CN104540385B

CN104540385B - 嘧啶基酪氨酸激酶抑制剂

Info

Publication number: CN104540385B
Application number: CN201380036869.5A
Authority: CN
Inventors: B.T.霍普金斯; P.康伦; T.R.钱; T.J.詹金斯; X.蔡; M.休莫拉; X.施; R.A.米勒; A.汤普森
Original assignee: Than Ao Gen Ma Co; Biogen Idec Inc
Current assignee: Than Ao Gen Ma Co; Biogen Inc
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: BR112014030655B1; MX2019003618A; AU2013271407A1; KR102468430B1; KR20150036020A; PH12014502699A1; US20210017155A1; KR20210072139A; IL235938A0; AU2013271407B2; JP6214643B2; PH12014502699B1; JP2017193583A; JP2019077728A; RS57978B1; NZ702715A; DK2858499T3; LT2858499T; EA027823B1; US20230174511A1

Abstract

本发明提供适用作布鲁顿酪氨酸激酶的抑制剂并且对布鲁顿酪氨酸激酶展现出所需的特征的化合物和其组合物。

Description

嘧啶基酪氨酸激酶抑制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月8日提交的美国临时申请序号61/657,360的优先权，其全部内容是特此以引用的方式并入本文中。

发明背景

Tec激酶是非受体酪氨酸激酶，包括Tec(在肝细胞癌中表达的酪氨酸激酶)、Btk(布鲁顿酪氨酸激酶)、Itk(白介素-2(IL-2)诱导型T细胞激酶，还称为Emt或Tsk)、Rlk(休眠淋巴细胞激酶，还称为Txk)、Lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)以及Bmx(染色体X上的骨髓酪氨酸激酶基因，还称为Etk))。这些激酶主要在造血细胞中表达，但还在内皮细胞和肝细胞中检测到Bmx和Tec的表达。Tec激酶(Itk、Rlk以及Tec)在T细胞中表达并且全部在T细胞受体(TCR)下游活化。Btk是B细胞受体(BCR)信号传导的下游介体，其涉及在调控B细胞活化、增殖以及分化中。更确切地说，Btk含有结合磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)的PH结构域。PIP3结合诱导Btk来使磷脂酶C(PLCγ)磷酸化，磷脂酶C(PLCγ)转而使PIP2水解，以产生两个二级信使，即肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)，其使蛋白激酶PKC活化，蛋白激酶PKC然后诱导另外的B细胞信号传导。使Btk酶活性无能的突变导致XLA综合征(X连锁无丙种球蛋白血症)、原发性免疫缺陷。考虑到Tec激酶在B细胞和T细胞信号传导中所起的关键作用，Tec激酶是自体免疫病症的关注靶标。

因此，本领域中极需要Tec激酶如Btk的有效抑制剂。本发明实现了这些和其它需要。

发明概要

在某些实施方案中，本发明提供一种式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R¹和环A如本文所定义和说明。所述化合物是Tec激酶家族、包括Btk的抑制剂。因此，所提供的化合物可用于多种方法中，包括体外筛选和活性测定，以及体内临床前、临床以及治疗环境，如本文所详细描述。

在某些实施方案中，本发明提供包含所提供化合物的医药制剂。

在某些实施方案中，本发明提供降低Btk的酶活性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使Btk与有效量的Btk抑制剂接触。

在某些实施方案中，本发明提供一种治疗有需要的受试者的对Btk抑制有应答的病症的方法。所述病症和方法在本文中进行详细描述。

发明详述

在某些实施方案中，本发明提供一种式I化合物：

或其药学上可接受的盐；

其中：

各R¹独立地为氢、任选取代的C_1-6脂族基团、任选取代的3-7元单环杂环基团，或具有3-7个碳原子以及1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选取代的杂环基烷基；

或两个R¹基团与其***原子一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选取代的3-7元饱和或部分不饱和单环杂环；

其中任选取代的基团可被以下基团取代：卤素、-NO₂、-CN、-OR、-SR、-N(R)₂、-C(O)R、-CO₂R、-N(R)C(O)OR、-C(O)N(R)₂、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-S(O)R、-S(O)₂R或-S(O)₂N(R)₂；

各R独立地为氢或C_1-6脂族基团；

或附接至同一氮的两个R基团与其***原子一起形成具有1-2个杂原子的任选取代的3-7元饱和或部分不饱和的单环杂环，其中任一第二杂原子独立地选自氮、氧或硫；

环A为

R²为-Cl或-F；以及

R³为-CF₃、-OCF₃或-F。

定义

本发明的化合物包括以上总体上描述的那些，并且通过本文公开的类别、子类别以及种类进一步说明。如本文所使用，除非另外指出，否则以下定义应适用。出于本发明的目的，根据元素周期表CAS版，Handbook of Chemistry and Physics,第75版，来鉴别化学元素。另外，有机化学的一般原理描述在“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999和“March’s Advanced OrganicChemistry”，第5版，Smith,M.B和March,J.编，John Wiley&Sons,New York:2001中，其全部内容特此以引用的方式并入。

本文所用的缩写具有其在化学和生物领域中常规的含义。本文阐述的化学结构和化学式根据化学领域中已知的化学价的标准规则来理解。

如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指直链(即未分枝)或支链、取代或未取代的烃链，其为完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元；或单环烃或二环烃，其为完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但不是芳香族的(本文还称为“碳环”、“环脂族”或“环烷基”)，具有附接至分子的其余部分的单一附接点。除非另外指出，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，并且在其它实施方案中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。适合的脂族基团包括但不限于直链或支链、取代或未取代的烷基、烯基、炔基，以及其杂合基团(hybrid)，如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。

如本文所用，术语“环脂族”(或“碳环”或“环烷基”)是指单环C₃-C₆烃，其为完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但不是芳香族的，具有附接至分子的其余部分的单一附接点。

如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”以及“杂环(heterocyclic ring)”可互换使用，并且是指稳定的3至7元单环杂环部分，其为饱和或部分不饱和的，并且除了碳原子以外还具有一个或多个、优选一至四个如以上所定义的杂原子。在参考杂环的环原子使用时，术语“氮”包括取代的氮。例如，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和的环中，氮可为N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基)、NH(如在吡咯烷基中)或⁺NR(如在N-取代的吡咯烷基中)。术语“杂环基烷基”是指被杂环基取代的烷基，其中烷基和杂环基部分独立地任选地被取代。

杂环可在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处附接至其侧基，并且任何环原子可任选地被取代。所述饱和或部分不饱和的杂环基团的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、哌啶基吡咯啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、二氮杂草基、氧氮杂草基(oxazepinyl)、硫氮杂草基、吗啉基以及奎宁环基。

如本文所用，术语“部分不饱和的”是指包括至少一个双键或三键的环部分。术语“部分不饱和的”旨在涵盖具有多个不饱和部位的环，但不旨在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。

术语“杂原子”意指以下中的一个或多个：氧、硫、氮、磷或硅(包括氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或杂环的取代的氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR⁺(如在N-取代的吡咯烷基中))。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和低等动物的组织接触，而没有不当毒性、刺激、过敏反应等，并且具有相称的合理益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中熟知的。例如，S.M.Berge等在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文中。

在某些实施方案中，通过使盐与碱或酸接触并且按常规方式分离母体化合物来再生中性形式的化合物。在一些实施方案中，化合物的母体形式在某些物理特性如极性溶剂中的溶解性方面不同于各种盐形式。

除非另外说明，否则本文所描绘的结构还意在包括所述结构的所有异构体形式(例如，对映异构体、非对映异构体以及几何异构体(或构象))，例如各不对称中心的R和S构象，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象)混合物均处于本发明的范围内。除非另外说明，否则本发明化合物的所有互变异构体形式均处于本发明的范围内。另外，除非另外说明，否则本文所描绘的结构还意在包括仅在一个或多个同位素富集的原子存在下不同的化合物。例如，具有本结构的、包括氢被氘或氚置换或碳被¹³C或¹⁴C富集的碳置换的化合物处于本发明的范围内。所述化合物用作例如分析工具、在生物测定中用作探针或根据本发明用作治疗剂。

化合物

如以上所述，在某些实施方案中，本发明提供式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中R¹和环A如本文所定义和描述。

出乎意料地发现式I化合物展现出优于Btk的已知抑制剂的有利特性。在某些实施方案中，式I化合物具有增大的效力。不希望受任何特定理论约束，相信本文公开的化合物作为Btk抑制剂拥有改善的效力、改善的脱靶轮廓，如通过hERG抑制或PXR诱导测定所测量，或其组合。后续实施例中提供了示出所述有利特性的实验数据。

在一些实施方案中，两个R¹均为氢。在一些实施方案中，各R¹独立地为C_1-6脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为C_1-5脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为C_1-4脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为C_1-3脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为C_1-2脂族基团。在一些实施方案中，两个R¹均为甲基。

在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或C_1-6脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或C_1-5脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或C_1-4脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或C_1-3脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或C_1-2脂族基团。在一些实施方案中，各R¹独立地为氢或甲基。

在一些实施方案中，一个R¹为氢或并且另一个R¹为C_1-6脂族基团。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为甲基。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为乙基。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为C_1-6(环烷基)烷基。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为C_1-6(环烷基)。

在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为任选地被-OR取代的C_1-6脂族基团，其中R为氢或C_1-6脂族基团。

在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为具有3-7个碳原子以及1-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的杂环基烷基。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为任选取代的3-7元单环杂环。

在一些实施方案中，两个R¹基团与其***原子一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选取代的3-5元饱和或部分不饱和的单环杂环。在一些实施方案中，两个R¹基团与其***原子一起形成任选取代的哌嗪环。

如以上所述，环A为在某些实施方案中，R²为-Cl。在其它实施方案中，R²为-F。在一些实施方案中，R³为-CF₃。在一些实施方案中，R³为-OCF₃。在一些实施方案中，R³为-F。

在某些实施方案中，环A选自：以及

在一些实施方案中，在本文描述的化合物中，在携带羧酰胺的哌啶取代基与携带内酰胺的哌啶取代基之间存在反式立体化学关系。

在一些实施方案中，本发明提供式II-a化合物：

或其药学上可接受的盐，其中各R¹、R²以及R³如以上所定义，并且如本文的类别和子类别中所描述。

在一些实施方案中，本发明提供式II-b化合物：

在一些实施方案中，本发明提供式III化合物：

或其药学上可接受的盐，其中各R²和R³如以上所定义，并且如本文的类别和子类别中所描述。

在一些实施方案中，本发明提供式IV化合物：

或其药学上可接受的盐，其中各R¹和R³如以上所定义，并且如本文的类别和子类别中所描述。在一些实施方案中，两个R¹均为氢。在一些实施方案中，一个R¹为氢并且另一个R¹为甲基。

在一些实施方案中，所提供的化合物为下表1中描绘的化合物，或其药学上可接受的盐。

表1-所选择的式I化合物

本发明化合物通过通常熟知合成方法的适当组合来合成。适用于合成本发明化合物的技术对于相关领域的技术人员是显而易见且可获取的。提供以下论述来说明可用于合成本发明化合物的各种方法中的某些。然而，该论述不意在限定适用于制备本发明化合物的反应或反应顺序的范围。

式I化合物通常可根据方案1来制备。

方案1

式I化合物通常还可根据方案2、3、3a、4、4a、5或5a来制备。

方案2

方案3

方案3a

方案4

方案4a

方案5

方案5a

方案1至5a中的化合物的PG、PG₁、PG₂以及PG₃基团各自独立地是合适的保护基。这类酯和胺保护基在本领域中是已知的并且在Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,第3版,John Wiley&Sons,1999中有详细描述，该文献的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方案中，保护基是Boc基团。

在某些实施方案中，方案1至5a中的各合成步骤可以与各步骤之后进行的各中间体的分离依次进行。或者，如以上方案1、2、3以及4中所述的各步骤可以以其中不分离一种或多种中间体的方式进行。

在某些实施方案中，可以进行上述合成的所有步骤以制备所需的最终产物。在其它实施方案中，可以进行两个、三个、四个、五个或更多个连续步骤以制备中间体或所需的最终产物。

用途、制剂及施用

在某些实施方案中，本发明化合物是用于医学中。在一些实施方案中，本发明提供降低Tec激酶家族(例如Tec、Btk、Itk、Txk、Lck以及Bmx)中激酶的酶活性的方法。在一些实施方案中，这类方法包括将Tec激酶家族的激酶与有效量的Tec激酶家族抑制剂接触。因此，本发明还提供通过将Tec激酶家族成员与本发明的Tec激酶家族抑制剂接触来抑制Tec激酶家族酶活性的方法。如本文所用，术语“Tec激酶家族成员”是指在Tec激酶家族中的任何非受体酪氨酸激酶。在一些实施方案中，Tec激酶家族成员是Tec、Btk、Itk、Txk、Lck以及Bmx。

在一些实施方案中，本发明提供降低Btk酶活性的方法。在一些实施方案中，这类方法包括将Btk与有效量的Btk抑制剂接触。因此，本发明还提供通过将Btk与本发明的Btk抑制剂接触来抑制Btk酶活性的方法。

如本文所用，Btk酶活性是指Btk激酶的酶活性。举例来说，当Btk酶活性降低时，PIP3结合和/或PLCγ的磷酸化也减少。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的半最大抑制浓度(IC₅₀)小于1μM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀小于500nM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀小于100nM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀小于10nM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀小于1nM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀是0.1nM至10μM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀是0.1nM至1μM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀是0.1nM至100nM。在一些实施方案中，Btk抑制剂针对Btk的IC₅₀是0.1nM至10nM。

在一些实施方案中，这类Tec激酶的抑制剂适用于治疗可通过抑制(即降低)一种或多种Tec激酶的酶活性来缓解的疾病和病症。本发明化合物是Tec家族激酶的有效抑制剂并且因此将适用于治疗与Tec家族激酶中的一种或多种激酶的活性相关的疾病。术语“疾病”意指疾病、综合征或疾病症状。因此，本发明提供治疗有需要的受试者的自体免疫病症、发炎性病症以及癌症的方法。这类方法包括向受试者施用治疗有效量的Tec、Btk、Itk、Txk、Lck和/或Bmx激酶的抑制剂。

术语“自体免疫病症”包括涉及针对天然抗原的不适当的免疫应答的疾病或病症，如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病、斑形脱发、抗磷脂抗体综合征(APS)、溶血性贫血、自体免疫肝炎、大疱性类天疱疮(BP)、腹腔疾病、皮肤肌炎、1型糖尿病、古德帕斯彻综合征(Good Pasture's syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、格-巴综合征(GBS)、桥本氏病、特发性血小板减少性紫癜、狼疮或全身性红斑狼疮(SLE)、混合***病、多发性硬化、重症肌无力、寻常天疱疮、伴随抑制剂的血友病、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征( syndrome)、颞动脉炎以及韦格纳肉芽肿。术语“发炎性病症”包括涉及急性或慢性炎症的疾病或病症，如过敏症、哮喘(例如过敏性哮喘)、异位性皮炎、***炎、血管球性肾炎、骨盆发炎性疾病(PID)、发炎性肠病(IBD，例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎)、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥反应(包括具有阳***叉匹配的移植患者)以及血管炎。在某些实施方案中，本发明提供治疗被批准用利妥昔单抗(一种针对CD20的单克隆抗体)来治疗的疾病、病症或病状的方法，包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、RA、韦格纳肉芽肿(WG)以及显微镜下多血管炎(MPA)。在一些实施方案中，本发明提供一种使用本文所公开的化合物来治疗类风湿性关节炎(RA)、SLE或异位性皮炎的方法。

术语“癌症”包括涉及异常细胞生长和/或增生的疾病或病症，如神经胶质瘤、甲状腺癌、乳癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、胃癌、胃肠基质肿瘤、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、***癌、肾细胞癌、淋巴瘤(例如间变性大细胞淋巴瘤)、白血病(例如急性髓细胞性白血病、T细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、多发性骨髓瘤、恶性间皮瘤、恶性黑色素瘤以及结肠癌(例如微卫星不稳定性高结肠直肠的癌)。在一些实施方案中，本发明提供一种治疗白血病或淋巴瘤的方法。

如本文所用，术语“受试者”是指药物组合物所施用于的哺乳动物。示例性受试者包括人类以及兽医和实验室动物，如马、猪、牛、狗、猫、兔、大鼠、小鼠以及水生哺乳动物。

所选择的适应症和B细胞抑制

如上所述，提供适用于治疗包括RA和SLE的疾病的化合物。如以下更详细地描述，这些疾病与B细胞有关。因此，本公开包括提供对于适用作这些及其它适应症的治疗剂的化合物的识别。

免疫***的调节异常对于RA的发病机理很重要(Panayi GS等人Rheum Dis ClinNorth Am 2001；27:317-334)。虽然在滑膜中大部分的浸润白细胞是T淋巴细胞(主要是活化的CD4+T细胞)以及单核细胞/巨噬细胞起源的细胞(其释放如IL-1、TNF-α和IL-6的促炎细胞因子以及包括胶原酶和金属蛋白酶的蛋白水解酶)，但是也在滑液中发现了B细胞和浆细胞(Zhang Z,Bridges SL.Rheum Dis Clin North Am 2001；27:335-353)。B细胞及其相关效应子功能在RA中的明确作用已经通过利妥昔单抗的功效来证明，利妥昔单抗是一种选择性B细胞消耗性治疗剂，其被批准用于治疗RA(Cohen SB等人；REFLEX TrialGroup.Arthritis Rheum.2006年9月；54(9):2793-806)。

虽然未完全了解SLE的病因，但病原性自身抗体和免疫复合物的沉积被认识是发生广泛性组织损伤的关键(Klippel JH等人Primeron the rheumatic diseases.Atlanta:Arthritis Foundation；2001)。自身抗体和免疫复合物介导的活化可以通过测量经由Fc受体刺激的巨噬细胞对巨噬细胞活化的抑制来研究(参见例证-原代人类巨噬细胞的FcγR活化)。对自身抗原的耐受性丧失最终导致B细胞的刺激从而产生经常针对核或细胞质组分的自身抗体。针对核组分的抗体(抗核抗体[ANA])靶向核抗原，包括DNA(通常是双链DNA[dsDNA])、RNA、组蛋白以及小核核糖核蛋白。这些抗体与自身抗原结合，形成沉积在组织中的免疫复合物、引起发炎性反应并且导致组织损伤。除B细胞在病原性自身抗体产生中的作用之外，B细胞还用作T细胞的抗原递呈细胞(APC)，由此在抗原特异性应答的起始中发挥作用。鉴于免疫***的体液分支在SLE的发病机理中的重要作用，B细胞或B细胞途径代表合乎需要的治疗靶标。贝利单抗(belimumab)(一种单克隆抗体)最近被批准用于SLE，其阻断BAFF结合至其由B细胞表达的受体。这些受体用于活化和强化B细胞的存活，这与在用贝利单抗治疗后所观察到的循环B细胞的减少一致。还参见Chan OT等人Immunol Rev.1999b；169:107-121；Navarra SV等人Lancet.2011Feb 26；377(9767):721-31；Furie R等人Arthritis Rheum.2011Dec；63(12):3918-30。B细胞和骨髓谱系细胞在自体免疫疾病如SLE中的作用进一步通过描述当小鼠用小分子不可逆性Btk抑制剂治疗时在临床前SLE动物模型中的功效的最新出版物来支持(Honigberg,L.A.PNAS.2010；107:13075)。

组合

在某些实施方案中，本发明化合物与另一药剂组合施用。在一些实施方案中，本发明化合物适用于治疗RA并且与包括但不限于以下的疾病缓解性防风湿药(DMARD)组合施用：氨甲蝶呤、阿巴西普(abatacept)、咪唑硫嘌呤、塞妥珠单抗(certolizumab)、氯喹和羟氯喹、环孢菌素、D-青霉胺、阿达木单抗、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、金盐(包括金诺芬和硫代苹果酸金钠)、英夫利昔单抗(infliximab)、来氟米特、二甲胺四环素、利妥昔单抗、柳氮磺胺吡啶、tocilizumab或其组合。在一些实施方案中，本发明化合物与NSAID或皮质类固醇组合施用。在一些实施方案中，本发明化合物适用于治疗SLE并且与用于治疗SLE的包括但不限于以下的药剂组合施用：皮质类固醇、抗疟药、贝利单抗、霉酚酸莫非替克(MMF)或霉酚酸钠、硫唑嘌呤或其组合。在一些实施方案中，本发明化合物适用于治疗异位性皮炎并且与用于治疗异位性皮炎的包括但不限于以下的局部药剂组合施用：局部类固醇、他克莫司(tacrolimus)、氨甲蝶呤、糠酸莫米松(MMF)、咪唑硫嘌呤、类视色素或其组合。

测定

为了开发有用的Tec激酶家族抑制剂，能够降低Tec激酶家族酶活性的候选抑制剂可以在体外被鉴定。抑制性化合物的活性可以利用本领域中已知的方法和/或本文所提到的方法来测定。

降低Tec激酶家族成员的酶活性的化合物可以使用重组或天然存在的生物活性Tec激酶家族成员来鉴定和测试。Tec激酶可见于天然细胞中，被体外分离或在细胞中共表达或表达。测量在抑制剂存在下Tec激酶家族成员酶活性相对于在抑制剂不存在下活性的降低可以使用本领域中已知的多种方法(如以下在实施例中所述的POLYGAT-LS测定)来进行。用于测定Btk及其它Tec激酶的活性的其它方法在本领域中是已知的。适当测定方法的选择完全在本领域技术人员的能力范围之内。

一旦鉴定出能够降低Tec激酶家族成员的酶活性的化合物，那么可以对化合物相对于其它酶选择性地抑制Tec激酶家族成员的能力进行进一步测试。

化合物可以进一步在细胞模型或动物模型中就其引起与Tec激酶家族成员活性有关的表型的可检测变化的能力进行测试。除细胞培养物之外，动物模型也可用于测试Tec激酶家族成员抑制剂在动物模型中治疗自体免疫病症、发炎性病症或癌症的能力。

药物组合物

另一方面，本发明提供包含式I化合物或式I化合物与药学上可接受的赋形剂(例如载体)组合的药物组合物。

药物组合物包括本文所公开的抑制剂的光学异构体、非对映体或药学上可接受的盐。包含于药物组合物中的式I化合物可以共价连接至载体部分，如上所述。或者，包含于药物组合物中的式I化合物没有共价连接至载体部分。

如本文所用，“药学上可接受的载体”是指药物赋形剂，例如药学上、生理学上可接受的有机或无机载体物质，它们适合于肠内或胃肠外应用并且不会与活性剂发生有害反应。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(如林格氏溶液)、醇类、油剂、明胶、以及碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、以及聚乙烯吡咯烷。这类制剂可以被灭菌并且按需要可与以下助剂混合，如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色和/或芳香物质等，它们不会与本发明化合物发生有害反应。

本发明化合物可以向受试者单独施用或共同施用。共同施用意味着包括单独地或组合地(多于一种化合物)同时或依次施用化合物。制剂在需要时还可以与其它活性物质(例如为了减少代谢降解)组合。

本发明化合物可以以广泛多种口服、肠胃外以及局部剂型来制备和施用。因此，本发明化合物可以通过注射(例如静脉内、肌肉内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内)来施用。并且，本文所述的化合物可以通过吸入(例如鼻内)来施用。另外，本发明化合物可以经皮施用。还预见多种施用途径(例如，肌肉内、口服、经皮)可用于施用本发明化合物。

对于由本发明化合物制备药物组合物来说，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂以及可分散颗粒。固体载体可以是还可充当稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或囊封材料的一种或多种物质。

在粉剂中，载体是微细的固体混合微细的活性组分。在片剂中，将活性组分与具有必要粘合特性的载体以合适的比例混合并且压实成所需的形状和尺寸。

粉剂和片剂优选含有5％至70％活性化合物。合适的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂”意图包括用囊封材料作为载体来配制活性化合物，提供其中具有或不具有其它载体的活性组分由因此与所述活性组分有关的载体包围的胶囊。类似地，包括扁囊剂和糖锭。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁囊剂以及糖锭可以用作适合于口服的固体剂型。

对于制备栓剂，首先熔化低熔点蜡如脂肪酸甘油酯的混合物或可可脂并且将活性组分如通过搅拌均匀分散在其中。然后将熔化的均匀混合物注入适宜尺寸的模具中，允许冷却并且从而固化。

液体形式制剂包括溶液、混悬液以及乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，液体制剂可以在聚乙二醇水溶液中以溶液形式配制。

当需要或想要肠胃外应用时，用于本发明化合物的特别合适的混合物是可注射的无菌溶液，优选油性或水性溶液，以及混悬液、乳液或植入物，包括栓剂。具体地，用于肠胃外施用的载体包括葡萄糖水溶液、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段聚合物等。安瓿是便利的单位剂量。本发明化合物还可以并入脂质体中或通过经皮泵或贴剂来施用。适合在本发明中使用的药物混合物包括在例如PharmaceuticalSciences(第17版,Mack Pub.Co.,Easton,PA)和WO 96/05309中所述的那些，两篇文献的教义特此以引用的方式并入。

适合口服使用的水溶液可以通过将活性组分溶解于水中并且按需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂及增稠剂来制备。适合口服使用的水性混悬液可以通过将微细的活性组分分散在含有以下粘性材料的水中而制得，如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠及其它众所周知的混悬剂。

还包括意图在使用前不久转化为用于口服施用的液体形式制剂的固体形式制剂。这类液体形式包括溶液、混悬液以及乳液。这些制剂除活性组分之外还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲液、人工及天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

药物制剂优选呈单位剂型。在这类形式中，制剂被再分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，所述包装含有离散量的制剂，如在小瓶或安瓿中的包装的片剂、胶囊及粉剂。并且，单位剂型可以是胶囊、片剂、扁囊剂或糖锭自身或其可以是适当数量的呈包装形式的这些剂型中的任一种。

活性组分在单位剂量制剂中的量可以根据具体应用以及活性组分的效力在0.1mg至10000mg，更通常在1.0mg至1000mg，最通常在10mg至500mg的范围内变化或调整。组合物按需要还可以含有其它相容性治疗剂。

一些化合物在水中可具有有限的溶解度且因此在组合物中可能需要表面活性剂或其它适当的共溶剂。这类共溶剂包括：聚山梨酸酯20、60以及80；普卢兰尼克F-68、F-84以及P-103；环糊精；以及聚烃氧基35蓖麻油。这类共溶剂通常在约0.01重量％与约2重量％之间的水平下使用。

大于简单水溶液的粘度可能是合乎需要的，以便降低分配制剂中的变异性，减少制剂的混悬液或乳液的组分的物理分离和/或另外改进制剂。这类粘度生成剂包括例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硫酸软骨素及其盐、透明质酸及其盐、以及前述的组合。这类试剂通常在约0.01重量％与约2重量％之间的水平使用。

本发明的组合物可以另外包含提供持续释放和/或舒适性的组分。这类组分包括高分子量阴离子拟粘膜聚合物、胶凝多糖、以及微细的药物载体基质。这些组分在美国专利号4,911,920；5,403,841；5,212,162；以及4,861,760中更详细地论述。这些专利的全部内容以引用的方式出于所有目的整体并入本文。

有效剂量

由本发明提供的药物组合物包括活性成分以治疗有效量，即有效获得其预期目的的量包含在其中的组合物。对于具体应用有效的实际量将尤其取决于所治疗的病状。例如，当在治疗癌症的方法中施用时，这类组合物将含有有效获得所需结果的活性成分的量(例如减少受试者中的癌细胞数目)。

所施用化合物的剂量和频率(单一或多个剂量)可以根据包括以下的多种因素而变化：施用途径；接受者的尺寸、年龄、性别、健康情况、体重、体重指数以及饮食；所治疗疾病(例如对Btk抑制有反应的疾病)的症状的性质和程度；其它疾病或其它健康相关问题的存在；同时治疗的种类；以及来自任何疾病或治疗方案的并发症。其它治疗方案或药剂可以结合本发明的方法和化合物来使用。

对于本文所述的任何化合物，治疗有效量可以是最初根据细胞培养测定确定的。目标密度将是能够降低激酶酶活性的活性化合物的那些浓度，如例如使用所述方法所测量的。

用于人类的治疗有效量可以由动物模型来确定。例如，用于人类的剂量可以被配制以获得在动物中被认为是有效的浓度。在人类中的剂量可以通过监测激酶抑制以及如上所述向上或向下调整剂量来调整。在某些实施方案中，所施用的剂量在每天约10mg至约1000mg范围之内，或者每天一次、两次或两次以上。

剂量可以根据患者的要求和所采用的化合物而变化。在本发明的上下文中，施用于患者的剂量将应足以在患者中随着时间实现有益的治疗反应。剂量的大小还将通过任何不良副作用的存在、性质以及程度而确定。一般说来，治疗是从较小剂量开始，所述较小剂量小于化合物的最佳剂量。此后，剂量以小的增量增加直到达到环境下的最佳作用。在一些实施方案中，剂量范围是0.001％至10％w/v。在一些实施方案中，剂量范围是0.1％至5％w/v。

剂量数量和间隔时间可以个别地调整以提供对于所治疗的具体临床适应症有效的所施用化合物的水平。这将提供与个体的疾病状况的严重性相称的治疗方案。

为了可以更充分地了解本文所述的的本发明，阐述以下实施例。应理解的是这些实施例仅出于说明性目的并且不被视为以任何方式限制本发明。

例证

如以下实施例中所述，在某些示例性实施方案中，化合物是根据以下一般程序来制备的。应了解，虽然一般方法描述合成本发明的某些化合物，但是以下一般方法及本领域的普通技术人员已知的其它方法可用于如本文所述的所有化合物以及这些化合物的每一种的子类和种类。

实施例1

合成(3'R,4'S)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯

制备3-氧代哌啶-4-甲酸乙酯中间体。在H₂下，在大气压下将1-苄基-3-氧代哌啶-4-甲酸乙酯1(15.0g，50.5mmol，1.0当量)在10％Pd/C(1.5g)催化剂的存在下在MeOH(250mL)中氢化16h。滤出催化剂并且在真空中浓缩溶剂以得到呈淡黄色固体状的3-氧代哌啶-4-甲酸乙酯2(10.2g，产率：98.0％)。ESI-MS(M+H)⁺:172.1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:4.23(q,2H),3.75(s,2H),3.37(s,2H),3.20-3.16(m,2H),2.44(t,1H),1.25(t,3H)。

制备3-氧代哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。将3-氧代哌啶-4-甲酸乙酯2(10.2g，60.0mmol，1.0当量)溶解于干燥的MeOH(200mL)中，并且添加Et₃N(33.1mL，240mmol，4.0当量)。将混合物搅拌1h并且添加Boc₂O(19.5g，90.0mmol，1.5当量)并搅拌16h。在真空中浓缩溶剂并且将粗产物通过柱色谱(二氧化硅，石油醚/EtOAc＝9:1)纯化以得到呈淡黄色油状的3-氧代哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯3(11.5g，产率：86％)。ESI-MS(M+H-56)⁺:216.0。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:4.24(q,2H),4.03(s,2H),3.49(t,2H),2.33(t,2H),1.47(s,9H),1.31(t,3H)。

制备(S)-3-((1-苯基乙基)氨基)-5,6-二氢吡啶-1,4-(2H)-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。在配备有Dean-stark分水器和回流冷凝器的干燥烧瓶中，将3-氧代哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯3(10.0g，37.0mmol，1.1当量)溶解于甲苯(100mL)中。添加S-(-)-α-甲基苄胺(4.9g，40.5mmol，1.1当量)和对甲苯磺酸一水合物(0.7g，3.7mmol，0.1当量)并且将混合物加热至回流持续16h。将粗反应混合物在真空中浓缩以得到呈稠厚橙色油状的(S)-3-((1-苯基乙基)氨基)-5,6-二氢吡啶-1,4(2H)-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯4(12.0g，Y：88％)，所述产物在不进一步纯化的情况下用于下一步中。ESI-MS(M+H)⁺:375.2。

制备3-(((S)1-苯基乙基)氨基)-5,6-二氢吡啶-1,4(2H)-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。将3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯4(11.2g，30.0mmol，1.0当量)溶解于CH₃CN(60mL)与乙酸(60mL)的混合物中并且冷却至0℃。缓慢添加NaBH(OAc)₃(19.0g，90.0mmol，3.0当量)并且允许在0℃下搅拌反应混合物2h。缓慢添加饱和NaHCO₃以中和溶液以便将***内部温度维持在10℃以下。将混合物用EtOAc(50mL×3)萃取。将合并的有机层干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，然后通过柱色谱(二氧化硅，石油醚/EtOAc＝9:1)纯化以得到呈淡黄色油状的3-(((S)1-苯基乙基)氨基)-5,6-二氢吡啶-1,4(2H)-二甲酸4-乙酯5(8.2g，Y：73％)。ESI-MS(M+H)⁺:377.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.31-7.22(m,5H),4.20(q,2H),4.11-3.86(m,3H),3.15(s,1H),3.00-2.90(m,2H),2.64(d,2H),1.87-1.85(m,1H),1.68(s,1H),1.50-1.25(m,15H)。

制备反式-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。在N₂下将3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯5(8.0g，21.2mmol，1.0当量)溶解于干燥的EtOH(20mL)中。将干燥的EtOH(150mL)置于单独的火焰干燥的Schlenk烧瓶中，并且在N₂下逐份添加钠(0.450g，63.6mmol，3.0当量)。将混合物保持在N₂下并且排气以除去析出的气体直到所有钠都已经溶解。然后将3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯的澄清溶液转移到NaOEt溶液中，并且在80℃下在N₂下搅拌混合物16h。在真空下除去溶剂，且添加盐水(150mL)并且将混合物用1N NaOH调节至pH＝10并用EtOAc(100mL×3)萃取。将合并的有机层干燥(Na₂SO₄)并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱(二氧化硅，石油醚/EtOAc＝5:1)纯化以得到呈淡黄色固体状的(反式)-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯6(3.7g，产率：46％)。ESI-MS(M+H)⁺:377.2。

制备反式-3-氨基哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。在H₂下，在30个大气压下，在50℃下将反式-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯6(3.7g，8.3mmol，1.0当量)在10％Pd/C(0.37g)催化剂的存在下在MeOH(100mL)中氢化8h。滤出催化剂并且在真空中除去溶剂以得到呈淡黄色油状的(反式)-3-氨基哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯7(2.5g，产率：92％)。ESI-MS(M+H)⁺:273.1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:4.18(q,2H),3.97-3.94(m,2H),3.37(s,1H),3.07-3.02(m,1H),2.89-2.85(m,1H),2.60-2.55(m,1H),2.01-1.91(m,1H),1.70-1.54(m,3H),1.46(s,9H),1.28(t,3H)。

合成反式-3-(5-溴戊酰胺基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯。在室温下向反式-3-氨基哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯7(2.5g，9.2mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液中添加Et₃N(2.5mL，18.4mmol，2.0当量)。在室温下搅拌反应溶液10min之后，添加5-溴戊酰氯(1.9g，9.6mmol，1.05当量)。在室温下搅拌反应溶液2h。将混合物用H₂O(20mL)淬灭并用CH₂Cl₂(50mL×3)萃取。将有机层收集，在真空中浓缩，并且将残余物通过柱色谱(二氧化硅，石油醚/EtOAc＝1:1)纯化以得到呈黄色油状的(反式)-3-(5-溴戊酰胺基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯8(3.2g，产率：80％)。ESI-MS(M+H-56)⁺:379.0。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.99(d,1H),4.39-4.38(m,1H),4.15(q,2H),3.79-3.74(m,1H),3.66-3.60(m,1H),3.41(t,2H),3.30-3.26(m,1H),3.21-3.14(m,1H),2.78-2.74(m,1H),2.19(t,2H),1.99-1.85(m,3H),1.80-1.72(m,3H),1.45(s,9H),1.27(t,3H)。

合成反式-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯。在0℃下向反式-3-(5-溴戊酰胺基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯8(3.0g，6.9mmol，1.0当量)在THF(20mL)中的溶液中以小份小心地添加NaH(276mg，6.9mmol，1.0当量)。在回流条件下搅拌反应溶液4h。将混合物用H₂O(20mL)淬灭，并且用EtOAc(30mL×3)萃取。将有机层收集，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱(二氧化硅，石油醚/EtOAc＝1:2)纯化以得到呈淡黄色油状的(反式)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯9(2.1g，产率：88％)。ESI-MS(M+H-56)⁺:299.1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:4.10(q,4H),3.38-3.19(m,4H),2.70-2.61(m,1H),2.36-2.31(m,2H),1.95-1.92(m,1H),1.75-1.71(m,6H),1.46(s,9H),1.23(t,3H)。

实施例2

制备反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺

合成反式-1'-叔丁基-4'-乙基-3-碘代-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸酯。在0℃下在N₂下向反式-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯8(141mg，2.58mmol，1.0当量)在干燥甲苯(10mL)中的溶液中依次添加TMEDA(0.89g，7.7mmol，3.0当量)和TMSCl(0.6mg，1.0mmol，2.0当量)。0.5h之后，以小份小心地添加I₂(0.98g，3.87mmol，1.5当量)。在0℃至室温下搅拌反应溶液16h。将混合物用EtOAc(100mL)稀释，用饱和Na₂S₂O₃(20mL×2)和盐水(20mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且在真空中浓缩。粗产物9(2.2g，Y：81％)在不进一步纯化的情况下直接用于下一步中。ESI-MS(M+H-56)⁺:424.9。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:4.78-4.73(m,1H),4.19-4.04(m,4H),3.55-3.30(m,4H),3.24-3.16(m,2H),2.73-2.60(m,1H),2.22-2.14(m,2H),1.96-1.78(m,2H),1.70-1.60(m,1H),1.44(s,9H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)。

合成反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯。在10-15℃下通过加料漏斗向3-氯-5-(三氟甲基)苯胺(15g，78mmol，1.2当量)在THF(13mL)中的溶液中添加双(三甲基二甲硅烷基)酰胺锂在THF(13mL，12mmol，2.0当量)中的1.0M溶液。允许在室温下搅拌混合物20min并且在10-15℃下经30min通过加料漏斗添加粗的反式-1'-叔丁基-4'-乙基-3-碘代-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸酯9(3.7g，65mmol，1.0当量)在THF(13mL)中的溶液。添加之后，允许在此温度下搅拌反应30min。一旦完成，就将反应冷却至5℃并且用水(10mL)缓慢淬灭，将温度保持在20℃以下。将淬灭的反应用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(30mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且在真空中浓缩。将所得的粗产物用10％至75％EtOAc在庚烷中的梯度洗脱经由硅胶纯化以得到所需产物10。ESI-MS(M+H-56)⁺:463.1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.92(s,1H),6.71-6.69(m,2H),4.17-4.06(m,4H),3.78-3.68(m,2H),3.46-3.36(m,3H),3.23-3.07(m,2H),2.73-2.65(m,1H),2.44-2.37(m,1H),2.03-1.85(m,3H),1.71-1.61(m,2H),1.46(s,9H),1.27-1.19(m,3H)。

合成反式-1'-(叔丁氧基羰基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸。向反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1',4'-二甲酸1'-叔丁酯4'-乙酯10(180mg，0.33mmol，1.0当量)在EtOH(5mL)中的溶液中添加NaOH(40mg，0.99mmol，3.0当量)并且在80℃下搅拌溶液1h。在真空中浓缩溶剂并且将残余物悬浮于水(10mL)中并用HCl(4N)调节至pH＝6。过滤沉淀得到呈黄色固体状的(反式)-1'-(叔丁氧基羰基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸11(150mg，Y：82％)，所述产物在不进一步纯化的情况下用于下一步中。ESI-MS(M+H-85)⁺:463.1。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.85(s,1H),6.82(s,1H),6.78(s,1H),4.12-3.96(m,4H),3.53-3.37(m,2H),3.11-3.04(m,2H),2.75-2.67(m,1H),2.24-2.18(m,1H),1.98-1.89(m,3H),1.71-1.58(m,2H),1.44(s,9H)。

合成反式-4'-氨基甲酰基-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯。向反式1'-(叔丁氧基羰基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸11(70mg，0.14mmol，1.0当量)在DMF(2mL)中的溶液中添加NH₄Cl(22mg，0.41mmol，3.0当量)、HBTU(103mg，0.270mmol，2.0当量)以及DIPEA(52mg，0.41mmol，3.0当量)。在室温下搅拌反应溶液16h，用EtOAc(10mL)稀释并且用水(5mL)和盐水(5mL)洗涤。将有机相分离并在真空中浓缩以得到粗油状物，将其通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈淡色固体状的化合物(反式)-4'-氨基甲酰基-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯12(60mg，产率：86％)。ESI-MS(M+H-56)⁺:463.1。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:6.87-6.86(m,1H),6.84-6.83(m,1H),6.80(s,1H),4.11-4.03(m,3H),3.53-3.35(m,2H),3.20-3.08(m,2H),2.77-2.74(m,1H),2.25-2.18(m,1H),1.99-1.88(m,3H),1.70-1.60(m,2H),1.46(s,9H)。

合成反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。在室温下向反式-4'-氨基甲酰基-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯12(60mg，0.11mmol)在CH₂Cl₂(1.0mL)中的溶液中添加CF₃CO₂H(1.0mL)。在室温下搅拌反应混合物2h，在真空中浓缩以得到所需产物13(43mg，90％)，将其在不进一步纯化的情况下直接用于下一步中。ESI-MS(M+H)⁺:419.0。

合成反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。向反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺13(42mg，0.10mmol，1.0当量)在1-丁醇(2mL)、6-氯-5-氟嘧啶-4-胺(18mg，0.12mmol，1.2当量)中的溶液中添加DIPEA(26mg，0.20mmol，2.0当量)。在120℃下搅拌反应溶液16h。将混合物用EtOAc(20mL)稀释，用H₂O(10mL)和盐水(10mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤，并且在真空中浓缩。将粗产物通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的化合物(反式)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14(44mg，产率：83％)。ESI-MS(M+H)⁺:530.0。HPLC:(214nm:100％,254nm:100％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.97(s,1H),6.84(s,1H),6.81(s,1H),6.76(s,1H),4.58-4.52(m,2H),4.09-4.03(m,1H),3.52-3.35(m,3H),3.29-3.27(m,4H),3.12-3.05(m,1H),2.24-2.17(m,1H),2.02-1.91(m,3H),1.80-1.63(m,2H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将化合物14的四种非对映体的混合物通过SFC(IA(2×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰且标题化合物对应于峰3。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝530.1(M+1)@1.20min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(d,J＝2.01Hz,1H),7.38(br.s.,1H),6.94(s,2H),6.75-6.87(m,2H),6.41-6.66(m,3H),4.29(br.s.,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,1H),3.96-4.18(m,2H),3.44(td,J＝6.15,12.30Hz,1H),3.24-3.33(m,1H),3.10(br.s.,1H),2.88(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.13(qd,J＝5.94,12.30Hz,1H),1.74-1.93(m,3H),1.58-1.74(m,1H),1.41-1.58(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将化合物14的四种非对映体的混合物通过SFC(IA(2×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰且标题化合物对应于峰2。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝530.1(M+1)@1.19min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(br.s.,1H),6.98(s,1H),6.96(s,1H),6.72-6.88(m,2H),6.57(s,2H),6.54(d,J＝7.78Hz,1H),4.05-4.33(m,4H),3.37(t,J＝6.27Hz,2H),3.11(br.s.,1H),2.94(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.02-2.16(m,1H),1.75-1.92(m,3H),1.57-1.74(m,1H),1.36-1.54(m,1H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将化合物14的四种非对映体的混合物通过SFC(IA(2×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰1进一步通过SFC(AD-H(2×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝530.1(M+1)@1.20min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.38(br.s.,1H),6.94(s,2H),6.83(s,1H),6.80(s,1H),6.42-6.66(m,3H),4.18-4.47(m,2H),3.95-4.18(m,2H),3.39-3.52(m,1H),3.24-3.31(m,1H),3.10(br.s.,1H),2.88(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.13(qd,J＝5.91,12.39Hz,1H),1.73-1.92(m,3H),1.58-1.73(m,1H),1.42-1.58(m,1H)。

(3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将化合物14的四种非对映体的混合物通过SFC(IA(2×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰1进一步通过SFC(AD-H(2×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝530.1(M+1)@1.20min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(br.s.,1H),6.98(s,1H),6.96(s,1H),6.73-6.88(m,2H),6.57(s,2H),6.54(d,J＝7.78Hz,1H),4.05-4.35(m,4H),3.37(t,J＝6.15Hz,2H),3.12(br.s.,1H),2.94(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.09(sxt,J＝5.80Hz,1H),1.74-1.92(m,3H),1.56-1.73(m,1H),1.36-1.52(m,1H)。

实施例3

替代合成(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺

除了实施例2中所述的方法之外，(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺(化合物I-1)还根据方案6来合成。

方案6

3-氧代哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯3-2。在N₂下向3-1(5.0kg，19.1mol，1.0当量)在EtOH(50L)中的溶液中添加(Boc)₂O(4.2kg，19.1mol，1.0当量)、Et₃N(1.9kg，19.1mol，1.0当量)以及10％Pd(OH)₂/C(250g，10％w/w)。排空并用加氢再填充三次之后，在1atm的氢气下在50℃下将混合物搅拌15小时。LC-MS指示3-1完全消耗。将混合物冷却至环境温度之后，将催化剂经由硅藻土层过滤并用EtOH(2.5L)洗涤。将滤液在真空中浓缩以得到粗的呈油状的3-2(5.2kg)，将其在不进一步纯化的情况下用于下一步中。

(S)-3-((1-苯基乙基)氨基)-5,6-二氢吡啶-1,4(2H)-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(3-3)。向配备有Dean-Stark装置的100L反应器中加入甲苯(20L)、用甲苯(30L)冲洗的粗化合物3-2(5.2kg，19.1mol，1.0当量)、pTSA(329g，0.2mol，0.01当量)以及S-(-)-α-甲基苄胺.95kg，16.2mol，0.85当量)。用氮气层将混合物加热至回流并且经由Dean-Stark除去水。18小时之后，LC-MS指示3-2完全消耗。然后将混合物冷却至环境温度。通过过滤除去不溶物且将滤液在真空中浓缩至干燥以得到呈稠厚油状的粗产物3-3。将此粗产物在不进一步纯化的情况下用于下一步中。在此反应中形成的3-10％酰胺副产物及其结构暂时基于LC-MS数据来指定。

(3R)-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-1,4-二甲酸1-叔丁酯4-乙酯(3-4)。向100L反应器中加入NaBH₄(1.16kg，30.5mol，2.0当量)并且在将温度维持在0～5℃下时在氮气下经30min向无水THF(60L)中缓慢添加TFA(10.5kg，92mol，6.0当量)。然后将混合物冷却至-45℃。在单独的反应器中，将粗产物3-3溶解于无水乙腈(30L)中，在将内部温度维持在-45～-30℃之间时将其缓慢添加至NaBH₄/TFA的上述溶液中。在-45℃下搅拌混合物1h，之后，HPLC指示化合物3-3完全消耗。将混合物用冰水(50kg)缓慢稀释且然后将混合物温至10℃。将产物用EtOAc(2×40L)萃取并且将合并的有机层用饱和NaHCO₃溶液(20L)洗涤。水层的pH是～8。将有机层干燥(Na₂SO₄)并在真空中浓缩至几乎干燥以得到残余物，将所述残余物进一步与MeOH(10L×3)共沸以除去过量的EtOAc。最终，获得10L粗的3-4在MeOH中的溶液，将其在不进一步纯化的情况下直接用于随后的步骤中。ESI-MS(M+H-1)⁺:377.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.31-7.22(m,5H),4.20(q,2H),4.11-3.86(m,3H),3.15(s,1H),3.00-2.90(m,2H),2.64(d,2H),1.87-1.85(m,1H),1.68(s,1H),1.50-1.25(m,15H)。

(3R)-1-(叔丁氧基羰基)-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-4-甲酸(3-5)。向100L反应器中加入THF/MeOH(1:1，80L)，添加LiOH·H₂O(2.5kg，60mol，4.0当量)在水(10L)中的溶液以及来自上述步骤的粗3-4在MeOH(10L)中的溶液。将所得混合物在22℃下搅拌18小时，此时LC/MS指示起始材料3-4完全消耗。将溶液用MTBE(40L)稀释并搅拌20min。将水层分离，冷却至0℃并且用3N HCl溶液中和至pH在7-8之间，同时维持内部温度低于10℃。将溶液用DCM(5×30L)洗涤或直到LC/MS指示产物3-5没有保留在水层中。将合并的有机层在真空中浓缩至干燥，悬浮于EtOAc和石油醚(2:1，10L)中并搅拌2小时，将固体过滤，用石油醚(5L)洗涤并且在50℃下在真空下干燥18小时以得到呈固体状的产物(3.5Kg，53％产率)，纯度是95％。化合物3-5是～30:70在C-4处的反式/顺式的混合物以及～93:7在C-3处的R:S的混合物。3-1的平均总产率是43-55％。ESI-MS(M+H-1)⁺:349.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.22-8.06(m,5H)4.11(m,1H),3.86-3.82(m,1H),3.59-3.56(m,1H),2.79-2.65(m,1H),3.22-2.62(m,2H),2.06-2.16(m,12H)。

(3R)-1-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-(((S)-1-苯基乙基)氨基)哌啶-4-甲酸(3-7)。向50L反应器中加入10L的2N HCl和3-5(850g，2.44mol，1.0当量)。将混合物温至30℃并搅拌2小时，此时HPLC指示起始的3-5完全消耗。将溶液用MTBE(4L)稀释并搅拌20min，分离各层并且经1小时向水层中添加固体K₂CO₃(660g)至pH～7。添加另外的K₂CO₃(660g，4.8mol，2.0当量)，随后添加6-氯-5-氟嘧啶-4-基胺(360g，2.44mole 1.0当量)和1,4-二噁烷(5L)。将混合物在100℃下加热至温和的回流并且在此温度下搅拌16小时。HPLC指示剩余了<2％的化合物3-6。将混合物用DCM(2×5L)洗涤并且丢弃有机洗涤溶液。将水层通过在30℃下搅拌浆液1小时随后通过硅藻土过滤来用活性炭(425g)处理。重复此活性炭处理。将所得的水溶液用浓HCl中和至pH～7，并且在22℃下搅拌3小时，过滤所得浆液并将湿饼用1,4-二噁烷/水(1:1，1.2L)洗涤，在真空下在50℃下干燥18小时直到KF为～0.5％。获得呈淡白色固体状的产物3-7(690g，81％产率)，纯度是98.6％。所述产物含有1:9在C3和C4位的顺式/反式异构体的混合物。ESI-MS(M+H-1)⁺:460.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:8.49(d,J＝2.01Hz,1H),8.21-8.14(m,5H)4.94-4.90(m,1H),4.63(d,J＝11.55Hz,1H),4.42(m,1H),4.03(m,2H),3.59-3.72(m,3H),2.84-2.93(m,1H),2.20-2.31(m,1H),2.15(d,J＝6.78Hz,3H)。

(3R)-3-氨基-1-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酸(3-8)。在N₂下向10L反应中加入i-PrOH(3.5L)、H₂O(3.5L)、3-7(1.0当量，0.97mol，350g)、氟化钾一水合物(290g，3.0当量，3.0mol)以及35g的20％Pd(OH)₂/C(10％v/w)。在排空/用氢气再填充三次之后，将混合物温至40-50℃并且在那个温度下在1个大气压氢气下剧烈搅拌。18小时之后，LC/MS指示剩余<1％的起始材料3-7。将混合物用N₂吹扫20min，冷却至22℃并且过滤。湿饼和滤液都含有产物并且单独处理。

在50℃下将滤液在真空中浓缩至～200mL的体积。冷却至20℃且在此温度下搅拌2小时之后，获得浆液并且过滤固体，用水(400mL)洗涤并且在真空下在50℃下干燥以得到产物3-8(65g)。将来自反应过滤的湿饼在1NHCl(1L)中搅拌2小时以溶解产物且然后将剩余的催化剂固体通过过滤除去。将酸性滤液用固体LiOH中和至pH～7以沉淀产物3-8。将产物用水(200mL)洗涤，在真空下且在50℃下干燥以得到120g产物。基于H NMR获得总共185g产物，纯度是98.7％且产率是75％。将所有母液合并并且浓缩至～400mL的体积，得到浆液，过滤，用水洗涤并且干燥得到另外64g固体，纯度是～50％。¹H NMR(400MHz,D₂O):δ7.77(s,1H)4.12(d,J＝14.05Hz,1H),4.01(d,J＝13.05Hz,1H),3.26(d,J＝13.80Hz,1),2.99-3.10(m,1H),2.64-2.73(m,1H),1.98(dd,J＝3.39,14.18Hz,1H),1.74-1.87(m,1H)。

((3R,3'R)-1'-(叔丁氧基羰基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸(3-10)。向3-8(440g，1.9摩尔，1.0当量)在DMSO(10L)中的溶液中依次添加3-8A(640g，1.9摩尔，1.0当量)及三乙酰氧基硼氢化钠(STAB,402.0g，3.8摩尔，2当量)及Et₃N(,190g，1.9mol，1.0当量)。将混合物加热至50℃并搅拌3小时以显示通过HPLC完全转化为中间体3-9。

将溶液用MeOH(182g，5.7mol，3.0当量)稀释以淬灭过量的STAB，并且将反应加热至70～80℃。16小时之后，HPLC指示形成22％的产物3-10且剩余61％中间体3-9并且手性HPLC指示～3％内酰胺差向异构体。将混合物再保持在70-80℃下24小时以得到50％3-10、35％3-9以及7％内酰胺差向异构体。再搅拌40小时之后，形成80％3-10，剩余4％3-9，并且内酰胺差向异构体增至14％。将混合物冷却至22℃，并且用2N NH₄Cl溶液(5L)淬灭以得到浆液混合物。30分钟搅拌之后，将混合物过滤并将湿饼用水(3L)洗涤，在真空下且在55℃下干燥直到KF<0.1。获得呈棕色固体状的粗3-10(850g，97.7％)；手性HPLC指示12.5％内酰胺差向异构体。此产物在不进一步纯化的情况下直接使用。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸(3-10-反式)。在N₂下向10L反应器中加入DMF(4.25L，5v/w)中的3-10(850g，1.9mol，1.0当量)以得到澄清溶液，添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP116g，0.95mol，0.5当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI，36.5g，0.19mol，0.1当量)。在15至22℃下搅拌混合物约1小时之后，再添加EDCI(36.5g，0.19mol，0.1当量)并且再搅拌1小时。HPLC指示69:1反式/顺式混合物。产物3-10-反式不被分离并且将其在一锅中转化为化合物I-1。¹H NMR(300MHz,DMSO d₆):δ1.47-1.55(m,1H),1.63-1.68(m,1H),1.81-1.87(m,1H),1.90-1.97(m,1H),2.93-3.19(m,1H),3.16-3.23(m,1H),3.33-3.45(m,2H)4.07-4.33(m,3H),6.80(m,1H),6.94-6.98(m,1H),7.10-7.16(m,2H),7.91(s,1H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺(I-1)。在22℃下向上述反应混合物中加入O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，600g，1.9mol，1.0当量)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，1.0kg，9.5mol，5.0当量)以及最终的NH₄Cl(260g，5.7mol，3.0当量)。将所得混合物在15℃下搅拌1小时，HPLC指示3-10-反式完全消耗，将混合物倒入盐水(25L)中并用EtOAc(2×2L)萃取。将合并的有机层用盐水(2×2L)洗涤并且在真空中在低于45℃下浓缩至干燥，得到粗I-1，将其通过EtOAc/石油醚/MeOH(1:1:0至50:50:10)色谱纯化得到三个级分，它们分别含有316g、98.8％化学纯度和10.8％差向异构体，160g、82.3％化学纯度和17.5％差向异构体以及180g、61％纯度和11.3％差向异构体。将上述前两个级分合并且通过制备型HPLC进一步纯化以得到200g产物，纯度>99％且差向异构体<1％。¹H NMR(400MHz,DMSO d₆):δ1.48-1.53(m,1H),1.66-1.69(m,1H),1.77-1.79(m,3H),2.11-2.16(m,1H),2.80-2.88(m,2H),3.11(s,1H),3.42-3.48(m,1H),4.0-4.25(m,4H),6.58(s,3H),6.80-6.85(d,J＝10.2,2H),6.95(s,2H),7.40(s,1H),7.77(s,1H)。

实施例4

除了实施例2和3中所述的方法之外，(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺(化合物I-1)还根据方案6来合成。

方案7

(3R)-3-氨基-1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-甲酸(4-L-6)。在氮气下向10L反应器中加入化合物4-5(100g，0.287摩尔)、MeOH(6L，60v/w)以及10g 20％Pd(OH)₂/C。将反应器排空/用氢气再填充三次并且将混合物温至40-50℃，同时在3Mpa的氢气下搅拌40小时。LC/MS指示起始材料4-5完全消耗。将混合物冷却至22℃并过滤，并且将滤液在真空中浓缩至干燥以得到固体产物。将此粗产物在22℃下在EtOH(500mL)中制成浆液历时2小时，过滤并在真空下在50℃下干燥以得到产率为85％的呈白色固体状的产物4-L-6(60g，0.245摩尔)。

(3R)-1-(叔丁氧基羰基)-3-(((R)-4-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-乙氧基-5-氧代戊基)氨基)哌啶-4-甲酸(4-L-8)。向4-L-6(48.4g，0.197摩尔)在DMSO(450mL)中的溶液中添加Et₃N(20.2g，0.199摩尔，1当量)、3-8A(67.4g，0.199摩尔，1当量)以及三乙酰氧基硼氢化钠(STAB，84.8g，0.40摩尔，2.0当量)。将混合物经30分钟加热至50℃并且在此温度下搅拌3小时。LC/MS指示大多数起始材料4-L-6的消耗和4-L-8的形成。

将反应通过添加EtOH(35mL)淬灭并且在50℃下搅拌30min。将混合物在75-85℃下加热3天。将混合物冷却至18℃并且缓慢转移至水(6L)中，同时剧烈搅拌以得到浆液。2小时之后，将固体过滤并用水(3×3L)洗涤，在真空下在60-70℃下干燥24小时以得到呈棕色固体状的4-L-9(114g)。所述固体直接用于随后的步骤中。

(3R,3'R,4'S)-1'-(叔丁氧基羰基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸(4-L-9-反式)。向粗4-L-9(100g)在DMF(500mL)中的溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(11g，0.09摩尔，0.5当量)并且在20℃下搅拌10min。添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(7.0g，0.036摩尔，0.2当量)并且在20℃下搅拌反应3小时。HPLC指示57:43顺式/反式混合物的比率并且添加另外的EDAC(3.5g，0.018摩尔，0.1当量)。5小时之后，HPLC指示完全转化为4-L-9-反式。将混合物缓慢转移至水(2.25L)中并且将混合物用EtOAc(2×500mL)萃取且将有机层用盐水(500mL)和水(500mL)洗涤，在真空中浓缩至干燥以得到呈棕色固体状的粗4-L-9-反式(100g)。在60℃下将粗产物溶解于EtOAc(135mL)中，然后经1小时冷却至20℃，之后添加50mL石油醚。将混合物老化2小时。将固体过滤并用3:1EtOAc/石油醚(50mL)洗涤，在真空下在50℃下干燥16小时以得到4-L-9-反式(23g，产率：22％，纯度：99％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.94(s,2H),6.81(s,1H),6.54-6.61(m,1H),3.99-4.08(m,1H),3.42-3.38(m,2H),2.07-2.16(m,1H),1.74-1.92(m,3H),1.39(s,9H)。

(3R,3'R,4'S)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸盐酸盐(4-L-10反式)。向0.5N HCl在EtOAc(76mL)中的溶液中添加4-L-9反式(20g，38mmol)并在20℃下加热18h以得到浆液。将固体过滤，用EtOAc(5mL)洗涤并在真空下在45℃下干燥18h以得到呈HCl盐的4-L-10(17g，97％产率)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸(3-10-反式)。将4-L-10(2.0g，4.38摩尔)、6-氯-5-氟-嘧啶-4-基胺(711mg，4.82mmole，1.1当量)、DIPEA(1.52mL，8.77摩尔，2当量)在40mLnBuOH中的溶液加热至130-140℃并持续72h。将混合物冷却至22℃并且在真空中浓缩得到残余物，将其通过柱纯化以得到3-10-反式(1.1g，47％)。还观察到相对较少量的差向异构体(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸。中间体3-10-反式可以经由上述程序转化为化合物I-1。

化合物I-1还根据方案8来合成。

方案8

使用如Phillips,D.P.；Zhu,X.-F.；Lau,T.L.；Yang,K.；Liu,H.TetrahedronLetters,2009,50,7293中的类似程序合成(R)-1-(3-氯-5-(三氟甲基)苯基)-5-氧代吡咯烷-2-甲酸叔丁酯4-e，由此(S)-5-氧代吡咯烷-2-甲酸甲酯和1-氯-4-碘苯被取代为(R)-5-氧代吡咯烷-2-甲酸叔丁酯和1-氯-3-碘代-5-(三氟甲基)苯。

(2R)-1-(3-氯-5-(三氟甲基)苯基)-5-羟基吡咯烷-2-甲酸叔丁酯。在氮气气氛下将4-e(11g，30mmol)在Me-THF(100mL)中的无水溶液冷却至-35℃。逐滴添加DIABL-H(5.9g，42mmol)在甲苯(42mL)中的溶液同时维持温度在-35℃下。将反应通过HPLC监测并且一旦完成，就添加1N Rochell盐溶液(100mL)同时维持反应温度低于0℃。将有机相分离，用1NRochell盐(50mL×3)洗涤并分离，用Et₃N(4mL)稀释，干燥(Na₂SO₄)并且在真空中浓缩以得到呈油状的4-f(8.3g)。

(3R)-1-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-(((R)-5-(叔丁氧基)-4-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-5-氧代戊基)氨基)哌啶-4-甲酸。将4-f(37.4g，0.146mmol)在DMF(700mL)中的溶液用3-8(40.2g，0.11mmol)、Et₃N(10.1g，0.1mmol)STAB(42.4g，0.2mmol)处理并且将混合物加热至55℃并持续5h。将反应用水(2.5L)稀释，用EtOAc(500mL×3)萃取，将有机相合并并且用洗涤盐水，分离，干燥(Na₂SO₄)且在真空中浓缩以得到呈固体状的4-a(40.2g)，将其在没有任何另外纯化的情况下使用。

(3R)-1-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-(((R)-4-羧基-4-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)丁基)氨基)哌啶-4-甲酸。向5N HCl溶液(250mL)中添加叔丁酯4-a并且将悬浮液加热至55℃并持续5h，同时通过HPLC监测水解。一旦产物完全形成，就在真空中除去水，得到固体4-b，将其在真空下干燥并且在没有任何另外纯化的情况下使用。

(3R,3'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酸。在0℃下向酸4-b(55g，0.1mol)在DMF(500mL)中的溶液中添加DIEA(64.5g，0.5mol)、CDI(32.5g，0.2mol)。将溶液在0℃下搅拌1.5h，用水(3L)稀释，用HCl调节至pH 3并且用EtOAc(2L×3)萃取。将有机相合并，干燥(Na₂SO₄)并且在真空中浓缩以得到4-c(48g)。

化合物I-1的剩余步骤经由上述程序完成。

实施例5

合成反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(甲基氨基甲酰基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯

合成反式-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(甲基氨基甲酰基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-1'-甲酸叔丁酯。类似程序如所述用于合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到粗材料，将其通过制备型HPLC(含有0.05％NH₃.H₂O的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(360mg，产率：67％)。ESI-MS(M+H)⁺:544.18。HPLC:(214nm:100.0％,254nm:100.0％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)(异构体的混合物)δ:7.69-7.68(m,1H),6.78(s,1H),6.75(s,1H),6.71(s,1H),4.39-4.36(m,2H),4.09-4.03(m,1H),3.53-3.31(m,3H),3.20-3.10(m,1H),2.99-2.92(m,1H),2.55(s,3H),2.28-2.19(m,1H),1.96-1.77(m,5H),1.68-1.58(m,1H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N-甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×15cm)，50％1:1IPA:甲醇(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成两个峰。将峰2进一步通过SFC分离(AD-H(2×15cm)，30％iPrOH(0.15％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝544.1(M+1)@1.24min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.72-7.85(m,2H),6.92(s,2H),6.81(s,1H),6.43-6.64(m,3H),4.34(br.s.,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,1H),3.93-4.19(m,2H),3.37-3.49(m,1H),3.22-3.30(m,1H),3.13(br.s.,1H),2.84(t,J＝12.05Hz,2H),2.57(d,J＝4.52Hz,3H),2.13(qd,J＝6.05,12.45Hz,1H),1.60-1.89(m,4H),1.40-1.58(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N-甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×15cm)，50％1:1IPA:甲醇(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成两个峰。将峰2进一步通过SFC分离(AD-H(2×15cm)，30％iPrOH(0.15％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝544.1(M+1)@1.24min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.83(q,J＝4.60Hz,1H),7.77(d,J＝1.76Hz,1H),6.97(d,J＝6.78Hz,2H),6.81(s,1H),6.58(s,2H),6.53(d,J＝7.78Hz,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,2H),3.90-4.19(m,2H),3.14(br.s.,1H),2.92(br.s.,1H),2.74-2.90(m,1H),2.55(d,J＝4.52Hz,3H),2.00-2.18(m,1H),1.74-1.89(m,3H),1.56-1.74(m,1H),1.34-1.50(m,1H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N-甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×15cm)，50％1:1IPA:甲醇(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成两个峰。将峰1进一步通过SFC(AD-H(2×15cm)，30％MeOH(0.15％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝544.1(M+1)@1.23min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.72-7.85(m,2H),6.92(s,2H),6.81(s,1H),6.57(s,2H),6.54(d,J＝7.53Hz,1H),4.23(d,J＝13.30Hz,1H),4.15(dd,J＝3.26,12.30Hz,1H),4.08(td,J＝7.06,10.48Hz,1H),3.36-3.47(m,1H),3.23-3.30(m,1H),3.13(br.s.,1H),2.84(t,J＝11.80Hz,2H),2.57(d,J＝4.52Hz,3H),2.13(qd,J＝6.17,12.61Hz,1H),1.62-1.91(m,4H),1.42-1.57(m,1H)。

反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N-甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×15cm)，50％1:1IPA:甲醇(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成两个峰。将峰1进一步通过SFC(AD-H(2×15cm)，30％MeOH(0.15％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝544.1(M+1)@1.23min。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝544.1(M+1)@1.24min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.80-7.89(m,1H),7.72-7.80(m,1H),6.97(d,J＝6.53Hz,2H),6.81(s,1H),6.58(s,2H),6.53(d,J＝7.78Hz,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,2H),3.89-4.19(m,2H),3.13(br.s.,1H),2.74-3.02(m,J＝12.42,12.42Hz,2H),2.55(d,J＝4.52Hz,3H),2.08(qd,J＝5.97,12.20Hz,1H),1.81(td,J＝6.24,12.36Hz,3H),1.56-1.74(m,1H),1.33-1.51(m,1H)。

实施例6

合成反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。类似程序如所述用于合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到粗材料，将其通过制备型HPLC(含有0.05％TFA的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(45mg，产率：90％)。ESI-MS(M+H)⁺:558.0。HPLC:(214nm:98.2％,254nm:100.0％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.77(s,1H),6.92-6.89(m,1H),6.83-6.81(m,1H),6.79(s,1H),4.38-4.38(m,2H),4.05-4.00(m,2H),3.55-3.53(m,1H),3.45-3.40(m,2H),3.15-2.89(m,7H),2.21-2.16(m,1H),1.90-1.86(m,3H),1.66-1.56(m,2H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:558.0¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.92(d,J＝1.76Hz,1H),6.94(s,1H),6.72(d,J＝7.78Hz,2H),5.21(d,J＝3.51Hz,1H),4.70(s,2H),4.45(dd,J＝2.76,12.80Hz,2H),4.17-4.32(m,1H),3.64-3.80(m,2H),3.44-3.58(s,3H),3.09(s,3H),3.00-3.09(m,1H),2.95(s,3H),2.40(dd,J＝5.52,13.30Hz,1H),1.63-1.99(m,3H),1.26-1.43(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:558.0¹H NMR(400MHz,(400MHz,CDCl₃)δ:7.93(d,J＝1.26Hz,1H),6.93(s,1H),6.69(br.s.,2H),5.06(d,J＝4.27Hz,1H),4.71(s,1H),4.45(d,J＝12.55Hz,2H),4.16-4.26(m,1H),3.66-3.81(m,2H),3.54-3.64(m,1H),3.40-3.54(m,2H),3.01-3.10(m,4H),2.95(s,3H),2.37(dd,J＝5.27,13.05Hz,1H),1.91-2.02(m,2H),1.48-1.75(m,2H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:558.0¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.92(d,J＝1.76Hz,1H),6.94(s,1H),6.72(d,J＝7.78Hz,2H),5.21(d,J＝3.51Hz,1H),4.70(s,2H),4.45(dd,J＝2.76,12.80Hz,2H),4.19-4.30(m,1H),3.66-3.79(m,2H),3.47-3.56(m,3H),3.09(s,3H),2.97-3.07(m,1H),2.95(s,3H),2.40(dd,J＝5.52,13.30Hz,1H),1.81-1.97(m,3H),1.73(dd,J＝3.76,12.80Hz,1H)。

(3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的各混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:558.0¹H NMR(400MHz,(400MHz,CDCl₃)δ:7.93(d,J＝1.26Hz,1H),6.93(s,1H),6.69(br.s.,2H),5.06(d,J＝4.27Hz,1H),4.71(s,1H),4.45(d,J＝12.55Hz,2H),4.16-4.26(m,1H),3.66-3.81(m,2H),3.54-3.64(m,1H),3.40-3.54(m,2H),3.01-3.10(m,4H),2.95(s,3H),2.37(dd,J＝5.27,13.05Hz,1H),1.91-2.02(m,2H),1.48-1.75(m,2H)。

实施例7

合成反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-[1,3'-联哌啶]-2-酮。类似程序如所述用于合成反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到23，将其通过反相HPLC(含有0.05％NH₃.H₂O的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(100mg，产率：70％)。ESI-MS(M+H)⁺:613.24。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.94(s,1H),6.94(s,1H),6.73-6.67(m,2H),5.25-5.03(m,1H),4.71(s,2H),4.49-4.40(m,2H),4.35-4.16(m,1H),3.82-3.64(m,3H),3.62-3.41(m,6H),3.08-2.97(m,1H),2.52-2.34(m,3H),2.30-2.25(m,2H),2.20(s,3H),1.85-1.64(m,2H),1.72-1.64(m,2H),1.49-1.31(m,1H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-[1,3'-联哌啶]-2-酮。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺23的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:613.2¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.95(s,1H),6.83-6.97(m,3H),4.50-4.68(m,2H),4.28-4.40(m,1H),3.66-3.91(m,8H),3.30-3.52(m,4H),3.14(t,J＝12.42Hz,2H),2.73(br.s.,2H),2.27(dd,J＝5.65,12.93Hz,1H),1.83-2.05(m,2H),1.54-1.79(m,2H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-[1,3'-联哌啶]-2-酮。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺23的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:613.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.91-7.99(m,1H),6.84-6.97(m,3H),4.57(dd,J＝14.18,19.70Hz,2H),4.34(br.s.,1H),3.42-3.53(m,1H),3.37(d,J＝1.51Hz,3H),3.05-3.19(m,1H),2.86(t,J＝7.53Hz,1H),2.68-2.78(m,2H),2.26(dd,J＝5.65,12.93Hz,1H),1.82-2.03(m,3H),1.55-1.79(m,2H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-[1,3'-联哌啶]-2-酮。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺23的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的所得混合物进一步分离成单一对映异构体。ESI-MS(M+H)⁺:613.2。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.94(s,1H),6.87-6.93(m,3H),4.57(dd,J＝14.18,19.70Hz,1H),4.34(br.s.,1H),3.43-3.51(m,1H),3.36-3.38(m,2H),3.13(t,J＝12.30Hz,1H),2.86(t,J＝7.53Hz,1H),2.73(br.s.,1H),2.26(dd,J＝5.65,12.93Hz,1H),1.96-2.03(m,1H),1.83-1.94(m,1H),1.51-1.75(m,1H)。

((3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-4'-(4-甲基哌嗪-1-羰基)-[1,3'-联哌啶]-2-酮。使用两步手性SFC分离从反式-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺23的手性分离获得标题化合物。首先使用ChiralPak IC(2×15cm，30％甲醇w/0.1DEA)柱将混合物分离成含有两种非对映体((3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺与(3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-N,N-二甲基-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺)的混合物的两个峰，然后使用ChiralPakIA(2×15cm，30％甲醇w/0.1％DEA 100巴)柱将含有一对异构体的各混合物进一步分离成单一对映异构体。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.96(br.s.,1H),6.90(br.s.,1H),6.76(d,J＝10.04Hz,2H),4.60(t,J＝14.06Hz,2H),4.19-4.32(m,1H),3.67-3.78(m,1H),3.43-3.54(m,3H),3.35-3.38(m,3H),3.16(t,J＝12.42Hz,1H),2.86(t,J＝7.40Hz,2H),2.79(s,3H),2.32(dd,J＝5.02,12.80Hz,1H),1.89-2.07(m,4H),1.62-1.76(m,5H),

实施例8

合成1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氟-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。类似程序如所述用于合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到粗物质，将其通过制备型HPLC(含有0.05％NH₃.H₂O的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(175mg，产率：69％)。ESI-MS(M+H)⁺:514.19。HPLC:(214nm:96.13％,254nm:96.53％)。¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ:7.79-7.78(m,1H),6.76(s,1H),6.63-6.54(m,2H),4.41-4.36(m,2H),4.08-4.06(m,1H),3.55-3.41(m,3H),3.28-3.25(m,1H),2.99-2.93(m,1H),2.28-2.21(m,1H),1.98-1.78(m,6H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氟-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IA(3×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)分离成三个峰且峰3对应于标题化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝514.0(M+1)@1.09min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.91(br.s.,1H),6.66(d,J＝8.53Hz,1H),6.63(s,1H),6.46(d,J＝10.79Hz,1H),6.12(br.s.,1H),5.47(br.s.,1H),5.16(d,J＝3.51Hz,1H),4.91(br.s.,2H),4.35-4.54(m,2H),3.82(td,J＝5.11,10.60Hz,2H),3.51-3.60(m,1H),3.34-3.48(m,3H),2.96(t,J＝12.30Hz,1H),2.35-2.47(m,1H),1.91-2.06(m,3H),1.84(dq,J＝3.89,12.76Hz,1H),1.48-1.62(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氟-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IA(3×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰2对应于所需化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MSm/e＝514.0(M+1)@1.10min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(s,1H),6.85(s,1H),6.81(s,1H),6.74(d,J＝12.30Hz,1H),6.47-6.66(m,4H),4.23(d,J＝12.80Hz,2H),3.90-4.18(m,2H),3.34-3.46(m,2H),3.12(br.s.,1H),2.94(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.42Hz,1H),2.10(qd,J＝5.75,12.11Hz,1H),1.74-1.92(m,3H),1.56-1.72(m,1H),1.37-1.52(m,1H)。

(3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氟-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IA(3×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰1进一步通过SFC(IA(3×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝514.0(M+1)@1.10min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,1.5Hz,1H),7.39(s.,1H),6.85(s,1H),6.81(s.,1H),6.74(d,J＝12.30Hz,1H),6.47-6.66(m,4H),4.16-4.46(m,2H),3.95-4.16(m,2H),3.34-3.48(m,2H),3.12(br.s.,1H),2.87-3.01(m,2H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.10(qd,J＝5.75,12.11Hz,1H),1.74-1.92(m,3H),1.54-1.74(m,1H),1.35-1.52(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氟-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IA(3×15cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰1进一步通过SFC(IA(3×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化以得到标题化合物。

LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝514.0(M+1)@1.10min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.38(br.s.,1H),6.84(s,2H),6.70(d,J＝12.30Hz,1H),6.47-6.65(m,4H),4.18-4.48(m,2H),3.92-4.18(m,2H),3.38-3.49(m,1H),3.20-3.30(m,1H),3.11(br.s.,1H),2.88-2.99(m,1H),2.83(t,J＝12.30Hz,1H),2.14(qd,J＝6.03,12.52Hz,1H),1.74-1.92(m,3H),1.59-1.74(m,1H),1.41-1.58(m,1H)。

实施例9

合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-氟苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。类似程序如所述用于合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到粗物质，将其通过制备型HPLC(含有0.05％NH₃.H₂O的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈白色固体状的标题化合物(141mg，Y：30％)。ESI-MS(M+H)⁺:479.9。HPLC:(214nm:100％,254nm:100％)。¹H NMR(400MHz,DMSO d₆)δ:7.78-7.77(m,1H),7.40-7.38(m,1H),6.86-6.82(m,1H),6.62-6.55(m,3H),6.45-6.37(m,3H),4.26-3.94(m,4H),3.47-3.39(m,1H),3.20-3.03(m,2H),2.90-2.78(m,2H),2.18-2.04(m,1H),1.86-1.34(m,5H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-氟苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IC(2×15cm)，25％MeOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分别分离成三个峰以得到标题化合物作为峰3。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝480.0(M+1)@1.01min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.90(br.s.,1H),6.44(d,J＝8.53Hz,1H),6.40(s,1H),6.30(br.s.,1H),6.23(d,J＝11.04Hz,1H),5.63(br.s.,1H),5.09(br.s.,1H),4.94(br.s.,2H),4.45(d,J＝12.80Hz,2H),3.68-3.95(m,2H),3.49-3.56(m,2H),3.35-3.46(m,2H),2.89-2.99(m,1H),2.31-2.44(m,1H),1.90-2.04(m,3H),1.76-1.89(m,1H),1.49-1.61(m,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-氟苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IC(2×15cm)，25％MeOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分别分离成三个峰以得到标题化合物作为峰1。LCMS(Agilent 460,254nm):ES(+)MS m/e＝480.0(M+1)@1.01min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(s.,1H),6.81(s,1H),6.57(s,3H),6.46(d,J＝12.30Hz,1H),6.39(dd,J＝1.76,8.78Hz,1H),6.34(d,J＝7.53Hz,1H),4.28(br.s.,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,1H),4.13(dd,J＝2.76,12.30Hz,1H),4.03(td,J＝6.56,10.98Hz,1H),3.33-3.46(m,2H),3.11(br.s.,1H),2.94(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.09(qd,J＝5.75,12.11Hz,1H),1.72-1.92(m,3H),1.56-1.72(m,1H),1.29-1.50(m,1H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-氟苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IC(2×15cm)，25％MeOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰2进一步通过SFC(IA(3×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MSm/e＝480.0(M+1)@1.01min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(d,J＝2.01Hz,1H),7.37(br.s.,1H),6.84(s,1H),6.57(s,2H),6.55(br.s.,1H),6.30-6.48(m,3H),4.28(br.s.,1H),4.23(d,J＝13.05Hz,1H),4.13(dd,J＝3.39,12.67Hz,1H),3.97(td,J＝6.84,10.42Hz,1H),3.38-3.50(m,1H),3.22-3.29(m,1H),3.10(br.s.,1H),2.71-2.97(m,1H),2.83(t,J＝12.30Hz,1H),2.13(qd,J＝6.13,12.49Hz,1H),1.73-1.91(m,3H),1.58-1.73(m,1H),1.39-1.53(m,1H)。

(3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-氟苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(IC(2×15cm)，25％MeOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)分离成三个峰。3个峰中的峰2进一步通过SFC(IA(3×15cm)，30％iPrOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，60ml/min)纯化以得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MSm/e＝480.0(M+1)@1.01min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(s,1H),6.81(s,1H),6.57(s,3H),6.46(td,J＝2.01,12.30Hz,1H),6.39(td,J＝1.95,8.66Hz,1H),6.34(d,J＝7.53Hz,1H),4.18-4.48(m,2H),4.09-4.18(m,1H),3.79-4.09(m,1H),3.33-3.45(m,2H),3.11(br.s.,1H),2.92(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.42Hz,1H),2.09(qd,J＝5.75,12.11Hz,1H),1.74-1.93(m,3H),1.51-1.74(m,1H),1.32-1.51(m,1H)。

实施例10

合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。类似程序如所述用于合成(3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺14以得到粗材料，将其通过制备型HPLC(含有0.05％NH₃.H₂O的MeOH/H₂O作为流动相)纯化以得到呈黄色固体状的标题化合物(320mg，产率：44％)。ESI-MS(M+H)⁺:546.16.HPLC:(214nm:98.4％,254nm:98.0％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(s,1H),7.39(s,1H),6.84-6.81(m,1H),6.75-6.72(m,1H),6.62-6.57(m,3H),6.52-6.47(m,2H),4.24-3.98(m,4H),3.47-3.40(m,1H),3.17-2.99(m,2H),2.86-2.79(m,2H),2.15-1.99(m,1H),1.86-1.60(m,4H),1.48-1.39(m,1H)。

(3R,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×25cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝546.0(M+1)@1.20min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝1.76Hz,1H),7.39(br.s.,1H),6.81(s,1H),6.75(s,1H),6.62(s,1H),6.57(s,2H),6.38-6.52(m,2H),4.23(d,J＝13.05Hz,2H),3.92-4.18(m,2H),3.34-3.45(m,2H),3.11(br.s.,1H),2.93(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.30Hz,1H),2.08(qd,J＝5.75,12.11Hz,1H),1.74-1.92(m,3H),1.56-1.73(m,1H),1.36-1.50(m,1H)。

(3S,3'S,4'R)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×25cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝546.0(M+1)@1.23min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:7.77(d,J＝2.01Hz,1H),7.37(br.s.,1H),6.84(s,1H),6.72(s,1H),6.60(s,1H),6.57(s,2H),6.43-6.54(m,2H),4.23(d,J＝13.05Hz,1H),4.22(br.s.,1H),4.13(dd,J＝3.26,12.30Hz,1H),4.01(td,J＝6.81,10.23Hz,1H),3.44(td,J＝6.18,12.49Hz,1H),3.20-3.29(m,1H),3.11(br.s.,1H),2.88(br.s.,1H),2.83(t,J＝12.30Hz,1H),2.12(qd,J＝6.05,12.46Hz,1H),1.73-1.91(m,3H),1.59-1.73(m,1H),1.48(td,J＝9.41,19.33Hz,1H)。

(3S,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×25cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝546.0(M+1)@1.22min。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.77(d,J＝2.01Hz,1H),7.38(br.s.,1H),6.81(s,1H),6.75(s,1H),6.62(s,1H),6.57(s,2H),6.42-6.51(m,2H),4.23(d,J＝12.80Hz,2H),3.97-4.18(m,2H),3.34-3.44(m,2H),3.10(br.s.,1H),2.93(br.s.,1H),2.82(t,J＝12.17Hz,1H),2.03-2.15(m,1H),1.77-1.90(m,3H),1.57-1.73(m,1H),1.37-1.48(m,1H)。

(3R,3'R,4'S)-1'-(6-氨基-5-氟嘧啶-4-基)-3-((3-氯-5-(三氟甲氧基)苯基)氨基)-2-氧代-[1,3'-联哌啶]-4'-甲酰胺。将四种非对映体的混合物通过SFC(AD-H(2×25cm)，30％EtOH(0.1％DEA)/CO₂，100巴，70ml/min)纯化得到标题化合物。LCMS(Agilent460,254nm):ES(+)MS m/e＝546.0(M+1)@1.23min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.93(s,1H),6.60(s,1H),6.52(s,1H),6.35(s,1H),5.85(br.s.,1H),5.32(br.s.,1H),4.97-5.15(m,1H),4.78(br.s.,2H),4.46(d,J＝13.05Hz,2H),3.67-3.87(m,2H),3.34-3.60(m,4H),2.99(t,J＝12.17Hz,1H),2.34-2.49(m,1H),1.91-2.08(m,3H),1.83(dq,J＝3.76,12.72Hz,1H),1.47-1.74(m,1H)。

实施例11

体外BTK激酶测定：BTK-POLYGAT-LS测定。BTK体外测定的目的是在于经由测量IC₅₀确定化合物针对BTK的效力。在活性BTK酶(Upstate14-552)、ATP以及抑制剂存在下监测荧光素标记的polyGAT肽(Invitrogen PV3611)的磷酸化的量之后测量化合物抑制。BTK激酶反应在黑色96孔板(costar 3694)中完成。对于典型的测定，将ATP/肽主混合物(最终浓度；ATP 10uM、polyGAT 100nM)在激酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、10mM MgCl₂、200uMNa₃PO₄、5mM DTT、0.01％Triton X-100以及0.2mg/ml酪蛋白)中的24uL等分试样添加至各孔中。接着，添加1uL在100％DMSO溶剂中的4-倍40X化合物滴定物，然后添加15uL在1X激酶缓冲液中的BTK酶混合物(最终浓度是0.25nM)。培育测定30分钟，之后用28uL 50mM EDTA溶液终止。将激酶反应的等分试样(5uL)转移至低体积的白色384孔板(Corning3674)中，并且添加5uL的2X检测缓冲液(Invitrogen PV3574，含有4nMTb-PY20抗体，Invitrogen PV3552)。覆盖所述板并且在室温下培育45分钟。测量分子装置M5(332nm激发；488nm发射；518nm荧光素发射)上的时间分辨荧光(TRF)。使用具有由DMSO对照测定的100％酶活性和由EDTA对照测定的0％活性的四参数拟合计算IC₅₀值。

所选择的式I化合物在polyGAT测定中测试并且被认为是有活性的。化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5以及I-7分别给出0.73nM、0.68nM、2.07nM、0.63nM、1.6nM以及1.2nM的IC₅₀值。化合物I-6具有小于1nM的IC₅₀值。以下所示的比较化合物I^C产生2.0nM的IC₅₀值。

实施例12

确定PXR核受体在人类DPX2细胞中的活化的研究方案

a)方案概述：PXR已经被证明是介导药物诱导的CYP3A4表达的主要核受体(Bertilsson G等人；Proc Natl Acad Sci U S A.1998年10月13；95(21):12208-13)。基于这个CYP3A4诱导途径，细胞基PXR报道基因测定通常用于在早期药物发现阶段就诱导CYP3A4的潜力来筛选新的分子实体(NME)(Luo G等人；Drug Metab Dispos.2002年7月；30(7):795-804)。研究被设计用来评估新的分子实体(NME)在DPX2细胞中对人类PXR活化的作用。将用PXR核受体和相应的反应元件稳定转染的细胞系接种至96孔板中。接种之后二十四小时，将细胞用6种不同浓度的NME在一式三份的孔中处理(参见下文)，然后细胞回到培育箱中持续另外24小时。这个培育期结束时，使用Promega的细胞滴定Fluor细胞毒性测定来测定活细胞/孔的数目。在这个测定之后，将Promega的ONE-Glo添加至相同的孔中并且评定报道基因活性。

b)测试***：测试***由接种在96孔微量滴定板上的稳定转化的DPX2肿瘤细胞系组成。含有PXR核受体的表达载体加上适当增强子和与荧光素酶报道基因有关的启动子已被稳定地整合到这些肿瘤细胞系中。受体活化通过监测报道基因活性以及通过将结果与媒介物处理的细胞比较来评定。阳性对照由用6种不同浓度(0.1、0.5、1、5、10以及20μM)的利福平处理的细胞组成。用这样的方式，活化PXR的化合物可以容易地并快速地被鉴定。因为使用稳定整合的细胞系，所以有可能观察到3至70倍的受体活化。

c)数据处理以及受体活化动力学：使用MS-Excel处理的数据被计算为在6种不同剂量的每一个下相对于媒介物处理的细胞的PXR活化倍数的平均值(n＝3)和％CV。所有活化数据被标准化为活细胞/孔的数目。结果还表示为在10μM剂量下由适当的阳性对照给出的反应百分比。使用典型的对数剂量反应曲线的非线性回归(Prism V5.0c,GraphPadSoftware,San Diego,CA)导出给出受体活化的测试化合物的EC₅₀和E_max值。展现出非典型的剂量反应曲线的试剂不用这种方式进行分析。

d)新的分子实体(NME)：测试化合物是在0.05、0.1、0.5、1、2.5以及10μM下测试。

所选择的式I化合物在PXR测定中测试。化合物I-1、I-2、I-3、I-4以及I-5分别给出62％、42％、47％、67％以及90％的PXR％诱导(相对于10uM利福平)。以上所示的比较化合物I^C产生95％的PXR％诱导。

实施例13

用于FastPatch hERG抑制测定的方案：

心脏钾通道hERG负责人类心室中的快速延迟整流电流(I_Kr)并且I_Kr的抑制是由非心脏药物造成心脏动作电位延长的常见原因(参见，例如Weirich和Antoni,BasicRes.Cardiol.,93,增刊1,125-32,1998；Yap和Camm,Clin.Exp.Allergy,29,增刊3,174-81,1999)。增加的动作电位持续时间已经被引证为引起QT间隔时间延长的因素，QT间隔时间延长与危险的室性心律失常(尖端扭转型室性心动过速)有关(Brown和Rampe,Pharmaceutical News,7,15-20,2000)。

研究所提供的化合物对于在用hERG cDNA稳定转染的人类胚肾(HEK293)细胞中表达的hERG(人类ether-à-go-go相关基因)的钾通道电流(I_Kr的替代因子，快速活化的延迟整流心脏钾电流)的体外作用。将细胞置于玻璃衬里的96孔板中的HEPES缓冲的生理盐水溶液中并且在各浓度下用适量的测试和对照溶液加载持续3分钟暴露时间。在0.3％DMSO中稀释测试化合物。将自动平行膜片钳***QPatch HT(Sophion Bioscience A/S,Denmark)用于在各种浓度(例如10μM)下进行评估。IC₅₀值是基于hERG抑制数据来估算。所述研究是在ChanTest(14656Neo Parkway,Cleveland,OH)进行。QPatch筛选进一步由Janzen和Bernasconi(编),High Throughput Screening,Methods and Protocols,第二版,第565卷,第10章,第209-223页,2009描述。

所选择的式I化合物在hERG测定中测试。化合物I-1、I-2、I-3以及I-4分别给出15.6uM、30uM、14.6uM以及13.7uM的hERG IC₅₀。化合物I-5显示在hERG测定中在10uM下(IC₅₀不可获得)没有可观察到的活性。化合物I-6显示在10uM下(IC₅₀不可获得)几乎不可观察到的hERG活性(<20％抑制)。化合物I-7显示在10uM下(IC₅₀不可获得)的hERG活性(65％抑制)。以上所示的比较化合物I^C产生1.18uM的hERG IC₅₀或在10uM下的活性(87％抑制)。

实施例14

在人类肝微粒体中的GSH捕获：方案

将测试化合物(最终浓度10uM)与人类或大鼠肝微粒体(最终浓度1mg/mL)连同活化辅助因子NADPH(最终浓度1mM)、磷酸钾(最终浓度100mM pH 7.4)、氯化镁(最终浓度3.3mM)以及捕获剂GSH(最终浓度5mM)一起培育。将培育混合物在37℃下培育60min且用冰冷的乙腈(与培育混合物体积相等)终止并且分离上清液。直接注射上清液用于LC/MS/MS分析或在N₂下干燥并在水:乙腈(80:20)混合物中复原，之后进行LC/MS/MS分析。使用TripleTOF5600/Xevo Qtof MSe经由LC/MS/MS评估相应的GSH缀合物。

实施例15

大鼠胶原诱导的关节炎模型

在雌性Lewis大鼠中的胶原诱导的关节炎(CIA)模型需要原代T和B细胞对II型胶原(CII)免疫的免疫应答以便发展严重的发炎性疾病(参见Goldschmidt TJ,HolmdahlR.Cell Immunol.154(1):240-8,1994；Helfgott,S.M.等人；Clin.Immunol.Immunopathol.31:403,1984；Holmdahl R.等人,J Autoimmun.7(6):739-52,1994；以及Stuart,J.M.等人,J.Exp.Med.155:1,1982)。二次CII激发之后临床疾病发病并且所述疾病在接下来的八天中进展。

一般说来，将雌性Lewis大鼠用不完全弗氏佐剂中的II型牛胶原免疫。大鼠(N＝10/组)从第1天开始通过口服管饲法BID接受每天口服施用测试化合物或媒介物(治疗剂)。关节炎的临床严重性通过从第0天开始每天进行踝的卡尺测量来评定。

详细方案：雌性Lewis大鼠用II型牛胶原(2mg/ml牛CII在0.01N乙酸:不完全弗氏佐剂中的1:1乳液)在背部皮肤的三个位点处皮下免疫。免疫之后六天大鼠接受牛CII的第二次皮下注射。从第0天开始通过口服管饲法BID施用式I化合物的悬浮液或媒介物(0.5％CMC，0.1％Tween 80)(预防剂)(n＝10个动物/组)。CIA的临床严重性通过从第9天开始每天进行踝的卡尺测量来评定。基线踝卡尺测量值被收集并证实是临床正常的(0.260-0.264英寸)用于预防处理。对于确定的疾病动物的基线踝卡尺测量在治疗给药的第一天评定并且将动物在证实临床疾病发病(0.2751-0.2755英寸)之后随机分配到处理组中。使用单因素方差分析(单因素ANOVA)连同适当的多重比较事后测试一起分析所有组中的数据。所有测试的显著性被设定在p≤0.05。

实施例16

经由抑制PLCγ2的磷酸化的BCR途径活化分析

方案：处理之前一天，将Ramos细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种在96孔组织培养滤板(Millipore,Billerica,MA)中的200μL完全培养基中。在处理当天，将使用的培养基通过过滤除去并且将细胞再悬浮于200μL含有连续化合物稀释物和DMSO的无血清的培养基中到0.1％，然后在37℃下培育2小时。在37℃下用10μg/mL山羊抗人类IgM刺激细胞5分钟。将所有培养基通过过滤除去并且将细胞用冰冷的PBS冲洗，然后在冰上用含有以下的溶胞缓冲液溶解1小时：20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、2mM Na₃VO₄、1％Triton X-100、0.1％SDS、蛋白酶抑制剂混合物、1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)、磷酸酶抑制剂混合物2(Sigma目录号P5726，来自Sigma,St.Louis,Mo.)以及磷酸酶抑制剂混合物3(Sigma目录号P0044，来自Sigma,St.Louis,Mo.)。随后将溶胞产物转移到标准MSD板(Meso ScaleDiscovery,(MSD),(Gaithersburg,Maryland))中，用捕获抗体(抗总PLCγ2抗体B10，(SantaCruz Biotechnologies(Santa Cruz,CA))预处理并且根据制造商说明书用BSA阻断。将溶胞产物在制备的MSD板中在4℃下在轻柔搅动下培育过夜。在室温下用TBST洗涤孔三次并且用在PBS中的1％BSA中的抗pPL Cγ2(SantaCruz)处理1小时。再次在室温下用TBST洗涤孔三次并且用抗兔磺基标记的抗体(MSD)处理1小时。用TBST洗涤之后，添加MSD读取缓冲液并且在MSD SECTOR成像器6000中测量发光。最大反应被测定为在含有用抗IgM和DMSO处理的被刺激的细胞的孔中的发光平均值。最小反应被测定为在含有用DMSO单独处理的未被刺激的细胞的孔中的发光平均值。最大和最小值被用于标准化在化合物处理孔中的发光。将标准化值针对化合物浓度按对数标度进行绘制，然后使用Prizm软件(GraphPadSoftware,Inc.)来分析。具有可变斜率的S形剂量-反应方程式被用于拟合数据并且产生50％抑制浓度(IC₅₀)。

将Ramos细胞在96孔板中在一定浓度范围的式I化合物下培育2小时，用10μg/mL抗IgM刺激5分钟，并且使用电化学发光免疫测定测量PLCγ2磷酸化。使用GraphPad Prism软件计算EC₅₀。

实施例17

抑制BCR诱导的人类B细胞增殖

将人类CD19+B细胞用抗IgM抗体刺激并且在72小时之后就改变的细胞代谢来评估式I化合物的活性。在上下文中，细胞代谢直接与细胞活化和增殖有关，并且还可以反映增殖期间的相对细胞存活。评估抗IgM抗体对B细胞增殖的作用并且测定以展现出对于10μg/ml活化的半最大浓度。使用这些活化条件，一式三份测定测试化合物在0.1％DMSO中的变化浓度对于从不同供体分离的CD19+B细胞的细胞代谢的影响。

方案：使用Ficoll-Hypaque梯度(Amersham)将人类B细胞从外周血单核细胞或未纯化的血沉棕黄层中分离并且通过磁性细胞分类(人类B细胞分离试剂盒II,MiltenyiBiotec)来阴性地选择。靶标细胞纯度通过流式细胞术通过染色B细胞、T细胞以及单核细胞的标记物(分别是CD19、CD3、CD14；BD Biosciences)来测定。数据在FACsCaliber流式细胞仪上收集并且使用FloJo软件(BD Biosciences)来分析。人类B细胞制剂的纯度通常大于95％。将阴性选择的人类B细胞在96孔板中用10μg/mL抗IgM F(ab’)₂(JacksonImmunoResearch)刺激。在37℃、5％CO₂下将在0.2mL RPMI+10％FBS中的100,000个B细胞用变化浓度(从在0.5％DMSO中的5000nM至0nM滴定)的式I化合物在一式三份的孔中或媒介物对照在0.5％DMSO最终浓度中处理30分钟，然后将细胞用10μg/mL抗IgM F(ab’)2刺激。在37℃、5％CO₂下刺激B细胞72小时。使用CellTiter-Glo试剂(Promega)测量增殖，如在光度计上所测量。平均值是针对最大增殖来绘制并且使用GraphPad Prism v5软件测定IC₅₀值。

实施例18

评估化合物对体外骨髓细胞活化的作用

原代人类巨噬细胞的FcγR活化。经由FcγR进行的自身抗体和免疫复合物介导的活化可以通过用固定的IgG活化巨噬细胞来模型化。源自GM-CSF处理的单核细胞的原代人类巨噬细胞上调活化标记物如CD80、CD86、MHC抗原以及FcγRIII受体。人类单核细胞来源的巨噬细胞可以通过板结合的纯化的人类IgG来活化。这个刺激交联FcγRIII受体并且诱导促发炎细胞因子如TNFα、IL-6、IL1β以及MCP-1的分泌。就人类巨噬细胞的FcR活化之后的细胞因子表达抑制对式I化合物进行评估。

一般说来，将巨噬细胞在先前用纯化的IgG培育然后洗涤的板中培养。将测试化合物的滴定物(10,000nM至0nM)添加至这些培养物中。就TNFα和IL-6的表达通过ELISA对细胞培养上清液进行分析。

方案：人类单核细胞是从健康供体的血沉棕黄层分离并且通过磁性细胞分类(单核细胞分离试剂盒II,Miltenyi Biotec)阴性地选择。将纯化的单核细胞在补充有低IgGFBS和100ng/mL GM-CSF的标准培养基中培养5至7天以便诱导巨噬细胞分化。将培养的巨噬细胞用100μg/mL板结合的纯化的IgG±测试化合物的滴定物(10μM至0nM)刺激。上清液在4小时和18小时之后收集并且分别就TNFα和IL-6进行分析。

实施例19

在小鼠胶原抗体诱导的关节炎中的功效

这个实施例不仅涉及关节炎，而且涉及评估自身抗体和免疫复合物的体内活性且因此与其它发炎性病症如SLE有关。在这个实验中，自身抗体和免疫复合物的活性产生取决于FcR信号传导的病理终点，并且这类抗体的Fc部分是通过施用式I化合物来抑制的。

在雌性DBA/1小鼠中的胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型不需要同源的T和B细胞应答用于诱导炎症，而是依赖于免疫效应子机构用于发展临床疾病。在CII特异性抗体转移之后3天施用的四种抗胶原II(CII)特异性单克隆抗体和免疫刺激性脂多糖(LPS)的混合物促进抗体-Fc受体接合(Kagari T.等人；J Immunol.170:4318-24(2003))、免疫复合物形成、补体激活(Banda NK等人；Clin Exp Immunol.159:100-8(2010))以及促发炎细胞因子产生以便经10天时间诱导严重的发炎性疾病。

一般说来，关节炎是通过在第0天将单克隆抗胶原抗体的混合物注射至DBA/1小鼠中来诱导。如所示，从第0天开始，小鼠(N＝10/组)QD或BID接受每天口服施用测试化合物。每天评估爪炎症。

方案：6至8周龄的雌性DBA/1小鼠在第0天i.v.接受2mg致关节炎的四个克隆的单克隆抗体混合物(Chondrex#10100)，然后在3天后接受50ug剂量的LPS。测试化合物悬浮液或媒介物(0.5％CMC，0.1％Tween 80)就在抗体混合物的i.v.转移之前从第0天开始(10个动物/组)通过口服管饲法BID施用。CIA的临床严重性通过监控所有四只爪的炎症来评定，采用在0至4范围内的标度。各爪分级如下：0，正常；1，踝或腕的轻度而有限的充血和肿胀，或1或2个足趾的任何严重程度的充血和肿胀；2，踝或腕的中度至重度充血和肿胀，或多于两个足趾；3，整只爪的充血和肿胀(显著水肿)；以及4，肢体最大程度的发炎，累及多个关节。四个单独评分的总和是关节炎指数，其中各动物的最高可能评分是16。

Claims

1.一种式I化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

各R¹独立地为氢、任选取代的C_1-6脂族基团；

或两个R¹基团与其***原子一起形成具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的任选取代的3-7元饱和单环杂环；

其中所述任选取代的C_1-6脂族基团可被以下基团取代：卤素、-NO₂、-CN、-OR、-SR、-N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-C(O)N(R)₂，或-N(R)C(O)R；和

其中所述任选取代的3-7元饱和单环杂环可被以下基团取代：卤素、-NO₂、-CN、-OR、-SR或-N(R)₂；

各R独立地为氢或C_1-6脂族基团；

环A为

R²为-Cl或-F；以及

R³为-CF₃、-OCF₃或-F。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式II-a：

或其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式II-b：

或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式III：

5.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物为式IV：

6.如权利要求5所述的化合物，其中R³为-CF₃。

7.如权利要求5所述的化合物，其中R³为-F。

8.如权利要求5所述的化合物，其中两个R¹均为氢。

9.如权利要求5所述的化合物，其中一个R¹为氢并且另一个R¹为任选取代的C_1-6脂族基团。

10.如权利要求9所述的化合物，其中一个R¹为氢并且另一个R¹为甲基。

11.如权利要求5所述的化合物，其中两个R¹均为任选取代的C_1-6脂族基团。

12.如权利要求1所述的化合物，其中一个R¹为氢并且另一个为任选取代的C_1-6脂族基团。

13.如权利要求1所述的化合物，其中两个R¹均为任选取代的C_1-6脂族基团。

14.如权利要求1所述的化合物，其中两个R¹均为氢。

15.如权利要求1所述的化合物，其中R²为-Cl。

16.如权利要求1所述的化合物，其中R²为-F。

17.如权利要求1所述的化合物，其中R³为-CF₃。

18.如权利要求1所述的化合物，其中R³为-OCF₃。

19.如权利要求1所述的化合物，其中R³为-F。

20.一种化合物，其选自：

21.如权利要求1至20中任一项所述的化合物或其组合物在制备用于降低布鲁顿酪氨酸激酶的酶活性的药物中的用途。

22.如权利要求1至20中任一项所述的化合物或其组合物在制备用于治疗对抑制布鲁顿酪氨酸激酶有应答的病症的药物中的用途。

23.如权利要求1至20中任一项所述的化合物或其组合物作为布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂在制备用于治疗选自以下的病症的药物中的用途：自体免疫病症、发炎性病症以及癌症。

24.如权利要求23所述的用途，其中所述病症为类风湿性关节炎。

25.如权利要求23所述的用途，其中所述病症为全身性红斑狼疮。

26.如权利要求23所述的用途，其中所述病症为异位性皮炎。

27.如权利要求23所述的用途，其中所述病症为白血病或淋巴瘤。