CN102533885B - 发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents

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本发明提供了一种发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法。本方法以纳豆芽孢杆菌为γ-聚谷氨酸的生产菌，主要发酵工艺步骤包括：将菌种在液态发酵培养基中预先好氧培养一段时间，然后添加NaCl以提高发酵基质的渗透压，再继续好氧培养至发酵终点等三个步骤。本方法比接种前添加NaCl或不加NaCl能明显提高γ-聚谷氨酸的产量，且操作简单、便于大规模生产，具有良好的应用前景。

Description

发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高效发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid，简称γ-PGA)是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种水溶性的生物高分子聚合物。由于γ-聚谷氨酸具有吸水性、可降解性、水解性等众多特性，因此被广泛用于医药、食品加工、农业、绿化以及水处理等多种领域，具有极大的开发价值和应用前景。
γ-聚谷氨酸最初由炭疽芽抱杆菌中发现，在高CO2浓度的诱导下，炭疽芽抱杆菌可产生γ-D-聚谷氨酸，产生的γ-D-聚谷氨酸附着在细胞壁上并在微生物细胞外面形成荚膜，炭疽芽抱菌株的毒性限制了其在工业上的应用。由于枯草芽孢杆菌和地衣芽抱杆菌的易培育性和安全性，现在聚谷氨酸的生产大多报道由此类菌株产生。γ-聚谷氨酸一般以游离形式直接分泌到培养基中，可静态发酵也可动态发酵，可称为游离型Y-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸可作为细胞外营养物存储，可促进细胞膜的形成，在非常时期为微生物提供生存所需，可防止噬菌体的侵袭，并在高盐环境下对金属离子进行包裹从而对细胞具有保护作用。
目前国内外主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸。迄今所报道的γ-PGA产生菌主要有四种：枯草(纳豆)芽孢杆菌(BaciLLus subtiLis)、地衣芽孢杆菌(BaciLLus Licheniformis)、耐高温芽孢杆菌(BaciLLusthermotoLerant)、炭疽芽孢杆菌(BaciLLus.anthracis)，尽管许多研究者对微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸进行了大量研究，但产率普遍还处于较低水平，生产成本高，这在很大程度上限制了γ-聚谷氨酸的工业生产与应用。由于γ-PGA生物合成的机理至今尚不很清楚，而且菌株生成γ'PGA的代谢途径复杂，调节方式多样，目前提高其生产效率的方法主要依靠选育优良菌种和优化发酵工艺。因此提高γ-聚谷氨酸的生产效率是大规模生产与应用亟待解决的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的发酵工艺以提高γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的产量，即将纳豆芽孢杆菌在液态发酵培养基中预培养一段时间后添加NaCl以提高发酵基质的渗透压，再继续培养至发酵终点以提高γ-PGA产量。
一般认为γ-PGA是某些细菌的荚膜或黏液层的主要有机成分，而荚膜或黏液层的形成既是这些细菌的遗传属性，也与其所处环境条件密切相关。如对数期的细菌很少形成荚膜，进入稳定期后才开始大量形成，这是细菌对环境劣变(如营养成分减少、代谢废物增加)的一种适应机制。有文献报道(李大力等，化学与生物工程，24：50-51，2007)在配制培养基时添加NaCl培养枯草芽孢杆菌能提高γ-PGA的产量，并认为这是菌种对渗透压提高的一种适应机制。但我们的研究发现这种添加NaCl的方式在培养纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)CICC20643时并不能提高γ-PGA的产量，甚至使产量和生物量都降低。究其原因是较高的渗透压对纳豆芽孢杆菌的生长会造成一定程度的抑制，使生物量比未加入NaCl的状态下要少一些。因此先让纳豆芽孢杆菌在不受抑制的状态下培养，待其进入稳定期后加入NaCl再继续培养，则既保证了足够的生物量，又形成了合成γ-PGA的有利环境，其结果使γ-PGA产量提高。
本发明提供的生产γ-聚谷氨酸的方法采取如下步骤：
(1)、将纳豆芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，在30～37℃摇瓶培养18～36h，即成纳豆芽孢杆菌种子液；
(2)、将纳豆芽孢杆菌种子液按1％～6％接种量接种于液态发酵培养基中，于30～37℃摇瓶培养或通气培养12～36h；然后在培养基中添加重量体积百分比为3％～6％的NaCl，NaCl以固体颗粒或溶液状态加入，添加NaCl后继续摇瓶培养或通气培养36～48h，终止发酵；
(3)、对发酵液进行提取、纯化，制得含γ-聚谷氨酸的产品。
其中，液态种子培养基，以重量体积比计，单位为g/L，其组成为：蛋白胨8～12g/L，牛肉膏4～6g/L，NaCl8～12g/L，pH6.5～7.5，其余为水。
其中，液态发酵培养基，以重量体积比计，单位为g/L，其组成为：蔗糖或葡萄糖20～25g/L，酵母膏5～10g/L，谷氨酸钠20～50g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH6.0～7.5，其余为水。
本发明的优点在于：在菌种生长稳定期加入NaCl不影响菌种生长，这样既保证了足够的生物量，又形成了合成γ-PGA的有利环境，结果使γ-PGA产量提高。本方法比接种前添加NaCl或不加NaCl能提高γ-聚谷氨酸的产量10％～40％，且操作简单、便于大规模生产，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1：摇瓶发酵
(1)种子液的制备
生产γ-PGA采用的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)来自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)，菌种编号CICC 20643。种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0，其余为蒸馏水或自来水，装液量50mL/250mL三角瓶，在121℃灭菌30min，冷却后，取一环预先保存于斜面培养基的纳豆芽孢杆菌接种于种子培养基中，在37℃、120r/min摇瓶培养24h，即成纳豆芽孢杆菌种子液。
(2)摇瓶培养
发酵培养基的成分：25g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸钠40g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，其余为蒸馏水；初始pH值为6.5，装液量70mL/250mL三角瓶，摇床转速为120r/min，在发酵24h后添加50g/LNaCl，NaCl以固体颗粒经灭菌后按无菌操作方式加入；继续培养48h后终止发酵。
(3)γ-PGA的提取
将发酵液于5000r/min下离心25min，上清液用1mol/L HCl调pH到3.0，加入4倍体积的95％乙醇，放于4℃下冰箱内过夜。然后于5000r/min下离心20min，用乙醇洗涤沉淀物，收集粘性沉淀物，干燥得γ-PGA产品。
实施例2：液态深层发酵
(1)种子液的制备
同实例1。
(2)液态深层培养
发酵培养基的成分：葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、谷氨酸钠20g/L、磷酸氢二钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、硫酸镁0.5g/L，其余为自来水；初始pH值为7.0，在5L微生物发酵罐中加入3L发酵培养基，灭菌冷却后以5％接种量接入纳豆芽孢杆菌种子液，37℃培养，通气比0.5～0.8(v/v)，搅拌转速200r/min，培养24h后添加4％的NaCl，NaCl以浓溶液经灭菌后按无菌操作方式加入。继续在37℃培养36h后结束，培养过程通气比降低至0.3～0.5(v/v)。
(3)γ-PGA的提取
提取纯化工艺同同实例1，γ-PGA的最高产量达到29.76g/L。

Claims (3)

1.发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于采取如下步骤：
(1)、将纳豆芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌冷却的液态种子培养基中，在30～37℃摇瓶培养18～36h，即成纳豆芽孢杆菌种子液；
(2)、将纳豆芽孢杆菌种子液按1％～6％接种量接种于液态发酵培养基中，于30～37℃摇瓶培养或通气培养12～36h；然后在培养基中添加重量体积百分比为3％～6％的NaCl，NaCl以固体颗粒或溶液状态加入，添加NaCl后继续摇瓶培养或通气培养36～48h，终止发酵；
(3)、对发酵液进行提取、纯化，制得含γ-聚谷氨酸的产品。
2.根据权利要求1所述的发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液态种子培养基，以重量体积比计，单位为g/L，其组成为：蛋白胨8～12g/L，牛肉膏4～6g/L，NaCl8～12g/L，pH6.5～7.5，其余为水。
3.根据权利要求1所述的发酵过程中添加NaCl生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液态发酵培养基，以重量体积比计，单位为g/L，其组成为：蔗糖或葡萄糖20～25g/L，酵母膏5～10g/L，谷氨酸钠20～50g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH6.0～7.5，其余为水。
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