CN102352315A - 微生物菌剂及其制备方法和其在制备青贮饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。本发明提供的微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。本发明还提供该微生物菌剂的制备方法及其在制备青贮饲料中的应用。应用本发明的微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短，发酵10天时纤维素和蛋白含量就有了明显的变化，发酵25天后纤维素含量和蛋白含量基本不再变化，蛋白含量达到了9.3%以上，纤维素含量降解了10%-19%，制成的青贮饲料香味浓郁，提高了青贮原料的利用率，改善了青贮饲料的营养价值；进行了中试试验，能直接进行大规模生产；用该青贮饲料喂养动物，家畜食用后容易消化，缩短了动物采食时间，提高了采食量，家畜增重速度快。

Description

微生物菌剂及其制备方法和其在制备青贮饲料中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌剂，本发明还涉及该微生物菌剂的制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。

背景技术

青贮饲料是家畜在冬、春季节维生素、矿物质、蛋白质的重要来源,它可以提高家畜的繁殖率和泌乳力,并促进幼畜的生长发育,是饲养家畜不可缺少的基础饲料。在冬季漫长的我国北方,天气寒冷,季节性强,生长期短,青割饲料生产受到限制,青贮饲料是提供冬季多汁饲料最理想的方式,也是灾年饲料短缺时的理想贮备饲料。

目前以农作物秸秆为青贮原料的青贮饲料，其规模化的生产主要是添加酵母菌来进行青贮原料的发酵，这种方法发酵时间长，通常需要2—3个月，得到的青贮饲料蛋白含量低，其质量百分含量仅为4%左右、纤维素基本无降解、香味较淡，家畜食用后消化率低，且青贮原料的利用率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物菌剂，以农作物秸秆为青贮原料，利用该微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短、蛋白含量高、纤维素降解幅度大、香味浓郁，家畜食用后容易消化，且青贮原料的利用率高；为此，本发明还提供一种该微生物菌剂的制备方法和其在制备青贮饲料中的应用。

为了实现上述目的本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。

优选地，所述的酵母诱变菌是酵母菌经由¹²C⁺⁶辐射诱变得到的。

优选地，所述绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌的体积份数比是1-3:1-2:1-3。

更优选地，所述绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌的体积份数比是1:1:1、2:1:2或3:2:3。

再优选地，所述微生物菌剂还包括营养盐，所述营养盐的组分按重量份数计为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份。

再优选地，所述微生物菌剂还包括乳酸菌。加入乳酸菌可以增加青贮饲料的口感，即适口性。

本发明还提供微生物菌剂的制备方法，所述制备方法的步骤为：

a、将酵母菌进行诱变得到酵母诱变菌；

b、将酵母诱变菌、绿色木霉、黑曲霉用PDA培养基进行斜面培养；

c、将步骤b中得到的经斜面培养的绿色木霉、黑曲霉分别在霉菌种子瓶培养基中进行扩大培养；

d、将步骤b中得到的经斜面培养的酵母诱变菌在酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养；

e、将扩大培养后的酵母诱变菌与绿色木霉、黑曲霉混合，混合比例按照体积份数比绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌为1-3:1-2:1-3，制得微生物菌剂。

本发明还提供该微生物菌剂在制备青贮饲料中的应用。

优选地，所述青贮饲料的发酵时间为25天。

更优选地，所述青贮饲料的青贮原料在发酵过程中pH值为6.0。

在此pH值下可以为霉菌提供良好的生长环境，同时也可抑制其他杂菌的生长，

应用本发明的微生物菌剂发酵制备的青贮饲料发酵时间短，发酵10天时纤维素和蛋白含量就有了明显的变化，发酵25天后纤维素含量和蛋白含量基本不再变化，蛋白含量达到了9.3%以上，纤维素含量降解了10%-19%，制成的青贮饲料香味浓郁，提高了青贮原料的利用率，改善了青贮饲料的营养价值；进行了中试试验，能直接进行大规模生产；用该青贮饲料喂养动物，家畜食用后容易消化，缩短了动物采食时间，提高了采食量，家畜增重速度快。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法和所用的试剂及设备，如无特别说明，均为常规方法、常规试剂和设备。

实施例1

1.1 菌种

绿色木霉菌株：购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号：GSICC 62010；

酵母菌株：购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号：GSICC 修改为51951；

黑曲霉菌株：购自甘肃省工业微生物菌种保藏中心，保藏编号：GSICC 60108；

乳酸菌：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：ACCC 11026。

1.2 本实验中所用的仪器如下

温室固体发酵培养箱：购自：上海鸿都电子科技有限公司 型号： DPN-9272B；   

粗纤维测定仪：购自： 济南盛泰仪器有限公司  型号：ST-06；

粗蛋白测定仪：购自： 济南盛泰仪器有限公司  型号：ST-04C；

高压蒸汽灭菌锅。

1.3 培养基。

（1）斜面培养基的制备：

乳酸菌斜面培养基配方：牛肉膏：0.15g；蛋白胨：0.5g；NaCl：0.25g；琼脂：1g；水：50ml。

马铃薯糖琼脂培养基（PDA）配方(用于绿色木霉、酵母诱变菌、黑曲霉)：马铃薯（去皮后切成小块，煮沸半小时）：20g；水：100ml；琼脂：2g；糖（培养霉菌时用蔗糖，培养酵母时用葡萄糖）：2g。

（2）种子瓶培养基的制备：

乳酸菌种子瓶培养基配方：

胰蛋白胨：2g ；酵母膏：0.5g；蛋白胨：0.5g；葡萄糖：0.5g；吐温80：0.005g；番茄汁25g，水1000 ml。

霉菌种子瓶培养基配方：（用于黑曲霉和绿色木霉）

蛋白胨：3g；硫酸铵：5g；硫酸镁 0.4g，蔗糖 30g，磷酸二氢钾 2g，水  1000ml。

酵母诱变菌种子瓶培养基配方：

葡萄糖：10g；蛋白胨：10g；酵母浸出粉： 5g；磷酸二氢钾： 3g；水：1000ml。

1.4 菌种的制备方法

1.4.1 绿色木霉菌种的培养

1.4.1.1绿色木霉菌种的斜面转接扩培养：

取购买的绿色木霉菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的PDA斜面上，放入35℃±0.5℃的温室培养箱中培养3d。

1.4.1.2 绿色木霉菌种种子瓶培养：

取出1.4.1.1中已生长成熟的绿色木霉菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的孢子转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，在35℃±0.5℃温度下发酵3d。

1.4.2黑曲霉菌株的培养

1.4.2.1黑曲霉菌种的斜面转接扩培养

取购买的黑曲霉菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的PDA斜面上，放入28℃±0.5℃的温室培养箱中培养3d。

1.4.2.2黑曲霉菌种种子瓶培养

取出1.4.2.1中已生长成熟的黑曲霉菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的孢子转接于种子培养基进行扩大培养，以220r/min旋转摇瓶机，在28℃±0.5℃温度下发酵3d。

1.4.3乳酸菌菌株的培养

1.4.3.1乳酸菌菌种的斜面转接扩培养：

取购买的乳酸菌菌种一支，在超净工作台里用接种针挑取孢子以划线方式接于制备好的乳酸菌斜面上，放入37℃±0.5℃的温室培养箱中培养20h。

1.4.3.2乳酸菌菌种种子瓶培养

取出1.4.3.2中已生长成熟的乳酸菌菌种进行观察，用接种铲挖取一定量长好的菌转接于种子培养基进行扩大培养，放入37℃±0.5℃的温室培养箱中培养20h。

1.4.4酵母菌种的重离子束辐照诱变：

1.4.4.1菌种的活化：

取已知效价且生产性能优良的酵母菌种一支，放置在恒温缓冲间（28℃±0.5℃）活化30min。

1.4.4.2 ¹²C⁺⁶离子束穿透诱变：

对酵母分批设计多点的不同辐照剂量，以重离子加速器提供的¹²C⁺⁶离子束对酵母菌种孢子悬浮液二个样品进行辐照诱变，辐照剂量分别为0 Gy，20 Gy,40 Gy,60 Gy,80 Gy,100 Gy,120Gy，然后将处理过的孢子悬液梯度稀释，准确吸取一个样品的孢子悬液0.2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落，以追求最佳诱变剂量。同时，以出发菌种另一个样品孢子悬液同法以普通分离平板培养基分离对照，以便进行菌落形态对比。待分离平板培养基在28℃±0.5℃培养6-7d生长成熟，于冰箱中2-4℃保存备用。研究重离子束¹²C⁺⁶对出发菌种诱变的剂量选择与诱变后筛选出高产菌株的比例。

1.4.4.3 高效价菌株的筛选：

（1）单个菌落的挑选：

在超净工作台上于分离好的平板上仔细挑选孢子丰满的单菌落，以及菌落形态有一定变异的单菌落，在记录好菌落详细形态及大小后转接于PDA斜面培养基上，于恒温箱内培养，培养温度为（28℃±0.6℃）、培养时间为6-7d，培养后冷藏备用。

（2）摇瓶初筛

种子瓶发酵：

取出已生长成熟的转接于PDA斜面上的菌种进行观察，取一定量长好的孢子转接于酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养，以200r/min旋转摇瓶机，恒温、恒湿条件下进行种子瓶发酵。

发酵瓶发酵：  

取上步骤培养好的种子液以一定的接种量转接于酵母诱变菌发酵培养基（60ml/500ml三角瓶）进行二级发酵，酵母诱变菌发酵培养基的配方与酵母诱变菌种子瓶培养基配方相同。转速设定为200r/min，恒温、恒湿条件下培养48h。

1.4.4.4测定结果：

效价测定；

甜高粱渣发酵测定

将10g甜高粱渣和20g水放入锥形瓶中，，每个辐照剂量按1%（100g接种1ml）的比例进行接种。接种后置于恒温箱中27℃培养7d。每天观察实验现象并做好记录，7天后用凯氏定氮仪测样品中的粗蛋白的含量。结果见下表1。

表1

       由表1可以看出，当辐照剂量为60 Gy时，粗蛋白含量出现了升高，当辐照剂量为80 Gy时，粗蛋白含量可上升至8.9%，较对照组提高了16%，上升量较为显著，因此在制备复合微生物菌剂时，可选用经过80Gy辐照后选育的酵母诱变菌株。

实施例2

1、微生物菌剂发酵甜高粱渣的实验

1.1、微生物菌剂发酵甜高粱渣的实验室实验

1.1.1、微生物菌剂的配比对发酵甜高粱渣的影响实验

将每组菌种按下列体积比混合：

组一：绿色木霉与酵母诱变菌1:1；

组二：黑曲霉与酵母诱变菌1:1；

组三：绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌为1:1:1；

组四：空白对照（不添加菌种只添加营养盐）；

每组分设三个平行对照。

将50g甜高粱渣和100g水放入锥形瓶中，加入营养盐，营养盐的配方如下：尿素：0.1g，硫酸镁：0.03g，磷酸二氢钾：0.2g，形成甜高粱渣发酵原料。在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30分钟，分别将四组菌种按如下比例接种：每100克甜高粱渣中接种5ml，接种方式为喷洒，锥形瓶中发酵，发酵温度28°C，发酵时间为10天。观察产物的颜色、感官及质感，做初步的混合比例判断，进行实验室实验方案的进一步设计。结果如下：

组一：颜色为深绿色，菌落生长旺盛，可以嗅到淡淡的香味；

组二：颜色为深黑色，菌落生长旺盛，可以嗅到淡淡的香味；

组三：颜色为墨绿色，菌落生长非常旺盛，可以嗅到浓厚的香味；

空白组：黄色秸秆，无香味，无菌落生长。

根据实验可以看出：组三的颜色、菌落生长状况及气味是最佳的，所以，用绿色木霉、黑曲霉和酵母诱变菌的混合物来制备微生物菌剂。

 1.1.2、营养盐对微生物菌剂发酵甜高粱渣的影响实验；其中营养盐的配方如下：尿素：0.1g，硫酸镁，0.03g，磷酸二氢钾，0.2g。

实验设四组：

第一组添加营养盐，绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌分别按1:1:1、2:1:2、3:2:3的体积比混合；

第二组不添加营养盐，绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌分别按1:1:1、2:1:2、3:2:3的体积比混合；

对照组分两组：第三组是空白对照的添加营养盐组，第四组是空白对照的不添加营养盐组；

每组分设三个平行对照。

将100g水放入锥形瓶中，在第一组和第三组的各个不同配比中分别添加5g营养盐，营养盐中各组分的质量份数比为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份，将四组混合好的溶液分别倒入50g甜高粱渣中，在高压锅中121℃灭菌30分钟，分别将四组菌种按如下比例接种：每100克甜高粱渣中接种5ml，接种方式为喷洒，锥形瓶中发酵，发酵温度28°C，发酵时间为10天。四分法取样，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。测定结果见表2。

表2 营养盐对微生物菌剂发酵能力的影响

       ﹡P＜0.001，与对照相组比差异极显著；°P＜0.001，与添加营养盐组相比差异极显著。

从表2可知：将第一组和第二组进行比较，第一组在蛋白含量上高于第二组，纤维素降解能力优于第二组，因此，添加营养盐可以促进菌种的生长，增强菌种的作用。将第二组和第四组进行比较，纤维素含量显著降低，蛋白含量显著提高，因此，不添加营养盐也可以达到较理想的效果。

从表2中还可以看出：1:1:1组在蛋白的提高上较为突出，有营养盐组与无营养盐组分别为9.03%和7.39%，而3:2:3组在纤维素降解的能力上较为突出，有营养盐组与无营养盐组分别为9.07%与10.08%。

 1.1.3、  灭菌对微生物菌剂发酵甜高粱渣的影响实验

将每组菌种按下列体积比混合：

第一组为灭菌组：绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌分别按1:1:1、2:1:2、3:2:3的体积比混合；

第二组为不灭菌组，绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌分别按1:1:1、2:1:2、3:2:3的体积比混合；

对照组分两组：第三组为空白对照的灭菌组，第四组为空白对照的不灭菌组；

每组分设三个平行对照。

将100g水放入锥形瓶中，每组的各个不同配比中分别添加5g营养盐，营养盐的重量配比为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份，将四组混合好的溶液分别倒入50g甜高粱渣中，将四组均用0.25ml/mol的HCl调节pH为6.0，将第一组和第三组在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min，分别将四组菌种按如下比例接种：每100克甜高粱渣中接种5ml，接种方式为喷洒，锥形瓶中发酵，温度28°C，发酵时间为10d，四分法取样，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测定每组的纤维素及蛋白的含量。实验结果见表3。

表3灭菌与否对微生物菌剂发酵能力的影响

      ^﹡P＜0.001，与对照组差异极显著，°P＜0.001，与灭菌组差异极显著，

^&P＜0.01，与灭菌组差异显著, ＾P＜0.05与灭菌组差异不显著。

从表3可以看出，灭菌组与不灭菌组在纤维素降解的能力上差异是极显著的；但是在蛋白含量的提高上差异不大：1:1:1的灭菌组与不灭菌组相差0.64%，2:1:2的灭菌组与不灭菌组相差0.26%，3:2:3的灭菌组与不灭菌组差异只有0.06%，所以，灭菌与否对蛋白的提高并没有明显的影响，不灭菌也可以达到较好的发酵效果。 

从表3还可以看出， 1:1:1组在蛋白的提高上较为突出，灭菌组与不灭菌组分别为8.03%和7.39%；而3:2:3组在纤维素降解的能力上较为突出，灭菌组与不灭菌组分别为9.09%与12.31%。

 1.2、微生物菌剂发酵甜高粱渣的中试实验

根据实验室实验结果及数据，进行小规模模拟工业化生产，在有菌及自然条件的温度下，绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌分别按以下体积比进行实验 1:1:1, 2:1:2，3:2:3。实验分为二方面进行：一方面测试自然发酵条件下营养盐对微生物菌剂发酵甜高粱渣的影响，另一方面将本发明的微生物菌剂与同类产品“微储王”秸秆分解剂进行比较，温度为室温，并通过对发酵时间进行四分法、阶段性取样获得实验数据，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。具体实验步骤及实验结果如下：

1.2.1、自然发酵条件下营养盐对微生物菌剂发酵甜高粱渣的影响。其中营养盐的成分按重量计为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份。

实验设四组：

第一组添加营养盐，绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌的体积比1:1:1，2:1:2 , 3:2:3；

第二组不添加营养盐，绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌的体积比分别为1:1:1，2:1:2 , 3:2:3；

对照组分两组：第三组是空白对照的添加营养盐组，第四组是空白对照的不添加营养盐组。

每组的不同配比各取3kg水，在第一组和第三组的各个不同配比中添加150g营养盐，营养盐中各组分的质量份数比为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份，将各组用0.25ml/mol的HCl调节pH为6.0，每组的各个不同配比添加以甜高粱渣质量计为2%的乳酸菌。将上述混合好的溶液分别倒入3kg刚榨汁的甜高粱渣中，分别将四组的各个不同配比的菌种按如下比例接种：每100克甜高粱渣接种5ml，接种方式为喷洒，在室温下发酵，分期、四分法进行取样，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。实验结果见表4和表5。

表4 营养盐及不同发酵时间对微生物菌剂降解甜高粱渣中纤维素（%）能力的影响

^﹡P＜0.001，与对照组差异极显著，° P＜0.01与添加营养液组差异显著，＾P＜0.05，与添加营养液组差异不显著。

如表4所示：通过纤维素降解量的比较及差异分析可以得出：第二组与空白对照的两组之间差异极显著，第二组在纤维素降解上不如第一组，可知添加营养盐可将甜高粱中的纤维素更好的降解；但实际生产时为了满足生产需要，降低生产成本，选择不添加营养盐也是可行的。

在发酵天数阶段性取样及测定过程中发现：在25天前，各组配比的纤维素降解是很迅速的，在25天后，纤维素降解缓慢，在55天至70天保持稳定，基本不再发生变化。因此，在实际生产时，优选发酵25天来制备青贮饲料。

对菌种的三种不同配比进行对比发现：3:2:3组在纤维素降解的能力上较为突出，有营养盐组与无营养盐组的纤维素含量分别为10.11%与10.51%，低于1:1:1组和2:1:2组，与实验室得出的结果保持了一致，即3:2:3组的纤维素降解能力是最好的。

表5不同发酵时间及营养盐对微生物菌剂提高蛋白（%）能力的影响

   ^﹡P＜0.001，与对照组差异极显著，°P＜0.01，与添加营养液组差异显著，

＾P＜0.05，与添加营养液组差异不显著。

从表5可知：通过蛋白含量提高的数据分析及差异分析可以得出：第二组与空白对照的两组之间差异极显著，第二组在蛋白含量上不如第一组，可知添加营养盐可使甜高粱渣发酵的更好；但实际生产时为了满足生产需要，降低生产成本，选择不添加营养盐也是可行的。

在发酵天数阶段性取样及测定过程中发现：在25天前，各组配比的蛋白提高是很迅速的，在25天后，蛋白提高缓慢，在55天至70天保持稳定，基本不再发生变化。因此，在实际生产时，优选发酵25天来制备青贮饲料。

对菌种的三种不同配比进行对比发现：1:1:1组在蛋白提高的能力上较为突出，添加营养盐组与不添加营养盐组蛋白含量分别为10.60%与9.94%，高于2:1:2组和3:2:3组，与实验室得出的结果保持一致，即1:1:1组在蛋白的提高上效果是最好的。

1.2.2、与“微储王”秸秆分解剂（购自乌龙木齐海星农业科学技术应用推广服务站）比较实验

实验设三组：“微储王”秸秆分解剂组、空白对照组、微生物菌剂组（绿色木霉、黑曲霉、产朊假丝酵母诱变菌的体积比分别为1:1:1，2:1:2 , 3:2:3）。每一实验组设三个平行对照。

“微储王”秸秆分解剂组按照“微储王”秸秆分解剂的使用说明进行实验，将“微储王”秸秆发酵活干菌一包，倒入200ml清水中，搅拌均匀，菌种激活1-2h后兑入200ml质量百分数为1%的盐水，将其以喷洒的方式接入3kg甜高粱渣，自然条件下进行发酵，分期、四分法进行取样。

空白对照组：将3kg甜高粱渣和3kg水混合，用0.25ml/mol的HCl调节pH为6.0，将其接入甜高粱渣3Kg，自然状态发酵。

微生物菌剂组：绿色木霉、黑曲霉、产朊假丝酵母诱变菌的体积比分别为1:1:1，2:1:2 , 3:2:3。每组各取3kg水，用0.25ml/mol的HCl调节pH为6.0，每组配比添加以甜高粱渣质量计为2%的乳酸菌。将上述混合好的溶液分别倒入3kg刚榨汁的甜高粱渣中，分别将三种不同配比菌种按如下比例接种：每100克甜高粱渣接种5ml，接种方式为喷洒，自然条件下发酵。分期、四分法进行取样，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。实验结果见表6。

表6不同发酵时间不同微生物菌剂发酵甜高粱渣效果表

^﹡P＜0.001，与对照组差异极显著，°P＜0.001，与生物分解剂组差异极显著

＾P＜0.05，与对照差异不显著。

从表6可以看出，“微储王”秸秆分解剂与空白对照组比较，纤维素含量差异显著，蛋白提高不显著。“微储王”秸秆分解剂与微生物菌剂比较，差异极显著：使用“微储王”秸秆分解剂发酵甜高粱渣70天后纤维素的质量百分含量16.34%，蛋白的质量百分含量4.73%，而微生物菌剂的1:1:1，2:1:2 , 3:2:3三个不同配比的纤维素质量百分含量分别为10.77%，10.60%。10.51%，蛋白的质量百分含量分别为9.94%，9.43%，9.33%，所以， “微储王”秸秆分解剂的效果没有本发明的微生物菌剂的效果好。由此可见，本发明通过对于三种菌群混合发酵甜高粱渣并配合添加乳酸菌，在降解纤维素、提高蛋白方面有较好的效果，且因为加入了乳酸菌从而增加了适口性，通过中试试验模拟大型甜高粱渣发酵，验证了实验用于大规模生产，实现产业化的可行性。

1.3、结论

根据表4-表6的实验数据可以看出，在随时间变化中，蛋白含量在提高，不同时间后，蛋白含量差异显著，以1:1:1组的蛋白含量提高最好，与实验室测出的效果一致，该组可作为微生物菌剂配方中的较优组进行生产。纤维素降解也随时间的变化有显著的差异，其中以3:2:3组的纤维素降解效果最好，也与实验室测出的结果保持一致。在低温及室温发酵一个月后，青贮饲料香味浓厚，烘干后有香甜的气味，且颜色为深黄色，蛋白含量大幅度提高，已经将粗饲料改良为精饲料，有效的提高了甜高粱渣的饲用价值。在实验数据中可以明显看出，在发酵初期到发酵55d期间，纤维素含量一直处于下降状态，而蛋白含量则稳步的上升，在发酵到55d后，纤维素及蛋白含量基本不再有明显的变化。每组不同配比中添加质量百分含量2%的乳酸菌后通过混合菌株的作用，青贮饲料表现出：颜色黄色，有浓厚的香气，感官效果好，适合饲用。

1:1:1组合，在蛋白含量的提升上有很好的效果；在纤维素的降解上也有较好的效果，但不及3:2:3组合降解纤维素的效果好,所以，该组合可用于纤维素含量不是很高的农作物秸秆进行发酵，可起到很好的蛋白提升效果。 2:1:2组合，降解纤维素和提升蛋白的能力与其他两个配比比较，较为居中。3:2:3组合的纤维素降解能力最好，蛋白提升效果较好。所以，该组可用于纤维素含量高的农作物秸秆的发酵，可以起到良好的纤维素降解效果，同时提高蛋白的含量。通过三种不同的配比，可针对不同的农作物秸秆进行发酵，以达到所需的青贮饲料。

本发明通过对实验室实验和中试试验进行比较，验证了实验室的效果，可以有效指导实际发酵生产。将微生物菌剂的pH调节至6.0，对菌群生长环境进行调整，达到很好的发酵效果。在微生物菌剂中添加乳酸菌后，有效的提高了青贮饲料的适口性，香气浓厚；且不影响其他菌种的发酵。

 2、微生物菌剂发酵玉米秸秆的实验

实验分为四组：绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌的体积比分别为1:1:1，2:1:2，3:2:3，空白对照一组。每组分别设三个平行对照。每组各取3kg水，用0.25ml/mol的HCl调节pH至6.0，每组添加以玉米秸秆质量计为2%的乳酸菌。将上述混合好的溶液分别倒入3kg玉米秸秆中，分别将四组菌种按如下比例接种：每100克玉米秸秆接种5ml，接种方式为喷洒，自然条件下发酵，采用分期、四分法取样进行实验，，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。实验结果见表7。

表7不同发酵时间微生物菌剂发酵玉米秸秆效果表

 ^﹡P＜0.001与对照组差异极显著，°P＜0.01与3:2:3组比较纤维素含量差异显著，＾P＜0.05与1:1:1组比较蛋白含量差异不显著。

将各组配比的纤维素含量与蛋白含量同时与对照组比较，可以看出用微生物菌剂发酵玉米秸秆可以获得较好的效果。

因3:2:3组是在纤维素降解效果上最好的一组，所以，以3:2:3组作为纤维素含量对照组与其他组进行比较，从表9中可以看出，3:2:3组纤维素降解能力上很好，为10.22%，纤维素含量低于1:1:1组和2:1:2组。因1:1:1组是在蛋白含量提高效果上最好的一组，所以，以1:1:1组作为蛋白含量对照组与其他组进行比较，从表9中可以看出，其与2:1:2组、3:2:3组的蛋白含量差异不显著，综合考虑以上各组情况，可选用3:2:3组作为玉米秸秆的生物分解剂发酵配比。

由表7可知：反刍家畜通过自身的消化***可分解纤维素，可选用1:1:1组发酵得到的青贮饲料来进行饲喂，该组的纤维素降解效果不是最好但是蛋白提高量最大；而其他家畜自身的消化***不能很好的分解纤维素，可选用3:2:3组发酵得到的青贮饲料来进行饲喂，该组的纤维素降解效果最好。

 3、微生物菌剂发酵高粱秸秆的实验

高粱秸秆作为我国主要的饲料来源，它的纤维素含量很高，其质量百分含量大约为31%，目前多用于饲喂牛羊等反刍家畜，通常与高蛋白饲料混合饲喂。为了使高粱秸秆能够用于饲喂所有家畜，降低其纤维素含量，提高蛋白含量，将其转变为优质精饲料可以提高其适口性和营养价值是很有意义的。

实验分为四组：绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌按体积比分别为1:1:1，2:1:2，3:2:3，空白对照一组，每组分别设三个平行对照。每组各取3kg水，用0.25ml/mol的HCl调节pH为6.0，每组配比添加以高粱秸秆质量计为2%的乳酸菌。将上述混合好的溶液分别倒入3kg高粱秸秆中，分别将四组按如下比例接种：每100克高粱秸秆接种5ml，接种方式为喷洒，自然条件下发酵，采用分期四、分法取样进行实验，，使用粗纤维测定仪和粗蛋白测定仪测其纤维素及蛋白的含量。实验结果见表8。

表8中试试验中不同发酵时间微生物菌剂发酵高粱秸秆后纤维素及蛋白含量（%）表

^﹡P＜0.001，与对照组差异极显著，°P＜0.01与3:2:3组比较纤维素含量差异显著，＾P＜0.05与1:1:1组比较蛋白含量差异不显著。

从表8中可以得到：将各组配比在相同发酵时间下的纤维素含量与蛋白含量同时与对照组比较，可以看出用微生物菌剂发酵高粱秸秆可以获得较好的效果。

从表8中还可以得到：2:1:2组在蛋白含量上，与蛋白提高效果很好的1:1:1组差异不显著；在纤维素的降解上，与纤维素降解能力能很好的3:2:3组差异不显著。所以，对于高粱秸秆的分解实验，我们在生产蛋白优质饲料的时候，可选择绿色木霉诱变菌、黑曲霉诱变菌、产朊假丝酵母诱变菌为2:1:2的配比进行发酵，不仅可以有效降低纤维素含量还可很好的提高蛋白含量。

实施例3

微生物菌剂发酵的玉米秸秆饲喂羊的实验

1．实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

从兰州市永登县一羊场的羊群中，挑选体重相近、健康无病的6月龄本地绵羊20只，随机分为实验组和对照组(见表9)，两组绵羊体重差异不显著( P> 0.05)。实验组饲喂本发明的微生物菌剂发酵的玉米秸秆，对照组饲喂普通干玉米秸秆。

表9微生物菌剂发酵的玉米秸秆饲喂绵羊的实验分组情况表：

       1.2 饲料处理

混合精料由以下质量百分含量的成分组成：玉米45%,棉饼41%,麸皮12%,骨粉2%组成，添加物有食盐〔按标准添加)、酵母粉(按日粮总量的0. 5%添加)和微量元素及多种维生素。

1.3 饲养管理

将实验组和对照组饲养在条件完全相同的相邻两个栏舍内。实验前给两组绵羊称重、驱虫，给料量控制在随意采食量的120%，每日三次投喂，计算各组绵羊平均每日采食量；两组绵羊每日同时补饲相同的混合精料0. 5公斤/只，全天供给干净充足的饮水。实验周期为50天。

2. 测定指标

2.1 采食量

采食量=给料量－剩料量

2.2 采食率

采食率=给料量－剩料量／给料量×100%

2.3 增重量

增重量=终末体重－初始体重

3. 实验结果

3.1 采食量与采食率

实验期，实验组的绵羊平均每日采食微生物菌剂发酵的玉米秸秆0. 59公斤/只，对照组的绵羊平均每日采食普通干玉米秸秆0.51公斤/只。观察微生物菌剂发酵的玉米秸秆对绵羊采食时间的影响，实验组平均每餐采食时间为45.2分钟，微生物菌剂发酵的玉米秸秆的采食率87.36%；对照组为55.4分钟，普通干玉米秸秆的采食率为71.69%。因微生物菌剂发酵的玉米秸秆质地较柔软，适口性好，因而实验组绵羊平均每餐采食微生物菌剂发酵过的玉米秸秆时间比对照组短，但是平均每只绵羊日采食量由0.51公斤增加到0. 59公斤，增加了15.7%；采食率由71.69%增加到87.36%，提高了21.86%，采食量和采食率都有了较大的提高。 

3.2 增重量的效果见表10。

表10 微生物菌剂发酵的玉米秸秆饲喂绵羊的实验增重效果对比表：

       通过表10可以看出：实验组增重效果较为明显，总增重比对照组多25Kg,平均日增重比对照组提高了26.46%，增重效果明显。

4. 经济效益分析

实验组绵羊比对照组绝对增重多25公斤，每公斤以现市价活重28元/公斤计，增加收入700元。扣除玉米秸秆经微生物菌剂发酵成本70元，增加纯收入630元，经济效益显著。

5. 讨论

经微生物菌剂发酵的玉米秸秆质地柔软、适口性增强；与普通干玉米秸秆比较，可改善普通干玉米秸秆的营养价值，从而缩短绵羊的采食时间，提高采食量、消化率和饲料转化率，增重效果显著。微生物菌剂发酵的玉米秸秆技术制作成本低，操作简便，技术容易掌握，是一项有综合效益、值得大力推广的实用技术。

实施例4

微生物菌剂发酵的甜高粱渣饲喂奶牛的实验

1. 实验材料与方法

1.1 实验动物

实验奶牛选用兰州市永登县一奶牛场饲养的3岁龄德系荷斯坦泌乳奶牛，选择年龄、体重、胎次、泌乳月，乳脂率、产乳量和生理性能基本一致或相近的泌乳奶牛12头，随机分成两组，每组6头，饲喂微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的一组为实验组，饲喂未经处理的甜高粱渣的另一组为对照组，分组后先进行7d预试期，在此期内进行编号、称重、驱虫、测乳脂率、调整两组体重和产乳量，经生物统计数据处理后两组差异不显著(p>0.05),然后转入试验期。

1.2 饲养管理

两组均采取舍饲拴系饲养，由同一名饲养员进行饲喂，每日饲喂、挤奶、饮水各3次，两组混合精料和青粗饲料相同，混合精料每日每头限量9kg，两组青粗饲料则以吃净不剩草为原则，计量不限量，每日供给充足的饮水和舍外运动,其它管理措施两组均保持一致，实验期内做产乳量、耗料量等有关数据记录和采食情况观察，待实验结束后，分别计算两组泌乳奶牛的产乳量，奶料比及经济效益情况分析。实验周期为30天。

2. 测定指标

2.1 采食量

采食量=给料量－剩料量

2.2 日均产乳量

日均产乳量=总产乳量／实验天数

2.3 奶料比

奶料比=总产奶量／总给料量

3. 实验结果与分析

3.1 采食量

饲喂用微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的实验组，由于经微生物菌剂发酵过的甜高粱渣较为疏松，且适口性好，泌乳奶牛在实验周期内表现奶牛喜食、采食量增加，粪便正常，无异常情况发生。

3.2 日均产乳量与奶料比见下表11

表11微生物菌剂发酵过的甜高粱渣饲喂实验中日均产乳量及奶料比对比情况表

由表11可以看出饲用微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的实验组，实验期内每头泌乳奶牛日均产乳量为26.39 kg，对照组为24.12 kg，实验组较对照组有了较大的提高；饲用微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的实验组奶料比为2.36:1，而对照组为2.07：1，即每耗lkg混合精料，实验组可比对照组多产0.29kg奶，奶料比提高了14%，实验组的奶料比较对照组也有了较大的提高。

4. 经济效益分析

由表11的两组泌乳奶牛的日均产乳量和奶料比对比情况分析结果显示：泌乳奶牛饲喂微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的试验组，实验组奶牛的产乳量为158.34kg，而对照组的产乳量为144.72kg，每日产乳量增加了13.62kg；实验组共消耗饲料67.08kg，对照组共消耗饲料69.9kg。按现有鲜奶市场价格3.20元/公斤，实验组日收入506.69元，对照组日收入463.1元，扣除各自的饲料成本及管理成本，实验组日盈利372.53元，对照组日盈利323.3元，日增加纯收入49.23元，日盈利水平提高了15.23%。

经试验证实，奶牛饲喂微生物菌剂发酵过的甜高粱渣的实验组，不仅提高了甜高粱渣的适口性和营养成分，而且对奶牛的采草量、饲料利用率、泌乳量和经济效益等均具有良好效果，因此，用微生物菌剂处理甜高粱渣的方法是可行的，此法安全可靠，简单易行，便于操作推广。

Claims (10)

1.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂由绿色木霉、黑曲霉、酵母诱变菌组成。

2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于：所述的酵母诱变菌是酵母菌经由¹²C⁺⁶辐射诱变得到的。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌的体积份数比1-3:1-2:1-3。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌的体积份数比1:1:1、2:1:2或3:2:3。

5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还包括营养盐，所述营养盐的组分按重量份数计为：尿素10份、硫酸镁3份、磷酸二氢钾20份。

6.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还包括乳酸菌。

7.权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法的步骤为：

a、将酵母菌进行诱变得到酵母诱变菌；

b、将酵母诱变菌、绿色木霉、黑曲霉用PDA培养基进行斜面培养；

c、将步骤b中得到的经斜面培养的绿色木霉、黑曲霉分别在霉菌种子瓶培养基中进行扩大培养；

d、将步骤b中得到的经斜面培养的酵母诱变菌在酵母诱变菌种子瓶培养基中进行扩大培养；

e、将扩大培养后的酵母诱变菌与绿色木霉、黑曲霉混合，混合比例按照体积份数比绿色木霉：黑曲霉：酵母诱变菌为1-3:1-2:1-3，制得微生物菌剂。

8.权利要求1-6任一权利要求所述的微生物菌剂在制备青贮饲料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述青贮饲料的发酵时间为25天。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述青贮饲料的青贮原料在发酵过程中pH值为6.0。