CN106434475B - 一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用。一株链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.12351。本发明还涉及该菌株培养方法与应用。本发明所述菌株是一株多能型多糖降解菌，利用该菌株制备的复合型多糖降解酶制剂可降解植物、海藻、动物和微生物多糖，尤其对来源于高等动物***的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E降解活性显著，具有潜在的应用价值，与现有已知的链霉菌(Streptomyces sp.)功能完全不相同。

Description

一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
多糖是由重复的单一糖单元或复杂糖单元通过糖苷键连接而成的多聚物，既有线性分子，也有支链状分子，或网络状聚合物。多糖的种类多、数量大，广泛存在于自然界中，如：高等植物中的纤维素、木聚糖、甘露聚糖等，海藻中的琼胶、褐藻胶、卡拉胶，甲壳动物中的几丁质，以及微生物来源的肽聚糖、黄原胶等。这些多糖不但是组成生物体的结构物质，还是储存能量的介质，是重要的生物资源之一[1]。而且，多糖及其降解产物具有多种重要生理活性，在医药、化妆品、食品工业及农业等方面具有重要的应用价值。从微生物中分离的多糖降解酶可以通过水解、裂解等多种方式催化糖苷键的断裂，生成具有新颖生物活性的低聚糖组分，从而产生巨大经济效益和社会效益。
多糖降解菌[2,3]是指能以多种类型的多糖为唯一碳源生长的菌株。多糖降解菌所产多糖降解酶的类型多样，具有重要开发价值。目前，已报道的多糖降解菌主要分离自海洋。韩文君等在海泥中筛选到的海洋细菌Persicobacter sp.JZB09[4]、Flammeovirgasp.MY04[5]均能利用10种以上的多糖为唯一碳源生长。国际享有盛名的2株多糖降解菌Zobellia galactanivorans[6]、Saccharophagus degradans 2-40[7]也是分离自海洋环境。相比之下，来源于陆地土壤的多糖降解菌鲜有报道。
链霉菌是放线菌门中种类最多的一个属，广泛存在于土壤中，是丝状的***，主要通过孢子繁殖，绝大多数链霉菌对人体无害[8,9]。链霉菌是产生各种抗生素的主要来源，源于链霉菌的抗生素包括红霉素、四环素、链霉素、氯霉素、新霉素、制霉菌素、卡那霉素、放线菌酮和两性霉素等[10]，因此，对于链霉菌的已有研究主要集中于菌株产生抗菌活性物质的能力和大小等方面。关于链霉菌产多糖降解酶的研究主要集中于菌株所产单一多糖降解酶，如几丁质酶、木聚糖酶及纤维素酶等[11-13]，少见单一链霉菌能够产生多种类型多糖降解酶的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株来源于植物药材川贝母根系土壤中的能降解、利用多种不同类型多糖的链霉菌及其培养方法与应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.12351。
链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，革兰氏染色阳性，在固体培养基上观测，菌落呈花朵状，中间肉状凸起，较湿润，边缘呈放射状且干燥，能产生黄色素，如图1A所示；采用普通光学显微镜和扫描电镜观察气生菌丝生长丰茂，分枝较多，呈树枝状，孢子呈长圆形，如图1B所示。用于菌体形态观察的固体培养基为TSB固体培养基，组分如下：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂20g/L，余量水，pH7.2。
链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，经测定，其16S rRNA的基因序列长度为1448bp，如SEQ ID NO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，本发明的菌株的16S rRNA的基因序列与NCBI注册的链霉菌标准菌株(Streptomyces)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。经比对，与标准菌株Streptomyces cyaneofuscatus ATCC 19746，Streptomyces griseusATCC 23345亲缘关系最近，相似度分别为99.2％、99.5％，但是上述标准菌株未见能够降解多种多糖的报道。
链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，采用16S rRNA基因***发育树构建方法：应用MEGA6.0软件包中的Clustal W对测得的16S rRNA基因序列以及基因库中的相似序列，一起进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建***发育树，并进行1000次Bootstraps检验，获得统计树，结果如图3所示。结果表明，CB16菌株与链霉菌属的模式菌株聚类，且位于该分支内部。因此，将CB16菌株鉴定至链霉菌属。
上述16S rRNA基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，连接到pEASY-Blunt Simple CloningVector，转化E.coli DH5α感受态细胞。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将所得序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对。
上述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株的培养方法，步骤如下：
(1)取链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株划线于固体培养基上，25～30℃倒置活化培养3～7天，制得活化后菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，摇床培养3～7天，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，扩大培养3～7天，制得链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的固体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g，水定容至1L，pH7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(2)和(3)中的液体培养基，每升组分如下：
碳源1～20g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、KNO3 1g、FeSO4 0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g，水定容至1L，pH值6.5～7.5。
根据本发明进一步优选的，所述的碳源选自：纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、几丁质、壳聚糖、淀粉、果胶、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E或黄原胶之一。
根据本发明优选的，所述液体培养基每升组分如下：
胰蛋白胨17g、植物蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH 7.2。
上述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株在降解复合型多糖中的应用。
一种复合型多糖降解酶制剂的制备方法，步骤如下：
(i)取上述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌液，按1～10％的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～220转/分钟的条件下，扩大培养3～7天，制得链霉菌CB16菌株发酵液；
(ii)取步骤(i)制得的链霉菌CB16菌株的发酵液，固液分离，取液体，加入硫酸铵，使饱和度为80％，离心后收集80％硫酸铵饱和度下所得沉淀，并用20～50倍体积的TGE缓冲液重悬沉淀，透析去除硫酸铵，制得复合型多糖降解酶制剂。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中的发酵培养基为高氏Ⅱ号培养基，每升组分如下：
可溶性淀粉20g，葡萄糖20g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏10g，CaCO3 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水定容至1L，pH7.0。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，固液分离为离心，条件为：12000×g、4℃离心5～20min。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，离心为：15,000×g，4℃离心5～20min。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，TGE缓冲液组分如下：
50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM二硫苏糖醇(DTT)，5.0％体积百分比的甘油(Glycerol)，余量水，pH 7.9。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，透析为采用分子截留量10,000Da的透析袋，进行搅拌透析。
有益效果
本发明首次从高山川贝母根系土壤中分离获得一株链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，该菌株能以陆地植物、海藻、动物以及微生物来源的多种类型的多糖为唯一碳源生长(图2)，所产多糖降解酶的种类丰富，是一株多能型多糖降解菌，利用该菌株制备的复合型多糖降解酶制剂可降解植物、海藻、动物和微生物多糖，尤其对来源于高等动物***的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E降解活性显著(图4)，具有潜在的应用价值，这与现有已知的链霉菌(Streptomyces sp.)功能完全不相同。
附图说明
图1、链霉菌CB16菌株的基本形态学特征照片；
其中，A、培养3天、6天和10天后菌株在TSB培养基上的菌落形态；
B、左图为光学显微镜照片，中图和右图为电镜照片；
图2、链霉菌CB16菌株在唯一碳源培养基中生长的最高菌体浓度柱状图；
图3、链霉菌CB16菌株基于16S rRNA基因序列绘制的进化树；
图4、链霉菌CB16菌株复合型多糖降解酶制剂对多糖降解能力的分析柱状图；
图5、复合型多糖降解酶制剂降解透明质酸所得产物的HPLC分析曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1、川贝母根系土壤微生物的分离与纯化
取川贝母根系土壤浸出液，上清液1mL加入到9mL无菌水中，分别稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液与50℃左右的高氏Ⅰ号培养基充分混匀，每个浓度做两个平行，28℃培养7天。将形态较为典型的放线菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于TSB液体培养基中，28℃、200转/分钟培养3天，取培养物1.6ml加入400μl甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。
上述TSB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH7.2。
高氏Ⅰ号培养基，每升组分如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 10g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，MgSO4 0.5g，琼脂15g，重铬酸钾0.1g，水定容至1L，pH7.2～7.4。
实施例2、多糖降解菌的筛选
把实施例1中所得到的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基上，200转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到TSB固体培养基上培养，并保种记为CB16。
上述唯一碳源培养基的配制方法是：
向离子培养基中分别添加多糖底物至终浓度为0.10％(w/v)；
上述多糖底物选自：纤维素，羧甲基纤维素，木聚糖，甘露聚糖，几丁质，壳聚糖，淀粉，果胶，琼脂糖，海藻酸钠，透明质酸，硫酸软骨素A，硫酸软骨素C，硫酸软骨素E，硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素或黄原胶；在115℃高压灭菌20min。
上述离子培养基，每升组分如下：
NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、KNO3 1g、FeSO4 0.01g、MgSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水定容至1L，调pH值7.2～7.4。
如图1，所述的链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，革兰氏染色阳性，在固体培养基上的菌落呈花朵状，中间肉状凸起较湿润，边缘呈放射状且干燥，能产生色素，气生菌丝生长丰茂，分枝较多，呈树枝状，孢子呈长圆形。
如图2所示，上述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，不仅能利用陆生高等植物来源的多糖，如：微晶纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果胶；也能利用海藻来源的多糖，如：褐藻胶；还能够利用动物来源的多糖，尤其是来源于高等动物***的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E，以及来源于甲壳动物的几丁质和壳聚糖；另外，对于来源于微生物的黄原胶，降解利用能力显著。通过对链霉菌CB16菌株的多糖利用能力分析，CB16菌株能够在至少14种唯一碳源培养基中生长，说明该菌株是一株多糖降解菌。
将上述分离获得的链霉菌属(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.12351。
实施例3、链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株基于16S rRNA基因的分子鉴定
利用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株基因组DNA，以菌株基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，转化到E.coli DH5α。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对，应用MEGA6.0构建***发育树。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的通用引物为：
正向引物为27f：5’-AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’；
反向引物为1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的反应体系如下，总体积30μL：
所用基因扩增试剂购自大连宝生物技术有限公司。
上述用于菌株16S rRNA基因扩增的程序为：
94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸90S，共35个循环；72℃延伸15min；降温至4℃并保温15min。
上述基于16S rRNA基因***发育树构建方法：
应用MEGA6.0软件包中的Clustal W对测得的16S rRNA基因序列以及基因库中的相似序列，一起进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建***发育树，并进行1000次Bootstraps检验，获得统计树。
结果如图3所示，本发明筛选到的CB16菌株与标准菌株Streptomycescyaneofuscatus ATCC 19746，Streptomyces griseus ATCC 23345亲缘关系最近，16SrRNA基因之间的相似度分别为99.2％、99.5％。且基于16S rRNA基因构建所得的统计树表明，CB16菌株与链霉菌属的模式菌株聚类，位于该分支内部。因此，CB16菌株被鉴定至链霉菌属。
实施例4、链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株复合型多糖降解酶制剂的制备
(1)从-80℃冰箱划线链霉菌CB16菌株于TSB固体培养基上，28℃倒置培养4天；
(2)挑取CB16单菌落至TSB液体培养基中，在温度为28℃、转速为200转/分钟的条件下，摇床培养4天，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液，按1％的体积百分比接种于高氏II号液体培养基中，在温度为28℃、转速为220转/分钟的条件下，扩大培养6天，制得链霉菌CB16菌株发酵液；
(4)取步骤(3)制得的链霉菌CB16菌株的发酵液，用无菌纱布过滤去除大部分菌体，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使饱和度为80％，15000×g、4℃离心20min后收集80％硫酸铵饱和度下所得沉淀，用20倍体积的TGE缓冲液重悬沉淀，并使用分子截留量为10,000Da的透析袋透析，以去除硫酸铵，制得胞外酶制剂。
所述步骤(1)、(2)中的TSB培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH7.2；固体培养基中还加入了质量浓度为2％的琼脂。
上述用于菌株发酵的培养基为高氏Ⅱ号培养基，每升组分如下：
可溶性淀粉20g/L，葡萄糖20g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏10g/L，CaCO3 0.5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，水定容至1L，pH7.0。
所述的固液分离方法为离心，条件为：12,000×g，4℃离心10min。
上述TGE缓冲液的组分如下：
50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM二硫苏糖醇(DTT)，5.0％体积百分比的甘油(Glycerol)，余量水，pH 7.9。
所述的透析，使用分子截留量为10,000Da的透析袋，在低温环境中对20～50倍体积的TGE缓冲液进行搅拌透析。
实施例5、复合型多糖降解酶制剂对不同多糖降解能力的分析
将浓度3mg/mL的多糖底物、复合型多糖降解酶制剂、PBS缓冲液以及水按2：1：2：1(体积比)的比例混合后，在30℃、pH7.4下反应12h，沸水浴中温育10min使酶失活，12,000×g，4℃离心10min，取上清，作为复合型多糖降解酶制剂的酶解产物，用DNS法检测生成的还原糖。
结果如图4所示，链霉菌CB16菌株制备的复合型多糖降解酶制剂不仅能降解陆生高等植物来源的多糖，如：微晶纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果胶；也能降解海藻来源的多糖，如：褐藻胶；还能够降解动物来源的多糖，尤其是对来源于高等动物***的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E具有较高降解活性；另外，对于来源于微生物的黄原胶，也具有一定的降解能力。因此，利用链霉菌CB16菌株制备的复合型多糖降解酶制剂可降解多种多糖，对来源于高等动物***的透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E降解活性显著，具有潜在的应用价值。
实施例6、复合型多糖降解酶制剂降解透明质酸所得产物的HPLC分析
将浓度3mg/mL的透明质酸、复合型多糖降解酶制剂、PBS缓冲液以及水按2：1：2：1(体积比)的比例混合后，在30℃、pH7.4的条件下反应12h，沸水浴中温育10min使酶失活，12,000×g，4℃离心10min，取上清，作为复合型多糖降解酶制剂的酶解产物。用沸水浴预先灭活的酶，进行对照组实验。
取上述酶解产物20μL进行高效液相(HPLC)分析，所用凝胶柱为Superdexpeptide10/300GL(GE)，流动相为0.2M碳酸氢铵，流速为0.4mL/min；检测条件为UV232nm。
结果如图5所示，复合型多糖降解酶制剂与透明质酸的反应产物中，主产物的出峰时间约为42min，提示是不饱和的透明质酸二糖。对照组的产物中检测不到具有特征吸收的成分。因此，用链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株制备的复合型多糖降解酶制剂，可用于生产透明质酸二糖。
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<120> 一株链霉菌属多糖降解菌及其培养方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> Streptomyces sp.
<400> 1
cgtcccaatc gccagtccca ccttcgacag ctccctccca caaggggttg ggccaccggc 60
ttcgggtgtt accgactttc gtgacgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat 120
tcaccgcagc aatgctgatc tgcgattact agcaactccg acttcatggg gtcgagttgc 180
agaccccaat ccgaactgag accggctttt tgagattcgc tccgcctcgc ggcatcgcag 240
ctcattgtac cggccattgt agcacgtgtg cagcccaaga cataaggggc atgatgactt 300
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ccgaagggca tgctggcaac acagaacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac 420
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accatctctg atgctttccg gtatatgtca agccttggta aggttcttcg cgttgcgtcg 540
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cgttcgtc 1448

Claims (13)

1.一株链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株，2016年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.12351。
2.权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株的培养方法，其特征在于，步骤如下：
（1）取链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株划线于固体培养基上，25～30℃倒置活化培养3~7天，制得活化后菌株；
（2）取步骤（1）制得的活化后菌株接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，摇床培养3～7天，制得种子液；
（3）取步骤（2）制得的种子液，按1～10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，扩大培养3～7天，制得链霉菌(Streptomycessp.)CB16菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的固体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，磷酸二氢钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g，水定容至1L，pH7.2。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）和（3）中的液体培养基，每升组分如下：
碳源1～20g、NaCl 0.5g、K2HPO4 0.5g、KNO3 1g、FeSO4 0.01g、MgSO4·7 H2O 0.5 g，水定容至1L，pH值6.5～7.5。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的碳源选自：纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、几丁质、壳聚糖、淀粉、果胶、海藻酸钠、透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E或黄原胶之一。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基每升组分如下：
胰蛋白胨17g、植物蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸二氢钾2.5g、葡萄糖2.5g，水定容至1L，pH7.2。
7.权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌株在降解复合型多糖中的应用；
所述复合型多糖选自微晶纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉、果胶、褐藻胶、透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E、几丁质、壳聚糖和/或黄原胶。
8.一种复合型多糖降解酶制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（i）取权利要求2所述链霉菌(Streptomyces sp.)CB16菌液，按1～10%的体积百分比接种于发酵培养基中，在温度为25～30℃、转速为150～220转/分钟的条件下，扩大培养3～7天，制得链霉菌CB16菌株发酵液；
（ii）取步骤（i）制得的链霉菌CB16菌株的发酵液，固液分离，取液体，加入硫酸铵，使饱和度为80%，离心后收集80%硫酸铵饱和度下所得沉淀，并用20～50倍体积的TGE缓冲液重悬沉淀，透析去除硫酸铵，制得复合型多糖降解酶制剂；
所述复合型多糖选自微晶纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉、果胶、褐藻胶、透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素E、几丁质、壳聚糖和/或黄原胶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（i）中的发酵培养基为高氏Ⅱ号培养基，每升组分如下：
可溶性淀粉20g，葡萄糖 20g，牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 10g，CaCO3 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水定容至1L，pH7.0。
10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，固液分离为离心，条件为：12000×g、4℃离心5～20min。
11.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，离心为：15,000×g，4℃离心5~20min。
12.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，TGE缓冲液组分如下：
50mM Tris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM二硫苏糖醇，5.0%体积百分比的甘油，余量水，pH7.9。
13.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，透析为采用分子截留量10,000Da的透析袋，进行搅拌透析。
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Denomination of invention: A Streptomyces polysaccharide degrading bacterium and its cultivation method and application

Effective date of registration: 20230816

Granted publication date: 20190528

Pledgee: Shandong Tengzhou Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: TENGZHOU WUTONG AROMA CHEMICALS CO.,LTD.

Registration number: Y2023980052326

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