CN106631440A - 一种红豆杉复合微生物有机肥料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种红豆杉复合微生物有机肥料及其制备方法和用途。本发明提供的一种红豆杉复合微生物有机肥料包括如下重量份组份：有机肥料80‑90份、复合微生物菌剂10‑20份。本发明提供的复合微生物有机肥料能明显促进曼地亚红豆杉苗的生长发育，尤其是提高植物体内的紫杉醇的积累，对于红豆杉抗癌药物的开发具有十分积极的作用；同时，本发明对红豆杉植物经有效成分提取后的残渣进行了二次利用，十分利于红豆杉植物的循环利用。

Description

一种红豆杉复合微生物有机肥料及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于肥料领域，具体涉及一种红豆杉复合微生物有机肥料及其制备方法和用途。
背景技术
红豆杉是新型抗癌天然药物紫杉醇(Taxol)的主要来源之一。紫杉醇是美国化学家Wall等(1971)首先从太平洋紫衫(Taxus brevifolia)树皮中提取的具有五甲基十五碳烯骨架的二萜类化合物。它是世界上公认的广谱、高活性的抗癌药物。由于国内外对红豆杉提取物紫杉醇的迫切需要，是我国出现了前所未有的红豆杉资源开发热潮，各地天然红豆杉资源遭到了严重的破坏，有的地方甚至濒临灭绝。因此，如何保护、开发和利用红豆杉资源，实现紫杉醇产业的可持续发展，已成为亟需解决的重要课题；此外，红豆杉中紫杉醇类有效物质的含量十分低，如何提高红豆杉中的紫杉醇含量对于红豆杉的开发的商业价值提升具有重要意义。
红豆杉中更加主要种类曼地亚红豆杉(Taxus madia)原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉(T.cuspidata)，父本为欧洲红豆杉(T.bauata)，在美国、加拿大生长发展已有近100年的历史。我国20世纪90年代中期从加拿大引种而来。曼地亚红豆杉植株各部分均含有紫杉醇，其含量是国内其他红豆杉的8-10倍，枝叶含量达0.03％以上，根系部分可达0.06％。虽然其生长速度较其他红豆杉快，但作为灌木，生长速度仍然较慢。人工栽培曼地亚红豆杉，提高紫杉醇及其前体在植株体内的生物合成和积累是解决紫杉醇资源瓶颈的重要途径。为实现曼地亚红豆杉短周期药用林的高产高效经营，施肥是一个重要的环节。目前，以微生物为基础开发的各种微生物肥料已经在农林业生产中得到广泛应用，该类肥料具有肥效高、本身无毒、不污染环境、成本低、节约能源等特点，是化学肥料的最有效的替代品。
丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae，AM)真菌是土壤中最重要的成员之一。AM真菌显着影响植物的初生代谢过程，它可以促进植物根系对磷、铜、锌、镉等矿质元素及养分的吸收，调节植物激素的合成和分配，改善植物的根际微生物环境并增强植物的抗病性，同时提高植株对环境胁迫的耐受力，从而全面改善宿主植物的生长状况。近年来，许多研究已经观察到AM真菌与植物次生代谢的相关性，AM真菌能够直接或间接地影响植物的次生代谢过程。现有技术中鲜有针对红豆杉进行的菌根生物技术的研究。
此外，目前对于红豆杉植物的药物有效成分提取的方法的研究已成为抗癌药物开发领域的热点，现有技术中大多是针对提高红豆杉植物的有效成分利用率进行的研发，如专利“从红豆杉中高效快速提取紫杉醇、三尖杉宁碱和10-DABⅢ的方法”(CN105669602A)对红豆杉植物中的有效成分紫杉醇、三尖杉宁碱和10-DABⅢ的提取率均达到98％以上。而红豆杉植物经过提取后的残渣大部分被作为废弃物浪费掉，这不利于红豆杉植物的绿色循环开发。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种能够提高红豆杉植物紫杉醇含量的红豆杉复合微生物有机肥料。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的一种红豆杉复合微生物有机肥料包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料80-90份、复合微生物菌剂10-20份。
本发明通过对红豆杉提取残渣进行废物利用，再复合微生物菌剂而制得的红豆杉复合微生物有机肥料能够促进红豆杉的根系发育，并且能够大大提高红豆杉植物中的紫杉醇含量。
进一步优选的，上述红豆杉复合微生物有机肥料包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料82-88份、复合微生物菌剂12-18份。
更进一步优选的，上述红豆杉复合微生物有机肥料包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料85份、复合微生物菌剂15份。
进一步的，上述红豆杉复合微生物有机肥料中，所述有机肥料包括如下重量份组份：牲畜粪便60-75份、红豆杉提取残渣20-30份、草炭5-15份、酵素菌1-5份。所述牲畜粪便为鸡、鸭、牛、羊、猪、鹅等常见牲畜的粪便。
进一步的，上述红豆杉复合微生物有机肥料中，所述复合微生物菌剂包括如下两种组份：分离自曼地亚红豆杉植株组织中或者根际土壤中的幼套球囊霉(Glomusetunicatum)和枯草芽胞杆菌(Bacillus s-ubtilis)。从红豆杉根际筛选优良AM真菌，利用菌根生物技术来促进红豆杉生长的及次生代谢产物紫杉醇和前体的积累，这将有助于曼地亚红豆杉的人工驯化栽培以及市场和患者对紫杉醇药物的需求。
本发明所提供的复合微生物菌剂配合有机肥料对紫杉醇的生长具有如下具体的有益效果：1.分泌抑制生长环境中的有害菌的滋生繁殖，有效预防重茬病害及线虫的侵染，增强植物的抗病免疫力，最大限度地阻断土壤土传病害；2.强力促进增根、生根、壮根，毛细根数增加，吸水、吸肥能力强，茎粗、壮苗、移栽缓苗快等功能；3.改善土壤团粒结构，改良土壤，提高土壤蓄水、蓄能和地温，缓解重茬障碍；4.固氮、解磷、解钾作用，平衡土壤的酸碱度，改良土壤结构，提高化肥利用率，促进作物生长，成熟，提高产品品质和产量；5.产生的过氧化氢酶及其它酵素和酶等外分泌物对作物生长均表现出不同程度的促进作用。
进一步优选的，上述红豆杉复合微生物有机肥料中，所述幼套球囊霉和枯草芽胞杆菌的配比是1mL：1g。
上述红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法包括步骤：将牲畜粪便、红豆杉提取残渣、草炭三个组份按照配比混合后加入酵素菌发酵制得有机肥料；
将幼套球囊霉的孢子进行培养制得幼套球囊霉；
将枯草芽胞杆菌菌种经过培养基发酵制得枯草芽胞杆菌；
将制得的有机肥料、幼套球囊霉和枯草芽胞杆菌混合即得产品。
所述牲畜粪便、红豆杉提取残渣、草炭混合物的含水量在加入酵素菌前优选的控制在10-15％。
进一步的，上述红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法中，所述幼套球囊霉按如下方法制备：将幼套球囊霉的孢子用白三叶草为载体富集培养，培养基质为灭过菌的土和沙混合物，培养2月后，去掉地上部分，制成幼套球囊霉；所述土和沙质量比为2：1。
进一步的，上述红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法中，所述枯草芽胞杆菌为LB培养基发酵24h后的培养液。
上述红豆杉复合微生物有机肥料的用途在于提高红豆杉的紫杉醇含量。
综上所述，本发明提供的复合微生物有机肥料能明显促进曼地亚红豆杉苗的生长发育，尤其是提高植物体内的紫杉醇的积累，对于红豆杉抗癌药物的开发具有十分积极的作用；同时，本发明对红豆杉植物经有效成分提取后的残渣进行了二次利用，十分利于红豆杉植物的循环利用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，本发明所记载的实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例二至四中的使用的红豆杉提取残渣是将红豆杉枝叶按照专利CN105669602A中实施例所记载的方法进行有效成分提取后的剩余固体残渣。使用前红豆杉提取废渣经过风干除去其中残留的有机试剂。
实施例一
复合微生物菌剂的制备
(1)把AM真菌幼套球囊菌的孢子用30％H2O2消毒10min，然后无菌水漂洗3次，把孢子用白三叶草为载体富集培养，培养基质为灭过菌的土和沙的混合物，土和沙的质量比为2：1，培养2月后，去掉地上部分，制成含有孢子、菌丝和侵染跟段的混合物作为AM真菌菌剂；
(2)将枯草芽孢杆菌活化，用接种环挑取少量菌体接种于含5mL LB培养基，LB培养基的具体成分为蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1000mL、pH 7.2～7.4，121℃灭菌30min。20mL培养瓶中，37℃，200r/min振荡过夜培养，作为种子液，按1％转接于含150mL LB培养基500mL三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养24h后作为菌剂。
将制得的幼套球囊菌的AM真菌菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂按照1mL：1g的比例混合即得复合微生物菌剂。
实施例二
复合微生物有机肥料的制备
牲畜粪便为鸡粪和猪粪按2：3的比例混合。将60kg牲畜粪便、30kg红豆杉残渣、10kg草炭按混合，含水量15％。混匀后加入酵素菌，发酵10天，即制成有机肥。
将85kg有机肥料，实施例一制备所得的复合微生物菌剂15kg份混合均匀即制得复合微生物有机肥料。
实施例三
复合微生物有机肥料的制备
牲畜粪便为牛粪和猪粪按1：1的比例混合。将75kg牲畜粪便、25kg红豆杉残渣、5kg草炭按混合，含水量控制在11％。混匀后加入酵素菌，发酵10天，即制成有机肥。
将80kg有机肥料，实施例一制备所得的复合微生物菌剂20kg份混合均匀即制得复合微生物有机肥料。
实施例四
复合微生物有机肥料的制备
牲畜粪便为猪粪。将65kg牲畜粪便、20kg红豆杉残渣、15kg草炭按混合，含水量控制在12％。混匀后加入酵素菌，发酵10天，即制成有机肥。
将90kg有机肥料，实施例一制备所得的复合微生物菌剂10kg份混合均匀即制得复合微生物有机肥料。
实施例五
复合微生物有机肥料的田间试验
将实施例二制备的复合微生物有机肥料施用于曼地亚红豆杉苗种植田内，作为基肥，每亩用量为50kg，种植上红豆杉扦插苗。不施肥和施用等量无机复合肥(包括氮肥、钾肥、磷肥等)作为对照。
曼地亚红豆杉假植苗1年后生长情况如表1所示。从表1中可看出，施肥有利于曼地亚红豆杉苗的生长，施用复合微生物有机肥效果更明显。其中施用复合微生物有机肥，曼地亚红豆杉假植苗的根重和枝叶重相对于不施肥分别增长了141％、121％，相对于施用无机肥分别增长了48％、72％。
表1复合微生物有机肥对曼地亚红豆杉苗生长的影响
注：P<0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。
实施例六
假植苗紫杉醇含量的检测
对实施例五中的红豆杉假植苗在种植1年后，分别将不同处理的根、茎、叶于35℃下烘干磨碎成粉状物备用。分别称取30g粉状物置于500mL烧杯中，加入300mL甲醇，常温下超声萃取1小时，抽滤；再加入100mL甲醇，常温下超声萃取1小时，抽滤。将两次滤液合并，通过高效液相色谱仪定量检测其中紫杉醇的含量。
曼地亚红豆杉假植苗生长1年后紫杉醇含量情况如表2所示。从表2中可看出，施肥有利于曼地亚红豆杉苗中紫杉醇的积累，施用复合微生物有机肥效果更明显。其中施用复合微生物有机肥，曼地亚红豆杉假植苗的根中和枝叶中紫杉醇的含量相对于不施肥分别增长了192％、46％，相对于施用无机肥分别增长了153％、17％。
表2复合微生物有机肥对曼地亚红豆杉苗紫杉醇积累的影响
注：P<0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。

Claims (10)

1.一种红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料80-90份、复合微生物菌剂10-20份。
2.根据权利要求1所述的红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料82-88份、复合微生物菌剂12-18份。
3.根据权利要求1所述的红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：包括如下重量份组份：含红豆杉提取残渣的有机肥料85份、复合微生物菌剂15份。
4.根据权利要求1或2所述的红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：所述有机肥料包括如下重量份组份：牲畜粪便60-75份、红豆杉提取残渣20-30份、草炭5-15份、酵素菌1-5份。
5.根据权利要求1或2所述的红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：所述复合微生物菌剂包括如下两种组份：幼套球囊霉和枯草芽胞杆菌。
6.根据权利要求5所述的红豆杉复合微生物有机肥料，其特征在于：所述幼套球囊霉和枯草芽胞杆菌的配比是1mL：1g。
7.如权利要求1至6中任意一项所述的红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法，其特征在于：包括步骤：
将牲畜粪便、红豆杉提取残渣、草炭三个组份按照配比混合后加入酵素菌发酵制得有机肥料；
将幼套球囊霉的孢子进行培养制得幼套球囊霉；
将枯草芽胞杆菌菌种经过培养基发酵制得枯草芽胞杆菌；
将制得的有机肥料、幼套球囊霉和枯草芽胞杆菌混合即得产品。
8.根据权利要求7所述的红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法，其特征在于：所述幼套球囊霉按如下方法制备：将幼套球囊霉的孢子用白三叶草为载体富集培养，培养基质为灭过菌的土和沙混合物，培养2月后，去掉地上部分，制成幼套球囊霉；所述土和沙质量比为2：1。
9.根据权利要求7所述的红豆杉复合微生物有机肥料的制备方法，其特征在于：所述枯草芽胞杆菌为LB培养基发酵24h后的培养液。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的红豆杉复合微生物有机肥料的用途，其特征在于：提高红豆杉的紫杉醇含量。
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