CN103497914B - 枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产γ-PGA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于利用微生物生产γ-PGA技术领域，具体涉及一种生产γ-PGA的生产菌株及利用该菌株生产γ-PGA的生产方法。枯草芽孢杆菌HNCL 1266菌株已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.7949。利用该菌株发酵生产γ-PGA的生产方法，包括先将该菌株接入种子培养基发酵，然后按比例接入发酵培养基发酵，最好提取制备γ-PGA等步骤。利用本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株生产γ-PGA，24小时积累γ-PGA量最高可达50 g/L，与现有技术所采用的生产菌株相比，仅需在初始培养基中加入少量的泡敌，即可有效抑制泡沫的生成，避免发酵过程出现逃液，利于工业化生产的实现。

Description

枯草芽孢杆菌菌株及利用该菌株生产γ-PGA的方法

技术领域

本发明属于利用微生物生产γ-PGA技术领域，具体涉及一种生产γ-PGA的菌株及利用该菌株生产γ-PGA的方法。

背景技术

γ-PGA，γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种水溶性的高分子氨基酸聚合物，具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保湿、无毒、可生物降解等性能，可广泛应用于医药、农业、食品等领域，具有极大的开发价值和应用前景。

现有技术中，γ-PGA主要是利用芽孢杆菌属类微生物如Bacillus licheniformis ATCC9945a，Bacillus licheniformis P-104，Bacillus subtilis IFO3335，Bacillus subtilis TAM-4，Bacillus subtilis F02-1等，以液体发酵方法来生产。但是现有菌株发酵生产γ-PGA存在周期长、效率低、成本高的缺陷，此外还有报道利用现有菌株生产γ-PGA过程中，在液体发酵阶段会产生脂肽类生物表面活性剂的副产物（Qijun Wang, et al.，Co-producing lipopeptides and poly-γ-glutamic acid by solid-state fermentation of Bacillus subtilis using soybean and sweet potato residues and its biocontrol and fertilizer synergistic effects. Bioresource Technology，2008，99：3318–3323），造成液体发酵过程中产生大量难以控制的泡沫，从而出现严重逃液和染菌的问题。

发明内容

本发明目的在于提供一株在液体发酵生产γ-PGA过程中不产生脂肽类生物表面活性剂副产物的生产菌株以及提供一种利用该菌株生产γ-PGA的方法。

本发明所采用的技术方案如下。

一种用于液体发酵生产γ-PGA的枯草芽孢杆菌，其命名为Bacillus subtilis HNCL 1266，该菌株已于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7949。

一种利用上述菌株发酵生产γ-PGA的生产方法，包括如下步骤：

（1）将菌株Bacillus subtilis HNCL 1266接入无菌种子培养基，好氧条件下30～40℃发酵培养5～20 h；所述种子培养基组成为：葡萄糖10～50g/L，氮源1～10g/L，谷氨酸钠1～20g/L，硫酸镁0.1～10g/L，磷酸氢二钾1～20g/L，用水配制，培养基pH 4～9；

（2）按1～10%的接种量将步骤（1）制备的菌种接入无菌发酵培养基，好氧条件下30～40℃发酵培养20～40 h；所述发酵培养基组成为：葡萄糖50～200g/L，氮源5～20g/L，谷氨酸钠5～100g/L，氯化钠0～50g/L，硫酸镁1～20g/L，磷酸氢二钾1～20g/L，用水配制，培养基pH 4～9；

（3）将步骤（2）发酵完成的菌液用于提取制备γ-PGA。

步骤（2）中按0.1~0.5g/L的比例在灭菌前的发酵培养基中加入泡敌。

步骤（1）和（2）中所述氮源选自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐等。

步骤（1）和（2）中pH值调节通过本领域的常规方法来实现，如添加盐酸、硫酸、氢氧化钠、氨水等无机酸或无机碱。

步骤（1）或（2）中所述无菌种子培养基或无菌发酵培养基的灭菌条件为115～121℃，15～30min。

利用本发明所提供的枯草芽孢杆菌菌株生产γ-PGA，生产效率得到较高提升，经统计，该菌株在好氧条件下能高效地积累γ-PGA，最高达到50 g/L，周期24小时。与现有技术所采用的菌株相比，主要的优点还在于，仅需在初始发酵培养基中加入少量的泡敌（0.1-0.5g/L），即可有效抑制泡沫的生成，避免发酵过程出现逃液，利于工业化生产的实现。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

本发明提供了一种用于γ-PGA发酵生产的枯草芽孢杆菌，其命名为Bacillus subtilis HNCL 1266，该菌株已于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7949。

为便于本领域技术人员更加方便的获得本发明所提供的菌株，下面发明人对获得本发明菌株的过程做一简要说明。

本发明所获得的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HNCL 1266由已筛选得到的γ-PGA生产菌株Bacillus subtilis HD11（朱丽娟等，γ-聚谷氨酸高产菌株的鉴定及诱变选育，安徽农学通报，2012，18(4)： 8-10），通过常压室温等离子体（ARTP）（参见中国专利2008200793821）诱变选育获得。其主要诱变原理为：等离子体产生的活性粒子能够破坏细胞结构也能够穿过细胞壁到达细胞内，破坏基因和蛋白质的结构，从而导致大部分微生物死亡。但少数经过ARTP 照射过的微生物会通过本身的自动修复***修复存活，并在这一过程中产生基因突变，从而获得突变菌株。

具体诱变选育过程中根据培养微生物目的所采用的培养基配方有：

保藏斜面培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L，pH7.0；

种子培养基：葡萄糖20g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸钠10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.25g/L、pH7.0，装液量20ml/250ml；

摇瓶发酵培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏8g/L、谷氨酸钠30g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.25g/L，pH7.0，装液量40ml/250ml。

诱变选育过程中根据培养目的所采用的微生物培养方法有：

菌种活化：取菌种一环，接人新鲜斜面培养基中，37℃培养18h；

种子培养：取活化菌种一环，接种种子培养基，37℃，200r/min，振荡培养10h；

摇瓶发酵培养：取1ml种子培养液接入到发酵培养基中，37℃，200r/min，振荡培养48h。

诱变选育过程中采用常压室温等离子体（ARTP）具体诱变条件为：

参数	操作条件
		功率(W)	120
处理距离(mm)	2
		处理时间(s)	240
样品添加量(μL)	10
		工作气体	氦气
通气量(SLM)	10

诱变后具体菌株筛选过程：

挑取诱变后平板上的单菌落，接入种子培养基，37℃，200rpm培养10h，取1ml种子液接入发酵培养基中37℃，200rpm培养48h，测定发酵液中γ-PGA和脂肽类生物表面活性剂的含量。其中γ-PGA产率的测定采用HPLC法（参见中国专利201110358375.1 ），脂肽类生物表面活性剂含量的测定采用排油圈法（宁长发等，产生物表面活性剂菌种的一种快速筛选模型，微生物学通报，2004，31(3)：55-58）。

经过多次诱变，获得了约500株突变菌株，分别进行摇瓶发酵，测定发酵液中γ-PGA和脂肽的含量，最终获得高产γ-PGA且不产脂肽的优良突变株Bacillus subtilis HNCL 1266。对其进一步通过连续传代10次的试验，证明其具有良好的遗传稳定性，适于工业化生产应用。

将筛选出的Bacillus subtilis HNCL 1266与Bacillus subtilis HD11比较，可以发现，其在平板菌落形态、摇瓶发酵的γ-PGA产率和排油圈直径等方面均存在较大差异，具体对比差异情况见下表。

菌株HNCL 1266 和HD11平板菌落形态的比较

菌株

大小

形状

颜色

***

边缘

表面

内部

HD-11

6 mm

圆形

白色不透明

突起

完整

干

拉丝

HNCL 1266

2 mm

圆形

白色不透明

凹陷

完整

湿

拉丝

菌株HNCL 1266 和HD11摇瓶发酵γ-PGA产率和排油圈直径的比较

菌株	γ-PGA(g/L)	排油圈直径(cm)
			HD-11	20	3
HNCL 1266	28	0

实施例2

利用筛选出的Bacillus subtilis HNCL 1266液体发酵生产γ-PGA的方法，具体生产步骤如下：

（1）将菌株Bacillus subtilis HNCL 1266接入无菌种子培养基，好氧条件下30～40℃发酵培养5～20 h；所述种子培养基组成为：葡萄糖10～50g/L，氮源1～10g/L，谷氨酸钠1～20g/L，硫酸镁0.1～10g/L，磷酸氢二钾1～20g/L，用水配制，培养基pH 4～9。

（2）在5L发酵罐中装培养基3L，所用培养基配方为：含葡萄糖100 g/L，酵母膏15 g/L，谷氨酸钠40 g/L，氯化钠10 g/L，硫酸镁5 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，调节pH7.0；

培养基灭菌前加入泡敌1g，泡敌由河南省南召县助剂厂生产，所用产品的生产批号为130319。

按3%的接种量将步骤（1）制备的菌种接入上述灭菌后的发酵培养基，600rpmd搅拌转速，通风量1vvm，pH7.0，温度37℃条件下，发酵24小时。

（3）将步骤（2）发酵完成的菌液用于提取制备γ-PGA。

观察发酵过程中存在少量泡沫，但不需补加泡敌，经测定，γ-PGA产率约为35g/L。

实施例3

生产参数同实施例2，仅泡敌添加量减为0.5g。

观察发酵过程中存在少量泡沫，但不需补加泡敌，经测定，γ-PGA产率约为35g/L。

实施例4

生产参数同实施例3，仅氯化钠调整为30 g/L。

本实施例目的在于改变发酵液的渗透压，以此促进γ-PGA的合成。

观察发酵过程中存在少量泡沫，但不需补加泡敌，经测定，γ-PGA产率约为40g/L。

实施例5

生产参数同实施例4，仅谷氨酸钠调整为60 g/L。

本实施例目的在于改变发酵液内反应物质的比例，以此来检验影响γ-PGA的产率的因素。

观察发酵过程中存在少量泡沫，但不需补加泡敌，经测定，γ-PGA产率约为50g/L。

上述实施例均是本发明较为典型的实施例，并非对本发明的限定，在上述实施例基础上，对培养基成分或其他反应参数条件进行适当改变，即可得出本发明请求保护的专利权范围，因此不再提供更多的实施例。

Claims (3)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HNCL 1266，2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7949。

2.一种利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌HNCL 1266生产γ-PGA的方法，包括如下步骤：

（1）将菌株Bacillus subtilis HNCL 1266接入无菌种子培养基，好氧条件下30～40℃发酵培养5～20 h；所述种子培养基组成为：葡萄糖10～50g/L，氮源1～10g/L，谷氨酸钠1～20g/L，硫酸镁0.1～10g/L，磷酸氢二钾1～20g/L，用水配制，培养基pH 4～9；

（2）按1～10%的接种量将步骤（1）制备的菌种接入无菌发酵培养基，好氧条件下30～40℃发酵培养20～40 h；所述发酵培养基组成为：葡萄糖50～200g/L，氮源5～20g/L，谷氨酸钠5～100g/L，氯化钠0～50g/L，硫酸镁1～20g/L，磷酸氢二钾1～20g/L，用水配制，培养基pH 4～9；

（3）将步骤（2）发酵完成的菌液用于提取制备γ-PGA。

3.如权利要求2所述生产γ-PGA的方法，其特征在于：步骤（2）中按0.1~0.5g/L的比例在灭菌前的发酵培养基中加入泡敌。