CN101701237B - 发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法，它包括斜面种子的制备，培养基的选择，培养及反应条件的优化和产物的提取等工艺步骤。本发明通过野油菜黄单胞菌发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚，具有原料及工艺步骤简单，生产过程中不使用有毒有害的有机溶剂，生产操作安全等优点。采用本发明生产α-葡萄糖基化丁香酚产量高，每升发酵液中含有16.5-37g α-葡萄糖基化丁香酚，丁香酚的转化率可达91％。α-葡萄糖基化丁香酚可作生发剂，也可作为前药靶向释放丁香酚，发挥抗氧化，杀菌及抗肿瘤等功效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)CGMCC NO.1243发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法。
背景技术
丁香酚具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、促进头发生长等多种药理活性。然而其难溶于水、易升华、有刺激性气味等性质，限制了它的应用。因此，研究对其进行结构改造设计成前药，从而改变物理性质，使它能够得到广泛应用。
近年来葡萄糖基化被认为是改造酚类化合物结构，保留其生物活性，提高水中的溶解性，增强药理作用，使酚类化合物具有靶向性的一种重要方法。因此，可以将丁香酚改造为α-葡萄糖基化丁香酚。
目前，国内利用生物技术生产α-葡萄糖基化丁香酚的文献尚未见报道；国外生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法主要是提取α-葡萄糖基转移酶，催化麦芽糖和丁香酚合成α-葡萄糖基化丁香酚。由于α-葡萄糖基转移酶的提取过程繁琐，费用昂贵，所以α-葡萄糖基化丁香酚的生产成本很高。而且该法的反应体系小，产率不高，给实际推广带来了很大的困难。因此，有必要发展一种低成本，高产率，利于大规模生产α-葡萄糖基化丁香酚的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-葡萄糖基化丁香酚的制备方法，该制备方法利用野油菜黄单胞(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243，选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入反应物丁香酚和麦芽糖(或蔗糖)，在最佳反应条件下发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚，发酵液经过大孔吸附树脂的分离纯化后，可得到高纯度的α-葡萄糖基化丁香酚。该方法克服了提取酶催化成本高、操作繁琐、反应体系小、产率低的缺点。而且该方法能够利用蔗糖，具有工艺操作简单、反应条件温和、成本低、产率高、操作安全等优点。
本发明的整体技术构思是：
发酵法生产α-葡萄糖基化丁香酚，该方法由下列工艺步骤组成：
(1)将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
(2)将斜面菌种接入摇瓶中进行发酵
(3)加入反应物丁香酚和麦芽糖(或蔗糖)
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：
步骤(1)中的斜面培养基由下列重量份组分组成：
麦芽糖(或蔗糖)5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂10-20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为6.0-9.0，温度为15-40℃，培养时间为12-60小时。
步骤(2)中的发酵液由下列重量份组分组成：
麦芽糖(或蔗糖)5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为6.0-9.0，培养温度为15-40℃，摇床转速为90-230转/分钟，培养时间为18-72小时。
步骤(3)中的反应条件为：反应温度为10-45℃，摇床转速为90-230转/分钟，pH值为4.0-10.0，反应物丁香酚浓度为60-150mmol/L，麦芽糖(或蔗糖)浓度为100-500mol/L，反应时间为24-120小时。在此反应条件下，丁香酚的转化率为63-91％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚16.5-37g。
步骤(4)中的α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，即可得到纯度为97％以上的α-葡萄糖基化丁香酚，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末。
本发明所用的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243。
本发明所取得的技术进步在于：
本发明是利用野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚，降低了生产成本，且生产过程中不使用有毒有害的有机溶剂，工艺步骤简单，提高了生产操作安全性。采用本发明生产的α-葡萄糖基化丁香酚产量高，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚16.5-37g，通过大孔吸附树脂分离纯化，纯度可达到97％以上，具有工业化意义。
实施例：以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
麦芽糖5份、蛋白胨8份、酵母粉1份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂10份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为7.5，温度为35℃，培养时间为12小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
麦芽糖5份、蛋白胨15份、酵母粉8份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为8.0，培养温度为15℃，摇床转速为170转/分钟，培养时间为18小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为60mmol/L及麦芽糖物质量浓度为100mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为35℃，摇床转速为90转/分钟，pH值为8.0，反应时间为24小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-糖基化丁香酚的转化率为91.2％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚17g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为98.0％。
实施例2
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
麦芽糖30份、蛋白胨15份、酵母粉10份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为9.0，温度为20℃，培养时间为36小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
麦芽糖20份、蛋白胨1份、酵母粉12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为6.0，培养温度为25℃，摇床转速为90转/分钟，培养时间为36小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为100mmol/L及麦芽糖物质量浓度为400mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为10℃，摇床转速为150转/分钟，pH值为6.0，反应时间为72小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-葡萄糖基化丁香酚的转化率为87.3％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚28g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为97.8％。
实施例3
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
麦芽糖50份、蛋白胨10份、酵母粉8份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂16份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为8.0，温度为40℃，培养时间为60小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
麦芽糖30份、蛋白胨8份、酵母粉3份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为8.5，培养温度为40℃，摇床转速为150转/分钟，培养时间为72小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为150mmol/L及麦芽糖物质量浓度为500mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为25℃，摇床转速为170转/分钟，pH值为10.0，反应时间为120小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-葡萄糖基化丁香酚的转化率为76.9％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚37g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为97.3％。
实施例4
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
蔗糖15份、蛋白胨1份、酵母粉3份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂12和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为6.0，温度为15℃，培养时间为24小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
蔗糖15份、蛋白胨6份、酵母粉1份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为7.5，培养温度为35℃，摇床转速为190转/分钟，培养时间为60小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为120mmol/L及蔗糖物质量浓度为300mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为30℃，摇床转速为230转/分钟，pH值为9.0，反应时间为96小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-葡萄糖基化丁香酚的转化率为67.8％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚26g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为97.6％。
实施例5
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
蔗糖40份、蛋白胨6份、酵母粉12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂15份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为8.5，温度为25℃，培养时间为48小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
蔗糖50份、蛋白胨10份、酵母粉6份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为9.0，培养温度为30℃，摇床转速为230转/分钟，培养时间为24小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为60mmol/L及蔗糖物质量浓度为200mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为15℃，摇床转速为130转/分钟，pH值为4.0，反应时间为48小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-葡萄糖基化丁香酚的转化率为87.6％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚16.5g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：在发酵液中加入2倍体积的乙醇，过滤除去黄原胶沉淀，旋蒸出乙醇；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为98.7％。
实施例6
(1)菌种斜面培养
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；
其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成：
蔗糖20份、蛋白胨4份、酵母粉5份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂18份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为：pH值为7.0，温度为28℃，培养时间为36小时。
(2)接种发酵
将斜面菌种接种到50ml的液体培养接种进行发酵；
其中发酵液由下列重量份组分组成：
蔗糖35份、蛋白胨12份、酵母粉10份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为：pH值为7.0，培养温度为28℃，摇床转速为130转/分钟，培养时间为48小时。
(3)生产α-葡萄糖基化丁香酚
加入反应物丁香酚物质量浓度为150mmol/L及蔗糖物质量浓度为500mmol/L；
其中的反应条件为：反应温度为45℃，摇床转速为190转/分钟，pH值为7.5，反应时间为108小时。在此反应条件下，丁香酚转化为α-葡萄糖基化丁香酚的转化率为63.4％，每升发酵液中含α-葡萄糖基化丁香酚30.5g。
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化，包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理：发酵液过滤除去沉淀；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品为白色粉末，纯度为97.5％。
Claims (3)
1.发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法，其特征在于：用野油菜黄单胞菌生产α-葡萄糖基化丁香酚，生产过程由下列工艺步骤组成：
(1)将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基，斜面培养基的组成为：麦芽糖或蔗糖5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份、琼脂10-20份和水1000份，于pH值为6.0-9.0，温度为15-40℃，培养12-60小时制成斜面菌种；
(2)将斜面菌种接入摇瓶中进行发酵，发酵液的组成为：麦芽糖或蔗糖5-50份、蛋白胨1-15份、酵母粉1-12份、磷酸氢二钾2.0份、无水硫酸镁0.5份、碳酸氢钙0.05份和水1000份，于pH值为6.0-9.0，培养温度为15-40℃，摇床转速为90-230转/分钟，培养时间为18-72小时；
(3)加入反应物丁香酚浓度为60-150mmol/L和麦芽糖或蔗糖浓度为100-500mmol/L，于反应温度为10-45℃，摇床转速为90-230转/分钟，pH值为4.0-10.0条件下反应24-120小时；
(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法，其特征在于：所述的(4)步骤中的α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化包括以下四个步骤：
a.对发酵完成的发酵液进行预处理；
b.将经过a步骤的发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；
c.把经过b步骤的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；
d.把经过c步骤的发酵液真空干燥，即可得到纯度为97％以上的α-葡萄糖基化丁香酚。
3.根据权利要求2所述的发酵生产α-葡萄糖基化丁香酚的方法，其特征在于：所述的a步骤的预处理方法为：发酵液过滤除去沉淀；b步骤中发酵液在6000转/分钟条件下离心20分钟；c步骤中的弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；d步骤中的真空干燥的真空度为0.1Mpa，温度为60℃，干燥后的成品纯度达97％以上。
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