CN101878298B - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents

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本发明提供促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。具体地讲，本发明提供形成胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。此外，本发明还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。本发明还提供在衍生自多能干细胞的胰岛素产生细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法。

Description

人胚胎干细胞的分化
技术领域
本发明提供促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。具体地讲，本发明提供形成胰腺激素表达细胞和胰腺激素分泌细胞的改进方法。此外，本发明还提供在不使用饲养细胞层的情况下促进多能干细胞分化的方法和与该方法相关或由该方法产生的产物。本发明还提供在衍生自多能干细胞的胰岛素产生细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。诸如例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标志物，例如HNF-3β、GATA4、Mixll、CXCR4和Sox-17。
多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养***中培养多能干细胞，所述培养***基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology 18：399-404(2000))和Thompson等人(Science，1998年11月6日：第282卷，第5391期，第1145-1147页)公开了用小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞层来培养来自人胚泡的多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells 21：546-556，2003)对一组11种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养的能力进行了评价。Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养层上培养的人胚胎干细胞系保持了人胚胎干细胞形态并保持了多能性”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的***系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
又如，Wang等人(Stem Cells 23：1221-1227，2005)公开了用于人多能干细胞在衍生自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期生长的方法。
又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23：306-314，2005)公开了一种衍生自人胚胎干细胞的自发分化的饲养细胞***。
在另一例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22：433-440，2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞的来源。
Amit等人(Biol.Reprod 68：2150-2156，2003)公开了衍生自人***的饲养细胞层。
又如，Inzunza等人(Stem Cells 23：544-549，2005)公开了来自人出生后***成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声 称：“本发明包括从胚胎组织获得或从胚胎干细胞分化而来的***系和成纤维细胞样细胞系。在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以及用该调理培养基培育干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了一种用于哺乳动物细胞的维持、增殖和分化的调理培养基。WO2005014799声称：“通过鼠细胞(特别是分化并永生化的转基因肝细胞，称为MMH(Met鼠肝细胞))的细胞分泌活性对根据本发明制备的培养基进行调理”。
又如，Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的调理培养基，所述干细胞衍生物已经过遗传修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确定的培养基。
一种可供选择的培养***采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprod DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养细胞的无血清培养***，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
又如，Levenstein等人(Stem Cells 24：568-574，2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或调理培养基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
又如，US20050148070公开了一种在无血清且无成纤维细胞饲养细胞的成分确定的培养基中培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代品、至少一种胰岛素或胰岛素替代品的培养基中培养干细胞，该培养基基本上无哺乳动物胎儿血清且含有至少约100ng/ml能激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的成纤维细胞生长因子，其中该生长因子的供给来源不是仅为成纤细胞饲养层，该培养基支持干细胞在无饲养细胞或调理培养基的情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的化学成分确定的培养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，该培 养基与被培养的干细胞基本上等渗。在给定的培养物中，特定的培养基包含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行基本上非分化性生长所必需。
又如，US6800480声称“在一个实施例中，提供了用于培养处于基本上未分化状态的衍生自灵长类的原始干细胞的细胞培养基，其包括可有效支持衍生自灵长类的原始干细胞生长的低渗透压、低内毒素的基础培养基。该基础培养基与可有效支持衍生自灵长类的原始干细胞生长的营养血清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质物质相混合。该培养基还包括非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
又如，US20050244962声称：“在一个方面，本发明提供了培养灵长类胚胎干细胞的方法。可在基本上无哺乳动物胎儿血清(优选还基本上无任何动物血清)的培养物中且在存在成纤维细胞生长因子的情况下培养所述干细胞，该成纤维细胞生长因子的供给来源不是仅为成纤维细胞饲养层。在优选的形式中，通过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成纤维细胞饲养层变得非必需”。
在又一个实例中，WO2005065354公开了一种基本上无饲养细胞和无血清的成分确定的等渗培养基，包含：a.基础培养基；b.bFGF，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；c.胰岛素，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长；和d.抗坏血酸，其量足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGFβ)蛋白家族的成员、成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基底上培养和分化。可在对组织培养基底进行涂覆前，将细胞外基质进行稀释。适于稀释细胞外基质以及涂布组织培养基底的方法的例子可见于Kleinman，H.K.等人，Biochemistry 25：312(1986)和Hadley，M.A.等人，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
在一个例子中，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞，产生了类似β细胞的细胞。
在另一例子中，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury+/HNF-3β+内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO 99/20741、WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特征的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D’Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出一种将人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素即胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长素释放肽(ghrelin)的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生。”
在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的***(US2006/0040387A1)。在这个情况中，分化途径分成三个阶段。首先用丁酸钠和激活素A的组合使人胚胎干细胞分化成内胚层。然后将细胞 与TGF-β拮抗剂(例如成头蛋白(Noggin))结合EGF或β细胞素一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论认为，Pdx1的过量表达增强了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。”
又如，Odorico等人报道了用于体外引导哺乳动物多能干细胞向胰腺谱系细胞分化的方法。该方法涉及在存在有效量的骨形态发生蛋白的情况下培养干细胞以诱导朝中内胚层方向的分化。进一步培养这些中内胚层细胞以形成富有定形内胚层定型细胞的拟胚体(EB)，其在限定的条件下最终向胰腺谱系细胞分化(US20070259423)。
又如，Tulachan等人(Developmental Biology，305，2007，第508-521页)声称：“在胚胎期抑制TGF-B信号转导可因而使得胰腺上皮细胞能朝内分泌谱系发展(Inhibition ofTGF-B signaling in the embryonic period may thus allow pancreatic epithelialcells to progress towards the endocrine lineage)”。
因此，仍明显需要开发用于建立能扩增以满足目前临床需要，同时又保持分化成胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞或胰腺激素分泌细胞的潜力，并且具有能响应葡萄糖浓度变化而分泌胰岛素的能力的多能干细胞系的条件。已采取一种替代方法来提高人胚胎干细胞向能响应葡萄糖水平的改变而分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞分化的效率。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供从多能干细胞产生能够进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌的细胞的方法，包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供在衍生自多能干细胞的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法，包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，通过用任何一种如下方法处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，从表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化得到表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞：
a.用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有该成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂的培养基并随后在将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂的培养基中进行培养，或
b.用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
c.用视黄酸、音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子和至少一种能抑制BMP的因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
d.用视黄酸、音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子和导蛋白(netrin)处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
e.用视黄酸、音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子、至少一种能抑制BMP的因子和导蛋白处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
f.用至少一种成纤维细胞生长因子、音猬蛋白抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除所述至少一种成纤维细胞生长因子和所述音猬蛋白抑制剂，随后用音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子和视黄酸处理所述细胞，或
g.用至少一种成纤维细胞生长因子、音猬蛋白抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除所述至少一种成纤维细胞生长因子和所述音猬蛋白抑制剂，随后用音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子、视黄酸和至少一种能抑制BMP的因子处理所述细胞，或
h.用至少一种成纤维细胞生长因子、音猬蛋白抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除所述至少一种成纤维细胞生长因子和所述音猬蛋白抑制剂，随后用音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子、视黄酸和导蛋白处理所述细胞，或
i.用至少一种成纤维细胞生长因子、音猬蛋白抑制剂处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除所述至少一种成纤维细胞生长因子和所述音猬蛋白抑制剂，随后用音猬蛋白抑制剂、至少一种成纤维细胞生长因子、视黄酸、至少一种能抑制BMP的因子和导蛋白处理所述细胞，或
在一个实施例中，通过用任何一种如下方法处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，从表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化得到表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞：
a.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有γ分泌酶抑制剂和GLP-1激动剂的培养基中培养，然后移除该含有γ分泌酶抑制剂和GLP-1激动剂的培养基，接着将细胞在含有GLP-1激动剂、IGF-1和HGF的培养基中培养，或
b.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有GLP-1激动剂的培养基中培养，然后移除该含有GLP-1激动剂的培养基，接着将细胞在含有GLP-1激动剂、IGF-1和HGF的培养基中培养，或
c.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有γ分泌酶抑制剂和GLP-1激动剂的培养基中培养，或
d.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有GLP-1激动剂的培养基中培养，或
e.用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
f.用抑制TGF-βR-1途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
g.用抑制Notch信号传导途径的因子和抑制TGF-βR-1途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，或
h.将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有约10mM至约20mM葡萄糖和GLP-1激动剂的培养基中培养。
附图说明
图1示出了本发明所用的分化方案的略图。分图a)指美国专利申请系列号11/736,908中报道的方法，分图b)和c)是本发明的方法。
图2示出了根据实例2中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。绘出了在阶段3至5(S3-S5)胰腺内胚层标志物(PDX-1，ISL-1)和内分泌标志物(NeuroD，胰岛素和胰高血糖素)的表达。在阶段4至5的胰岛素和胰高血糖素的表达有显著增加。
图3示出了根据实例3中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。阶段3至5的胰腺内分泌标志物a)胰岛素，b)NKX2，c)胰高血糖素，d)NeuroD，以及胰腺内胚层标志物d)PDX-1。在阶段3、阶段4或在阶段3和4评价了多种激酶抑制剂的作用。(+/+指在阶段3和4均存在具体化合物，+/-指在阶段3存在具体化合物而在阶段4不存在，-/+指在阶段4存在具体化合物而在阶段3不存在)。
图4示出了根据实例4中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。绘出了阶段3至5的胰腺标志物a)胰高血糖素和胰岛素，b)HAND1和NeuroD，c)HNF4a和PDX-1，d)NKX2.2和Sox17。在阶段4、阶段5或在阶段4和5评价了ALK5抑制剂II的作用。(+/+指在 阶段4和5均存在抑制剂，+/-指在阶段4存在具体化合物而在阶段5不存在，-/+指在阶段5存在具体化合物而在阶段4不存在)。
图5示出了根据实例5中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。绘出了在阶段4至5时1-10μm ALK5抑制剂I和II对a)胰高血糖素、b)胰岛素、c)PDX-1、d)NeuroD的表达的作用。对照处理在分化过程不包含任何ALK5抑制剂。
图6示出了根据实例6中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。绘出了在阶段3至5时1μm ALK5抑制剂和0-500ng/ml重组人成头蛋白对a)白蛋白、b)CDX2、c)胰岛素、d)胰高血糖素、e)PDX-1、f)NeuroD和g)NKX2.2的并用作用。ALK5抑制剂在阶段4和5添加，成头蛋白在阶段3添加。
图7示出了根据实例7中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。绘出了在阶段4至5时1μm ALK5抑制剂和100ng/ml重组人成头蛋白对a)胰岛素、b)胰高血糖素、c)ngn3、d)NeuroD、e)CDX-2、f)PDX-1的并用作用。ALK5抑制剂在阶段4和5添加，成头蛋白在阶段3、4或阶段3和4中添加。
图8示出了根据实例7所公开的方法分化的细胞的形态。a)阶段5第6天的细胞的4倍相差显微镜图像，b)阶段5第6天的细胞的10倍相差显微镜图像，c)阶段5第12天的细胞的4倍相差显微镜图像，d)阶段5第12天的细胞的10倍相差显微镜图像。
图9示出了根据实例7所公开的方法分化的细胞的免疫荧光图像。细胞为在阶段5第12天时的a)单个簇的胰岛素染色以及b)DAPI核染色。
图10示出了根据实例7中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。
图11示出了根据实例8中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。数据绘出了在阶段3和4添加的成头蛋白连同在阶段4添加的Netrin-4和/或ALK 5抑制剂对a)ngn3、b)PDX-1、c)NeuroD、d)Pax4、e)胰岛素和f)胰高血糖素的表达的并用作用。
图12示出了根据实例8中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。分图a)胰岛素、b)胰高血糖素、c)ngn3、d)NKX2.2、e)NeuroD和f)PDX-1。
图13示出了延长的阶段5培养物的体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS).在阶段5的培养物中在第a)6、b)12和c)8-20天，用葡萄糖激发根据实例9中所公开的方法制备的阶段5细胞。
图14示出了Netrin-1或Netrin-2对内分泌标志物表达的作用。根据实例10中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。
图15示出了使用诱导定形内胚层的备选方法对内分泌标志物的诱导。根据实例11中所公开的方法分化的、人胚胎干细胞系H1细胞的实时PCR分析。分图a)胰岛素，b)胰高血糖素，c)NKX2.2，d)Pax4，f)PDX-1和g)NeuroD。
图16示出了在图1c所列分化方案的多个阶段的多种标志物的表达。分图a)：示出了在阶段1的第三天，H1细胞中通过FACS测定的CXCR4的表达。分图b)示出了在阶段1的第三天，细胞中通过实时PCR测定的定形内胚层谱系和胚外谱系的特征性标志物的表达。分图c)-n)示出了在阶段2-6末收获的细胞中通过实时PCR测定的多种基因的表达。
图17示出了与成人胰岛相比的、在图1c所列分化方案的阶段6末时的细胞中C-肽和前胰岛素含量。
图18
示出了在图1c所列分化方案的阶段6末时，细胞中胰岛素的表达(分图a)、突触素的表达(分图b)和突触素(X-轴)和胰岛素(Y-轴)的共表达(分图c)。
图19示出了在图1c所列分化方案的阶段6末时，细胞中突触素的表达(分图a和c)和胰岛素的表达(分图b和d)，所述细胞在阶段3-4用100ng/ml Chordin而不是用成头蛋白处理。
图20示出了根据图1c所列分化方案处理过的人胚胎干细胞系H9细胞中，多种标志物的表达。所示数据是在阶段3-6末收获的细胞中，通过实时PCR测定的a)HNF4a、b)HNF6、c)CDX2、d)PDX-1、e)NKX6.1、f) Pax4、g)NKX2.2、h)NeuroD、i)NGN3、j)PECAM、k)胰高血糖素和1)胰岛素的表达。
图21示出了根据图1c所列分化方案处理过的人胚胎干细胞系H1细胞中，多种标志物的表达，其中细胞用B27或N2处理。所示数据是在阶段3-6末收获的细胞中，通过实时PCR测定的a)CDX2、b)胰高血糖素、c)胰岛素和d)PDX-1。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于它们能够在体外分化成多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞，以及在移植后产生多种胚层组织，并在注射进囊胚后形成基本上大部分(如果不是全部)组织。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理***内能产生所有的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的或分化诱导的细胞是在细胞的谱系当中具有较为特化的(“定向的”)地位的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞的谱系将该细胞置于发育和分化的遗传安排(hereditary scheme)当中。谱系特征性标志指与目的谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向目的谱系的分化。
“β-细胞谱系”是指对于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种具有阳性基因表达的细胞：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
如本文所用的，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种如下标志物的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用的，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX-1、HNF-1β、PTF-1α、HNF-6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用的，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6.1、Pax-4、或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰腺激素表达细胞、胰腺激素分泌细胞和β-细胞谱系的细胞。
如本文所用的，“定形内胚层”是指这样一种细胞，其具有在原肠胚形成期间来源于上胚层的细胞的特征，并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA-4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和Mixll。
如本文所用的，“胚外内胚层”是指表达至少一种下列标志物的细胞群：SOX-7、AFP和SPARC。
如本文所用的，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在这个情形中，差异表达意思是阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在目的细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将目的细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用的，“中内胚层细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用的，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”是指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。
如本文所用的，“胰腺内胚层细胞”指能够表达至少一种下列标志物的细胞：NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、PAX-4、NKX2.2。
如本文所用的，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用的，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用的，“后前肠细胞”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：PDX-1、HNF-1、PTF-1A、HNF-6、HB-9、PROX-1。
如本文所用的，“前原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Nodal或FGF8。
如本文所用的，“原肠管细胞”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：HNF-1、HNF-4A。
如本文所用的，“原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Brachyury、Mix样同源盒蛋白或FGF4。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特征性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述的(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞还通常表达Oct-4和TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。多能干细胞的多能性可例如通过这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三个胚层的细胞类型。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
增殖的多能干细胞系可以用标准G-显带技术进行核型分析并与所公开的相应灵长类物种的核型相比较。理想的是获得具有“正常核型”的细胞，“正常核型”的细胞意指该细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括确立多能细胞系。非限制性实例是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养***中培养多能干细胞，所述培养***基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化 学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基质是 (Becton Dickenson)。是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重组基底膜。
其他的胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特征得益于密切注意接种分布，并可由本领域的技术人员容易地确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
从多能干细胞形成能够进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌的细胞
在一个实施例中，本发明提供从多能干细胞产生能够进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌的细胞的方法，包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供在衍生自多能干细胞的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞中促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的方法，包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH编码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH编码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH编码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。能表达至少一种以下多能细胞特有标志物的细胞也适用于本发明：ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX-17、GATA4、Hnf-3beta、GSC、Cer1、Noda1、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱特征性标志物选自Pdx1、HNF-1β，PTF1a、HNF-6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系的特有标志物选自NGN-3、NeuroD、Islet-1、Pdx-1、NKX6.1、Pax-4和PTF-1 alpha。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多 肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰腺激素分泌细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞能表达Pdx1和至少一种以下转录因子：NGN-3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在血清不存在下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和血清一起培养，再然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A的培养基中在血清不存在下进行培养，然后将所述细胞与激活素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有激活素A和Wnt配体的培养基中在血清不存在下进行培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与激活素A和血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请系列号6I/076,889中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请系列号61/076,900中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请系列号61/076,908中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据美国专利申请系列号61/076,915中公开的方法处理多能干细胞，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能干细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征有待继续鉴定。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、cripto、FoxD3、Connexin43、Connexin45、Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给Lifescan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
b.用至少一种选自视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理约1至约6天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、音猬蛋白抑制剂、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理约6天。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个替代实施例中，本发明提供了使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
b.用至少一种选自视黄酸和成纤维细胞生长因子的因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
c.移除所述至少一种选自视黄酸和成纤维细胞生长因子的因子并随后用至少一种选自音猬蛋白抑制剂、视黄酸、成纤维细胞生长因子、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理细胞。
在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自视黄酸和成纤维细胞生长因子的因子处理约1至约3天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自视黄酸和成纤维细胞生长因子的因子处理约3天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自音猬蛋白抑制剂、视黄酸、成纤维细胞生长因子、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理约1至约4天。在一个实施例中，将表达定形内胚层特征性标志物的细胞用至少一种选自音猬蛋白抑制剂、视黄酸、成纤维细胞生长因子、能抑制BMP的因子和导蛋白的因子处理约4天。
任何表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，通过本发明方法产生的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞显示与肝脏和肠组织相关的标志物的表达水平降低。在一个实施例中，通过本发明方法产生的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞显示白蛋白和CDX-2的表达水平降低。
所述至少一种成纤维细胞生长因子选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10。
在一个实施例中，BMP为BMP4。在一个实施例中，所述至少一种能抑制BMP4的因子是成头蛋白。
导蛋白选自导蛋白1、导蛋白2和导蛋白4。
视黄酸可以约1nM至约1mM的浓度使用。在一个实施例中，视黄酸以1μM的浓度使用。
FGF-2可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-2以50ng/ml的浓度使用。
FGF-4可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-4以50ng/ml的浓度使用。
FGF-7可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-7以50ng/ml的浓度使用。
FGF-10可以约50pg/ml至约50μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，FGF-10以50ng/ml的浓度使用。
成头蛋白可以约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，成头蛋白以100ng/ml的浓度使用。
导蛋白1可以约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，导蛋白1以100ng/ml的浓度使用。
导蛋白2可以约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，导蛋白2以100ng/ml的浓度使用。
导蛋白4可以约500ng/ml至约500μg/ml的浓度使用。在一个实施例中，导蛋白4以100ng/ml的浓度使用。
在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种如下因子处理：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7或FGF-10、环巴胺、成头蛋白、导蛋白1、导蛋白2或导蛋白4。
在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-2、环巴胺和成头蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-4、环巴胺和成头蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-7、环巴胺和成头蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-10、环巴胺和成头蛋白处理。
在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-2、环巴胺和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层 谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-4、环巴胺和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-7、环巴胺和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-10、环巴胺和导蛋白处理。
导蛋白选自导蛋白1、导蛋白2和导蛋白4。
在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-2、环巴胺、成头蛋白和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-4、环巴胺、成头蛋白和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-7、环巴胺、成头蛋白和导蛋白处理。在一个实施例中，将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用视黄酸、FGF-10、环巴胺、成头蛋白和导蛋白处理。
导蛋白选自导蛋白1、导蛋白2和导蛋白4。
可以将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体(mimetobody)、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸-NA、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和 B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1998))。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明公开的任何方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个实例在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除该含有毒蜥外泌肽4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子 处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，通过用抑制TGF-βR-1途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。抑制TGF-βR-1途径的因子可为TGF-β细胞外受体-1的拮抗剂。或者，该因子抑制TGF-βR-1受体的生物学活性。或者，该因子抑制细胞内的TGF-βR-1信号传导途径中的元件或为该元件的拮抗剂。
将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制TGF-βR-1信号传导途径的因子处理约1至约12天。作为另一种选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制TGF-βR-1途径的因子处理约5至约12天。作为另一种选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制TGF-βR-1途径的因子处理约12天。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，本发明提供了使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的方法，包括以下步骤：
a.培养表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
b.用抑制Notch信号传导途径的因子和抑制TGF-βR-1信号传导途径处理细胞。
将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导途径的因子和抑制TGF-βR-1途径的因子处理约1至约12天。作为另一种选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导 途径的因子和抑制TGF-βR-1途径的因子处理约5至约12天。作为另一种选择，将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导途径的因子和抑制TGF-βR-1途径的因子处理约12天。
任何表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞均适用于使用本方法来分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，抑制Notch信号传导途径的因子是γ-分泌酶抑制剂。在一个实施例中，该γ-分泌酶抑制剂是1S-苄基-4R-[1-(1S-氨甲酰基-2-苯乙基氨甲酰基)-1S-3-甲基丁基氨甲酰基]-2R-羟基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也称为L-685，458。
L-685，458可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约80μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，L-685，458是以约10μM的浓度使用。
在一个实施例中，抑制TGF-βR-1信号传导途径的因子是TGF-βR-1激酶抑制剂。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂是(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)。在另一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂是[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑。
TGF-βR-1激酶抑制剂可以约0.1μM至约100μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约90μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约80μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约70μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约60μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约50μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约40μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约30μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约20μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约10μM的浓度 使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约1μM的浓度使用。在一个实施例中，TGF-βR-1激酶抑制剂以约0.1μM的浓度使用。
可以将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种其他额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和血小板衍生生长因子-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I，II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、Exendin-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β-巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂例如三乙烯五胺、毛喉素、丁酸-NA、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、轴索生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充剂(Gibco，CA)、甾族生物碱例如环巴胺(EMD，CA)、角质化细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体浸膏、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如NGN-3、NeuroD、Islet-1的表达。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他β细胞谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子的表达，例如Pdx1(胰十二指肠同源盒基因-1)、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnf1b、Hnf-6、Hnf-3β和MafA等等。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。作为另一种选择，可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：ColdSpring Harbor LaboratoryPress(1998))。
在本发明的一个方面，通过在处理后测定给定细胞培养物中胰岛素阳性细胞的百分比来确定分化的效率。在一个实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约100％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约90％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约80％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实 施例中，本发明方法在给定培养物中产生约70％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约60％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约50％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约40％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约30％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约20％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约10％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约5％的胰岛素阳性细胞。
在本发明的一个方面，通过测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌来确定分化的效率，胰岛素分泌可通过测量由细胞释放的C-肽的量测定。在一个实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约1000ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约900ngC-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约800ngC-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约700ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约600ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约300ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约200ngC-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约100ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约90ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约80ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约70ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约60ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约50ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞 可产生约40ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约30ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约20ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约10ng C-肽/pg DNA。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进患者中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及将多能干细胞进行培养，使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进该患者中。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)和胰高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可将这些细胞形成簇，可将 这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、原来的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与其同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，将生长因子用于使所施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该细胞掺入三维的支持物中。在移植进患者前，可将该细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成含有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药 物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂加入支持物中以改变药剂的释放速率。在一个替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog. 14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人发展了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(CentrifugationalCell Immobilization，CCI)。
本发明进一步通过如下实例举例说明，但不受限于如下实例。
实例
实例1
人胚胎干细胞培养物
从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。简而言之，将细胞在ES细胞培养基中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上进行培养，该培养基由补充有20％knoekout血清替代品、100nM MEM非必需氨基酸、0.5mMβ巯基乙醇、具有4ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺(全部得自Invitrogen/GIBCO)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBCO)组成。衍生自E13至13.5小鼠胚胎的MEF细胞从Charles River购得。将MEF细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM MEM非必需氨基酸的DMEM培养基中扩增。用10μg/ml丝裂霉素C(Sigma，St.Louis，MO)处理亚汇合的MEF细胞3小时以使细胞***停滞，然后用胰蛋白酶进行处理并以2x104/cm2接种于0.1％牛明胶涂覆的培养皿上。将传代两次至四次的MEF细胞用作饲养层。将接种于MEF细胞饲养层上的人胚胎干细胞在37℃的5％CO2气氛中，在调湿的组织培养箱内进行培养。当汇合时(接种后大约5-7天)，用1mg/ml IV型胶原酶(Invitrogen/GIBCO)处理人胚胎干细胞5-10分钟，然后用5ml吸管轻轻刮落。将细胞以900rpm离心5分钟，然后将沉淀物以细胞在新鲜培养基中为1∶3至1∶4的比率重新悬浮，并再次接种。
实例2
在涂覆有MATRIGELTM的组织培养基底上培养的人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的 分化。
将第45代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A (R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理三天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&DSystems，MN)中另外温育三天。图1a绘出了该方法的略图。从处于多个分化阶段的培养物收集RNA样品。图2示出了从在阶段3至5收获的细胞获得的实时PCR数据。在阶段4和5的细胞中观察到内分泌标志物(例如胰岛素和胰高血糖素)的表达，以及NeuroD的表达有显著增加。
实例3
多种化合物对根据图1a所列分化方案处理的多能干细胞中胰腺内分泌谱系特征 性标志物的表达的作用。
将第51代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4 (Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&DSystems，MN)中另外温育三天。在阶段3、阶段4或阶段3+4将一些培养物用1μm如下化合物处理：MEK/MAPK抑制剂(2′-氨基-3′-甲氧基黄酮)(PD98059，Calbiochem，CA)、RAF激酶抑制剂(5-碘-3-[(3，5-二溴-4-羟苯基)亚甲基]-2-吲哚酮)(#553008，Calbiochem，CA)、SMAD3抑制剂(6，7-二甲基-2-((2E)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基-丙-2-烯酰))-1，2，3，4-四氢异喹啉)(#566405，Calbiochem，CA)、AKT抑制剂(1L6-羟甲基-手性肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯)(#124005，Calbiochem，CA)、MEK抑制剂(#444937Calbiochem，CA)和TGF-B受体I抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)(抑制激活素受体样激酶5，#616452，Calbiochem，CA)。
图3a-e示出了从在阶段3至5末收获的细胞获得的实时PCR数据，所述细胞经所标明的条件处理。注意到，向阶段4的细胞或向阶段3和4的细胞添加TGF-B受体I激酶抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)显著增强了胰岛素、胰高血糖素、NeuroD和NKX2.2的表达，而稍微影响了在阶段5末时的PDX-1表达。仅向阶段3的细胞加入TGF-B受体I激酶抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)稍微上调了阶段5末的细胞中内分泌标志物的表达。
实例4
加入TGF-β受体I激酶抑制剂对根据图1a所列分化方案处理的多能干细胞中胰腺 内分泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第44代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA) +20ng/mlFGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&DSystems，MN)中另外温育三天。在阶段4、阶段5或阶段4和5，将一些培养物用1μm TGF-B受体I激酶抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)(激活素受体样激酶5的抑制剂，#616452，Calbiochem，CA)处理。
图4a-e示出了来自在阶段3至5末收获的且在阶段4至5添加或不添加激酶抑制剂的细胞的实时PCR数据。注意到，在阶段4或阶段4和5向细胞添加TGF-B受体I激酶抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)显著增强了胰岛素、胰高血糖素、NeuroD和NKX2.2的表达，而稍微影响了在阶段5末的PDX-1表达。仅在阶段5加入TGF-B受体I激酶抑制剂(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)稍微上调了阶段5末的细胞中内分泌标志物的表达。
实例5
多种TGF-β受体I激酶抑制剂对根据图1a所列分化方案处理的多能干细胞中胰腺 内分泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第41代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&DSystems，MN)中另外温育三天。在阶段4和5，将一些培养物用1-10μm TGF-B受体I激酶抑制剂(ALK5抑制剂II)(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶)(激活素受体样激酶5的抑制剂，#616452，Calbiochem，CA)或TGF-B受体I抑制剂I(ALK5抑制剂I)([3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑)(#616451，Calbiochem，CA)处理。
图5a-e示出了来自在阶段4-5末收获的、添加或不添加ALK5抑制剂I或II的细胞的实时PCR数据。注意到，与对照比较(标准处理)，在阶段4和5以1-10μm加入ALK5抑制剂I或II显著增加了在阶段4至5末胰岛素、胰高血糖素、PDX-1和NeuroD的表达。所有样品均一式三份。
实例6
成头蛋白和ALK5抑制剂对根据图1a所列分化方案处理的多能干细胞中胰腺内分 泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第41代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)+0-500ng/ml成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，Ca)+1μm ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&D Systems，MN)+1μm ALK5抑制剂II中另外温育三天。
图6a-g示出了来自在阶段3-5末收获的、添加或不添加0-100ng/ml成头蛋白的细胞的实时PCR数据。与未处理对照相比，在阶段3添加100ng/ml成头蛋白稍微增强了阶段4末胰岛素和胰高血糖素的表达，而显著抑制了白蛋白和CDX2的表达。添加500ng/ml成头蛋白没有影响PDX-1的表达，但却显著减弱了内分泌标志物连同白蛋白和CDX2的表达。白蛋白是肝脏前体细胞的标志物，而CDX2是肠细胞的标志物。
实例7
在阶段3加入成头蛋白以及在阶段4和5加入ALK5抑制剂对根据图1所列分化方案 处理的多能干细胞中胰腺内分泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第44代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，Ca)+1μm ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)+/-100ng/ml成头蛋白中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&D Systems，MN)+1μm ALK5抑制剂II中另外温育三天。
图7a-f示出了来自在阶段4-5末收获的、添加或不添加100ng/ml成头蛋白的细胞的实时PCR数据。在阶段3+4添加100ng/ml成头蛋白以及添加ALK5抑制剂II明显增加了阶段4-5的胰岛素和胰高血糖素的表 达。具体地讲，与未处理样品比较，在阶段3和4两个阶段添加成头蛋白显著增加了NGN3(内分泌前体标志物)的表达，同时显著抑制了白蛋白和CDX2的表达。
图8a-d绘出了根据上述方案的培养物的相差显微镜图像。在一些培养物中，将阶段5从3天延长至21天。到在阶段5培养基中培养的10-12天，有类似人胰岛的明显的细胞簇存在于整个培养皿中。分图a和b示出了阶段5中第6天培养物的图像，而分图c-d示出了阶段5第12天的培养物的图像。手动移出一些细胞簇，接种于1∶30MATRIGEL-涂覆的培养皿上的阶段5培养基。在温育2天后，针对胰岛素和胰高血糖素对所述细胞簇染色。大部分图9a-b中所示簇中大部分细胞对人胰岛素是阳性的。为了进一步优化BMP抑制剂成头蛋白的剂量，在阶段2-4将培养物用0、10、50或100ng/ml的成头蛋白进行处理。图10示出了在阶段2-4用多种剂量的成头蛋白处理的培养物在阶段4的NGN3表达。看起来，50-100ng/ml的成头蛋白导致NGN3在阶段4有最大表达。
实例8
在阶段3-4加入成头蛋白、在阶段4加入导蛋白以及在阶段4加入ALK5抑制剂对根 据图1所列分化方案处理的多能干细胞中胰腺内分泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第48代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有2％脂肪酸BSA和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/mlWNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)+1μm ALK5抑 制剂II(Calbiochem，Ca)+/-100ng/ml成头蛋白+100ng/ml导蛋白-4中温育培养三天。
图11a-f示出了来自在阶段4末收获的、在阶段4添加或不添加100ng/ml导蛋白-4的细胞的实时PCR数据。在阶段3和4添加100ng/ml成头蛋白加上在阶段4添加ALK5抑制剂II和100ng/ml导蛋白-4明显增强了NGN3、NeuroD和Pax4在于阶段5末收获的细胞中的表达。
在一些阶段4培养物中，忽略成头蛋白而添加导蛋白-4加Alk5抑制剂。图12a-d表明，在于阶段5末收获的细胞中，在阶段4忽略成头蛋白显著减少了NGN3、NKX2.2和NeuroD的表达，而只稍微影响胰岛素和胰高血糖素的表达。
实例9
根据图1b所列分化方案处理的多能干细胞的体外葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)。
将第48代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有2％脂肪酸BSA和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/mlWNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，Ca)+1μm ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)+/-100ng/ml成头蛋白+100ng/ml导蛋白-4中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/mlExendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&D Systems，MN)+1μmALK5抑制剂II中另外温育3-21天。
通过在37℃下在KREBS缓冲液(克-林二氏溶液：0.1％BSA，10mM HEPES，5mMNaHCO3，129mM NaCl，4.8mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，5mM NaHCO3)中洗涤1小时，然后在KREBS缓冲液加2mM D-葡萄糖中温育1小时，以及在KREBS缓冲液加20mMD-葡萄糖中另外温育1小时，在第6、8、12和20天测试阶段5培养物的GSIS。每次温育后，移出上清液并冷冻于-20℃下以用于进一步分析。用超敏C-肽ELISA(Alpco Diagnostics，Sweden)测定分泌的C-肽的水平。图13a-c绘出了响应体外葡萄糖激发而分泌的人C-肽的水平。在阶段5的早期和中间温育期没有导致显著的刺激指数(高剂量葡萄糖下分泌的C-肽与低剂量葡萄糖下分泌的C-肽之比)，而在阶段5培养基中温育20天的样品显示出强劲的响应葡萄糖的刺激。这表明，延长暴露于阶段5培养基确实导致细胞簇的成熟，其显示出GSIS的迹象。
实例10
加入导蛋白-1或导蛋白-2受体对根据图1b所列分化方案处理的多能干细胞中胰 腺内分泌谱系特征性标志物表达的作用。
将第44代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。
接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)中培养六天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+50ng/ml IGF(Peprotech，NJ)+50ng/ml HGF(R&DSystems，MN)中另外温育三天。在一些培养物中，在阶段2-5加入50ng/ml的导蛋白-1或导蛋白-2(R&D Systems，MN)。图14示出了来自在阶段5收获的、在阶段2至5添加或不添加50ng/ml导蛋白-1或导蛋 白-2的细胞的实时PCR数据。导蛋白-1或导蛋白-2的加入确实在阶段5末收获的细胞中显著上调了胰高血糖素和胰岛素表达。
实例11
诱导定形内胚层谱系特征性标志物表达的备选方法。
将第48代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并让其向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化，这可通过：
a.在补充有1％B27添加剂(Invitrogen，Ca)和50ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加1mM丁酸钠(Sigma，MO)的RPMI培养基中培养一天，然后用补充有1％B27添加剂(Invitrogen，Ca)和50ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加0.5mM丁酸钠(Sigma，MO)的RPMI培养基另外处理三天来进行，或通过
b.在补充有0.5％FBS和100ng/ml激活素-A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)的DMEM/F12培养基中培养两天，然后用补充有2％FBS和100ng/ml激活素-A(AA)的DMEM/F12培养基另外处理两天来进行。
接着，将培养物用DMEM/F12+2％FBS+20ng/ml FGF7+0.25μm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+20ng/mlFGF7+0.25μm环巴胺-KAAD+2μm视黄酸(RA)(Sigma，MO)中温育四天。接着将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml Exendin-4(Sigma，MO)+1μm DAPT(Calbiochem，CA)+1μm ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)中温育三天。
使用上述备选方法a)向定形内胚层诱导培养物导致78％的CXCR4表达(通过FACS测定)，与之相比通过备选方法b)的为56％的CXCR4表达。CXCR4被认为是定形内胚层细胞的标志物。
图15a-f展示了来自使用备选方法a)或b)的、于阶段5末收获的细胞的实时PCR数据。据显示，备选方法a)也可用于诱导胰腺内胚层和内分泌标志物的表达。
实例12
在不存在血清的情况下在涂覆有MATRIGELTM的组织培养基底上培养的人胚胎干细 胞向胰腺内分泌细胞的分化。
将第52代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并暴露于补充有2％BSA(Catalog#152401，MP Biomedical，Ohio)和100ng/ml激活素A(R&D Systems，MN)加20ng/ml WNT-3a(Catalog#1324-WN-002，R&D Systems，MN)加8ng/ml的bFGF(Catalog#100-18B，PeproTech，NJ)的RPMI培养基一天，然后用补充有2％BSA和100ng/ml激活素A加8ng/ml的RPMI培养基另外处理两天。接着，将培养物用DMEM/F12+2％BSA+50ng/ml FGF7+0.25mm环巴胺-KAAD(#239804，Calbiochem，CA)处理两天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7+0.25mm环巴胺-KAAD+2mM视黄酸(RA)(Sigma，MO)+100ng/ml的成头蛋白(R&D Systems，MN)中温育四天。接着，将细胞在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+100ng/ml成头蛋白+1mm DAPT(Catalog#565784，Calbiochem，CA)+1mmALK5抑制剂II(Catalog#616452，Calbiochem，Ca)+100ng/ml的导蛋白-4(R&D Systems，MN)中温育三天，然后在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)+1mm ALK5抑制剂II(Calbiochem，Ca)中另外温育七天。添加了最后一个阶段以进一步使内分泌培养物成熟，该阶段由在DMEM/F12+1％B27(Invitrogen，CA)中处理七天构成。除了该最后的阶段，所有其他阶段均包括每日更换培养基。图1c绘出了该方法的略图。在每个阶段，用血球计计算细胞数目并收集RNA用于PCR分析。所有样品均一式三份进行收集。
图16a-b展示了阶段1第3天的通过FACS测定的CXCR4表达和实时PCR数据。示出了相对于未分化的H1胚胎干细胞的表达的改变倍数。图16c-n绘出了在阶段2-6末收获的细胞中关键的胰腺标志物和内分泌标志物的实时PCR数据。
实例13
根据图1c所列分化方案处理的多能干细胞中的C-肽和前胰岛素含量。
将第42代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并根据图1c所列方案使其分化，如上面实例12所述的。
将细胞在克-林二氏缓冲液(129mM NaCl，4.8mM KCl，1.2mM NaH2PO4，1.2mMMgSO4，2.5MM CaCl2，5mM NaHCO3，10mM HEPES，0.3％(wt/vol)BSA)中洗涤并在37℃、5％CO2、95％空气下用Krebs缓冲液温育15分钟，然后在掺有2mM D-葡萄糖的Krebs缓冲液中温育45分钟。收集0.5ml的上清液，吸出剩余的介质并替换为掺有一种如下刺激物的Krebs缓冲液：20mM D-葡萄糖(HG)、30mM KCl、100μM甲苯磺丁脲(tol)、100mM IBMX、2mM BAY K8644或10mM酮异己酸(KIC)，在37℃、5％CO2、95％空气下持续45分钟。收集0.5ml的上清液，弃去剩余的介质。用C-肽ELISA试剂盒(Catalog#80-CPTHU-E01，Alpco Diagnostics，NH)分析该上清液的人C-肽含量。样品必须进行常规的5-10倍稀释以落入试剂盒所提供的标准品的线性范围内。
测量了用多种刺激物刺激后在分化方案的阶段6末时细胞的C-肽释放。
为了测定阶段6培养物的C-肽、前胰岛素和DNA含量，将含有阶段6培养物的6孔板每孔用500μl的细胞溶解缓冲液(10mM Tris-HCL+1mM EDTA，pH 7.5)处理，然后超声处理30秒。分别用C-肽ELISA试剂盒(Catalog#80-CPTHU-E01，Alpco Diagnostics，NH)和前胰岛素ELISA试剂盒(Catalog#11-1118-01，Alpco Diagnostics，NH)测定C-肽含量和前胰岛素含量。用Quant-ITTM DNA试剂盒(Catalog#P7589，Invitrogen，Ca)定量细胞溶解物的DNA含量。样品必须进行常规的500-1000倍稀释以落入试剂盒所提供的标准品的线性范围内。图17示出了含有阶段6培养物的6孔板的三个不同孔的C-肽含量和前胰岛素含量，该含量相对DNA进行了归一化。作为比较，还测定了三份不同的成人尸体胰岛样品的C-肽和前胰岛素含量。注意到，该数据反应了整个培养物的并且不仅仅是培养物中存在的簇的胰岛素含量。
实例14
根据图1c所列分化方案处理的多能干细胞的FACS分析。
将人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并根据图1c所列方案使其分化，如上面实例12所述的。用TrypLE Express(Invitrogen，Carlsbad，CA)将细胞从单层培养物分离成单个细胞并在冷PBS中洗涤。为了固定，将细胞再悬浮于200-300μl Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD 554722，BD，Ca)中并在4℃下温育30分钟。将细胞在1ml Perm/Wash缓冲溶液(BD 554723)中洗涤两次并再悬浮于100μl含有Perm/Wash缓冲液中的2％正常山羊血清的染色/封闭溶液中。为了进行流式细胞检测分析，将细胞用如下一抗染色：抗胰岛素抗体(Anti-Insulin)(兔单克隆抗体，Cell SignalingNo.C27C9；1∶100稀释)、抗胰高血糖素抗体(Anti-Glucagon)(小鼠单克隆抗体，SigmaNo.G2654，1∶100)、抗突触素抗体(Anti-Synaptophysin)(兔多克隆抗体，DakoCytomationNo A0010，1∶50)；将细胞在4℃下温育30分钟，然后在Perm/Wash缓冲液中洗涤两次，进一步与合适的如下二抗温育30分钟：山羊抗兔抗体Alexa 647(Goat anti-Rabbit Alexa647)(Invitrogen No.A21246)或山羊抗小鼠抗体647(Goat anti-Mouse647)(InvitrogenNo.A21235)；山羊抗兔抗体R-PE(Goat anti-Rabbit R-PE)(Biosource No.ALI4407)。所有的二抗均以1∶200稀释度使用。将细胞在Perm/Wash缓冲液中至少洗涤一次并用BDFACSArray进行分析。获取至少10,000个事件用于分析。对照包括未分化的H1细胞和b-TC(ATCC，VA)细胞系。图18a-c示出了阶段6培养物中的胰岛素阳性和突触素阳性细胞的百分比。
实例15
在图1c所列分化方案的阶段3和4添加Chordin上调胰腺内分泌谱系特征性标志物 的表达。
将第52代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并根据图1c所列方案使其分化，不同的是在阶段3-4添加50-100ng/ml的Chordin(R&DSystems，MN)而不是成头蛋白。与成头蛋白类似，Chordin也是已知的BMP信号传导抑制剂。通过FACS分析阶段6培养物(图19a-b)显示，胰岛素和突触素的表达与在阶段3-4添加成头蛋白时所观察到的相似。
实例16
在不存在血清的情况下在涂覆有MATRIGELTM的组织培养基底上培养的人胚胎干细 胞向胰腺内分泌细胞的分化。
将第39代的人胚胎干细胞系H9细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并根据图1c所列方案使其分化，如上面实例12所述的。在阶段1-6末收集RNA。图20a-I绘出了在阶段3-6末收获的细胞中关键的胰腺标志物和内分泌标志物的实时PCR数据。与H1细胞系所获得的结果相似，H9细胞能够表达胰腺内分泌谱系特征性标志物。
实例17
培养基补充剂对多能干细胞分化成胰腺内分泌细胞的能力的影响。
将第39代的人胚胎干细胞系H1细胞在涂覆有MATRIGELTM(1∶30稀释物)的培养皿上培养并根据图1c所列方案使其分化，不同的是在一些培养物中，DMEM/F12基础培养基补充有0.25-1％B27或1％N2(Invitrogen，Ca)+2％BSA。该分化方案的所有其他组分均保持为如实例12所列的。在阶段3、5和6末一式三份收集样品，并通过实时PCR分析。图21a-d绘出了在阶段3、5和6末收获的细胞中关键的胰腺标志物和内分泌标志物的实时PCR数据。用N2/BSA替代B27引起的关键胰腺内分泌标志物的表达非常相似。此外，B27的浓度可降低至0.25％而不会显著影响关键胰腺内分泌标志物的表达。
将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由根据专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。

Claims (36)

1.一种从多能干细胞产生能够进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌的细胞的方法，包括如下步骤：
a.培养所述多能干细胞，
b.使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.通过用导蛋白和成头蛋白处理细胞使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.通过用TGF-βR-1激酶抑制剂处理所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞，
其中所述多能干细胞为确立的人胚胎干细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的步骤通过用至少一种选自如下的另外的因子处理所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞来实现：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、和音猬蛋白抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用导蛋白和成头蛋白和至少一种选自如下的因子处理1至6天：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、和音猬蛋白抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用导蛋白和成头蛋白和至少一种选自如下的因子处理6天：视黄酸、FGF-2、FGF-4、FGF-7、FGF-10、和音猬蛋白抑制剂。
5.根据权利要求2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理1至3天，然后用音猬蛋白抑制剂、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理所述细胞1至4天。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理3天。
7.根据权利要求5所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用音猬蛋白抑制剂、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理4天。
8.根据权利要求2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理1至3天，然后用音猬蛋白抑制剂、成头蛋白、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理所述细胞1至4天。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞(a)用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理3天，或者(b)用音猬蛋白抑制剂、成头蛋白、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理4天。
10.根据权利要求2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理1至3天，然后用音猬蛋白抑制剂、成头蛋白、导蛋白、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理所述细胞1至4天。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞(a)用音猬蛋白抑制剂和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理3天；或者(b)用音猬蛋白抑制剂、成头蛋白、导蛋白、视黄酸和至少一种选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10的因子处理4天。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述因子选自FGF-2、FGF-4、FGF-7和FGF-10。
13.根据权利要求11所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用FGF-7以50pg/ml至50μg/ml的浓度处理。
14.根据权利要求11所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用FGF-7以20ng/ml的浓度处理。
15.根据权利要求2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸以1nM至1mM的浓度处理。
16.根据权利要求2所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用视黄酸以1μM的浓度处理。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述音猬蛋白抑制剂是环巴胺。
18.根据权利要求17所述的方法，其中环巴胺以0.1μM至10μM的浓度使用。
19.根据权利要求17所述的方法，其中环巴胺以0.25μM的浓度使用。
20.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用成头蛋白以500ng/ml至100μg/ml的浓度处理。
21.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用成头蛋白以100ng/ml的浓度处理。
22.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用导蛋白以500ng/ml至100μg/ml的浓度处理。
23.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达定形内胚层特征性标志物的细胞用导蛋白以100ng/ml的浓度处理。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述导蛋白选自导蛋白1、导蛋白2和导蛋白4。
25.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用TGF-βR-1激酶抑制剂处理1至12天。
26.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用TGF-βR-1激酶抑制剂处理5至12天。
27.根据权利要求1所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用TGF-βR-1激酶抑制剂处理12天。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的步骤通过用抑制Notch信号传导途径的因子和TGF-βR-1激酶抑制剂处理所述表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞来实现。
29.根据权利要求28所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导途径的因子和TGF-βR-1激酶抑制剂处理1至12天。
30.根据权利要求28所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导途径的因子和TGF-βR-1激酶抑制剂处理5至12天。
31.根据权利要求28所述的方法，其中将所述表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞用抑制Notch信号传导途径的因子和TGF-βR-1激酶抑制剂处理12天。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述抑制Notch信号传导途径的因子是γ-分泌酶抑制剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂是L-685，458。
34.根据权利要求33所述的方法，其中L-685，458以0.1μM至100μM的浓度使用。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGF-βR-1激酶抑制剂以0.1μM至100μM的浓度使用。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述TGF-βR-1激酶抑制剂是2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶或[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑。
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