CN108384746A - 一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，属于细胞工程技术领域。其包括如下步骤：诱导多能干细胞预处理培养；诱导形成侧板中胚层细胞；诱导形成内皮细胞倾向的内皮祖细胞；诱导形成成熟内皮细胞。本发明通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。

Description

一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，属于细胞工程技术领域。
背景技术
血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells，vEC)是组成血管内壁的一层特异性扁平上皮细胞，是维持全身血液循环***稳定状态的重要保障。在糖尿病、高血压及其它慢性病理中，经常伴随有内皮细胞功能失调或损伤，极易诱发动脉粥样硬化、甚至心肌梗死等心血管疾病，严重威胁患者生命健康。因此，调节修复或替换损伤的血管内皮，对于预防和治疗心血管疾病具有重要的临床价值。研究指出，具备完善功能的成熟血管内皮细胞可以在机体血管梗死区域重新形成血管组织，有效解决局部缺血症状。另外，由成熟血管内皮细胞在体外形成的血管结构也有极大潜力取代常规静脉分离手段，为心血管疾病患者进行心脏搭桥手术提供适用性更强的替代材料。但如何获得大量具备成管能力的成熟血管内皮细胞，目前仍处于研究摸索阶段，这也就直接限制了其在临床应用上的顺利开展。
作为再生医学发展过程中的重中之重，诱导性多能干细胞(induced pluripotentstem cells,iPSC)的出现，为内皮细胞(Endothelial Cells，EC)的临床应用提供了一条具有高度可行性的方案。诱导多能干细胞成功地绕开了免疫原性和伦理性两个最关键的问题，而且来源广泛，可以通过建立患者特定的诱导多能干细胞进而完成个体化治疗。采用患者来源的诱导多能干细胞在体外诱导扩增来获得大量成熟血管内皮细胞，有助于顺利跨过EC临床应用的高门槛，同时也可为将来针对内皮细胞的基因治疗做好准备。
近几年相关研究领域发展迅速，目前多种诱导多能干细胞诱导分化为成熟内皮细胞的方法被相继提出，包括早期的3D拟胚体诱导法[1]和近期的2D直接诱导法[2-4]，均采用一系列内皮分化所需诱导因子进行多重组合，都能够在一定程度上诱导诱导多能干细胞向成熟内皮细胞分化。但这些诱导方法也都有一定的局限性，比如诱导周期长(普遍需要9-20天)、转化效率低(20％-60％)、纯化过程繁琐(需经MACS或流式进行筛选)、内皮功能不完善(体外或体内成管能力欠缺)等等。
鉴于此，要想真正得到临床应用级别的内皮细胞，还需要进一步摸索优化诱导多能干细胞向内皮细胞诱导分化的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法。本发明通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。同时，整个诱导过程耗时短，操作简单，不涉及动物源性细胞和成分，大大提高了诱导多能干细胞来源的内皮细胞的高效性、功能性、安全性，为利用患者自身的诱导多能干细胞大规模生产临床应用级别的成熟内皮细胞提供了一种新的途径和方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，包括如下步骤：
步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；
步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万-5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；
步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16-24小时，重复步骤5操作一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；
步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；
步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液；
步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，
按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万-6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。
与现有技术相比，本发明的方法，不再需要纯化步骤，所得成熟内皮细胞纯度高达96％以上，降低了操作难度，同时减少纯化步骤对细胞状态的干扰。以6孔细胞培养板为例，每孔起始铺种30-35万个诱导多能干细胞，在诱导第9天可收获400-500万个成熟内皮细胞，是现有技术内皮细胞产量的2-3倍。采用本发明的方法，诱导9天，获得的内皮细胞/起始诱导多能干细胞转化比例可达15/1，也是现有技术内皮细胞/诱导多能干细胞转化比例的2-3倍。本发明所得成熟内皮细胞具备显著的体外成管能力。
其中，步骤3中，移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，具体的操作方法为：倾斜培养板，用移液器将旧培养基吸出。
步骤4中、步骤5中、步骤6中、步骤9中，移去细胞培养板中的旧培养基的方法，同上述步骤3中移去细胞培养板中的旧培养基的方法。
步骤5中，内皮祖细胞，即Endothelial progenitor cell,简称EPC。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液的方法为：
在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70-80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中，离心，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。
其中，上述DMEM/F12培养基，购自Life Technologies公司,型号为11039021。
更进一步，所述诱导性多能干细胞复苏、传代的方法为：
复苏前一天准备好基底膜基质包被的细胞培养板，置于细胞培养箱中，过夜孵育，得到过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板；
从液氮中取出冻存的诱导多能干细胞，接种于上述过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板中，置于细胞培养箱中，孵育16-24小时；
随后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至75-85％，即得到复苏后的诱导性多能干细胞；
将复苏后的诱导多能干细胞传代，一天后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至75-85％，即得到传代后的诱导性多能干细胞。
更进一步，所述离心的条件为室温，200g，离心5min。
进一步，步骤2中，所述TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物中，ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM/L。
进一步，步骤3中，所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Activin A，其中BMP4的浓度为20-30ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-10μM/L，Activin A的浓度为30-70ng/mL。
上述BMP4、CHIR-99021和Activin A均为诱导小分子。其中，BMP4，全称为BoneMorphogenetic Protein4,中文名为骨形态发生蛋白4，其与细胞的增殖以及分化、细胞凋亡、形态发生时的细胞传讯等细胞发育有直接或间接的关系。CHIR-99021为GSK抑制剂，高特异性抑制GSK3β和GSK3α。Activin A为激活素A，是参与多种重要生物过程的多效细胞因子，包括维持多能干细胞。
采用上述进一步的有益效果是：BMP4和CHIR-99021可启动诱导多能干细胞向侧板中胚层细胞的诱导分化进程，而Activin A可以在此基础上进一步促进诱导多能干细胞的分化进程，提高最终的内皮转化效率。Activin A处理时间过久会导致诱导多能干细胞最终分化为内胚层细胞，而内皮细胞只来源于中胚层细胞，所以Activin A的处理时间需要控制在24小时以内。
更进一步，所述第一N2B27胰岛素缺失培养基中BMP4的浓度为25ng/mL，CHIR-99021的浓度为8μM/L，Activin A的浓度为50ng/mL。
进一步，步骤4中，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为20-30ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-10μM/L。
采用上述进一步的有益效果是：BMP4和CHIR-99021可启动诱导多能干细胞向侧板中胚层细胞的诱导分化进程。
更进一步，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基中BMP4的浓度为25ng/mL，CHIR-99021的浓度为8μM/L。
进一步，步骤5中，所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为100-300ng/mL，Forskolin的浓度为1-4μM/L，SB431542的浓度的5-15μM/L。
上述VEGFA、Forskolin和SB431542均为诱导小分子。其中，VEGFA，全称为VascularEndothelialGrowth Factor A,中文名为血管内皮生长因子A，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。Forskolin，即毛喉素，为腺苷酸环化酶激活剂。SB431542，是一种强效的小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子β(TGF-β)I型受体活化素受体样激酶ALK5(IC50＝94nM)、ALK4(IC50＝140nM)和ALK7。
采用上述进一步的有益效果是：VEGFA、Forskolin和SB431542组合在一起可以高效快速地引导诱导多能干细胞从中胚层细胞向内皮方向分化，提高内皮转化效率。
更进一步，所述第一StemPro-34培养基中VEGFA的浓度为200ng/mL，Forskolin的浓度为2μM/L，SB431542的浓度的10μM/L。
进一步，步骤6中，所述细胞分解酶混合液由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成。
进一步，步骤7中，所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA，其中，VEGFA的浓度为30-70ng/mL。
采用上述进一步的有益效果是：含有VEGFA的第二StemPro-34培养基可以用于诱导内皮细胞进一步成熟，同时也可以维持内皮细胞的正常生长增殖。
更进一步，所述第二StemPro-34培养基中VEGFA的浓度为50ng/mL。
进一步，步骤8中，所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板由如下方法得到：按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2ml的比例，在细胞培养板中加入10μg/mL的纤维连接蛋白工作液，室温静置包被1小时，移去纤维连接蛋白工作液，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，即得到所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板。
进一步，所述细胞培养箱的培养条件均为37℃、5％v/v CO2。
进一步，步骤9之后还包括步骤10，即对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行扩增和冻存。
其中，对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行扩增的具体方法为：
当细胞聚合度已扩增至80-90％，即可开始进行传代操作。
取出细胞培养板，吸去旧的培养基，室温下PBS洗2次，随后按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中2-3min，直到大部分细胞开始以团块状浮动脱落。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入37℃预热过的第一StemPro-34培养基，中和细胞消化液和胰蛋白酶的酶解作用，用移液枪轻轻吹打脱落细胞团块进行重悬，随后转移至15mL离心管中。
室温条件下，200g，离心5min。用移液枪移去上清液，随后加入3mL37℃预热过的第二StemPro-34培养基，轻轻吹打充分重悬细胞沉淀。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，在细胞培养板中加入37℃预热过的第二StemPro-34培养基。随后按照1:3或1:2的传代比例，将3mL细胞重悬液平分到细胞培养板中，放入37℃、5％v/v CO2细胞培养箱，随后静置培养即可。
其中，对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行冻存的具体方法为：
镜下观察细胞，确定EC细胞无污染，状态良好，且聚合度达到80-90％时可对其进行冻存操作。
取出细胞培养板，吸去旧的培养基，室温下PBS洗2次，随后按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中2-3min，直到大部分细胞开始以团块状浮动脱落。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入37℃预热过的第二StemPro-34培养基，中和细胞消化液和胰蛋白酶的酶解作用，用移液枪轻轻吹打脱落细胞团块进行重悬，随后转移至15mL离心管中。
室温条件下200g离心5min。期间准备冻存管，并进行标记(培养人姓名，冻存时间，培养代数等)。
用移液枪吸去上清液，随后加入2mLCryo-SFM冻存液，轻轻吹打充分重悬细胞沉淀，随后按每管1mL分装到冻存管中(冻存时建议按照1:2比例进行)。
将冻存管放入4℃预冷的程序降温盒内，置于-80℃冰箱，第二天转入液氮罐内存储即可。
本发明所用培养基的具体配制方法：
1、TeSR-E8培养基：按照表1所示规格比例现用现配，4℃条件下最长保存1个月。
表1 TeSR-E8培养基的配制
2、N2B27胰岛素缺失培养基：按照表2所示规格比例现用现配，4℃条件下最长保存1个月。
表2 N2B27胰岛素缺失培养基的配制
3、StemPro-34培养基：按照表3所示规格比例现用现配，4℃条件下最长保存1个月。
表3 StemPro-34培养基的配制
本发明的有益效果是：
1、本发明的整个诱导过程耗时短，操作简单，不涉及动物源性细胞和成分，大大提高了诱导性多能干细胞来源的内皮细胞的高效性、功能性、安全性，为利用患者自身的诱导多能干细胞大规模生产临床应用级别的成熟内皮细胞提供了一种新的途径和方法。
2、本发明通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。
3、本发明的方法，还具有以下显著优点和积极效果：
(1)短时性：本发明的方法只需8-9天，耗时已达目前相关领域最快水平，在临床应用上具有很高的应用时效。
(2)便捷性：本发明的方法精简优化了诱导因子组合，简单易操作，重复性稳定。
(3)高纯度：细胞纯度极高，不需额外纯化步骤，即可获得96％以上纯度的成熟内皮细胞。
(4)高效性：细胞产量显著，采用少量诱导多能干细胞即可获得大量成熟内皮细胞，8-9天时间最终获得的内皮细胞/诱导性多能干转化比例可达15/1。
(5)功能性：获得的成熟内皮细胞具备显著的成管能力，功能完善。
(6)安全性：诱导过程透明易监测，不涉及动物源性细胞和成分；诱导彻底，无干细胞存留，消除成瘤风险。
附图说明
图1为本发明的整体流程图。
图2为侧板中胚层细胞的诱导形成过程中第1天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图3为侧板中胚层细胞的诱导形成过程中第2天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图4为侧板中胚层细胞的诱导形成过程中第4天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图5为本发明的方法在高内皮细胞倾向的内皮祖细胞诱导形成中第6天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图6为现有技术的方法在内皮祖细胞诱导形成中第6天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图7为本发明的方法在高内皮细胞倾向的内皮祖细胞诱导形成中第6天的细胞免疫标记图(10X显微镜视野)。
图8为现有技术的方法在内皮祖细胞诱导形成中第6天的细胞免疫标记图(10X显微镜视野)。
图9为成熟内皮细胞的诱导形成过程中第7天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图10为成熟内皮细胞的诱导形成过程中第9天的细胞形态特征图(10X显微镜视野)。
图11为成熟内皮细胞的体外成管能力鉴定(10X显微镜视野)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，具体流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液。其具体方法为：
在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70-80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中。其中，上述DMEM/F12培养基，购自Life Technologies公司,型号为11039021。
室温，200g，离心5min，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。
其中，所述诱导性多能干细胞复苏、传代的方法为：
复苏前一天准备好基底膜基质包被的细胞培养板，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，过夜孵育，得到过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板。
所用诱导性多能干细胞采用诱导试剂盒诱导体细胞而来，所用诱导试剂盒为Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming Kit，购自赛默飞世尔科技，MAN0008352。
从液氮中取出冻存的诱导多能干细胞，接种于上述过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，孵育16-24小时。
随后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至80％，即得到复苏后的诱导性多能干细胞。
将复苏后的诱导多能干细胞传代，一天后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至80％，即得到传代后的诱导性多能干细胞。
步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3.5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物的细胞培养板中,置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养20小时。其中，所述TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物中，ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM/L。诱导第1天细胞形态如图2所示。
步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养20小时。所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Activin A，其中BMP4的浓度为25ng/mL，CHIR-99021的浓度为8μM/L，ActivinA的浓度为50ng/mL。诱导第2天细胞形态如图3所示。
步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞。其中，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为25ng/mL，CHIR-99021的浓度为8μM/L。诱导第4天细胞形态如图4所示。
步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养20小时，重复步骤5一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。其中，所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为200ng/mL，Forskolin的浓度为2μM/L，SB431542的浓度的10μM/L。
步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。诱导第6天，即诱导形成相比原方法具有更高内皮细胞倾向的内皮祖细胞，细胞镜下状态如图5所示，相比原方法不再具备显著的“环形山”结构(如图6所示)；通过细胞免疫标记(如图7、8所示)可以看到，本发明的方法在第6天得到的混合细胞具有更小比例的后期内皮祖细胞(黑色箭头所示)，而具有更多的近成熟内皮细胞(白色箭头所示)。
步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液。其中，所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA，其中，VEGFA的浓度为50ng/mL。
步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种4.5万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养20小时。其中，所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板由如下方法得到：按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2ml的比例，在细胞培养板中加入10μg/mL的纤维连接蛋白工作液，室温静置包被1小时，移去纤维连接蛋白工作液，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，即得到所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板。20小时后，细胞镜下状态如图9所示。
步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。细胞镜下状态如图10所示。得到的成熟的内皮细胞具备显著的体外成管能力，如图11所示。
由此可见，本发明通过增减搭配多种细胞诱导因子，并在诱导方法上进行合理升级，可以高效诱导诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化，在采用少量诱导多能干细胞且不需要纯化操作的条件下，即可获得大量纯度高、功能完善的成熟内皮细胞。同时，整个诱导过程耗时短，操作简单，不涉及动物源性细胞和成分，大大提高了诱导多能干细胞来源的内皮细胞的高效性、功能性、安全性，为利用患者自身的诱导多能干细胞大规模生产临床应用级别的成熟内皮细胞提供了一种新的途径和方法。
实施例2
本实施例的诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，具体流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液。其具体方法为：
在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中。其中，上述DMEM/F12培养基，购自Life Technologies公司,型号为11039021。
室温，200g，离心5min，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。
其中，所述诱导性多能干细胞复苏、传代的方法为：
复苏前一天准备好基底膜基质包被的细胞培养板，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，过夜孵育，得到过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板。
所用诱导性多能干细胞采用诱导试剂盒诱导体细胞而来，所用诱导试剂盒为Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming Kit，购自赛默飞世尔科技，MAN0008352。
从液氮中取出冻存的诱导多能干细胞，接种于上述过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，孵育16小时。
随后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至75％，即得到复苏后的诱导性多能干细胞。
将复苏后的诱导多能干细胞传代，一天后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至75％，即得到传代后的诱导性多能干细胞。
步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物的细胞培养板中,置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养24小时。其中，所述TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物中，ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM/L。
步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养24小时。所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Activin A，其中BMP4的浓度为20ng/mL，CHIR-99021的浓度为6μM/L，ActivinA的浓度为30ng/mL。
步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞。其中，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为20ng/mL，CHIR-99021的浓度为6μM/L。
步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养24小时，重复步骤5一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。其中，所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为100ng/mL，Forskolin的浓度为1μM/L，SB431542的浓度的5μM/L。
步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。
步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液。其中，所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA，其中，VEGFA的浓度为30ng/mL。
步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养16-24小时。其中，所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板由如下方法得到：按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，在细胞培养板中加入10μg/mL的纤维连接蛋白工作液，室温静置包被1小时，移去纤维连接蛋白工作液，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，即得到所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板。
步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。得到的成熟的内皮细胞具备显著的体外成管能力。
实施例3
本实施例的诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，具体流程如图1所示，包括如下步骤：
步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液。其具体方法为：
在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中。其中，上述DMEM/F12培养基，购自Life Technologies公司,型号为11039021。
室温，200g，离心5min，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。
其中，所述诱导性多能干细胞复苏、传代的方法为：
复苏前一天准备好基底膜基质包被的细胞培养板，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，过夜孵育，得到过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板。
所用诱导性多能干细胞采用诱导试剂盒诱导体细胞而来，所用诱导试剂盒为Epi5TM Episomal iPSC Reprogramming Kit，购自赛默飞世尔科技，MAN0008352。
从液氮中取出冻存的诱导多能干细胞，接种于上述过夜孵育后的基底膜基质包被过的细胞培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，孵育24小时。
随后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至85％，即得到复苏后的诱导性多能干细胞。
将复苏后的诱导多能干细胞传代，一天后更换新鲜的37℃预热过的TeSR-E8培养基，每天重复换液直至细胞聚合度增至85％，即得到传代后的诱导性多能干细胞。
步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物的细胞培养板中,置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养16小时。其中，所述TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632混合物中，ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM/L。
步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养16小时。所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Activin A，其中BMP4的浓度为30ng/mL，CHIR-99021的浓度为10μM/L，Activin A的浓度为70ng/mL。
步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞。其中，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为30ng/mL，CHIR-99021的浓度为10μM/L。
步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养16小时，重复步骤5一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。其中，所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为300ng/mL，Forskolin的浓度为4μM/L，SB431542的浓度的15μM/L。
步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞。
步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液。其中，所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA，其中，VEGFA的浓度为70ng/mL。
步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中培养16小时。其中，所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板由如下方法得到：按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，在细胞培养板中加入10μg/mL的纤维连接蛋白工作液，室温静置包被1小时，移去纤维连接蛋白工作液，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，即得到所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板。
步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。得到的成熟的内皮细胞具备显著的体外成管能力。
步骤10：对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行扩增和冻存。
其中，对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行扩增的具体方法为：
当细胞聚合度已扩增至80-90％，即可开始进行传代操作。
取出细胞培养板，吸去旧的培养基，室温下PBS洗2次，随后按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中2-3min，直到大部分细胞开始以团块状浮动脱落。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入37℃预热过的第一StemPro-34培养基，中和细胞消化液和胰蛋白酶的酶解作用，用移液枪轻轻吹打脱落细胞团块进行重悬，随后转移至15mL离心管中。
室温条件下，200g，离心5min。用移液枪移去上清液，随后加入3mL37℃预热过的第二StemPro-34培养基，轻轻吹打充分重悬细胞沉淀。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，在细胞培养板中加入37℃预热过的第二StemPro-34培养基。随后按照1:3或1:2的传代比例，将3mL细胞重悬液平分到细胞培养板中，放入37℃、5％v/v CO2细胞培养箱，随后静置培养即可。
其中，对得到的成熟诱导分化内皮细胞进行冻存的具体方法为：
镜下观察细胞，确定EC细胞无污染，状态良好，且聚合度达到80-90％时可对其进行冻存操作。
取出细胞培养板，吸去旧的培养基，室温下PBS洗2次，随后按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成的细胞分解酶混合液，置于37℃、5％v/v CO2细胞培养箱中2-3min，直到大部分细胞开始以团块状浮动脱落。
按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入37℃预热过的第二StemPro-34培养基，中和细胞消化液和胰蛋白酶的酶解作用，用移液枪轻轻吹打脱落细胞团块进行重悬，随后转移至15mL离心管中。
室温条件下200g离心5min。期间准备冻存管，并进行标记(培养人姓名，冻存时间，培养代数等)。
用移液枪吸去上清液，随后加入2mLCryo-SFM冻存液，轻轻吹打充分重悬细胞沉淀，随后按每管1mL分装到冻存管中(冻存时建议按照1:2比例进行)。
将冻存管放入4℃预冷的程序降温盒内，置于-80℃冰箱，第二天转入液氮罐内存储即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液；
步骤2：将步骤1得到的细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种2万-5万个细胞的比例，移入含有TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物的细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤3：移去步骤2中细胞培养板中旧培养基，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤4：移去步骤3中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按每10cm2的细胞培养板底面积加液量为6mL的比例，加入第二N2B27胰岛素缺失培养基，置于细胞培养箱中培养48小时，在细胞培养板中得到侧板中胚层细胞；
步骤5：移去步骤4中含有侧板中胚层细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为4mL的比例，加入第一StemPro-34培养基，然后置于细胞培养箱中培养16-24小时，重复步骤5操作一次，在细胞培养板中诱导得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；
步骤6：移去步骤5中含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞的细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入细胞分解酶混合液，进行酶解，得到酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞；
步骤7：将步骤6得到的酶解后含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为1mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，得到含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液；
步骤8：将步骤7得到的含有内皮细胞倾向的内皮祖细胞重悬液，按照每1cm2的细胞培养板底面积铺种3万-6万个细胞的比例，移入含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板中，置于细胞培养箱中培养16-24小时；
步骤9：移去步骤8中细胞培养板中的旧培养基，并用PBS冲洗细胞培养板，按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，置于细胞培养箱中，培养48小时，即得到成熟诱导分化内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤1中，所述将诱导性多能干细胞进行预处理，得到细胞重悬液的方法为：
在细胞培养板里，将诱导性多能干细胞复苏、传代后，用PBS冲洗2次，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为0.5mL的比例，加入37℃预热过的细胞消化液进行酶解消化，得到酶解消化液；待70-80％的诱导性多能干细胞开始脱落时，加入上述酶解消化液5倍体积的DMEM/F12培养基进行中和，然后将诱导性多能干细胞转移到离心管中，离心，移去上清，加入TeSR-E8培养基，重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液。
3.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤2中，所述TeSR-E8培养基和ROCK抑制剂Y27632的混合物中，ROCK抑制剂Y27632的浓度为10μM/L。
4.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤3中，所述第一N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4、CHIR-99021和Act i v i n A，其中BMP4的浓度为20-30ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-10μM/L，Act i v i n A的浓度为30-70ng/mL。
5.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤4中，所述第二N2B27胰岛素缺失培养基是在N2B27胰岛素缺失培养基中添加BMP4和CHIR-99021，其中BMP4的浓度为20-30ng/mL，CHIR-99021的浓度为6-10μM/L。
6.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤5中，所述第一StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA、Forskolin和SB431542，其中VEGFA的浓度为100-300ng/mL，Forsko lin的浓度为1-4μM/L，SB431542的浓度的5-15μM/L。
7.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤6中，所述细胞分解酶混合液由细胞消化液和胰蛋白酶按体积比为1:1组成。
8.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤7中，所述第二StemPro-34培养基是在StemPro-34培养基中添加VEGFA，其中，VEGFA的浓度为30-70ng/mL。
9.根据权利要求1所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，步骤8中，所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板由如下方法得到：按照每1cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，在细胞培养板中加入10μg/mL的纤维连接蛋白工作液，室温静置包被1小时，移去纤维连接蛋白工作液，再按照每10cm2的细胞培养板底面积加液量为2mL的比例，加入第二StemPro-34培养基，即得到所述含有第二StemPro-34培养基的细胞分化培养板。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种诱导性多能干细胞向成熟内皮细胞高效分化的方法，其特征在于，所述细胞培养箱的培养条件均为37℃、5％v/v CO2。
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