CN110656110B - 棉花纤维特异表达启动子8dp2及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种棉花纤维特异性表达启动子8DP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本申请的8DP2启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子。

Description

棉花纤维特异表达启动子8DP2及其应用

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体的说，涉及一种棉花纤维特异表达启动子。

背景技术

我国是棉花生产和消费大国，棉花生产在我国国民经济中占有重要的地位。传统的育种方法曾在棉花品种改良上取得了较大的成功，但近20年来，世界棉花品种的产量已经达到平台期。因此，利用现有的遗传资源和传统育种手段难以再大幅度提高棉花产量。基因工程方法具有后代易于稳定，育种周期短等优点，可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移。利用基因工程改良棉花产量和纤维品质是解决这一难题的有效途径。但基因工程在作物改良中的作用发挥取决于三个方面的进展程度：目标基因的功能、调控目标性状的分子机理和控制目标基因在特定部位和特定时间表达的特异启动子。在棉花纤维品质和产量的基因工程改良中，常常需要在纤维细胞中超量或抑制一些基因的表达，来达到提高产量或改良品质的目的。在棉花纤维发育的分子机理研究中，也需要纤维细胞特异表达启动子来上调或下调目标基因的表达，进而分析其在纤维细胞中的功能。最大限度地减少目标基因对其他组织和器官的不良影响。但是，目前已报道的具有棉花纤维特异性的启动子非常有限。因此，棉花纤维特异启动子的克隆，对棉花纤维发育相关基因功能研究和棉花纤维的基因工程改良，具有十分重要的意义。

近年来，植物组织器官和发育特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织器官和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于棉花纤维的发育直接影响纤维的品质和产量。因此，研究和筛选纤维特异表达的启动子不仅有助于解析基因表达调控的分子机制，并可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种棉花纤维特异表达启动子8DP2。

本发明的另一个目的是提供含有上述特异表达启动子8DP2的植物表达载体。

本发明的再一个目的是提供含有上启动子或植物表达载体的宿主(转化体)。

本发明的又一个目的是提供上述棉花纤维特异表达启动子8DP2在制备转基因植物中的应用。

本发明的又一个目的是提供一种转基因植物的制备方法。

为实现上述目的，本发明的一个方面公开了一种棉花纤维特异性表达启动子8DP2，所述启动子8DP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个方面是公开了一种含有上述启动子8DP2的表达载体。优选的表达载体是植物表达载体，更优选的是pBI121-8DP2::GUS。

根据本发明的又一方面，公开了一种含有上述表达载体的宿主。优选的，所述宿主为根癌农杆菌。更优选的，所述根癌农杆菌为农杆菌LBA4404。

根据本发明的又一方面，公开了一种上述启动子8DP2在制备转基因植物中的应用。优选的，所述转基因植物为棉花。

本发明也公开了一种上述表达载体在制备转基因植物中的应用。优选的，所述转基因植物为棉花。

本申请还公开了一种含有上述植物表达载体的宿主在制备转基因植物中的应用。优选的，所述转基因植物为棉花。

本申请再公开一种利用启动子8DP2制备转基因植物的方法，包括以下步骤：

(1)将所述启动子8DP2可操作地***到表达载体中，构建植物表达载体；

(2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体；

(3)用所述转化体转化植物，培养转化后的植物，获得转基因植物。

进一步的，提供了一种制备转基因棉花的方法，包括以下步骤：

(1)将所述启动子8DP2可操作地***到表达载体中，构建植物表达载体；

(2)将获得植物表达载体导入宿主，获得转化体：

(3)用所述转化体转化棉花愈伤再生组织，培养所述棉花愈伤再生组织，经筛选和诱导获得含棉花纤维特异性启动子8DP2的棉花植株。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1)本申请提供了棉花鞘脂delta8去饱和酶1(Ghdelta8DES1)的启动子(8DP2)及应用，该启动子是一个棉花纤维细胞特异表达启动子。

2)本申请利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的Ghdelta8DES1基因的启动子，所述8DP2启动子含2179bp片段。

3)本申请还验证了8DP2启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子。

4)本申请的8DP2启动子与组成型启动子(如CaMV35S启动子)相比，具有较高的纤维表达特异性和较好的表达效率(多数纤维特异性启动子表达效率极低)；在改良纤维的基因工程中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用。

5)本申请为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择，同时为改良棉花品种和纤维品质的分子设计提供了有效途径。

当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本申请实施例1中Ghdelta8DES1基因在棉花不同器官和组织中的表达特性；

图2为本申请实施例1中Ghdelta8DES1基因在棉花纤维和胚珠不同发育时期的表达特性；

图3为本申请实施例1中8DP2启动子序列上具有的顺式调控元件；

图4为本申请实施例2中pBI121-8DP2::GUS植物表达载体图谱；

图5为本申请实施例2中启动子分析植物表达载体的酶切验证电泳图；

图6为本申请实施例3中扩增验证转基因棉花中的GUS基因电泳图；

图7为本申请实施例3中8DP2启动子在转基因棉花根、茎和叶中的表达情况图；

图8为本申请实施例3中8DP2启动子在转基因棉花花器官中的表达情况图；

图9为本申请实施例3中8DP2在转基因棉花纤维发育过程中的表达情况图。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

除非另有说明，本申请实施例中的试剂、药品、材料均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

在本申请的下述实施例中，所用的棉花实验材料为徐州142(Gossypium hirsutumL.cv徐州142)，来源于中国农业科学院棉花研究所。转基因受体为冀棉14，来源于河北农业大学。

实施例1

1、棉花RNA的提取

选取新鲜棉花材料(根、茎、叶、花、开花后0天的胚珠和纤维至开花后6天的胚珠和纤维、开花后6天的纤维至开花后20天的纤维、开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠)，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(货号：RN09)提取各个样品的总RNA，具体操作按说明书进行。

2、cDNA一链合成

利用宝生物工程有限公司(TakaRa，中国大连)的cDNA一链合成试剂盒(PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser，货号：RR047A)和实验1提取的总RNA，合成cDNA一链。于-20℃冻存产物。

3、Ghdelta8DES1基因在棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期中的表达特性

运用实时定量PCR扩增分析Ghdelta8DES1的表达水平。采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行扩增，在20微升的反应体系中包括10微升扩增混合缓冲液(试剂盒提供)，5'-端和3'-端引物各1微升(5微摩/升)，cDNA一链1微升，用水补足至20微升。循环参数为94℃预变性3分钟；94℃，30秒，54℃，30秒，72℃，30秒，预设循环数为40。用棉花Histone3基因作内标，Histone3的5'-引物是GhHIS1(5'-ATGCCCAAGGACATCCAGTTG-3')(如SEQ ID NO.2所示)，3'-引物为GhHIS2(5'-CCTACCACTACCATCATGGCT-3')(如SEQ ID NO.3所示)。扩增Ghdelta8DES1基因的5'-引物序列为Ghdelta8DES1-1(5'-GATACAGAGTGGTTGGATAGG-3')(如SEQ ID NO.4所示)，3'-引物序列为Ghdelta8DES1-2(5'-GATCCTAGCAAAGCACATGAC-3')(如SEQ ID NO.5所示)。

按上述实验1和2的方法获得棉花不同组织器官和纤维胚珠不同发育时期的总RNA进行实时定量RT-PCR分析。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带，每个样品重复3次。

结果如图1所示，Ghdelta8DES1基因在棉花根、茎、叶、花、开花当天纤维胚珠和开花后16天纤维细胞中几乎不表达，在开花后10天的胚珠中有少量表达，在开花后10天的纤维细胞中表达量极高。说明Ghdelta8DES1基因具有明显的纤维细胞表达特异性和纤维细胞发育时期表达特异性。图2中，0DPA和4DPA分别表示开花后0天的胚珠(含纤维)和开花后4天的胚珠(含纤维)；6-F～20F:分别表示开花后6天的纤维至开花后20天的纤维；6-O～20-O:分别表示开花后6天的胚珠至开花后20天的胚珠。在纤维发育过程中，Ghdelta8DES1基因在发育起始期(0DPA)几乎不表达，在纤维的早期伸长阶段(4DPA胚珠纤维和6DPA纤维)，该基因的表达逐渐升高；在纤维细胞快速伸长期(8DPA纤维和10DPA纤维)表达量最高；此后，表达量逐渐降低；在纤维细胞次生壁合成起始期(16DAP和18DPA)，该基因的表达水平很低；在纤维细胞次生壁稳定沉积期(纤维细胞完全停止伸长期)该基因的表达水平极低。同时，该基因除在6DPA胚珠中有一定的表达外，在整个胚珠发育过程中基本不表达。由此说明Ghdelta8DES1基因在纤维中特异表达，而且在纤维细胞快速伸长期表达水平较高。图1和2中误差棒表示3次生物学重复的标准差。

4、棉花基因组DNA的提取

取棉花幼叶，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN15)提取棉花的基因组DNA，-20℃保存备用。具体操作按说明书进行。

5、克隆Ghdelta8DES1基因的启动子8DP2序列

利用Ghdelta8DES1基因的cDNA序列，搜索已公布的棉花D-亚基因组序列(http://www.phytozome.net)。获得Ghdelta8DES1基因的5'-上游调控序列，进而在ATG上游大约2.0Kb处设计特异引物8DP2-up(5'-CCTAAAGCAACCACATGCTTC-3')(如SEQ ID NO.6所示)和在近ATG位点处设计特异引物8DP2-down(5'-GGTTTGCATGTGGTGGAGAAT-3')(如SEQ ID NO.7所示)，以徐州142基因组DNA为模板进行扩增，20微升的反应体系包含约20纳克棉花DNA，10微升2XTaq Master Mix(上海近岸科技有限公司，novoprotein，货号：E005-02)，5微摩/升的上下游引物各1微升，用水补足至20微升。扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，52℃，30秒，72℃，2.5分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。扩增产物经过电泳回收、将其连接在克隆载体pMD19(TaKaRa，中国大连)上，形成pMD19-8DP2载体，该载体经过转化大肠杆菌、验证和测序，结果表明扩增片段长度为2179bp，命名为8DP2，如SEQ ID NO.1所示。序列分析在PlantCare数据库进行(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，分析结果见图3，序列中除具有一般启动子所具有的大量TATA框和CAAT框以及较多的光反应元件外，还具有许多特异性响应元件，如厌氧反应元件(AAACCA)，油菜素内酯反应元件(CACGTG)，茉莉酸反应元件(CGTCA)，MYB结合位点(CAACCA)，防御与胁迫反应元件(CTATCTCTTA)等。

SEQ ID NO.1

CCTAAAGCAACCACATGCTTCATTGCTGTTTCTTTTTTCAATTAATCTAACATTCCAAACCATATCCTTCAACTACCCTTCAAAATTATATGGATATTCGTTTTTGAAAGGTTGAATATGCTACCATGATTATTATTTTTCAAATAAATTAAATTTCATTAAACATAATAAAATAAGGGTAGTAATAACTGTAATTAATCTTATCACTACATGAACGGAGACGATGGTGCACATCGACCAACAATTATAATCAAGGGCGAAGATAGAGAATTCTTTTAGGAGCTTGAATTAAGTTATTTTATATTGCTATAATTTGTTATTAGATCAAAAAAATTTCTATTTTAAAAAGGTCAAAGTGTAATTTTAACATTTACTAAATTAAAATCTTATAAAATGTAAAAGGTTAAAAGTGAAATTCCTTATTTTAGGGGACTGAAGCCGCTTACTGTATCCCTAAGACTAGTTGCACCGAGAGACGATGAAGATTTTATTTCTATGTAATGGTAAAAAAATTATGTTGTCATCACGTGACATCCTTCTCTATAAATATAGGTAGGTCCAATGTAATTTGATTTATACTTTGAAAATCAATACATATTTAAATAATTTAGAAGAGAGTATTGTATATGAAGATGATAACATTAATAAGTATATGAAGAAAAGCTCTTGTCTTGAAGGACTAAGCTAACATCACGTGGTTATATTTTACTACAAAATTGTGATTGTGTTAGGTTTGACTTCATTTCTTGTCGTCCAAGTAACAATATTTTCATGATGTAAACTTCAATCTTGACTAATTAAGTATAAATAATAATAATAATAACAACCAAAGCTGTCAAATTAATTGGAAAATTTCTATTAGGGATGAATTAATATCTACTCCATCACAACTTTTTCTAACTTTATTCTTGACATATTTTATCTATTTCGAAACTTGTCAACTTTATTAGGTGATGAATGGCACGACACAAATTTAAAGTGTCACATTATTATATTTTAATAAAATTTAAATTCAGAGACTAAATTAGAAAAAAAGTTCCTAAATTTCGAAACTAATGCAAACAAAAAGATCCCGTCACCAAAACGAACAAAATTATGACTAAATTTCATATTATCAAAAAGGAAAAACATGAGAAAATTTCAATCTTAATCTTAAAATTACTTGCAACTTGAAAGAATTTTCATGTACTTCTTTGCTTATTATAATATTTCTCTAGATCTATTCAAACATTGAATTATTTGATGATTAAAGTGATTGGACCGTTATTTCTACCATATAATAAAATAGATGTATTTAAATTTTCCTCTTTTAAAGGTGAGTTTGGATGGGCAGTGCGTTTATCTACAGTTAGTGTAAAAACAGTGGTGGCGGTGAGATTAGATACTGTAGCGTGAGACAAAAAGTAAGCTAAACGCACCGCACCGCACTCAAAACCCAATCGCCCACCCAAACCCACCCTAAGTCAACAAGATTTTATATTAATTACAAGGGTAAGTTTTGAGCAATAAAATCTCAAATAGTTAAAACCTATTTATTTACATACCTTTTTTAGAATTTATTTAAAAGGAAAACCACCCATATTTAACTAAAAAAAGTATTTTGTTATACAATTGCCTTCATTTAATTCAATAGAAACACATTTAATTTTTTTTCTATAAAAAGTATTATAATAAATATAAATAAGTTTCATTTTATCTTTTAGATAATTTATTTTAAAAATATAAAAAAGCAACCACTACATTTTGTTAAATTTAAAAAGGTTAAATATGCTTCAAATCTCTGTATTCTTTGTACATTTAGCATTTAGTCCCTCTCCTTTATTTTTCATGAATTTAGTCTTTGTACTTTTCAGATTTCAAAATTCAAGTTTAATTATTAACACTGTTAAAATTATTCCATTAAATTTGTCGATCTGACAGTTTTAATTAAACAAAAAACCATTGAAATGAACTTGAATTTAACAAAAGAATGTTAATAGGGTTTAACAATAAGACTTACATTTTTAAATTAAAAAAGTAGAGGGACTAAATCCCTTATTTTTCCTCATTCAATTTCATCCTTCTCTTTTTATTTTGGCTTTTGCTTTGCATGTGAGCTCTATAAACCCCGCCTCCCATTTTCCTCTACATCATGATAAATTCATATCACTTCCCTTCCATTCTCCACCACATGCAAACC

实施例2

8DP2启动子分析植物表达载体pBI121-8DP2::GUS的构建

用HindⅢ和XbaⅠ内切酶从pMD19-8DP2载体上切下8DP2片段，连接到用HindⅢ和XbaⅠ双酶切的pBI121载体片段上，从而使8DP2片段置换了pBI121载体中的CaMV35S启动子。通过酶切验证(见图5)，构建成植物表达载体pBI121-8DP2::GUS(见图4)。

如图4所示，植物表达载体pBI121-8DP2::GUS中，LB为T-DNA区段左边界；RB为T-DNA区段右边界；Kan^r为卡那霉素抗性基因；GUS为β-葡萄糖酸苷酶基因(报告基因)；Nos-T为冠瘿碱合成酶基因终止子。

图5中，M为DNA Marker；1～5表示已经接入8DP2片段的pBI121-8DP2::GUS质粒。样品1-5中酶切出2000bp左右的片段，说明载体质粒中已经含有8DP2片段，启动子8DP2已经成功***pBI121载体，植物表达载体pBI121-8DP2::GUS构建成功。

实施例3

1、棉花的遗传转化

用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株并进行棉花遗传转化。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404菌株。

上述的植物表达载体通过农杆菌介导棉花下胚轴转化方法导入棉花。具体方法如下：

冀棉14(河北农业大学提供)种子剥去外壳，用0.1％的升汞(HgCl₂)灭菌10分钟，用大量无菌水冲洗8次。在125毫升三角瓶中加入约35毫升无菌水震荡过夜，次日换一次无菌水。当种子长出下胚轴根后，播种于种子萌发培养基上，在28℃，黑暗条件下萌发2～3天，此时种子下胚轴开始进入快速伸长的时期，适宜进行遗传转化。

转化用的含pBI121-8DP2::GUS植物表达载体的农杆菌菌株在含50毫克/升卡那霉素(Kan)和125毫克/升链霉素(Sm)的YEB固体培养基上活化。挑取其单菌落，接种于5毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200转/分钟震荡培养过夜。培养后的农杆菌菌液按1︰20的比例转接到25毫升含相同抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD600值约为0.6～0.8，10000转/分钟、1分钟离心收集菌体，菌体用等体积的液体共培养基重悬备用。

转化时，将棉花下胚轴切成1.5～2.0厘米的小段，放入三角瓶中用制备好的农杆菌菌液侵染，条件为28℃摇床120转/分钟，侵染30分钟。然后吸干菌液，将下胚轴段转到共培养基上，28℃暗培养2-3天。

共培养后，下胚轴段转入到下胚段筛选培养基，28℃光照培养，约20天继代一次，直到出现大量愈伤组织。愈伤组织连同下胚段转移到胚性愈伤诱导培养基，约15天继代一次，直到出现大量的浅黄色胚性愈伤。胚性愈伤挑到胚性愈伤悬浮培养基中，28℃、120转/分钟摇床培养一周左右。用减去尖头的1.0毫升枪头吸取细沙状的体胚平铺于体胚伸长培养基，20-30天后出现大量的绿色小体胚。挑取生长状态良好的体胚继代培养，待体胚伸长到1-2厘米时，将其转移到成苗培养基生根出苗。幼苗生长到3-5厘米高时，通过嫁接或者移栽的方式转移到温室花钵中生长。其中，本实验例中所用的培养基如表1所示。

表1根癌农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化所用培养基

注:MS(基础盐混合物)：Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986.

2、转基因棉花的分子验证

取棉花抗性苗幼叶，利用北京艾德来(Aidlab，中国)生物科技公司的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN15)提取棉花的基因组DNA，-20℃保存备用。具体操作按说明书进行。以8DP2-up(5'-CCTAAAGCAACCACATGCTTC-3')(如SEQ ID NO.6所示)和结合GUS基因5'-端的3'引物GUS-down(5'-ATCGAAACGCAGCACGATACG-3')(如SEQ ID NO.8所示)扩增抗性棉花基因组DNA，预计扩增片段大约2.4kb。20微升的反应体系包含约20纳克棉花DNA，10微升2XPrimeSTAR Max Premix(宝生物工程有限公司，TaKaRa,中国大连，货号：R045)，5微摩/升的上下游引物各1微升，加水补足至20微升。扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒，52℃，30秒，72℃，20秒，35个循环；72℃延伸30秒。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

如图6所示，M为DNA Marker；“+”为阳性对照(煮沸过的pBI121-8DP2::GUS农杆菌液)；“W”为以水为模板的扩增产物；“C”为阴性对照(未转基因的棉花)；1为转基因后再生的卡那霉素(Kan)抗性苗，表示T-DNA区段已经整合到转基因棉花基因组中。从图6中可以看出，从抗性棉花植株中扩增出了约2.4kb的启动子序列和部分GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)的特异带，说明外源片段已经整合到转基因棉花植株的基因组中。

3、转基因棉花中GUS活性的检测

随机选取5株PCR阳性的转基因棉花植株进行全面的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性检测，GUS的表达特性基本一致。检测了根、茎、叶、花的表达情况，检测结果如图7和图8所示，图中Non-T是非转基因的野生型棉花；8DP2-GUS是pBI121-8DP2::GUS载体转基因棉花；35S-GUS为pBI121载体转基因棉花。除在雄蕊中检测到微弱的GUS信号外，在所有检测样品中都没有检测到阳性信号，说明8DP2启动子在棉花的根、茎、叶、叶柄和花器官中均不表达。

进而检测了纤维不同发育时期的GUS表达情况，如图9所示，图中Non-T是非转基因野生型棉花不同发育时期的纤维；8DP2-GUS是pBI121-8DP2::GUS载体转基因棉花不同发育时期的纤维；35S-GUS是pBI121载体转基因棉花不同发育时期的纤维；5DPA～30DPA分别表示开花后5天至开花后30天的纤维。在开花后5天的纤维细胞上几乎没有GUS信号，在开花后10天和15天的纤维中有较高的GUS信号，在开花后20天到开花后30天纤维中有较低的GUS信号。与35S-GUS的样品相比较，8DP2-GUS样品各个时期的GUS信号较弱。说明8DP2启动子是一个纤维细胞特异表达启动子，在纤维快速伸长期高量表达，在纤维伸长后期和次生壁合成期表达较低，其表达效率低于组成型强启动子CaMV35S。

本申请提供了一个鞘脂delta8去饱和酶基因Ghdelta8DES1的启动子(8DP2)及应用，该启动子是一个棉花纤维细胞特异表达启动子；本发明利用基因工程技术成功地分离了棉花纤维特异表达的Ghdelta8DES1基因的启动子，所述8DP2启动子含2179bp片段；本发明还验证了所述8DP2启动子序列在棉花中具有纤维表达特异性，能够指导报告基因在棉花纤维中特异性表达，为利用基因工程改良棉花纤维的品质和产量提供了纤维特异性表达的启动子序列。

本申请的8DP2启动子与组成型强启动子(如CaMV35S启动子)相比，具有稍弱的表达效率(多数纤维特异性启动子表达效率均低于CaMV35S启动子)和纤维表达特异性；在改良纤维的基因工程中，能够很好地避免目的基因在其它组织器官表达带来的副作用。为进一步研究基因在纤维发育中的功能提供了新选择，同时为改良棉花品种和纤维品质的分子设计提供了有效途径。

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者***不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者***所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者***中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 棉花纤维特异表达启动子8DP2及其应用

<130> CQ302-19P122631

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2179

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum L.

<400> 1

cctaaagcaa ccacatgctt cattgctgtt tcttttttca attaatctaa cattccaaac 60

catatccttc aactaccctt caaaattata tggatattcg tttttgaaag gttgaatatg 120

ctaccatgat tattattttt caaataaatt aaatttcatt aaacataata aaataagggt 180

agtaataact gtaattaatc ttatcactac atgaacggag acgatggtgc acatcgacca 240

acaattataa tcaagggcga agatagagaa ttcttttagg agcttgaatt aagttatttt 300

atattgctat aatttgttat tagatcaaaa aaatttctat tttaaaaagg tcaaagtgta 360

attttaacat ttactaaatt aaaatcttat aaaatgtaaa aggttaaaag tgaaattcct 420

tattttaggg gactgaagcc gcttactgta tccctaagac tagttgcacc gagagacgat 480

gaagatttta tttctatgta atggtaaaaa aattatgttg tcatcacgtg acatccttct 540

ctataaatat aggtaggtcc aatgtaattt gatttatact ttgaaaatca atacatattt 600

aaataattta gaagagagta ttgtatatga agatgataac attaataagt atatgaagaa 660

aagctcttgt cttgaaggac taagctaaca tcacgtggtt atattttact acaaaattgt 720

gattgtgtta ggtttgactt catttcttgt cgtccaagta acaatatttt catgatgtaa 780

acttcaatct tgactaatta agtataaata ataataataa taacaaccaa agctgtcaaa 840

ttaattggaa aatttctatt agggatgaat taatatctac tccatcacaa ctttttctaa 900

ctttattctt gacatatttt atctatttcg aaacttgtca actttattag gtgatgaatg 960

gcacgacaca aatttaaagt gtcacattat tatattttaa taaaatttaa attcagagac 1020

taaattagaa aaaaagttcc taaatttcga aactaatgca aacaaaaaga tcccgtcacc 1080

aaaacgaaca aaattatgac taaatttcat attatcaaaa aggaaaaaca tgagaaaatt 1140

tcaatcttaa tcttaaaatt acttgcaact tgaaagaatt ttcatgtact tctttgctta 1200

ttataatatt tctctagatc tattcaaaca ttgaattatt tgatgattaa agtgattgga 1260

ccgttatttc taccatataa taaaatagat gtatttaaat tttcctcttt taaaggtgag 1320

tttggatggg cagtgcgttt atctacagtt agtgtaaaaa cagtggtggc ggtgagatta 1380

gatactgtag cgtgagacaa aaagtaagct aaacgcaccg caccgcactc aaaacccaat 1440

cgcccaccca aacccaccct aagtcaacaa gattttatat taattacaag ggtaagtttt 1500

gagcaataaa atctcaaata gttaaaacct atttatttac ataccttttt tagaatttat 1560

ttaaaaggaa aaccacccat atttaactaa aaaaagtatt ttgttataca attgccttca 1620

tttaattcaa tagaaacaca tttaattttt tttctataaa aagtattata ataaatataa 1680

ataagtttca ttttatcttt tagataattt attttaaaaa tataaaaaag caaccactac 1740

attttgttaa atttaaaaag gttaaatatg cttcaaatct ctgtattctt tgtacattta 1800

gcatttagtc cctctccttt atttttcatg aatttagtct ttgtactttt cagatttcaa 1860

aattcaagtt taattattaa cactgttaaa attattccat taaatttgtc gatctgacag 1920

ttttaattaa acaaaaaacc attgaaatga acttgaattt aacaaaagaa tgttaatagg 1980

gtttaacaat aagacttaca tttttaaatt aaaaaagtag agggactaaa tcccttattt 2040

ttcctcattc aatttcatcc ttctcttttt attttggctt ttgctttgca tgtgagctct 2100

ataaaccccg cctcccattt tcctctacat catgataaat tcatatcact tcccttccat 2160

tctccaccac atgcaaacc 2179

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 3

cctaccacta ccatcatggc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 4

gatacagagt ggttggatag g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 5

gatcctagca aagcacatga c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 6

cctaaagcaa ccacatgctt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 7

ggtttgcatg tggtggagaa t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Synthetic

<400> 8

atcgaaacgc agcacgatac g 21

Claims (9)

1.棉花纤维特异性表达启动子8DP2，其特征在于，所述启动子8DP2的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.含有如权利要求1所述启动子8DP2的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，所述植物表达载体为pBI121-8DP2::GUS。

4.含有权利要求2或3所述的表达载体的宿主，其特征在于所述宿主为根癌农杆菌。

5.如权利要求1所述的棉花纤维特异性表达启动子8DP2在制备转基因植物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述转基因植物为棉花。

7.如权利要求2或3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为棉花。

9.利用权利要求1所述的棉花纤维特异性表达启动子8DP2制备转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述启动子8DP2可操作地***到表达载体中，构建植物表达载体；

(2)将获得植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(3)用所述转化体转化植物，培养转化后的植物，获得转基因植物。

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