CN101838619A - 一株大量产生γ-聚谷氨酸的诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091 - Google Patents
一株大量产生γ-聚谷氨酸的诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091 Download PDFInfo
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Abstract
本发明利用复合诱变技术筛选获得一株γ-聚谷氨酸高产菌株TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336)，该菌株是以从原产我国四川省的豆豉中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007为出发菌株经紫外线诱变后得到的，在优化条件下γ-聚谷氨酸产量达到17.5±2.1g/L。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生γ-聚谷氨酸的诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091及其培养方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamic acid)，γ-PGA]，是由L-谷氨酸[L-Glu]、D-谷氨酸[D-Glu]通过γ-酰胺键结合形成的一种高分子氨基酸聚合物。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。γ-聚谷氨酸作为一种高分子聚合物，具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如生物可降解性、良好生物相容性、强保水性、对人体无毒害等特性。这些特性决定了γ-聚谷氨酸在农业、食品、医药、环保、化妆品工业、烟草、皮革制造工业和植物种子保护等领域的广泛用途。
γ-聚谷氨酸是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到得聚谷氨酸之一。PGA在1937年首次在炭疽芽孢杆菌的芽孢中被发现(
novics and Bruckner1937；
novics and
s 1937)。1942年Bovamick等人发现有些芽孢杆菌属细菌能通过发酵培养积累聚谷氨酸，许多研究就此代谢产物而开展。1973年Troy发现γ-聚谷氨酸(以下简称γ-PGA)是Bacillus anthracis细胞夹膜的一种化学组分，它是一种水溶性的酰胺化合物，可以通过芽抱杆菌的变种来生产。目前日本、韩国和美国等一些过年对γ-PGA发酵的研究处于世界领先水平，很多相关的生产工艺和技术已形成专利。其中，日本明治制果公司已实现了γ-PGA商业化生产，并逐步推广其应用。近年来，国外已经开始利用分子生物学和代谢工程的理论和技术进行γ-PGA合成相关基因和相关合成酶的研究。到目前为止，生物合成γ-PGA的详细机制还不是很清楚。尽管如此国内对发酵生产γ-PGA的研究起步较晚，虽然最近的几年内取得了很大的进展，但较国外的研究水平还有很大的差距。因此加强γ-聚谷氨酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究平台，具有重要的理论价值和应用价值。
目前合成γ-PGA的主要方法是化学合成法、提取法和微生物液态发酵法等。化学合成法应用于PGA的合成，面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低。由于PGA作为一种高分子聚合物，其许多物理化学性质与分子量密切相关，采用化学合成法得到的PGA分子量较低，而提高产物分子量必将大大降低产率，因此，该方法不具备实际应用价值。提取法由于本产品固有的特性，使得提取工艺复杂，成本较高，无法大规模生产。γ-PGA的制备方法主要集中在微生物发酵合成，生物合成γ-PGA具有突出的优点，分子量高、生产条件温和、产物纯度较高，但微生物发酵生产γ-PGA产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。
本发明利用复合诱变技术筛选获得一株γ-聚谷氨酸高产菌株TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336；分类命名：地衣芽孢杆菌；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，提高γ-聚谷氨酸的产量，有效降低了生产成本，实现了γ-聚谷氨酸的工业化生产。
发明内容
本发明利用复合诱变技术筛选获得一株γ-聚谷氨酸高产菌株——地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336)，该菌株是以从原产我国四川省的豆豉中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007为出发菌株经紫外线诱变后得到的，本发明解决该技术问题所采用的技术方案为：
1.采用多组复合诱变技术选育γ-聚谷氨酸高产菌株
(1)选择生长良好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做106个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，将菌悬液梯度稀释涂平板，避光培养，计算致死率；
(2)根据(1)致死率选择高、中、低三个不同剂量的照射时间分别对菌株NXTK0007的孢子悬浮液进行紫外照射处理；
(3)然后把(2)三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，梯度稀释涂平板，避光培养；
(4)将(3)中的诱变菌株接种到以谷氨酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；
(5)将(4)中的种子液以10％接种量接种到以柠檬酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；
(6)将(5)中的种子液以10％接种量接种到以甘油为唯一碳源的发酵培养基中培养；
(7)取(6)中的种子液接种到发酵培养基的固体平板上培养，筛选培养基中菌落边缘较为整齐，有粘稠感，用接种环碰触有拉丝状，透明圈明显的菌株，即得高产聚谷氨酸诱变菌株；
(8)取(7)中得到的多株菌株接种到发酵培养基中，在37℃下，220r/m振荡培养3d，从中挑选得到聚谷氨酸高产菌株TKPG091。
2.地衣芽孢杆菌TKPG091的培养方法为：
(1)菌种活化：将斜面菌种——地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacilluslicheniformis)转接保藏培养基，37℃活化培养12-24h；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面作为种子，利用接种环接一环菌体与种子培养基中，于37℃，200～260r/m下培养1～2d，制得种子液；
(3)发酵培养：将(2)中的种子培养液以8～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在37℃下，220r/m振荡培养3～5d；
3.地衣芽孢杆菌TKPG091所用到的培养基为：
(1)保藏分离培养基：LB培养基：胰蛋白陈10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(2)种子培养基：K2HPO40.5g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，甘油20.0g/L，柠檬酸2.0g/L，L-谷氨酸4.0g/L，pH 7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)发酵培养基：L-谷氨酸20.0g/L，柠檬酸12.0g/L，甘油80.0g/L，NH4C17.0g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.04g/L，CaCl2.0.075g/L，MnSO4·H2O 0.104g/L，pH 7.4，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(4)选择培养基：
①L-谷氨酸30.0，NH4C17.0，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O0.04，CaCl2 0.075，MnSO4·H2O 0.104，蒸馏水1.0L，用1mol/L NaOH调pH 7.4，121℃灭菌15min。
②柠檬酸30.0，NH4Cl 7.0，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O0.04，CaCl2 0.075，MnSO4·H2O 0.104，蒸馏水1.0L，用1mol/L NaOH调pH 7.4，121℃灭菌15min。
③甘油30.0，NH4C17.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O 0.04，CaCl2 0.075，MnSO4·H2O 0.104，蒸馏水1.0L，用1mol/L NaOH调pH 7.4，121℃灭菌15min。
本发明与现有技术相比，有益效果是：本发明的诱变菌株TKPG091与常规γ-聚谷氨酸生产菌相比，其γ-聚谷氨酸生产能力更为高，并由此能够有效提高γ-聚谷氨酸的产率，降低生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1从土壤中筛选出的生产γ-聚谷氨酸的菌株地衣芽孢杆菌NXTK0007
1.菌体形态：菌体呈短杆状，菌体周围形成明显的荚膜，周生菌毛，并被粘液层包裹。菌体***方式二***繁殖，从中间逐渐形成隔膜，进而***成俩个形态，大小和构造完全相同的子细胞。芽孢生长在菌的中间或一侧。
2.菌落形态：在平板上，当培养基潮湿时，菌落大体上呈圆形，表面光滑，周围相对整齐，菌落不透明；当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，中间较为凹陷，边缘不规则。
3.培养特征：此菌为高耗氧菌，最适生长温度为28℃～40℃，最适生长pH6-8；在摇床转速200～250r/min，培养3-4d，pH 6～7时，聚谷氨酸产量最高。发酵过程中溶氧对聚谷氨酸的产生具有显著作用。
4.可以利用的碳源：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳源一般混合使用，不常用单一碳源。
实施例2以地衣芽孢杆菌NXTK0007为出发菌株采用多组复合诱变技术筛选菌株TKPG091
1.诱变菌株的获得
(1)选择生长良好的γ-聚谷氨酸生产菌株NXTK0007斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做106个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下，30cm处，分别照射10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，菌悬液梯度稀释涂平板，于37℃避光培养，计算致死率；
(2)选择40s、60s、80s三个不同剂量的照射时间分别对菌株NXTK0007的孢子悬浮液进行紫外照射处理；
(3)然后把三个不同照射时间的菌悬液混合均匀，进行10倍系列稀释10-1～10-6，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，37℃避光培养1～2d；
(4)将上述(3)中的诱变菌株接种到以谷氨酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；将种子液置于37℃恒温摇床，220r/m，振荡培养1～2d；
(5)将(4)中的种子液以10％接种量(v/v)接种到以柠檬酸为唯一碳源的发酵培养基中培养；
(6)将(5)中的种子液以10％(v/v)接种量接种到以甘油为唯一碳源的发酵培养基中培养；
(7)取(6)中的种子液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的菌悬浮液，并接种到发酵培养基固体平板上培养，筛选培养基中菌落边缘较为整齐，有粘稠感，用接种环碰触有拉丝状，透明圈明显的菌株；
(8)取(7)中得到的多株菌株接种到发酵培养基中，在37℃下，220r/m振荡培养3d，从中挑选得到聚谷氨酸高产菌株TKPG091。
发酵培养基成分为：L-谷氨酸20.0，柠檬酸12.0，甘油80.0，NH4Cl 7.0，K2HPO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O 0.04，CaCl2 0.075，MnSO4·H2O0.104，蒸馏水1.0L，pH 7.4，121℃灭菌15min.
培养条件：500mL摇瓶，装液量50mL，37℃，220r/m，振荡培养3～4d.
2.诱变菌株TKPG091的特性
(1)菌体形态：菌体呈短杆状，菌体周围形成明显的荚膜，菌体***方式二***繁殖，从中间逐渐形成隔膜，进而***成俩个形态，大小和构造完全相同的子细胞。芽孢生长在菌的中间或一侧。
(2)菌落形态：在平板上，当培养基潮湿时，菌落大体上呈圆形，面积较大，菌苔边缘整齐，菌落不透明且粘度大，用接种环碰触有拉丝状；当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，中间较为凹陷，边缘不规则。
(3)培养特征：37℃，180～220r/m下振荡培养60～72h，发酵液颜色较浅，稳定为秸秆黄色。
(4)可以利用的碳源：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳源一般混合使用，不常用单一碳源。
(5)可以分别以谷氨酸、柠檬酸、甘油为唯一碳源进行生长，并生长良好；
实施例3地衣芽孢杆菌TKPG091的培养
1.培养基的配制
保藏分离培养基：LB培养基：胰蛋白陈10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水配制，使用1mol/L NaOH调pH到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。
种子培养基成分：K2HPO4 0.5，柠檬酸铁铵0.5，MgSO4·7H2O 0.5，甘油20.0，柠檬酸2.0，L-谷氨酸4.0，蒸馏水1.0L，初始pH 7.4，121度灭菌15分钟，培养温度37℃。
发酵培养基：L-谷氨酸20.0，柠檬酸12.0，甘油80.0，NH4Cl 7.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeCl3·6H2O 0.04，CaCl2 0.075，MnSO4·H2O 0.104，蒸馏水1.0L，用1mol/L NaOH调pH 7.4，121℃灭菌15min，培养温度37℃。
2.菌种活化
将地衣芽孢杆菌转接TKGA091种子斜面培养基，于恒温培养箱中，37℃培养12～24h；
3.种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶(500mL三角瓶内装50mL的培养基)中，于37℃，220r/m下培养1～2d；
4.发酵培养
将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中(500mL内装50mL的培养基)，于37℃，220r/m下培养3d；
检测结果：地衣芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TKGA09在发酵培养基发酵生产γ-聚谷氨酸产量为17.5±2.1g/L。
Claims (3)
1.一株γ-聚谷氨酸高产菌株地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacillus licheniformis，该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3336)。
2.根据权利要求1所述的一株产生其特征在于：所述诱变菌株地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacillus licheniformis)是以从原产我国四川省的豆豉中筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株NXTK0007为出发菌株经紫外线诱变后得到的。
3.根据权利要求1所述一株γ-聚谷氨酸高产菌株地衣芽孢杆菌TKPG091(Bacilluslicheniformis)，其特征在于菌株的特征为：
(1)菌体形态：菌体呈短杆状，菌体周围形成明显的荚膜，菌体***方式二***繁殖，从中间逐渐形成隔膜，进而***成俩个形态，大小和构造完全相同的子细胞。芽孢生长在菌的中间或一侧。
(2)菌落形态：在平板上，当培养基潮湿时，菌落大体上呈圆形，面积较大，菌苔边缘整齐，菌落不透明且粘度大，用接种环碰触有拉丝状；当培养基干燥时，菌落粗糙皱褶，中间较为凹陷，边缘不规则。
(3)培养特征：37℃，180～220r/m下振荡培养60～72h，发酵液颜色较浅，稳定为秸秆黄色。
(4)可以利用的碳源：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、谷氨酸，上述碳源一般混合使用，不常用单一碳源。
(5)可以分别以谷氨酸、柠檬酸、甘油为唯一碳源进行生长，并生长良好。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Effective date: 20110829 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20110829 Address after: 300457 Tianjin city in the economic and Technological Development Zone, Road No. 29 Building No. 2 Applicant after: Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co., Ltd. Address before: 300457 No. thirteenth, 29 street, Tianjin economic and Technological Development Zone, Tianjin University of Science and Technology Applicant before: Tianjin University of Science & Technology |
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| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100922 |