摇床中200rpm振摇1h。
各管以5000rpm室温离心3min,弃去300μl上清,再重悬菌体,取200μl涂布于终浓度为100μg/ml Amp的LB平板。平板倒置于37℃培养箱中培养24h。
5)pGEX-6p-2-MntC(wt)阳性重组质粒的筛选、鉴定:
①阴性对照平板没有菌落出现;阳性对照平板长满菌落,说明感受态细胞制作正确,结果可信。挑取连接产物转化平板上分隔良好的菌落,接种于终浓度为100μg/ml Amp的LB培养基中,37℃振荡培养过夜;
②质粒抽提:参照质粒提取试剂盒说明书进行;
③质粒DNA进行BamH I和Not I双酶切;
双酶切反应体系:
37℃酶切2h;
④1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果,结果如图2所示,可见泳道3、4样品为构建成功的pGEX-6p-2-MntC(wt)重组质粒;
⑤pGEX-6p-2-MntC(wt)重组质粒送往上海英俊公司测序验证,保留正确序列的重组质粒。
实施例3:MntC在原核表达***-大肠杆菌中诱导表达
1.目的蛋白诱导表达
1)取鉴定正确的pGEX-6P-2-MntC(wt)/XL1-blue菌液及全基因合成pGEX-6P-2-MntC(r)/XL1-blue菌液各100μL加入至10mL含100μg/ml Amp的LB培养基中,80rpm37℃过夜培养,分别取过夜培养的菌液2mL加入至100mL含100μg/ml Amp的LB培养基中;至OD600为0.8-1.0时,加入IPTG使其终浓度为200μM,再置于摇床诱导表达30℃3h,16℃过夜诱导表达。
2)取出诱导表达后的菌液,以10000rpm离心5min,弃去上清,加入5mL裂解缓冲液(PBS)混匀,超声(功率300瓦)裂解10min(工作6秒,休息9秒),再4℃14000rpm离心15min,分离上清和沉淀。
2.处理上清:
上清结合:取谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B80μl,用PBS洗涤3次后,加入准备好的上清,室温结合1h。在4℃下以14000rpm离心3min后,使用PBS-0.25%吐温20洗涤2次,PBS洗涤三次。取沉淀16μl,加入4μl5×蛋白质上样缓冲液,煮沸5min,14000rpm离心3min。
用PP酶(Prescission蛋白酶,美国GE公司)进行酶切洗脱:PP酶的使用按厂家推荐的方法进行。由于所使用的PP酶带有GST标签,以利于去除PP酶。酶切完成后,离心收集上清和沉淀。各取上清和沉淀16μl,加入4μl5×蛋白质上样缓冲液,煮沸5min,14000rpm离心3min。进行10%SDS-PAGE,结果如图3所示。
由图可以看出,密码优化后,工程菌表达量比未优化前有显著提高。以下实验将使用密码优化后的工程菌进行。
实施例4:MntC工程菌发酵
1、发酵条件的确定:
1)培养基对工程菌生长与目的蛋白表达的影响:
通过如前述培养方法在摇瓶中测试四种培养基对MntC蛋白表达的影响:
植物源性改良TB(磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、大豆蛋白胨12g、硫酸镁1g,加水至1L);
动物源性改良TB(磷酸二氢钾2.3g、十二水磷酸氢二钠13g、甘油5ml、酵母提取物24g、动物源胰蛋白胨12g、硫酸镁1g,加水至1L);
植物源性M9-CAA(磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、大豆蛋白胨3.6g、植物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g,加水至1L);
动物源性M9-CAA(磷酸氢二钠15.6g、磷酸二氢钾4.3g、氯化铵1g、硫酸镁1g、氯化钠0.67g、葡萄糖5g、动物胰蛋白胨3.6g、动物源酵母粉4g、酸水解酪蛋白6g,加水至1L)。
取pGEX-6P-2-MntC(r)/XL-1blue接种于Amp+LB平板内,37℃孵育16h-20h,挑取单菌落于10mlAmp+LB培养基里,置于摇床中37℃、200rpm摇到OD600大约2左右时,按1:100分别接种于100ml四种培养基中,37℃、200rpm摇14小时,每2小时取样测OD600,其结果见图4。
由图可知:植物源性培养基均差于动物源性,工程菌都是大约8h时就生长减缓,而在动物源性培养基中就长势很好,一直处于对数期,且TB好于M9,故选用动物源培养基(动物源性改良TB和M9-CAA之后简称TB、M9)。
将新鲜MntC工程菌菌液(OD600大约2)按1:100分别接种于100mlTB和M9培养基中,37℃、200rpm摇至OD6000.8左右,加入1mM的IPTG,25℃诱导12h。取100ml菌液离心,弃上清,称重TB:2.4g,M9:1.5g。以1g:10ml加PBS超声(功率300瓦)裂解10min(工作6秒,休息9秒)破菌,结合GST4B(过程详见实施例5),进行10%SDS-PAGE,结果如图5所示。
如图5所示:单位目的蛋白表达量TB好于M9,且单位菌湿重TB大于M9,故MntC发酵用基础培养基选用TB培养基。
2)IPTG浓度对目的蛋白表达的影响:
考察不同终浓度的IPTG对目的蛋白表达水平的影响。IPTG的终浓度分别是0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM(培养基),对其进行比较选出最佳浓度。将新鲜MntC工程菌菌液(OD600大约2)按1:100分别接种于四个100ml TB中,37℃、200rpm摇至OD6000.8左右,分别加入IPTG使其浓度分别对应上述四种浓度(一瓶一个浓度),25℃诱导12h。将四瓶菌液分别离心,弃上清,以1g:10ml加入PBS,超声(功率300瓦)裂解10min(工作6秒,休息9秒)破菌,结合GST4B后,进行10%SDS-PAGE,结果如图6所示。
由图6可知:IPTG终浓度为0.2mM时蛋白表达与0.5mM、1mM时的蛋白表达基本相同,明显好于0.1mM时的蛋白表达,所以选择0.2mM为发酵用IPTG终浓度。
3)种子菌的不同接种量对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响:
研究5%、10%、15%三种不同种子菌接种量对发酵的影响。通过细菌生长曲线、单位蛋白表达量来确定最佳接种量。当种子菌OD600在2左右时,倒入发酵罐内开始计时,每1小时取样测OD600,直到诱导前结束,绘制工程菌前期生长期曲线(图7),可判断细菌生长速度快慢。诱导结束后取样后,按照之前方法处理,进行10%SDS-PAGE,判断单位目的蛋白表达量(图8)。由图7可知,5%接种量细菌生长最慢而且最高OD600较另两种接种量低很多,10%与15%接种量相差不大。由图8可知,不同接种量单位目的蛋白表达量。表达最好的是5%接种量,其次是10%,但相差不大,15%最差。
综上所述:5%接种量表达最好,但生长速度慢,最终细菌得率少;15%接种量生长速度快,但表达最差;10%接种量的表达量比5%相差不多,而且生长速度也比15%相差不多,所以选择10%接种量作为发酵接种量。
4)氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响:
此工程菌为兼性需氧菌,氧浓度的高低对细菌生长影响很大,所以在发酵过程中对溶氧的控制就显得特别重要,现分别考察溶氧在25%、45%、65%时细菌的生长情况(图9)和目的蛋白表达量(图10)。
从细菌生长情况可知:45%溶氧条件下,细菌是长得最好的;从单位蛋白表达量来看,45%溶氧条件下,表达也是最好的,所以溶氧浓度选择45%。
5)甘油用量的确定:
在不同菌量时诱导,会影响MntC的表达量,而发酵时培养基中甘油的量会直接影响菌量的多少。当罐内甘油消耗完了,细菌停止生长,在短时间内pH值和溶氧值迅速上升,此时应马上加IPTG开始诱导。所以甘油的多少直接决定诱导时机。通过研究5ml/L、10ml/L、15ml/L的甘油量对目的蛋白表达的影响和最终湿重得率来确定最佳诱导时机。结果如图11所示。
从图可知:5ml/L甘油浓度时,表达量最高;10ml/L其次,但相差不多;15ml/L就差多了。但是5ml/L甘油浓度时,最后菌体湿重是低很多的;10ml/L与15ml/L相差不多,所以最终确定甘油量加10ml/L。
6)不同的诱导温度和时间对目的蛋白表达的影响:
考察30℃、25℃、16℃三个不同诱导温度对蛋白表达的影响,以及达到最大表达时用的时间。在诱导后每2h取样,诱导10h,处理样品,进行10%SDS-PAGE,其结果如图12所示。
由电泳图可知:30℃单位诱导表达量是最高的,且达到最大表达所用时间是最短的,4h-6h之间的表达差异不大。而25℃、16℃单位表达量就不如30℃,且表达时间长。故诱导温度和时间选用30℃、5h。
根据上述研究,最终确定了本发明的MntC工程菌的优选发酵工艺是:
(1)基础培养基选用动物源性TB培养基,其中甘油量是10ml/L;
(2)发酵开始时,种子菌的接种量比例是10%;
(3)在发酵过程中溶氧浓度始终保持在45%左右;
(4)诱导时,温度调为30℃、IPTG浓度为0.2mM、诱导5h。
2、工程菌发酵工艺放大
按照上述的优化条件对发酵规模进行扩大(25L),并得到MntC工程菌生长曲线(图13)和单位蛋白表达电泳图(图14)。
由图13可知,工艺放大后,整个生长曲线比较标准,前期细菌生长较快,后期诱导时曲线较平稳,最终获得菌密度(OD600)达38,单位菌湿重47g/L。
由图14可知,从单位目的蛋白表达看:表达量随时间的延长有明显增加,5h表达量最高。
综上所述:MntC发酵工艺放大成功,完全符合预期结果。本发明的发酵工艺可适用于大范围的工业生产应用。
实施例5:MntC重组蛋白的纯化工艺
1、破菌制备上清:
将实施例1构建的菌体200-500g以20mmol/L PB,pH7.0缓冲液,按重量:体积比1:10比例混匀悬浮,4℃预冷。
高压匀浆:使用蒸馏水冲洗高压匀浆机(高压匀质机APV-1000,丹麦An Invernsys Group)管道,低温循环***开启预冷至1-4℃备用。将预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机,压力维持在60-80Mpa破菌3-5次,取PBS涂片进行结晶紫染色,油镜下每个视野下未破碎菌小于2个视为破菌完全(破菌率大于90%)。
高速离心:破菌后的液体装入离心桶(Beckman,美国),4℃,10,000-15,000g离心15-30min,收集上清备用。
2、谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化
向每升MntC工程菌破菌液中加入200ml GST填料,20~25℃结合4h以上,结合过程采用垂直旋转或搅拌的方法以促进MntC蛋白与GST填料的结合。将上述结合MntC蛋白的GST填料采用PBS洗涤5个体积以除去未与GST填料结合的杂蛋白。然后向填料按每100ml GST填料加入20ml的PP酶,在20~25℃条件下酶切6小时后抽滤并收集滤液,获得酶切除GST标签后的MntC蛋白,并进行SDS-PAGE分析。结果如图15所示。
3、阳离子交换层析
1)层析填料的选择
比较采用MMC和Phenyl HP对MntC蛋白的纯化效果,使用的样品为上述获得的MntC粗纯化样品。
仪器***:AKTA-expolrer100/Avant25液相色谱***(GE公司);
层析填料:MMC、Phenyl HP(均为GE公司);
柱规格:(Φ)2.6cm×(H)20cm、(Φ)1.6cm×(H)10cm;
装柱体积:54ml、5ml;
MMC缓冲液:缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188,pH6.0;缓冲液B:10mMHis+0.01%泊洛沙姆188+1M NaCl,pH6.0;
Phenyl HP缓冲液:缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+1.5M(NH4)2SO4,pH6.0;缓冲液B:10mM His+0.01%泊洛沙姆188,pH6.0;
上样样品:取GST亲和层析后样品分别调节至与MMC及Phenyl HP缓冲液A一致pH备用。
(1)MMC:上样流速:12ml/min,洗脱流速:12ml/min;
洗脱程序:0-100%B,7个柱体积(CV),结果如图16和17所示。
(2)Phenyl HP:上样流速:8ml/min,洗脱流速:8ml/min;
洗脱程序:0-100%B,10个柱体积(CV)。结果如图18和19所示。
各洗脱程序中其余份额的缓冲液是对应的缓冲液A。
收集:将目的蛋白各洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分析,评价纯化效果。
从图16-19可以看出,在不同层析条件下,MMC比Phenyl HP对MntC的结合能力强,穿透峰中几乎无MntC目的蛋白,洗脱峰MntC纯度可以达到95%左右,目的蛋白得率高,具有很好的层析纯化效果。
因此,确定选择使用MMC作为第一步层析纯化的填料。
2)层析纯化工艺的优化
在确立使用MMC作为第一步填料的基础上,对此层析填料进行条件优化,主要优化的条件是上样样品电导,评价指标为MntC的纯度及得率。
仪器***:AKTA-explorer100液相色谱***(GE Healthcare);
层析填料:MMC;
柱规格:(Φ)2.6cm×(H)20cm;
装柱体积:54ml;
缓冲液:
①缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+0.15M NaCl,pH6.0;
缓冲液B:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+1M NaCl,pH6.0;
②缓冲液A:10mM His+0.01%泊洛沙姆188,pH6.0;
缓冲液B:10mM His+0.01%泊洛沙姆188+1M NaCl,pH6.0;
上样样品:分别取MntC粗纯化样品调节至与两种缓冲液A一致。
流速:20ml/min
洗脱程序:0-100%B,10个柱体积(CV)。
将目的蛋白各洗脱样品收集,并进行SDS-PAGE纯度分析,评价纯化效果。
从图20-23可以看出,在低上样样品电导条件下,目的蛋白无流穿,且纯化的目的蛋白纯度高,因此,确定选择使用上样样品条件应低于10ms/cm。
4、脱盐
采用疫苗稀释液平衡脱盐G25柱,将上步纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。
该过程具体步骤为:将上步获得的样品,用疫苗稀释液溶解,平衡层析***(AKTAExplorer100,美国GE Healthcare)及层析柱XK50-60(美国GE Healthcare)(600mL SephadexG 25),用流速20mL/min脱盐。
5、第二步纯化脱内毒素
仪器***:AKTA-explorer100液相色谱***(GE Healthcare);
层析填料:Q HP;
柱规格:(Φ)2.6cm×(H)20cm;
装柱体积:50ml;
缓冲液:缓冲液A:疫苗稀释液,无内毒素;缓冲液B:1M NaOH;
上样样品:G25脱盐后样品;
用缓冲液B(1mol/L NaOH)在位清洗消毒5个柱体积,放置半小时后,使用疫苗稀释液平衡***至pH为6.0,然后上样。流速:8ml/min。收集穿透峰即目的蛋白峰。
6、工艺放大
按照以上确定的上样以及洗脱模式进行工艺放大:所采用的MMC层析柱规模放大为(Φ)2.6cm×(H)20cm,装柱体积CV=70ml,Q HP层析柱规模放大为(Φ)2.6cm×(H)20cm,装柱体积CV=50ml。重复三批次实验,10%SDS-PAGE分析MntC纯化后的效果及得率,评价此工艺放大后的稳定性和可重复性。
从图24-32可以看出,MntC蛋白的MMC层析工艺放大后,层析纯化模式和小量试验层析纯化色谱图无明显变化,经纯化后的MntC纯度达到97%以上。
7、HPLC纯度检测
HPLC仪Agilent1260(美国Agilent公司),分析柱ZorBax SB-300-C34.6x150mm3.5micron(美国Agilent公司)。
流动相:A:0.1%三氟乙酸(Tedia,美国),水(18.2MΩ);B:0.1%三氟乙酸(Tedia,美国),乙腈(Tedia,美国)。
柱温60℃,流速0.5mL/min,上样10μl。
检测方法:0-30min:90%A,10%B;30-35min:100%B;35-40min:90%A,10%B;40-45min:90%A,10%B。
结果如图33和表1所示,从图中看出MntC主峰保留时间13.409分,主峰面积比率99.5%。
表1:MntC样品的HPLC检测结果
峰# |
保留时间(min) |
类型 |
峰宽(min) |
峰面积(mAU*s) |
峰面积% |
1 |
11.158 |
|
0.0000 |
0.00000 |
0.0000 |
2 |
13.409 |
BV |
0.1356 |
3606.82300 |
99.5314 |
3 |
13.918 |
VB |
0.1400 |
16.98190 |
0.4686 |
4 |
32.252 |
|
0.0000 |
0.00000 |
0.0000 |
8、测序验证获得的MntC重组蛋白。
委托上海中科新生命生物科技有限公司对获得的MntC重组蛋白的N端、C端测序、进行分子量测定及氨基酸组成分析,结果与设计的MntC重组蛋白完全一致。
实施例6:MntC蛋白内毒素含量测定
1、将实施例5获得的样品用无热原水(湛江博康海洋生物有限公司)稀释至50μg/mL作为待测样品。根据内毒素检测试剂盒(湛江博康海洋生物有限公司)能检测到的最高范围0.25EU/mL,对待测样品进行稀释。即假定待测样品内毒素含量为5EU/mL,则用无热原水进一步稀释待测样品至2.5μg/mL(稀释20倍);
2、按照试剂盒(湛江博康海洋生物有限公司)说明书配制内毒素标准品阳性对照溶液、待测样品工作液、待测样品检测溶液;
3、鲎试剂的准备:根据待测样品及对照品的数量,取鲎试剂,酒精棉球消毒瓶颈,晾干后开启,每支加入检查用水0.1ml,轻轻摇匀备用;
4、加样:向配制好的鲎试剂中分别加入待测样品检测溶液、内毒素标准品阳性对照液、检查用水各0.1ml,轻摇混匀,封口膜封口,37℃水浴60±2分钟,期间严禁移动;检查用水为阴性对照;
5、检测:取出样品,轻轻垂直旋转180°,观察瓶底,液体凝固不流动为阳性,流动不凝固为阴性;
6、测定结果:阴性,小于5EU/ml。
实施例7:MntC疫苗的制备
磷酸铝为美国GENERAL CHEMICAL公司原装进口产品(20mg/ml)
1、配制金黄色葡萄球菌重组MntC疫苗
1)量取磷酸铝佐剂80μL,将其加入到配制瓶中;量取疫苗稀释液220μL,总体积300μL,充分混匀;
2)用疫苗稀释液将MntC重组蛋白稀释至30μg/300μL,充分混匀;
3)将等体积的稀释后佐剂溶液与稀释后的蛋白溶液加入至分装瓶中,温度范围4℃-32℃条件下,垂直混悬或水平搅拌吸附1小时后即得。
2、10%SDS-PAGE鉴定MntC疫苗中抗原蛋白磷酸铝佐剂吸附均一性与完全性
1)从MntC疫苗取样1ml,4℃,6000rpm离心5分钟,小心吸取上清,并从上清取样40μl;
2)补入与上清等体积的解离液(1M Na2CO3),室温条件下,垂直混悬1小时,取样40μl;
3)按上述1的方法配制不含磷酸铝佐剂的蛋白溶液,磷酸铝所占体积以疫苗稀释液补足,充分混匀后取样40μl;
4)将所取样品加入10μl5×蛋白上样缓冲液,100℃加热5分钟,冷却并瞬时离心后,取10μl上样;
5)10%SDS-PAGE电泳,电压先80v电泳20分钟,再调至180v,电泳40分钟,然后将胶取出,置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色,再置于脱色液中振荡脱色后,在呈像***下观察结果,结果示于图34,可见磷酸铝佐剂能充分吸附重组蛋白。
实施例8:MntC疫苗免疫动物及抗体的检测
1、免疫动物
1)实验动物:6只6周龄BALB/c小鼠(北京华阜康),体重约为16g
2)免疫程序:根据实施例7制备的疫苗制剂以30μg/600μl分三次在股四头肌肌注(0、14、21天)免疫。
2、第三次免疫后第7天,采集BALB/C小鼠的血清,用ELISA检测小鼠免疫后IgG应答水平。
3、ELISA
1)制备液体
①包被液的配制:称取NaHCO31.6g,Na2CO32.9g,溶于1L ddH2O,将pH调至9.6;
②封闭液的配制:1g牛血清Ⅴ(Sigma,美国),溶于100mL抗体稀释液(1:100);
③抗体稀释液的配制:在电子天平上称取NaCl8g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,吐温200.5mL,调节pH至7.4,加蒸馏水定容至1000mL;
④洗涤液的制备:称取2.42g Tris溶于1L ddH2O,再加入500μL吐温20,再将pH调至7.4;
⑤显色液(TMB),为天根公司产品;
⑥终止液(2M H2SO4)的制备:将22.2mL浓硫酸倾注入177.8mL ddH2O中。
2)ELISA检测MntC重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价:
①包被:将MntC重组蛋白用包被液稀释至1μg/mL,包被96孔板(Corning,美国),200μL/孔,4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍,空干后用保鲜膜包上,置于4℃冰箱中备用;设置PBS对照孔;
②封闭:向酶标板加入封闭液,100μL/孔,置于37℃孵育箱中2小时,洗涤3遍;
③将血清按照1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行倍比稀释;
④取封闭好的酶标板,依次加入稀释的血清,100μL/孔,置于37℃孵育箱30min,洗涤3遍,空干;
⑤将加HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体保存液,稀释1:5000,制成抗体工作液;
⑥加入稀释的抗体工作液,100μL/孔,置于37℃孵育箱1h,洗涤三遍,空干;
⑦加入底物显色液(TMB)100μL/孔,室温避光反应5min;
⑧加入终止液(2mol/L H2SO4),立即置于酶标仪上以450nm波长处测定OD值;
⑨结果判断:A样品/A阴性值≥2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。
结果:检测MntC重组蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价达到1:512000,说明本发明构建的MntC亚单位重组蛋白能够使免疫小鼠体内产生抗体。
实施例9:通过MntC疫苗免疫小鼠确定免疫动物的攻毒保护效果
同实施例8的免疫方案,第三次免疫小鼠后,在第14天采用致死剂量,尾静脉注射MRSA-252活菌进行攻毒实验,每只BALB/C小鼠注射菌液量为1.25×109CFU,观察10天,统计各组小鼠的存活率。3轮动物保护试验(10只/轮)结果示于表2。
表2:MntC重组蛋白免疫小鼠对动物的攻毒保护
组别 |
小鼠(只) |
免疫组分 |
10天后存活数 |
3轮平均保护率(%) |
实验组 |
30 |
MntC+AlPO4佐剂 |
12 |
40 |
阴性对照组 |
30 |
疫苗稀释液 |
2 |
6.7 |
表2显示:阴性对照组的3轮平均免疫保护率分别为6.7%,MntC加AlPO4佐剂组的3轮平均免疫保护率为40%。因此,证实本发明的MntC疫苗具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生保护性免疫应答,并且能够对SA感染起到免疫保护作用,可以辅以铝佐剂制备重组亚单位疫苗用于预防金黄色葡萄球菌的感染。
通过以上实施例,本领域技术人员利用本领域普通技术知识可以显而易见地应用本发明所制备的重组蛋白与其他相关试剂,例如包被试剂、检测抗体、显色剂、终止剂、佐剂等制备相关重组亚单位疫苗、治疗性抗体及检测试剂盒,用于免疫防治及诊断金黄色葡萄球菌感染的应用。