CN104017739B - 复合微生物菌剂、其制备方法及其在生产高蛋白薯渣饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了复合微生物菌剂，是由酿酒酵母YB发酵菌液、黑曲霉‑李氏木霉发酵菌液混合得到的，并提供了其制备方法和其在生产高蛋白薯渣饲料中的应用。本发明的有益效果为：提供的复合微生物菌剂中，酿酒酵母YB菌株为重离子束诱变后选育出的高效价菌种，得出了薯渣发酵饲料在达到储存要求的水分含量的最佳烘干时间，获得薯渣发酵生物饲料产品；经微生物培养，产生大量菌体蛋白；经发酵作用，将马铃薯渣中的粗纤维、果胶等含量较高的成分降解，释放出许多活性物质，可转化为饲用菌体蛋白，使马铃薯渣的粗蛋白含量提高到可直接饲喂畜禽类动物的水平，也可利用菌种的发酵作用改善马铃薯渣的适口性，提高动物采食量，降低生产成本和提高养殖业经济效益。

Description

复合微生物菌剂、其制备方法及其在生产高蛋白薯渣饲料中 的应用

技术领域

本发明涉及饲料添加剂领域，具体涉及复合微生物菌剂、其制备方法及其在生产高蛋白薯渣饲料中的应用。

背景技术

随着经济的发展，我国的消费水平也在逐步提高，人们对肉、奶、蛋的需求也在大幅度增加，但是我国的人均蛋白摄取量很低，不足世界人均水平的一半。种植业可以提供植物性蛋白，例如农作物秸秆、大豆饼粕、玉米粉等，养殖业可以提供动物性蛋白，例如鱼粉、肉骨粉等，虽然数量巨大，但是这些蛋白资源的总量大约仅可以满足我国畜牧业蛋白饲料需求量的一半左右。我国蛋白资源匾乏，因此需要积极探寻新的蛋白资源种类与来源，而微生物技术的发展，为蛋白饲料的生物转化提供了技术支持。

马铃薯为茄科属一年生草本植物，作为世界各国的主要经济作物之一，其种植业发展迅速，产量也是逐年上升，我国马铃薯种植面积和总产量已跃居至世界首位。

马铃薯渣是在马铃薯淀粉生产加工过程中，产生的一种主要成分为水、细胞碎片和残余淀粉颗粒的副产物。马铃薯渣含有动物生长所需要的粗蛋白等各种营养成分，只是含量比较低，而且适口性也比较差，直接饲喂的效果不是很好，如果经过微生物的发酵处理后，来提高其粗蛋白含量，改善适口性，马铃薯渣也是可以作为提供蛋白资源种类之一的。这对于缓解我国蛋白资源的匾乏现状，促进畜牧业的发展，提高我国人均蛋白摄取量是非常有意义。

马铃薯渣主要含水、果胶、粗纤维等多糖物质，其中蛋白质含量仅为1％-8％，淀粉含量小于10％。营养价值较低的薯渣利用大多局限于以鲜薯渣或晾干后的薯渣直接作为禽畜饲料，仅有少数薯渣烘干制成干饲料。然而烘干能耗较大，使得薯渣干饲料成本较高，生产难以长期维持，而且这种饲料的营养价值低，不能满足家畜对营养的均衡需求。鲜薯渣水分含量高达80％以上，不便于千燥和运输，生产季节时期若不能及时处理，占用场地而且容易腐败变质，造成资源浪费和环境污染。

在国外，马铃薯渣的研究则相对较为成熟，应用范围也较为广泛。除了与国内相似的处理方法外，研究更倾向于把薯渣做为一个整体，利用纤维、淀粉和蛋白质之间的相互作用，通过各种处理方法对其进行研究。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了针对马铃薯渣生物饲料制备的高效的复合微生物菌剂。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：复合微生物菌剂，是由酿酒酵母YB发酵菌液、黑曲霉-李氏木霉发酵菌液混合得到的；所述黑曲霉-李氏木霉发酵菌液是由黑曲霉和李氏木霉经种子瓶各自培养后，按照体积比黑曲霉发酵菌液：李氏木霉发酵菌液为1-3∶2-4混合得到的。

上述的复合微生物菌剂，所述酿酒酵母YB发酵菌液是将酿酒酵母YB菌株经种子瓶培养后得到的；所述酿酒酵母YB菌株是将酿酒酵母菌株经¹²C⁺⁶离子束辐照并选育得到的；所述酿酒酵母YB菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年6月29日，保藏编号为CGMCC No.5004。

进一步的，上述的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂中各组分的混合比例按照体积比为黑曲霉-李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4-6∶3-5。

进一步的，上述的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂中各组分的混合比例按照体积比为黑曲霉-李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4∶3或4∶4或4∶5或5∶3或6∶3。

本发明的第二个目的是提供了上述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将酿酒酵母菌株进行辐射诱变并选育，得到酿酒酵母YB菌株；

2)将酿酒酵母YB菌株、黑曲霉和李氏木霉分别置于马铃薯糖琼脂培养基上进行斜面培养；

3)将步骤2)得到经斜面培养后的黑曲霉和李氏木霉接种于黑曲霉和李氏木霉种子瓶培养基进行扩繁，黑曲霉和李氏木霉种子瓶菌液按照体积比黑曲霉：李氏木霉为1-3∶2-4，以5％接种量接种发酵瓶混合培养得到黑曲霉-李氏木霉混合发酵菌液，并加入保护剂；

4)将步骤2)得到的经斜面培养后的酿酒酵母YB菌株置于酵母种子瓶培养基中进行培养；得到酿酒酵母YB菌株培养液，并加入保护剂；

5)将步骤3)得到的黑曲霉-李氏木霉发酵菌液与步骤4)得到的酿酒酵母YB菌株培养液混合，得到混合菌液，混合比例为按照体积比黑曲霉-李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB菌株培养液为4-6∶3-5；

6)将步骤5)得到的带有保护剂的混合菌液冻干得到复合微生物菌剂。

进一步的，上述的复合微生物菌剂的制备方法，所述步骤1)中的辐射剂量为10Gy-130Gy。

进一步的，上述的复合微生物菌剂的制备方法，所述步骤1)中的辐射剂量为为90Gy。

进一步的，上述的复合微生物菌剂的制备方法，所述步骤3)和步骤4)中的保护剂为脱脂乳、甘油和维生素C，或脱脂乳、海藻糖和维生素C；所述保护剂的加入量为按照质量百分比脱脂乳10％、甘油6％、维生素C4％，或脱脂乳8％、海藻糖8％和维生素C4％。

进一步的，上述的复合微生物菌剂的制备方法，所述步骤5)中，黑曲霉-李氏木霉发酵菌液和酿酒酵母YB菌株培养液的混合比例为按照体积比黑曲霉-李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB菌株培养液为4∶3或4∶4或4∶5或5∶3或6∶3。

本发明的第三个目的是提供了上述的复合微生物菌剂在制备薯渣蛋白饲料中的应用，是按照如下步骤进行的：

a)将20重量份的马铃薯渣、2重量份的草粉、2重量份的甜高粱秸秆粉混合，得到薯渣发酵原料；

b)将复合微生物菌剂喷洒到薯渣发酵原料上，每100g薯渣发酵原料上喷洒0.5ml复合微生物菌剂，得到复合发酵底料；

c)将乳酸杆菌接入复合发酵底料中，接种比例为按照质量百分比1‰。

其中，所用到的菌种均由甘肃工业微生物菌种保存中心购买，具体为：

黑曲霉菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买；

李氏木霉菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买；

乳酸杆菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买；

酿酒酵母YB菌株：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买，同时，由于此菌株为中科院近代物理所生物物理实验室重离子辐照选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的，保藏日期为2011年6月29日，保藏编号为CGMCC No.5004，即甘肃工业微生物菌种保存中心和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心均可提供此菌株。

黑曲霉和李氏木霉混合培养的优势：混合培养不仅具有和单一培养相似的生物生产性力，而且混合培养液中木聚糖酶的活性比单一培养高得多，说明混合培养具有协同作用，使酶制剂含有丰富的纤维素酶和木聚糖酶，对纤维素和半纤维素同时能够有效地降解作用。此外，两种菌株混合培养在生产中可比单独培养减少一个发酵罐投入，降低设备投入成本，降低生产费用。

本发明的有益效果为：本发明提供的复合微生物菌剂、其制备方法及其在生产高蛋白薯渣饲料中的应用，具有如下优点：

1、由于新鲜马铃薯渣中水分含量过高，高于发酵要求的最高水分含量，采用了向薯渣中添加部分草粉的方法，既降低了薯渣中的草粉含量，又增加了复合微生物菌剂中黑曲霉、李氏木霉混合发酵液菌种的发酵底物，具有诱导纤维素酶产生作用；

2、马铃薯渣发酵底物中糖分含量很低，甜高粱秸秆中含有丰富糖份，糖含量可达16-24％，添加甜高粱秸秆可以给发酵底物提供微生物生长的碳源，促进添加复合微生物菌剂菌株生长，有利于提高饲料中菌体蛋白、活性成分及营养物质。

3、本发明所用的酿酒酵母YB菌株为重离子束诱变后选育出的高效价菌种；

4、针对性的做出了灭菌组与未灭菌组的对照，并模拟生产做了中试试验，此外，实验在薯渣发酵结束后做了烘干实验，得出了薯渣发酵饲料在达到储存要求的水分含量的最佳烘干时间，获得薯渣发酵生物饲料产品；

5、经过微生物培养，产生大量菌体蛋白；经发酵作用后，将马铃薯渣中的粗纤维、果胶等含量较高的成分降解，释放出许多活性物质，也可转化为饲用菌体蛋白，使马铃薯渣的粗蛋白含量提高到可以直接饲喂畜禽类动物的水平，并且也利用菌种的发酵作用来改善马铃薯渣的适口性，提高动物采食量，降低生产成本和提高养殖业的经济效益。

具体实施方式

实施例1：

一、酵母菌种的重离子束辐照诱变与选育实验

1.材料与方法

酿酒酵母菌株甘肃省工业微生物菌种保藏中心

2.实验步骤与方法

2.1菌种的活化

取已知效价且生产性能优良的酵母菌种一支，放置在恒温培养箱(30℃±0.6℃，30min)，使其活化。

2.2¹²C⁺⁶离子束穿透诱变

兰州重离子加速器国家实验室提供的¹²C⁺⁶离子束对酵母孢子悬浮液进行辐照诱变，辐照剂量分别为0Gy，10Gy，30Gy，50Gy，70Gy，90Gy，110Gy，然后将辐照过的孢子悬液梯度稀释，准确吸取稀释液的孢子悬液0.2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落。同时，以未辐照的出发菌株孢子悬液平板分离培养菌落作为对照。分离平板在30℃±0.6℃培养2天，将菌落直径大于对照平均菌落20％的作为正向突变菌株，研究辐照剂量与菌落大小正突变的关系，寻找优选繁殖能力强、生长旺盛的突变酵母菌株的最佳辐照剂量。辐照剂量与正突变率的关系如表1所示。

表1

辐照剂量	0Gy	10Gy	30Gy	50Gy	70Gy	90Gy	110Gy	130Gy
									正向突变菌落(％)	3.7	4.5	11.8	19.2	24.3	32.5	27	12.3

2.3高效价菌株的筛选

2.3.1平板筛选

2.3.1.1平板初筛

在记录好菌落个数、形态、大小，挑选分离平板上孢子丰满、菌落形态大的正突变单菌落，转接于PDA斜面培养基上，于恒温箱内培养，温度为30℃±0.6℃，培养时间为2d，冷藏备用。

2.3.1.2平板复筛

挑选分离平板上孢子丰满、菌落形态大的单菌落转接的斜面，接种子瓶培养12h，转接发酵瓶，转速220r/min，温度30℃，培养48h得初筛酵母培养液。将初筛酵母培养液与黑曲霉、李氏木霉发酵液按比例混合培养，在3天取混合液梯度稀释，准确吸取稀释液的0.2ml/板，倒在制好的酵母平板筛选培养基上，分离单个菌落。于恒温箱内培养，培养温度为30.0℃±0.60℃、培养2d。以未辐照的出发菌株平板分离培养菌落作为对照，将菌落直径大于对照平均菌落20％的作为正向突变菌株，转接斜面，30.0℃±0.60℃、培养2d，冷藏备用。

2.3.2摇瓶筛选

2.3.2.1种子瓶发酵

取平板复筛正向突变菌株斜面，挖取一定量转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下进行种子瓶发酵。

2.3.2.2发酵瓶复筛

将培养好的种子液按5％的接种量转接于发酵培养基(40ml/250ml三角瓶)进行二级发酵，以220r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下培养24h。在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、18、22、24小时取样，对发酵液菌体中酵母个数进行计数，通过单位时间发酵液中酵母个数多少，筛选获得高产辐照诱变目的酵母菌株。

2.3.3诱变高产目的菌株与原始菌株菌体个数比较

测定酵母诱变高产菌株与原始菌株发酵液中菌体个数的测定，血球计数板法。诱变高产菌株与原始菌株发酵液中菌体个数比较(0-7小时，8-16小时，18-24小时)分别如表2-表4所示。

表2

发酵时间(h)	0	1	2	3	4	5	6	7
									诱变高产菌(106)	4	4.5	6.5	7.75	9.25	10.5	14.28	19.3
原始菌株(106)	4	4.25	5	6.75	7.8	9.25	10.3	10.3

表3

发酵时间(h)	8	9	10	11	12	13	14	16
									诱变高产菌(106)	26.25	28.5	30.25	39	42	66.25	68	70
原始菌株(106)	13.5	20.5	25.5	28.5	36.5	55.8	65	66

表4

发酵时间(h)	18	22	24
				诱变高产菌株	75	71	66.75
原始菌株	70	65.25	64

由于菌体蛋白也是生物蛋白饲料蛋白提升的重要组成部分。经过重离子束辐照后，诱变高产目的酵母菌株，在单位发酵液中酵母个数明显高于原始对照，比对照菌株最高可提高90％。

二、实验步骤：

1、材料

1.1、菌种

黑曲霉菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买。

李氏木霉菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买。

酵母辐射诱变菌(YB，Saccharomyces cerevisiae)：中科院近代物理所生物物理实验室重离子辐照选育并保藏，保藏编号为CGMCC No：5004。

乳酸杆菌：由甘肃工业微生物菌种保存中心购买。

1.2、菌种制备方法：

l.2.1酵母菌种的重离子束辐照诱变：

1.2.1.1酵母菌株由甘肃省工业微生物菌种保藏中心购买，保藏号为GSICC51951，所用仪器同如下：

“HIFRL”型中能重离子加速器，中科院兰州近代物理研究所提供；

超净工作台，型号：SW-CJ-2FD；

旋转摇瓶机，型号：HTG-3A；

隔水式电热恒温培养箱：DHP-9082上海一恒科学仪器有限公司；

pH计：pHS-3C型，上海雷磁仪器厂；

生物显微镜：XSP-8CA上海光学仪器一厂；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-30KB上海申安医疗器械厂；

1.2.1.2菌种的活化：

取已知效价且生产性能优良的酵母菌种一支，放置在恒温缓冲间(30℃±0.5℃，30min)，使其活化。

1.2.1.3¹²C⁺⁶离子束穿透诱变：

对酵母分批设计多点的不同辐照剂量，以重离子加速器提供的¹²C⁺⁶离子束对酵母菌种孢子悬浮液二个样品进行辐照诱变，辐照剂量分别为0Gy，10Gy，30Gy，50Gy，70Gy，90Gy，110Gy，然后将处理过的孢子悬液梯度稀释，准确吸取一个样品的孢子悬液0.2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落，以追求最佳诱变剂量。同时，以出发菌种另一个样品孢子悬液同法以普通分离平板培养基分离对照，以便进行菌落形态对比。待分离平板培养基在30℃±0.5℃培养2-3天生长成熟，将菌落直径大于对照平均菌落20％的作为正向突变菌株，转接斜面，30.0℃±0.60℃、培养2d，冷藏备用。研究重离子束¹²C⁺⁶离子对出发菌种诱变剂量的选择与诱变后筛选出高产菌株的趋势。

1.2.1.4高效价菌株的筛选：

1.2.1.4.1平板筛选

(1)平板初筛

在记录好菌落个数、形态、大小，挑选分离平板上孢子丰满、菌落形态大的单菌落，转接于PDA斜面培养基上，于恒温箱内培养，温度为30℃±0.6℃，培养时间为2d，冷藏备用。

(2)平板复筛

挑选分离平板上孢子丰满、菌落形态大的单菌落转接的斜面，接种子瓶培养12h，转接发酵瓶，转速220r/min，温度28℃，培养48h得初筛酵母培养液。将初筛酵母培养液与黑曲霉、李氏木霉发酵液按比例混合培养，在1、3、5、7、9天取混合液梯度稀释，准确吸取稀释液的0.2ml/板，倒在制好的酵母平板筛选培养基上，分离单个菌落。于恒温箱内培养，培养温度为30.0℃±0.60℃、培养2d。以未辐照的出发菌株平板分离培养菌落作为对照，将菌落直径大于对照平均菌落20％的作为正向突变菌株，转接斜面，30.0℃±0.60℃、培养2d，冷藏备用。

1.2.1.4.2摇瓶筛选

(1)种子瓶发酵

取平板复筛正向突变菌株斜面，挖取一定量转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，30.0℃±0.60℃温度下进行种子瓶发酵。

(2)发酵瓶复筛

将培养好的种子液按5％的接种量转接于发酵培养基(40ml/250ml三角瓶)进行二级发酵，以220r/min旋转摇瓶机，30.0℃±0.60℃温度下培养24h。

1.2.1.5发酵甜高梁秸秆实验

将30g薯渣、5％(1.5g)的草粉、10％(3g，水分55-65％)甜高粱秸秆粉混合均匀后放入三角瓶中，每个辐照剂量按1％(按100g薯渣中一个比例接种1ml)的接种比例进行接种。接种后放于恒温箱中30℃的条件下培养，时间为7天。然后每天观察实验现象并做好记录，7天后用凯氏定氮仪测样品中的粗蛋白的含量。辐照剂量与粗蛋白含量关系结果如表5所示：

表5

辐照剂量(Gy)	0	10	30	50	70	90	110	130
									粗蛋白含量(％)	7.5	7.1	6.9	7.9	8.3	8.5	7.4	6.5

由表5可以看出，当辐照剂量为70和90Gy时，粗蛋白含量出现了提升，当辐照剂量为90Gy时，粗蛋白含量可提升到8.5％，较对照组提高了13.34％，提升较为显著，因此在制备复合微生物菌剂时，可选用在90Gy时辐照后选育的酵母菌株。

1.3培养基

(1)斜面培养基的制备：

乳酸菌斜面培养基配方：牛肉膏：0.15g；蛋白胨：0.5g；NaCl：0.25g；琼脂：1g；水：50ml。

霉菌培养基配方(用于李氏木霉、黑曲霉)：琼脂：2g；蔗糖：2g；马铃薯(去皮后切成小块，加水煮沸半小时)：20g；水：100ml。

酵母斜面培养基配方：琼脂：2g；葡萄糖：2g；马铃薯(去皮后切成小块，加水煮沸半小时)：20g；水：100ml。

酵母平板筛选培养基(用于酵母诱变菌)：琼脂：2g；葡萄糖：1g；蔗糖：1g；马铃薯(去皮后切成小块，加水煮沸半小时)：20g；水：100ml。

(2)种子瓶培养基的制备：

霉菌种子瓶培养基配方：(用于黑曲霉、李氏木霉种子瓶及黑曲霉和李氏木霉混合发酵瓶)

蛋白胨：0.3g；硫酸铵：0.5g；七水合硫酸镁0.04g，蔗糖3g，磷酸二氢钾0.2g，水100ml。温度：35℃；转速：300转；PH：调整PH为5.5±0.2；培养时间：24小时；121℃灭菌30分钟，在斜面上挑四环菌株。

酵母种子瓶培养基配方：

葡萄糖：1g；蛋白胨：1g；酵母浸出粉：0.5g；磷酸二氢钾：0.3g；水：100ml。

PH：调整PH为6.5±0.2；温度：30度；转速：220转；培养时间：24h。

每个三角瓶中装50ml培养液，接种时用接种环在斜面上挑四环菌株。

1.4其他材料

草粉，由干燥的玉米秸秆粉碎后获得；

甜高粱秸秆粉，饲用型甜高粱用青贮机粉碎，含水量55-65％。

分解剂“微储王”(由新疆农科院生产)。

实施例2：

一、复合微生物菌剂发酵马铃薯渣实验中草粉添加比例实验：

根据实验需求分别设计了六个添加比例，分别是：20克草粉，20克薯渣，20克薯渣加上5％的草粉，20克薯渣加上10％的草粉，20克薯渣加上15％的草粉，20克薯渣加上20％的草粉。

然后用电子天平分别按不同比例称好薯渣和草粉，将其拌匀后装入到三角瓶中。

提前将烘干机预热到100度，然后将六个广口瓶分别贴上标签放入到烘干机中，开始计时，每半个小时称重一次，记录到试验本上，直到水分的含量不再发生变化。

水分含量记录如表6所示：

表6

20克草粉

20克薯渣

20+5％

20+10％

20+15％

20+20％

水分含量

11％

76％

72.9％

70.5％

66.5％

65.8％

从水分烘干速度来看，20克薯渣的水分含量最高；从添加草粉的比例来看，5％草粉添加量的薯渣水分含量最高；往后依次是10％的草粉添加量，15％的草粉添加量，20％的草粉添加量的薯渣的水分含量最低。

根据郭维烈，郭庆华的《新型发酵蛋白饲料》，发酵过程中的水分含量一般在30％-70％，相对湿度则保持在90％-97％，所以从经济角度考虑，应该选择的草粉添加比例为10％，主要的原因有两点：(1)、添加10％的草粉其水分含量刚好可达到发酵过程中的水分含量要求。(2)、由于草粉中含有大量的纤维素，有诱导黑曲霉、李氏木霉混合发酵液中纤维素酶生成作用，更有利于薯渣混合发酵底物中纤维素的分解及转化。

鉴于以上因素考虑，适合发酵的薯渣中草粉的添加比例为10％。

二、复合微生物菌剂生物处理马铃薯渣实验：

共选用了八组，分别为：

按照体积比：

黑曲霉培养液(H)，李氏木霉培养液(M)，酵母辐射诱变菌培养液(J)；

组一：M∶J为1∶1；

组二：(H∶M)∶J为(1∶2)∶2/3；

组三：(H∶M)∶J为(1∶2)∶1；

组四：(H∶M)∶J为(1∶3)∶3/4；

组五：(H∶M)∶J为(1∶1)∶3/2；

组六：(H∶M)∶J为(1∶1)∶1；

组七：(H∶M)∶J为(1∶3)∶1/2；

组八：空白对照。

将30g薯渣、3g甜高梁秸秆粉与3g的草粉混合均匀后放入三角瓶中，按如下比例进行接种：100g薯渣混合发酵底物中接种1ml复合微生物菌剂。为了比较灭菌对薯渣中粗蛋白含量提升的影响，每个组都分别进行灭菌组与未灭菌组的对照实验。灭菌组，在高压锅中121℃30分钟灭菌后在无菌操作台上进行接种，以防被杂菌污染；未灭菌组不进行灭菌。然后每组按1‰的比例统一加上乳酸杆菌。接种后放于恒温箱中30℃的条件下培养，时间为10天。10天后用凯氏定氮仪测样品中的粗蛋白的含量。

各菌种比例发酵后的蛋白含量，见下表7：

表7

*表示差异显著P<0.05，**表示差异特别显著P<0.01。

从表7中可以看出，空白组的蛋白含量平均为4.78％，发酵后蛋白含量都得到了明显的提高，最高的可达到16.7％，蛋白含量提高了将近4倍。其中组三、组四、组五、组六蛋白含量都超过了20％，效果较好。

从颜色效果来说，木霉与酵母组发酵后的颜色黑色的程度最低，也就是组一，并且其发酵后的蛋白含量也达到了12.04％。

未灭菌组的效果普遍低于灭菌组，从图标中分析，低了大约3-7个百分点，但从工业生产角度考虑，灭菌的可行性不是很高。而未灭菌与空白对照相比蛋白均有提高，最高可使粗蛋白提高81.9％，因此从工业角度综合考虑，选用不进行灭菌组四，提高薯渣饲料营养成分效果最好。

三、复合微生物菌剂的制备及其工艺优化

选取了最佳的四个比例，分别为组三、组四、组五和组六并进一步制成了复合微生物菌剂一，复合微生物菌剂二，复合微生物菌剂三和复合微生物菌剂四。

复合微生物菌剂制备的工艺流程主要为，菌种斜面的制备，菌种种子瓶培养基的制备，加入保护剂，混合后冻干，包装。试验中主要解决了两个问题，一个是保护剂的选择，另一个是混合后冻干与冻干后混合的菌种活性对比。

保护剂主要有两个，一个是加入脱脂乳10％、甘油6％、维生素C4％；另一个是加入脱脂乳8％、海藻糖8％和维生素C4％。在冻干前分别向所要冻干的菌液中加入这两种保护剂，冻干后测定冻干粉中菌种的存活率。

混合后冻干和冻干后混和是两种不同的生产工艺，菌液分别冻干后混合减少了不同菌种之间的相互影响，但混合后冻干则更接近于大规模工业生产，可以减轻生产成本。

加入不同保护剂对菌种冻干后存活率的影响结果如表8所示：

表8

由表8可以看出，加入保护剂二后的菌种的存活率为85.6％，高于加入保护剂一的菌种存活率，所以在冻干的过程中选择保护剂二。

复合微生物菌剂的制备选取了两种不同的工艺，分别为不同菌液的分别冻干后混合和不同菌液混合后一起冻干，结果见下表9：

表9

由表9可以看出，冻干后混合和混合后冻干的菌种的存活率分别为83.6％和84.2％，两次工艺的差别不大。所以从大规模工业生产的角度考虑，选取将菌液混合后再进行一块冻干，以节省生产成本。

四、复合微生物菌剂与分解剂处理薯渣效果对比实验

分为三组，空白对照组、复合微生物菌剂二组、分解剂“微储王”组，每组分两种不同发酵温度：5℃，30℃，不同温度设三个平行对照，每组均不灭菌，按100g薯渣接种1ml菌液比例喷晒马铃薯渣，接种后混合均匀，装入密封透明的塑料袋中，每袋5kg，分别置于5℃和30℃培养箱中发酵。每两周取一次样，测量其中的粗蛋白含量。

分解剂使用方法：将“微储王”秸秆发酵活干菌一包(3g)，倒入200ml清水中，搅拌均匀，待菌种激活1-2h以后兑入1％的盐水中即可使用，接种量为1％。

取样：每两周取一次样，测量其中的粗蛋白含量。

复合微生物菌剂与分解剂“微储王”处理薯渣效果对比，以粗蛋白测定结果为依据，如表10所示：

表10

*表示差异显著P<0.05**表示差异特别显著P<0.01

从以上的数据中可以看出，第二周时蛋白提高最为明显，以后的蛋白提高率逐渐放缓，到第六周时，部分组的蛋白含量出现了降低，其原因可能受取样的影响，但从平均值也可看出，其整体的蛋白含量已经基本上不再提高。到第八周时，蛋白含量基本保持恒定不变。

如表10所示，由于温度的差异，对薯渣中粗蛋白的提升影响较为显著，复合微生物菌剂二高温实验组在第六周时，蛋白含量可以提高到7.56％，较空白组4.52％，提高了67.2％，而复合微生物菌剂二低温验组同样在第六周时，其粗蛋白含量仅达到5.58％，较空白组的4.52％仅仅提高了23.5％，可见温度对薯渣发酵粗蛋白的提升作用较为显著。

五、复合微生物菌剂处理薯渣中试实验

分为了五个组，对照组、复合微生物菌剂三组、复合微生物菌剂四组、复合微生物菌剂二组、复合微生物菌剂一组，每组均不灭菌，按100g薯渣接种1ml菌液比例喷晒马铃薯渣发酵底物，接种后混合均匀，然后装入密封透明的塑料袋中，每袋装处理马铃薯渣10kg。然后放于30℃的培养箱中。每两周取一次样，分别测其中的粗蛋白含量。每一组设三个平行对照，结果以平均值表示。见下表11：

表11

*表示差异显著P<0.05，**表示差异特别显著P<0.01。

以表11可以看出，第二周时蛋白含量的提升最为明显，之后的第四周和第六周蛋白提高率逐渐放缓，到第六周时也出现了部分组的蛋白含量下降，但仅是个别的，总体来说其蛋白含量仍有提升的空间。但到了第八周，总体粗蛋白含量变化较为平稳，增长基本已经停止，部分组继续出现蛋白比例下降。

六、马铃薯渣微生物蛋白饲料发酵后水分烘干实验

将已经发酵六周的七瓶薯渣发酵底物打开瓶口，提前将烘干机预热到100度，然后将七个广口瓶分别保留标签放入到烘干机中，开始计时，每半个小时称重一次，直到水分的含量不再发生变化。

马铃薯渣微生物蛋白饲料发酵后水分烘干6小时后的水分含量结果如表12所示：

表12

因为饲料可以储存的湿度为水分含量不高于14％，所以从上表中可以得出在薯渣烘干到六小时左右时即可以达到储存要求。

七、马铃薯渣发酵蛋白饲料饲喂实验：

1.材料与方法：

1.1试验分组

试验选择20头品种接近，公母各半，45日龄的三元杂交仔猪为试验对象，选择的仔猪要求体重接近，体型一致，体重间的差异与平均体重相比P>0.05(差异不显著)。按照仔猪的体重分为两组，一组为试验组，采用常规饲料添加马铃薯渣发酵蛋白饲料饲喂；一组为对照组，采用常规饲料饲喂。试验分组情况见下表13：

表13

1.2饲料处理：

对照组饲料以常规饲料为主，选用玉米、鼓皮、豆渣、食盐等按照一定的比例配合而成，试验组在常规饲料的基础上添加10％的发酵后的马铃薯渣蛋白饲料。如下表14：

表14

1.3饲养管理：

马铃薯渣饲料在饲喂前要与其他饲料混合均匀，然后用水浸泡，料水比大致在1∶2。试验猪自由采食和饮水，每天饲喂3-4次，按照养殖场常规管理进行。试验全程日粮中不添加使用任何药物。猪群在试验开始及结束称重，同时记录每组猪饲料采食量。观察猪群采食情况、粪便形状和健康状祝。试验期120d。试验时间为2012年9月到12月。

2.测定指标

2.1平均日增重：平均日增重＝(终末体重-初始体重)/120

2.2平均日采食量：平均日采食量＝试验期间饲料总消耗/120

2.3料肉比：料肉比(FCR)是指饲养的畜禽增重一公斤所消耗的饲料量，它是评价饲料报酬的一个重要指标料。料肉比高说明用的饲料多，但增长的肉少；反之，料肉比低说明用的饲料少，但增长的肉多。

2.4屠宰率：也称净肉率或畜禽活重和宰后胴体重量的比率。

计算公式屠宰率(％)＝胴体重量/畜禽活重×100％

3.实验结果：

3.1实验结束后，测所有猪的终末体重，并求其平均值，计算其总增重和平均日增重。

如下表15所示：

表15

通过表15可以看出：添加发酵后的马铃薯渣的实验组增重效果比较明显，总增重比实验组多114.1Kg，平均日增重比对照组提高了7.8％。

3.2饲料转化比：即料肉比

实验结束后，测得每组中所消耗的饲料的总量，料肉比＝饲料总消耗/总增重，见下表16：

表16

从上表可以看出，实验组的料肉比为3.30∶1，对照组的料肉比为3.68∶1，实验组比对照组料肉比降低了11.5％，可见经发酵的马铃薯渣饲料明显的降低了料肉比，提高了饲料的利用率，节约了养殖的成本，提高经济效益。

3.3屠宰率：

实验结束后，从实验组和对照组中分别选择两头最接***均体重的猪进行屠宰，分别测出屠宰前猪的重量和屠宰后猪胴体的重量，如表17：

屠宰率(％)＝胴体重量/畜禽活重×100％

表17

从上表17可以看出，实验组的屠宰率为71.8％，而对照组的屠宰率为65.9％，实验组的屠宰率比对照组提高了9.0％，饲喂发酵后马铃薯渣饲料的猪屠宰率有了一定的提高，增加了出肉率，增加了经济效益。

4.经济效益分析：

实验结束后，分别计算实验组和对照组的总投入和总收入，总投入主要包括，购买仔猪，饲料的投入，添加剂及药物的投入以及饲养管理成本；总收入主要包括生猪成熟后的卖出收入，按当时的市场价24.5元/Kg，详细见表18：

表18

从上表可以看出，实验组10头猪的总盈利为8563元，对照组10头猪的总盈利为7087元，实验组的总盈利比对照组提高了20。8％，经济效益显著。

5.小结：

从以上的饲喂实验中，可以得出如下结论：添加发酵后的马铃薯渣的实验组增重效果相比较为明显，实验组总增重为998.9Kg，对照组的总增重为889.7Kg。总增重比实验组多114.1Kg，平均日增重比对照组提高了7.8％，增重效果明显；实验组的料肉比为3.30∶1，对照组的料肉比为3.68∶1，实验组比对照组料肉比降低了11.5％，降低了料肉比，提高了饲料的利用率；实验组的屠宰率为71.8％，而对照组的屠宰率为65.9％，实验组的屠宰率比对照组提高了9.0％，增加了经济效益；实验组10头猪的总盈利为8563元，对照组10头猪的总盈利为7087元，实验组的总盈利比对照组提高了20.8％，经济效益显著。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.复合微生物菌剂，其特征在于，是由酿酒酵母YB发酵菌液、黑曲霉—李氏木霉发酵菌液混合得到的；所述黑曲霉—李氏木霉发酵菌液是由黑曲霉和李氏木霉经种子瓶各自培养后，按照体积比黑曲霉发酵菌液：李氏木霉发酵菌液为1-3:2-4混合后，接种于发酵瓶中培养得到的；

所述酿酒酵母YB发酵菌液是将酿酒酵母YB菌株经种子瓶培养后得到的；

所述酿酒酵母YB菌株，其保藏编号为CGMCC No.5004；

所述复合微生物菌剂中各组分的混合比例按照体积比为黑曲霉—李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4-6：3-5。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物菌剂中各组分的混合比例按照体积比为黑曲霉—李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4：3或4：4或4：5或5：3或6：3。

3.权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将酿酒酵母YB菌株、黑曲霉和李氏木霉分别置于马铃薯琼脂培养基上进行斜面培养；酿酒酵母YB菌株保藏编号为CGMCC No.5004；

2)将步骤1)得到经斜面培养后的黑曲霉和李氏木霉接种于黑曲霉和李氏木霉种子瓶培养基进行扩繁，黑曲霉和李氏木霉种子瓶菌液按照体积比黑曲霉：李氏木霉为1-3:2-4，以5％接种量接种发酵瓶混合培养得到黑曲霉—李氏木霉混合发酵菌液，并加入保护剂；

3)将步骤1)得到的经斜面培养后的酿酒酵母YB菌株置于酵母种子瓶培养基中进行培养；得到酿酒酵母YB发酵菌液，并加入保护剂；

4)将步骤2)得到的黑曲霉—李氏木霉发酵菌液与步骤3)得到的酿酒酵母YB发酵菌液混合，得到混合菌液，混合比例为按照体积比黑曲霉—李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4-6：3-5；

5)将步骤4)得到的带有保护剂的混合菌液冻干得到复合微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的保护剂为脱脂乳、甘油和维生素C，或脱脂乳、海藻糖和维生素C；所述保护剂的加入量为按照质量百分比脱脂乳10％、甘油6％、维生素C 4％，或脱脂乳8％、海藻糖8％和维生素C4％。

5.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，黑曲霉—李氏木霉发酵菌液和酿酒酵母YB发酵菌液的混合比例为按照体积比黑曲霉—李氏木霉发酵菌液：酿酒酵母YB发酵菌液为4：3或4：4或4：5或5：3或6：3。

6.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在制备薯渣蛋白饲料中的应用，其特征在于：是按照如下步骤进行的：

a)将20重量份的马铃薯渣、2重量份的草粉、2重量份的甜高粱秸秆粉混合，得到薯渣发酵原料；

b)将复合微生物菌剂喷洒到薯渣发酵原料上，每100g薯渣发酵原料上喷洒0.5ml复合微生物菌剂，得到复合发酵底料；

c)将乳酸杆菌接入复合发酵底料中，接种比例为按照质量百分比0.1％。