CN107287254B - γ-聚谷氨酸的发酵工艺 - Google Patents
γ-聚谷氨酸的发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种γ‑聚谷氨酸的发酵工艺，包括：S1：制备枯草芽孢杆菌种子液；S2：将枯草芽孢杆菌种子液接种于液态发酵培养基中，于37℃、120r/min摇瓶培养12‑16h后，得发酵液；采用频率为10‑20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液3‑5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养96h；S3：对发酵液进行提取、纯化，得到γ‑聚谷氨酸。本发明具有节省成本、产率高的优点，可广泛应用于微生物发酵技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地说，本发明涉及一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺。
背景技术
γ-聚谷氨酸在医药、食品、农业等领域均有广泛的应用，其经济价值不言而喻。在现有技术中，生产γ-聚谷氨酸的主流方法是微生物发酵法。γ-聚谷氨酸产生菌主要有四种：枯草(纳豆)芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐高温芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。尽管对微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸进行了大量研究，但γ-聚谷氨酸的产率仍然不乐观。产率低导致γ-聚谷氨酸的生产成本高，限制了γ-聚谷氨酸的生产与应用。由于γ-聚谷氨酸生物合成的机理至今尚不明确，代谢途径复杂，目前提高γ-聚谷氨酸产率主要依靠选育优良菌种和优化发酵工艺。因此，提高γ-聚谷氨酸的产率是大规模生产与应用亟待解决的重要课题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种节省成本、产率高的γ-聚谷氨酸的发酵工艺。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括：S1：制备枯草芽孢杆菌种子液；S2：将枯草芽孢杆菌种子液接种于液态发酵培养基中，于37℃、120r/min摇瓶培养12-16h后，得发酵液；采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液3-5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养96h；S3：对发酵液进行提取、纯化，得到γ-聚谷氨酸；其中，制备肽聚糖冷冻胶囊的具体的步骤为：S4：按质量比3:1将肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入质量为肽聚糖2倍的磁化水搅拌，以冷却速度3℃/min降至4℃，于磁场强度为0.45T的磁场环境保温保持静置24h，得肽聚糖混合液；S5：然后将肽聚糖混合液分装到多个淀粉胶囊壳内，其中每个淀粉胶囊壳盛装3g步骤s4得到的肽聚糖混合液；S6：再以冷却速度5℃/min将盛装肽聚糖混合液的淀粉胶囊壳冷却至-12℃，保温6h，得肽聚糖冷冻胶囊。
优选地，所述液态发酵培养基的碳源浓度为10-15g/L。
优选地，所述的γ-聚谷氨酸的发酵工艺还包括补料工艺，所述补料工艺的具体步骤为：在S2中将发酵液低温保存后，添加补料维持发酵液中碳源浓度为40-60g/L。
优选地，所述补料为甘油和麦芽糖的混合物。
优选地，所述补料工艺的补料次数为两次；第一次补料时间为：在S2中将发酵液低温保存后；第二次补料与第一次补料的间隔时间为36-40h。
优选地，发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊的具体步骤为：步骤一:制备预冷至-12℃的肽聚糖冷冻胶囊；步骤二:将发酵液在4℃静置20分钟后，在超净台中按1颗/15min向发酵液中逐步加入步骤一得到肽聚糖冷冻胶囊4颗，边加入边轻轻摇动；步骤三：将发酵液放置入20℃的培养箱静置20分钟；步骤四:将发酵液30°培养箱中静置20分钟。
优选地，超声30s的具体步骤为：S7：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液2s；S8：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液3s；S9：采用频率为20Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液15s；S10：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s；S11：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s。
优选地，制备甘油和麦芽糖的混合物的过程为：S12：将质量份数为10的水预热至60℃，将质量份数为1的麦芽糖缓慢加入到水中，边加边搅拌至麦芽糖完全溶解后冷却到室温后抽滤，得到第一混合溶液；S13：将S12中得到的第一混合溶液与质量分数为1的甘油完全混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液放置在37°培养箱备用。
本发明至少包括以下有益效果：
一、与现有技术相比较，本发明的γ-聚谷氨酸的产率高，且使用的设备及试剂均是实验室常用的，故发明是一种节省成本的γ-聚谷氨酸的发酵工艺。
二、与现有技术相比较，本发明的γ-聚谷氨酸的产率高达45g/L，故发明是一种节省成本的γ-聚谷氨酸的发酵工艺。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验工艺，如无特殊说明，均为常规工艺，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，包括：S1：制备枯草芽孢杆菌种子液；S2：将枯草芽孢杆菌种子液接种于液态发酵培养基中，于37℃、120r/min摇瓶培养12-16h后，得发酵液；采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液3-5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养96h；S3：对发酵液进行提取、纯化，得到γ-聚谷氨酸；其中，制备肽聚糖冷冻胶囊的具体的步骤为：S4：按质量比3:1将肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入质量为肽聚糖2倍的磁化水搅拌，以冷却速度3℃/min降至4℃，于磁场强度为0.45T的磁场环境保温保持静置24h，得肽聚糖混合液；S5：然后将肽聚糖混合液分装到多个淀粉胶囊壳内，其中每个淀粉胶囊壳盛装3g步骤s4得到的肽聚糖混合液；S6：再以冷却速度5℃/min将盛装肽聚糖混合液的淀粉胶囊壳冷却至-12℃，保温6h，得肽聚糖冷冻胶囊。本发明在发酵过程中，用超声波处理发酵液，可以延长枯草芽孢杆菌处于对数期及稳定期的时间；并且在超声波处理发酵液后，用低温保存的方法，延缓枯草芽孢杆菌的增殖速率及代谢速率，让其短暂处于修养状态，并且在低温保存过程中加入肽聚糖刺激细胞膜的修复，并且在低温处理后加入补料，补充发酵液的碳源，以免发酵时间延长引起碳源不足，导致细胞提前进入衰亡期。本发明将肽聚糖制备成肽聚糖冷冻胶囊，并且让其保存在-12℃低温状态，而且在制备肽聚糖冷冻胶囊的过程中混合了魔芋粉，都是为了让肽聚糖在加入到发酵液后，能缓慢释放，以免复杂的发酵液成分对肽聚糖的破坏。同时，降温的过程是一个阶段性降温过程，先降温至4℃，是为了防止一次性降温温差大导致肽聚糖的析出。在将温度从常温降到4℃采用的是3℃/min的快速冷却是为了加快试验进度，从4℃降温至-12℃采用的是5℃/min的快速冷却，一方面是为了加快试验进度，另一方面是为了快速通过最大冰晶区，防止冰晶破坏肽聚糖和魔芋粉形成的凝胶状态。在肽聚糖和魔芋粉形成凝胶状态后，将其置于磁场强度为0.45T的磁场环境保温保持静置24h，是为了在凝胶的结构不会损坏的情况下，让肽聚糖和魔芋粉结合力更大。制备肽聚糖冷冻胶囊使用的试剂均为无菌，且制备环境也为无菌，制备出的肽聚糖冷冻胶囊也是无菌。
所述液态发酵培养基的碳源浓度为10-15g/L。在发酵前期，枯草芽孢杆菌处于迟缓期，代谢不旺盛，需要的碳源较少，故处于成本的考虑，将液态发酵培养基的碳源浓度设定在10-15g/L。
所述的γ-聚谷氨酸的发酵工艺还包括补料工艺，所述补料工艺的具体步骤为：在S2中将发酵液低温保存后，添加补料维持发酵液中碳源浓度为40-60g/L。液态发酵培养基的碳源浓度设定在10-15g/L，而经过迟缓期碳源基本被耗尽，在细胞进入对数期后，碳源的浓度需要在40-60g/L，才能维持其稳定增长。加入的补料影响发酵的产率，加入补料的体积越小越好。
所述补料为甘油和麦芽糖的混合物。碳源选择甘油和麦芽糖是本发明的一个优选方案，但不仅仅限于此，凡是可以达到补充碳源目的的碳源均在本发明的保护范围内。
所述补料工艺的补料次数为两次；第一次补料时间为：在S2中将发酵液低温保存后；第二次补料与第一次补料的间隔时间为36-40h。在发酵液低温保存后，枯草芽孢杆菌逐步进入对数生长期，为了维持其生长，需要在此时补料。而枯草芽孢杆菌在经过对数生长期后，对碳源的耗费也较大，如果不及时补充碳源会导致其快速进入衰亡期，因此在第一次补料后，间隔36-40h进行第二次补料，第二次补料也维持发酵液中的碳源浓度为40-60g/L。
发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊的具体步骤为：步骤一:制备预冷至-12℃的肽聚糖冷冻胶囊；步骤二:将发酵液在4℃静置20分钟后，在超净台中按1颗/15min向发酵液中逐步加入步骤一得到肽聚糖冷冻胶囊4颗，边加入边轻轻摇动；步骤三：将发酵液放置入20℃的培养箱静置20分钟；步骤四:将发酵液30°培养箱中静置20分钟。在加入肽聚糖冷冻胶囊前将发酵液冷却至4℃，延缓枯草芽孢杆菌的增殖速率及代谢速率，让其短暂处于修养状态，同时，便于其适应肽聚糖冷冻胶囊的温度，加入肽聚糖冷冻胶囊让其逐步升温，让其逐步适应发酵温度。
超声30s的具体步骤为：S7：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液2s；S8：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液3s；S9：采用频率为20Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液15s；S10：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s；S11：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s。逐步提高超声波频率，让枯草芽孢杆菌逐步适应超声波的刺激，在超声波达到最大频率处理后，再逐渐降低超声波频率，让其逐步适应无超声波刺激的环境，这种梯度设置都是为了保护枯草芽孢杆菌。
制备甘油和麦芽糖的混合物的过程为：S12：将质量份数为10的水预热至60℃，将质量份数为1的麦芽糖缓慢加入到水中，边加边搅拌至麦芽糖完全溶解后冷却到室温后抽滤，得到第一混合溶液；S13：将S12中得到的第一混合溶液质量分数为1的甘油完全混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液放置在37℃培养箱备用。将用于溶解麦芽糖的水预热到60℃，加快麦芽糖溶解的速率，该种方式比将麦芽糖投入到水中再逐步加热溶解的方法受热均匀，避免了出现局部温度过高破坏麦芽糖的情况。麦芽糖、水、甘油的质量份数比为1:10:1，仅仅是本发明的优选方案。将第二混合溶液放入37℃的环境中，避免补料的加入对发酵液温度的影响。
本发明实施例一：
(1)种子液的制备
生产γ-聚谷氨酸采用的枯草芽孢杆菌。种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，其余为蒸馏水或自来水，装液量50mL/250mL三角瓶，在121℃灭菌30min，冷却后，取一环预先保存于斜面培养基的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，在37℃、120r/min摇瓶培养24h，即成枯草芽孢杆菌种子液。
(2)摇瓶发酵培养
所述液态发酵培养基的成分：蛋白胨3g/L，柠檬酸1g/L，葡萄糖6g/L，谷氨酸15g/L，NH4Cl 7g/L，K2HPO4 0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.04g/L，CaCl2 ·2H2O0.15g/L，MnSO4·H2O 0.104g/L，初始pH值为7.0。枯草芽孢杆菌种子液按1％～6％接种量接种于液态发酵培养基，装液量1L/3L塑料摇瓶，37℃、120r/min摇瓶培养12h，采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液3min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养36h后第二次补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养60h终止。
其中，所述补料为甘油和麦芽糖的混合物，在S2中将发酵液低温保存及第二次补料后，添加补料维持发酵液中碳源浓度为40g/L。
(3)γ-聚谷氨酸的提取
将发酵液于3000r/min下离心30min，上清液用1mol/L HCl调pH到3.0，加入4倍体积的95％乙醇，放于4℃下冰箱内过夜。然后于3000r/min下离心30min，用乙醇洗涤沉淀物，收集粘性沉淀物，干燥得γ-聚谷氨酸产品，所得γ-聚谷氨酸的产率为38g/L。
本发明实施例二：
(1)种子液的制备，同上。
(2)摇瓶培养
所述液态发酵培养基的成分：蛋白胨4g/L，柠檬酸1.5g/L，葡萄糖7g/L，谷氨酸15g/L，NH4Cl 7g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.04g/L，CaCl2·2H2O 0.15g/L，MnSO4·H2O 0.104g/L，初始pH值为7.0。枯草芽孢杆菌种子液按1％～6％接种量接种于液态发酵培养基，装液量1L/3L塑料摇瓶，37℃、120r/min摇瓶培养14h，采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液4min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养38h后第二次补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养58h终止。
其中，所述补料为甘油和麦芽糖的混合物，在S2中将发酵液低温保存及第二次补料后，添加补料维持发酵液中碳源浓度为50g/L。
(3)γ-聚谷氨酸的提取，同上，所得γ-聚谷氨酸的产率为41g/L。
本发明实施例三：
(1)种子液的制备，同上。
(2)摇瓶培养
所述液态发酵培养基的成分：蛋白胨5g/L，柠檬酸2g/L，葡萄糖8g/L，谷氨酸15g/L，NH4Cl 7g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.04g/L，CaCl2·2H2O0.15g/L，MnSO4·H2O 0.104g/L，初始pH值为7.0。枯草芽孢杆菌种子液按1％～6％接种量接种于液态发酵培养基，装液量1L/3L塑料摇瓶，37℃、120r/min摇瓶培养16h，采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养40h后第二次补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养56h终止。
其中，所述补料为甘油和麦芽糖的混合物，在S2中将发酵液低温保存及第二次补料后，添加补料维持发酵液中碳源浓度为60g/L。
(3)γ-聚谷氨酸的提取，同上，所得γ-聚谷氨酸的产率为45g/L。
对比例：
现有γ-聚谷氨酸的发酵工艺中，γ-聚谷氨酸的平均产率为33g/L。
| γ-聚谷氨酸的产率(g/L) | |
| 实施例一 | 38 |
| 实施例二 | 41 |
| 实施例三 | 45 |
| 对比例 | 33 |
由表格可知，本发明的三个实施例的产率均比对比例高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (1)
1.一种γ-聚谷氨酸的发酵工艺，其特征在于，包括：
S1：制备枯草芽孢杆菌种子液；
S2：将枯草芽孢杆菌种子液接种于液态发酵培养基中，于37℃、120r/min摇瓶培养12-16 h后，得发酵液；
采用频率为10-20Khz且功率为5W/mL的超声波处理发酵液3-5min后，其中，所述超声波处理的具体步骤为：每超声30s后，间隔30s再次超声；
将超声波处理得到的发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊，补料，再继续37℃、120r/min摇瓶培养96h；
S3：对发酵液进行提取、纯化，得到 γ-聚谷氨酸；
其中，制备肽聚糖冷冻胶囊的具体的步骤为：
S4：按质量比3:1将肽聚糖和魔芋粉混合，向其中投入质量为肽聚糖2倍的磁化水搅拌，以冷却速度3℃/min降至4℃，于磁场强度为0.45T的磁场环境保温保持静置24h，得肽聚糖混合液；
S5：然后将肽聚糖混合液分装到多个淀粉胶囊壳内，其中每个淀粉胶囊壳盛装3g步骤s4得到的肽聚糖混合液；
S6：再以冷却速度5℃/min将盛装肽聚糖混合液的淀粉胶囊壳冷却至-12℃，保温6h，得肽聚糖冷冻胶囊；
所述液态发酵培养基的碳源浓度为10-15 g/L；
所述补料工艺的具体步骤为：在S2中将发酵液低温保存后，添加甘油和麦芽糖的混合物维持发酵液中碳源浓度为40-60g/L；
所述补料工艺的补料次数为两次；第一次补料时间为：在S2中将发酵液低温保存后；第二次补料与第一次补料的间隔时间为36-40h；
所述发酵液低温保存并加入肽聚糖冷冻胶囊的具体步骤为：
步骤一:制备预冷至-12℃的肽聚糖冷冻胶囊；
步骤二:将发酵液在4℃静置20分钟后，在超净台中按1颗/15min向发酵液中逐步加入步骤一得到肽聚糖冷冻胶囊4颗，边加入边轻轻摇动；
步骤三：将发酵液放置入20℃的培养箱静置20分钟；
步骤四：将发酵液在30℃培养箱中静置20分钟；
所述超声30s的具体步骤为：
S7：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液2s；
S8：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液3s；
S9：采用频率为20Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液15s；
S10：采用频率为15Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s；
S11：采用频率为10Khz且功率为5W/mL的超声波发酵液5s；
制备甘油和麦芽糖的混合物的过程为：
S12：将质量份数为10的水预热至60℃，将质量份数为1的麦芽糖缓慢加入到水中，边加边搅拌至麦芽糖完全溶解后冷却到室温后抽滤，得到第一混合溶液；
S13：将S12中得到的第一混合溶液与质量分数为1的甘油完全混合得到第二混合溶液，将第二混合溶液放置在37℃培养箱备用。
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| KR20140044161A (ko) * | 2012-10-04 | 2014-04-14 | 계명대학교 산학협력단 | 고초균과 젖산균을 이용한 이단발효를 통한 γ-ＰＧＡ와 ＧＡＢＡ가 증진된 발효물 제조방법 |
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|---|
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