CN104232504A - 一种合成γ-聚谷氨酸的菌株以及利用其高效制备γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ-聚谷氨酸的合成菌株，从化肥厂周围土壤中筛选得到，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus SubtilisNS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC NO：M 2014142，保藏日期2014年4月23日。本发明还公开了上述的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法。和现有生产γ-聚谷氨酸技术相比，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株可以高效的发酵生产γ-聚谷氨酸；通过对枯草芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加碳源、无机盐及能量物质，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达100～200g/L，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物和发酵技术领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸的合成菌株。本发明还涉及一种利用γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，以下简称γ-聚谷氨酸）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，可由微生物发酵合成。由于γ-聚谷氨酸具有极佳的成膜性、成纤维性、可塑性、粘合性、保湿型、可降解性等优异的理化和生物学特性，在工农业、化妆品与医药等领域极具应用潜力。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成法、提取法和微生物发酵法。微生物发酵法比前俩种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸。国内外已对γ-聚谷氨酸的发酵工艺进行了广泛的研究，主要以液体深层发酵的培养基配方和培养工艺为主。南京工业大学筛选得到一株γ-聚谷氨酸高产菌株Bacillus Subtilis NX-2，并对液体发酵生产γ-聚谷氨酸做了比较全面的研究，并申请了专利，专利公开号为CN1346891；华中农业大学也进行了γ-聚谷氨酸产生菌的筛选和工艺的工作，其菌种和液体生产工艺也已经申请了专利，专利公开号为CN1536071；Kubota在Osaka City University土壤中分离得到的一株Bacillus Subtilis F201，该菌株在最佳发酵条件下可达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产量（Kubota H.Biosci Biotec Biochem，1993:1212～1213）。虽然以上γ-聚谷氨酸的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在生产周期较长，生产效率低下，生产成本较高的问题。因此，高产量、低成本生产γ-聚谷氨酸仍有待进一步研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株γ-聚谷氨酸的高产合成菌株，该菌株能够大量合成γ-聚谷氨酸。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法。
为了解决上述技术问题，本发明如下技术方案：
一种合成γ-聚谷氨酸菌株，从化肥厂周围土壤中筛选得到，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus Subtilis NS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2014142，保藏日期2014年4月23日，保藏地址为中国-武汉-武汉大学，邮编430072，联系电话（027）68754052，联系传真（027）68754833，联系邮箱cctccwhu.edu.cn。
16s rDNA序列分析：测得16s rDNA大部分序列1600bp，见序列表，将所测序列从GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以16s rDNA全序列为基础的***发育树。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16s rDNA全系列分析的***发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus Subtilis NS-9。
利用上述的合成γ-聚谷氨酸的菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）种子培养：从平板上挑单菌落接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速150～200rpm，30～37℃下培养3～15h至对数生长中期；
（2）发酵培养：将步骤（1）获得的种子溶液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量1～10%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量10～100ml/摇瓶容积200ml，摇床转速150～200rpm，30～37℃下培养24～48h；发酵过程中当残糖含量低至1-2g/L时要及时补加碳源；
（3）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000～10000r/m；
②微滤除杂：采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质；
③产物沉淀：直接采用有机溶剂进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
其中，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸中的任意一种或几种的任意比例的组合；优选碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的任意一种或几种的任意比例的组合；优选碳源为蔗糖；氮源为有机氮源、无机氮源中的一种或两种的任意比例的组合，有机氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米浆中的任意一种或几种的任意比例的组合，无机氮源为氯化铵、硫酸铵中的任意一种或二种的任意比例的组合，上述氮源可单独使用也可复配使用；优选氮源为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏中的任意一种或几种任意比例的组合；谷氨酸盐为采用添加味精、谷氨酸、谷氨酸钠等含谷氨酸物质中的任意一种或几种的任意比例的组合；无机盐为K2HPO43H2O，MgSO4，NH4Cl，CaCl22H2O，MnSO4H2O中的任意一种或几种的任意比例的组合；
其中发酵培养基和培养基包括以下浓度组分：碳源40～80g/L、氮源5～10g/L、谷氨酸钠70～90g/L、无机盐0.25～6g/L，其余为水，pH值为7.0～7.5；
步骤（3）中，所述的微滤膜孔径为0.22～0.65um；
步骤（3）中，采用的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙醇、丙酮之一或多种组合；
在步骤（1）种子培养之前还有种子斜面培养活化，将低温冻存的合成γ-聚谷氨酸菌株NS-9接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0。
和现有生产γ-聚谷氨酸技术相比，本发明使用的枯草芽孢杆菌微生物菌株可以快速大量的发酵生产γ-聚谷氨酸，24h发酵周期内可以发酵生产50g/L产品；通过对枯草芽孢杆菌菌株培养条件的优化，特别是在发酵过程中补加碳源、无机盐及能量物质，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达100～200g/L，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
具体实施方式
通过下述实施例详细说明本发明技术方案，可以更好地理解本发明内容。为了便于本领域的技术人员容易理解，实施例中所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应也不会限制本发明权利要求书中所要求保护的内容。
实施例1
一种合成γ-聚谷氨酸的菌株，从化肥厂周围土壤中筛选得到，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus Subtilis NS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2014142，保藏日期2014年4月23日。
16s rDNA序列分析：测得16s rDNA大部分序列1600bp，将所测序列从GenBank数据库中的相关种进行比较，构建以16s rDNA全序列为基础的***发育树。结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）同源性为99%。结合形态、细胞化学成分及16s rDNA全系列分析的***发育研究结果，可以将其分类定位为枯草芽孢杆菌，具体为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）NS-9。
实施例2
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量20ml/摇瓶容积250ml，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：30 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用4倍体积无水乙醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达140g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例3
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量20ml/摇瓶容积250ml，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为麦芽糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：30 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用4倍体积甲醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达150g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例4
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量20ml/摇瓶容积250ml，摇床转速220rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，牛肉膏：5 g/L，谷氨酸钠：30 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用4倍体积丙醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达170g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例5
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量20ml/摇瓶容积250ml，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：30 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，NaCl：10g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速10000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用4倍体积丙酮进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达100g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例6
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量20ml/摇瓶容积250ml，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：80 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用2倍体积无水乙醇和2倍体积丙酮进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达200g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例7
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养12h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量200ml/摇瓶容积2L，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：80 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用2倍体积无水乙醇和2倍体积甲醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达110g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例8
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量200ml/摇瓶容积2L，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为蔗糖：40g/L，蛋白胨：5 g/L，谷氨酸钠：80 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，MnSO4H2O：2.5 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用2倍体积无水乙醇和2倍体积丙醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达200g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例9
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量200ml/摇瓶容积2L，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为麦芽糖：40g/L，牛肉膏：5 g/L，谷氨酸钠：80 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，MnSO4H2O：2.5 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用2倍体积甲醇和2倍体积丙酮进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达220g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
实施例10
利用实施例1的γ-聚谷氨酸的合成菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）斜面培养：将低温冻存的实施例1菌株接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0；
（2）种子培养：将活化后的菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速200rpm，37℃下培养12h至对数生长中期；种子培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值7.0，121℃灭菌20分钟；
（3）发酵培养：将步骤（2）获得的种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量2%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量200ml/摇瓶容积2L，摇床转速200rpm，37℃下培养24h；发酵过程中当残糖含量很低时及时补加碳源；发酵培养基组分为麦芽糖：40g/L，牛肉膏：5 g/L，谷氨酸钠：80 g/L，K2HPO43H2O：2 g/L，MgSO4：0.25 g/L，NH4Cl：3 g/L，MnSO4H2O：2.5 g/L，pH值7.0，115℃灭菌15分钟；
（4）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000rpm，取上清液；
②微滤除杂：对上清液采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质，得去菌液；再将去菌液用截留分子量60KDa的超滤膜浓缩，得浓缩液；
③产物沉淀：浓缩液采用1倍体积无水乙醇、1体积丙酮、1倍体积甲醇和1倍体积丙醇进行沉淀，收集沉淀，沉淀物为γ-聚谷氨酸，湿重含量约达280g/1L发酵液；再将沉淀物真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
SEQUENCE LISTING
<110> 樟树市狮王生物科技有限公司
<120> 一种合成γ-聚谷氨酸的菌株以及利用其高效制备γ-聚谷氨酸的方法
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> bacillus subtilis 16S rDNA
<400> 1
tgcactgggt cgtgattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagatta gagtttgatc 60
atggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg gacagatggg 120
agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 180
gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt 240
caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 300
tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 360
acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 420
aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 480
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Claims (10)
1.一种合成γ-聚谷氨酸菌株，从化肥厂周围土壤中筛选得到，分类命名为枯草芽孢杆菌NS-9，即Bacillus Subtilis NS-9，中国典型培养物保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2014142，保藏日期2014年4月23日。
2.使用权利要求1的菌株高效制备γ-聚谷氨酸的方法，步骤如下：
（1）种子培养：从平板上挑单菌落接种于含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速150～200rpm，30～37℃下培养3～15h至对数生长中期；
（2）发酵培养：将步骤（1）获得的种子溶液接入含有碳源、氮源、谷氨酸盐、无机盐和水的无菌摇瓶发酵培养基中，接种量1～10%（种子溶液v/发酵培养基溶液v），摇瓶装液量10～100ml/摇瓶容积200ml，摇床转速150～200rpm，30～37℃下培养24～48h；发酵过程中当残糖含量低至1-2g/L时要及时补加碳源；
（3）γ-聚谷氨酸的提取与纯化：
①发酵液除菌：将发酵液降至4℃下离心10min，离心转速8000～1000r/m；
②微滤除杂：采用微滤膜滤除菌体与小分子杂质；
③产物沉淀：直接采用有机溶剂进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，制得γ-聚谷氨酸成品。
3.如权利要求2所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，发酵培养基和种子培养基包括以下浓度组分：碳源40～80g/L、氮源5～10g/L、谷氨酸钠70～90g/L、无机盐0.25～6g/L，其余为水，pH值为7.0～7.5。
4.如权利要求3所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、柠檬酸中的任意一种或几种的任意比例的组合；氮源为有机氮源、无机氮源中的一种或两种的任意比例的组合，有机氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、玉米浆中的任意一种或几种的任意比例的组合，无机氮源为氯化铵、硫酸铵中的任意一种或二种的任意比例的组合；谷氨酸盐为采用添加味精、谷氨酸、谷氨酸钠等含谷氨酸物质中的任意一种或几种的任意比例的组合；无机盐为K2HPO4·3H2O，MgSO4，NH4Cl，CaCl2·2H2O，MnSO4·H2O中的任意一种或几种的任意比例的组合。
5.如权利要求4所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，优选碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的任意一种或几种的任意比例的组合。
6.如权利要求4所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，优选碳源为蔗糖。
7.如权利要求4所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，优选氮源为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏中的任意一种或几种任意比例的组合。
8.如权利要求1或2所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的微滤膜孔径为0.22～0.65um。
9.如权利要求1或2所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤（3）中，采用的有机溶剂为乙醇、甲醇、丙醇、丙酮之一或多种组合。
10.如权利要求1或2所述高效制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在步骤（1）种子培养之前还有种子斜面培养活化，将低温冻存的合成γ-聚谷氨酸菌株NS-9接种于斜面培养基活化，37℃培养20h，斜面培养基组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH值7.0。
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