CN113166219A - 干细胞衍生的人小神经胶质细胞、制备方法及使用方法 - Google Patents

干细胞衍生的人小神经胶质细胞、制备方法及使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于产生衍生自干细胞(例如人干细胞)的小神经胶质细胞的方法，从此类方法获得的小神经胶质细胞以及包括其的组合物，以及所述小神经胶质细胞用于疾病建模和用于治疗小神经胶质细胞相关病症的用途。

Description

干细胞衍生的人小神经胶质细胞、制备方法及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月28日提交的美国临时申请第62/738,176号的优先权，在此将其全部内容并入本文以供参考，并要求其优先权。
技术领域
本公开涉及用于产生衍生自干细胞(例如人干细胞)的小神经胶质细胞的方法，从此类方法获得的小神经胶质细胞以及包括其的组合物，此类小神经胶质细胞用于疾病建模和用于治疗小神经胶质细胞相关病症的用途。
背景技术
小神经胶质细胞(microglia或microglial cells)是中枢神经***(CNS)的组织定居巨噬细胞，在胚胎早期发育过程中定植在大脑中(Prinz等,Nat.Rev.Neurosci.(2014)；15,300–312)。这些吞噬细胞在中枢神经***中起着许多作用：包括清除细胞碎片、向神经元和星形胶质细胞传递信号以介导突触连接以及保持CNS稳态。当前关于小神经胶质生物学的最新文献仅在啮齿动物模型中进行了探索(Béchade等,Front Cell Neurosci.(2013)；7,32；Bialas等,Nat.Neurosci.(2013)；16,1773–1782；Bilimoria等,Brain Res.(2015)；1617,7–17；Ji等,PLoS One(2013)；8；48；Pascual等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2012)；109；Schafer等,Neuron(2012)；74,691–705；Tremblay等PLoS Biol.(2010)；8；Wu等,Trends Immunol.(2015)；36,605–613；Zhan等Nat.Neurosci.(2014)；17,400–406)。
尽管小鼠已成为显示出与人病理学相似的强大哺乳动物体系，但小鼠和人小神经胶质细胞之间存在显著差异(Zhang等,Neuron(2016)；89,37–53)。这些包括仅在小鼠而不在人体内表达的基础受体，比如巨噬细胞F4/80受体，以及对药物治疗响应的功能性差异(Smith等,Trends Neurosci.(2014)；37,125–135)。此外，某些神经发育疾病与不在小鼠中表达的基因密切相关，比如精神***症和补体成分C4A等位基因(
Figure BDA0003086720250000021
等,Biol.Psychiatry(2012)；70,35–42；Sekar等,Nature(2016)；530,177–183)。然而，人原代小神经胶质细胞较昂贵，难以从死后组织中获得，并且不能培养增殖，使疾病建模极为困难(Melief等,Glia.(2016)；64(11):1857-681)。替代的人永生化小神经胶质细胞系与原代小神经胶质细胞不共享关键基因(Melief等,Glia.(2016)；64(11):1857-681)。
人多能干细胞(即hPSC)衍生的小神经胶质细胞允许从患者细胞中提供发育衍生的小神经胶质细胞，其与患者脑中发现的小神经胶质细胞功能相同。hPSC是来自人胚胎干细胞(即ES细胞)或诱导多能干细胞(即iPS细胞)的自我更新细胞，它们具有分化为体内任何细胞类型的能力。通常，iPS细胞衍生自患有特定疾病的个体的体细胞。hPSC衍生的小神经胶质细胞可用于在疾病建模时探索神经元与小神经胶质细胞之间的非细胞自主相互作用，并且它们可用于筛选潜在的药物靶标(Hoing等,Cell Stem Cell(2012)；11,620–632)。此外，hPSC衍生的小神经胶质细胞可用作神经发育和神经退行性疾病以及CNS脑肿瘤的潜在细胞疗法。
小神经胶质细胞是唯一从卵黄囊前体直接发育而来的组织定居巨噬细胞，而其它则从先迁移到肝脏的前体发育而来(Hoeffel等,Immunity(2015)；42,665–678)。因此，重要的是对早期卵黄囊原始的造血作用进行建模以产生小神经胶质细胞。
现有的在体外产生人小神经胶质细胞的策略没有遵循这种发育模式，未能首先引发原始的造血作用。这些策略要么从外周单核细胞开始(Noto等,Neuropathol.Appl.Neurobiol.(2014)；40,697–713；Ohgidani等,Sci.Rep.(2014)；4,4957)，其源于确定的造血作用，因此在体内不产生小神经胶质细胞，要么通过使用未针对原始的造血作用预先模式化的拟胚体方法，因此对于发育细胞命运的决定是黑盒(Etemad等,Neurosci.(2012)；209,79–89；Hinze等,Inflamm.(2012)；9,12；Lachmann等,Stem CellReports(2015)；4,282–296；Noto等,Neuropathol.Appl.Neurobiol.(2014)；40,697–713；Ohgidani等,Sci.Rep.(2014)；4,4957；van Wilgenburg等,PLoS One(2013)；8.；Muffat等,Nature Medicine(2016)；22(11),1358–1367；Bahrini等,Sci.Rep.(2015)；5,7989)。很难确定这些策略是通过早期的红系骨髓前体细胞(EMP)(它们是小神经胶质细胞的真正前体)还是晚期的EMP(它们产生确定的造血作用)进行。因此，需要一种用于产生人小神经胶质细胞的新方法。
附图说明
图1A和1B示出根据本公开的某些实施方式的分化方法。图1A示出Wnt抑制和激活的组合产生了KDR+CD235a+双阳性原始造血前体。Wnt激动剂Chir099021激活Wnt18小时产生了早期中胚层，通过免疫荧光经Brachyury(T)标示。到分化的第4天，通过流式细胞术，这些细胞也是KDR+和CD235a+(原始造血前体)。图1B示出ChiR暴露的时机。对分化方案中Chir099021暴露的浓度和时机进行优化，其中在3uM下暴露18小时，然后通过3uM的IWP2进行Wnt抑制，通过流式细胞术显示获得最高百分比的原始造血前体(KDR+CD235a+)。
图2示出造血内皮细胞和造血细胞发育的时间线。造血内皮细胞在对所分选的KDR+CD235a+原始造血前体重新铺板1天后发育。这些细胞在培养的7天内产生悬浮的造血细胞，并在培养中逐渐变得更多。
图3示出通过VE-钙粘蛋白+染色对造血内皮细胞的验证。分选后第1天，细胞通过免疫荧光检测为VE-钙粘蛋白阳性，证实它们是造血内皮细胞，并且悬浮的细胞具有特征性的造血细胞小核。
图4示出通过发育中间体：Kit+、Kit+CD45+进行的圆形细胞培养。在对原始造血前体重新铺板后的第5天，出现Kit+细胞，它们是早期的红系骨髓祖细胞(EMP)，即小神经胶质细胞的前体。这些细胞然后通过流式细胞术获得CD45+，表明完全的造血归属。
图5示出用于衍生hPSC-小神经胶质细胞的策略。从EMP阶段开始，可以通过与神经元直接共培养至少4天，或单独成熟为巨噬细胞，然后与神经元共培养至少11天来获得小神经胶质细胞。
图6示出在一小亚类的EMP/pMac(圆形细胞，前体)上存在的巨噬细胞标志物。在分选后培养的第8天，在存在混合的EMP群体处，这些细胞被识别为小神经胶质细胞和巨噬细胞祖细胞，而不是成熟的巨噬细胞。仅一小部分巨噬细胞表达成熟的巨噬细胞标志物，例如CX3CR1、CD14、Cd11b和MRC。然而，大多数细胞表达CD45，表明它们归于造血谱系。通过流式细胞术检查所有标志物。
图7示出到共培养的第4天，与神经元一起培养pMac产生了Iba1+Pu.1+细胞。在分选后第8天，将含有pMac的细胞与神经元一起悬浮培养，仅到共培养的第4天就产生了早期的小神经胶质细胞。这些细胞通过Iba1+和Pu.1+染色识别。所有CD45+细胞也均为Pu.1+，这表明任何在培养中持续存在的造血细胞(以CD45+表示)都归于髓样/小神经胶质细胞谱系(以PU.1表示)。这表明通过免疫荧光该策略是高效的。
图8示出Iba1+细胞在培养中是稳定的。与皮质神经元共培养14天后，小神经胶质细胞(通过免疫荧光检测的Iba1+)仍然持续存在。
图9示出Iba1+细胞在培养中是稳定的。培养21天后，在与神经元共培养物中，小神经胶质细胞(通过免疫荧光检测的Iba1+、PU.1+)仍然持续存在。
图10示出在RPMI+10％血清、M-CSF、IL-34中培养pMac。在产生小神经胶质细胞的第二种策略中，伴随10％血清和M-CSF和IL-34，EMP成熟为巨噬细胞。它们到培养的第4天发育出成熟的巨噬细胞标志物CD11b，并到培养的第11天发育出成熟的纺锤形态。
图11示出使用11天后存在于大多数细胞上、表明成熟的巨噬细胞的巨噬细胞标志物检测到的巨噬细胞的高效诱导。在11天后在血清和M-CSF和IL-34中的培养物中持续存在的所有细胞均为CD45+，表明它们均为造血细胞。通过流式细胞术分析，大多数还对于成熟的巨噬细胞标志物如CX3CR1、CD14、CD11b和Dectin呈阳性。
图12提供在IMDM/F12/N2/B27+M-CSF、IL-34中培养pMac的无血清方法。与M-CSF和IL-34一起使用IMDM/F12/N2/B27代替血清，在没有血清的情况下也可以使pMac成熟为巨噬细胞。添加M-CSF与IL-34通过鼓励细胞***而提高了产量。GM-CSF的添加也允许细胞***，但是所得细胞似乎更粒状并且被激活。
图13示出巨噬细胞样细胞与神经元的共培养显示出强的Iba1和Pu.1表达。与神经元共培养的巨噬细胞产生具有分枝形态和增加的Iba1免疫荧光染色的小神经胶质细胞。Iba1在来自巨噬细胞的小神经胶质细胞中增加，因此通过与神经元共培养，细胞已转变为小神经胶质细胞身份。
图14示出共培养的pMac衍生的小神经胶质细胞(EMP共培养)和pMac-巨噬细胞衍生的小神经胶质细胞(EMP-巨噬细胞共培养)与人胎儿小神经胶质细胞共享关键小神经胶质细胞基因的表达。对来自用于衍生小神经胶质细胞的两种不同策略的RNA进行定量PCR，其与来自人胎儿小神经胶质细胞(商业来源)的RNA共享一组关键的小神经胶质细胞基因的基因表达。相比之下，代表外周巨噬细胞的单核细胞衍生的巨噬细胞不表达这些标志物。值得注意的是，当单独培养EMP衍生的巨噬细胞时，它们下调关键的小神经胶质细胞基因TMEM119和SALL1，表明共培养对于保持小神经胶质细胞身份是必要的。
图15示出第14天神经元、小神经胶质细胞和星形胶质细胞的三培养。可以将本公开衍生的小神经胶质细胞与星形胶质细胞共培养，以建立包含CNS的三个成分的体系：神经元、小神经胶质细胞和星形胶质细胞。小神经胶质细胞以RFP标记，星形胶质细胞通过免疫荧光为GFAP+。
图16示出第30天神经元、小神经胶质细胞和星形胶质细胞的三培养。可以将本公开衍生的小神经胶质细胞与星形胶质细胞共培养，以建立包含CNS的三个成分的体系：神经元、小神经胶质细胞和星形胶质细胞。小神经胶质细胞以RFP标记，星形胶质细胞通过免疫荧光为GFAP+。
图17示出可用于研究细胞类型之间相互作用的三培养体系。炎症刺激或引起炎症刺激的疾病状态影响具有串扰的小神经胶质细胞和星形胶质细胞两者。这种串扰是一种反馈或前馈回路，然后会导致对神经元的毒性。这种相互作用可以使用与hPSC衍生的星形胶质细胞和神经元三培养的本公开的hPSC衍生的小神经胶质细胞来研究，以在体外检查完整的人体系。
图18示出三培养中的LPS刺激导致反应性细胞因子释放。将1μg/mL的LPS加入至含有小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的三培养的细胞中、或仅含有小神经胶质细胞和神经元、或仅含有星形胶质细胞和神经元、或仅含有神经元的培养物中。只有含有小神经胶质细胞的培养物才对LPS作出应答，因为它们是表达LPS受体(TLR4)的唯一细胞类型，但是在三培养物中，与仅含有小神经胶质细胞和神经元的培养物相比，C3的释放增加。该效果可能归因于来自激活的小神经胶质细胞的反应性细胞因子反馈到星形胶质细胞，引起它们的反应性和星形胶质细胞C3的释放。LPS刺激的三培养物和仅小神经胶质细胞/神经元的培养物还分泌其它反应性细胞因子，包括IL-6、TNFα、GM-CSF、IL1B和IFNγ。通过ELISA测量细胞因子。
图19示出，与H9对照相比，与阿尔茨海默氏病的神经元的三培养显示出C3增强和C3释放增加(图19)。与APP/SWe突变神经元(家族性阿尔茨海默氏病的遗传模型)共培养的三培养物，与仅小神经胶质细胞和神经元的培养物相比，显示C3增加，并且与神经元衍生自H9对照胚胎干细胞系的培养物相比，其水平增加。相比之下，与H9对照中的小神经胶质细胞/神经元培养物相比，三培养物中的C3水平没有增加，表明在没有疾病刺激的情况下不会发生C3增强。通过ELISA测量C3。
图20示出GM-CSF减少阿尔茨海默氏病和H9共培养物两者中C3释放的结果。GM-CSF减少所有培养物即阿尔茨海默氏病和对照两者中的C3释放。通过免疫荧光，在添加GM-CSF的条件和对照条件之间的细胞数目也相当，表明这种效果不是由于较少的小神经胶质细胞。
图21示出在对淀粉样蛋白42肽具有选择性的小神经胶质细胞共培养物中淀粉样蛋白β的负荷降低(图21)。小神经胶质细胞与阿尔茨海默氏病的神经元的共培养通过ELISA显示总淀粉样蛋白β降低，特别是与40和38肽相比的淀粉样蛋白β42肽。
图22示出小神经胶质细胞内部42-488的荧光增加表明摄取增加。为了检定小神经胶质细胞是否吞噬淀粉样蛋白β，将荧光标记的淀粉样蛋白β42肽与alexa fluor 4888一起使用，通过免疫荧光发现2小时后，大多数小神经胶质细胞在其内部包含淀粉样蛋白β42。另一方面，淀粉样蛋白β40(通过555标记)在小神经胶质细胞内部未发现明亮，表明它没有被高效吞噬。这证明小神经胶质细胞对淀粉样蛋白β42的选择性。
图23示出切换荧光团产生相似的结果：淀粉样蛋白β42被小神经胶质细胞吸收得更多。切换代表淀粉样蛋白42和40的荧光团，以确保细胞内42亮度增加的效果不是由于技术上的荧光团亮度效果。即使使用切换的荧光团，在该实验中，42标记为555，40标记为488，通过免疫荧光，小神经胶质细胞内存在更多的42的亮度，这证实了先前的结果，即小神经胶质细胞选择性吞噬淀粉样蛋白β42。
图24提供FACS分析，示出基线处对淀粉样蛋白42的选择性以及在GM-CSF处理时摄取的增加。GM-CSF处理增加小神经胶质细胞内淀粉样蛋白β42以及40的吞噬作用，并且使用流式细胞术对其内具有淀粉样蛋白β肽的细胞数量进行了定量。
图25示出基线处ALS小神经胶质细胞和星形胶质细胞的补体C3释放增加。SOD1突变iPSC衍生的ALS星形胶质细胞和小神经胶质细胞单独或一起培养，通过ELISA定量，与同基因、野生型对照细胞系衍生的星形胶质细胞或小神经胶质细胞相比，表现出C3水平更高。这表明C3反应性并非阿尔茨海默氏病所独有，本公开的体系可用于研究其中小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间也可能存在回路的其它神经退行性疾病。
图26A-26D示出在窄发育窗口期间发生的朝向原始造血作用的模式化。图26A示出用于从hPSC分化原始造血细胞的本公开的示例性方法的示意图。图26B示出必须在WNT激活后18小时开始WNT抑制，以有效地产生KDR+CD235A+成血管细胞。图26C示出优化的WNT激活随后抑制，到第3天产生30％的KDR+CD235A+群体。图26D示出，仅KDR+CD235A+级分到分化的第6天产生CD43+CD235A+CD41+EMP，而到分化的第10天产生CD45+巨噬细胞前体。
图27A-27F示出，单细胞RNA测序验证体外分化中小神经胶质细胞发育的阶段。图27A示出对来自第6天和第10天培养物的合并数据进行扩散映射之后T-分布随机邻域嵌入(TSNE)揭示了不同的造血内皮细胞(HE)、红系骨髓祖细胞(EMP)、红细胞(ERY)、巨核细胞(MK)和早期巨噬细胞(PMAC)簇。图27B示出Palantir分析，显示HE簇分化程度最低，通过EMP中间体进展，并在拟时间(pseudotime)内分支为朝向红细胞(ERY)、巨核细胞(MK)和骨髓(MY)群体的3个单独的分化轨迹。图27C示出单独的分化臂(ERY、MK和MY)在拟时间内渐增地表达的ERY、MK和MY身份的关键标志物。图27D示出与小鼠卵黄囊EMP和PMAC基因签名(Mass等,Science(2016)；353(6304)aaf4238)相比，拟时间内来自细胞的沿骨髓轨迹的基因表达数据的热图显示EMP基因富集在拟时间0.16-0.77之间，对应于体外人EMP簇，以及PMAC基因富集在拟时间0.8-1.0之间，对应于体外人PMAC簇。图27E提供体外人数据到小鼠原肠胚形成数据的映射，示出人PMAC簇与小鼠My(骨髓)簇之间的相似性。图27F示出与小鼠发育的E8.5期间存在的簇最紧密地映射的体外人pMAC簇。
图28A-28J示出从PMAC阶段衍生分子和功能与体内小神经胶质细胞相似的hPSC-小神经胶质细胞的两种不同方法。图28A示出两种从PMACS衍生小神经胶质细胞的方法的示意图。图28B示出，第10天祖细胞与hPSC衍生的皮质神经元直接共培养，到共培养的第4天，产生分枝的IBA1+细胞。图28C示出，在共培养的第4天，共培养物中超过30％的细胞表达CX3CR1+。图28D示出，与hPSC衍生的皮质神经元共培养6天的GFP+第10天祖细胞超过50％CD45+，其中超过80％为CX3CR1+。CD45阴性(CD45-)的约10％GFP+群体由约50％的CD41+CD235A+(EMP)和约50％的未定型细胞(uncommitted)组成。图28E示出，使第10天祖细胞在没有神经元的IL-34和M-CSF中成熟，到培养的第11天，产生表达CD11B(～99％)和CX3CR1(>85％)的原始巨噬细胞的渐纯群体。平行成熟的PBMC表达CD11B(100％)，但不表达CX3CR1+。图28F示出与hPSC衍生的皮质神经元一起培养原始巨噬细胞产生分枝的IBA1+小神经胶质细胞样细胞。图28G示出，和与皮质神经元共培养的PBMC成熟的巨噬细胞(其不表达CX3CR1并且具有更高的CD45表达和上调的关键的小神经胶质细胞特异性基因)相比，共培养的小神经胶质细胞保持了CX3CR1的表达，并且CD45的表达较低。图28H示出，通过任一种方法产生的hPSC-小神经胶质细胞均表达与人胎儿小神经胶质细胞(来自商业来源的RNA)相似的一组关键的小神经胶质细胞特异性基因，而PBMC衍生的巨噬细胞不表达。与单独培养的小神经胶质细胞相比，共培养中的TMEM119和SALL1的表达增加。n＝2。图28I示出衍生自两种不同方法的***神经胶质细胞的大量RNA测序数据的基因表达。每组n＝3。图28J示出与d70 hPSC衍生的皮质神经元共培养的小神经胶质细胞包含突触蛋白内含物的共聚焦成像(40x)(图i)；以及对包含以RFP标记的一般神经元物质的内含物定量，比包含突触蛋白的内含物的体积更大(图ii)。每组n＝4。
图29A-29K示出，与hPSC衍生的星形胶质细胞和神经元一起培养的hPSC衍生的小神经胶质细胞建立了功能性的人三培养体系，该体系允许在体内模拟神经炎症轴。图29A示出三培养分化的示意图。图29B示出，hPSC衍生的星形胶质细胞是GFAP+，一些是AQP4+。图29C显示，hPSC衍生的神经元是端脑的，并保持FOXG1。图29D示出D50 hPSC衍生的神经元表达皮质层标志物TBR1和CTIP2。图29E表示三培养物，其示出与MAP2+神经元相互作用的IBA1+小神经胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞。图29F表示通过CC3+测量的具有最小细胞死亡的三培养物。图29G示出通过ELISA测定，与小神经胶质细胞/神经元(M/N)培养物相比，三培养物(TRI)中C3蛋白的分泌增加，在LPS处理时会加剧。C3在星形胶质细胞/神经元(A/N)和仅神经元(N)培养物中不分泌。每组n＝4，ANOVA，Sidak的事后检验(post-hoc test)。图29H示出LPS刺激诱导其它炎症细胞因子的分泌。图29I示出通过ELISA，C3 KO小神经胶质细胞不分泌C3蛋白。图29J示出，C3KOA培养物具有与野生型(wt)三培养物相比降低的C3释放，但是比M/N培养物分泌更多的C3。C3KOM培养物具有低水平的最小C3释放。与三培养物相比，C3KOA培养物中C3的释放因LPS处理而降低；与其它组相比，C3KOM具有较低的C3释放。图29K示出三培养中的神经炎症回路，其由小神经胶质细胞向星形胶质细胞信号传导开始，该信号传导返回小神经胶质细胞，导致C3释放增加。
图30A-30H示出，阿尔茨海默氏病(AD)的三培养模型显示AD三培养物中C3释放的增加是由于小神经胶质细胞向星形胶质细胞信号传导所致。图30A示出同基因APPSWE+/+神经元表达端脑标志物FOXG1。图30B示出皮质层标志物CTIP2和TBR1。图30C示出由D50同基因APPSWE+/+神经元和WT对照分泌的总淀粉样蛋白量。n＝2，Student t-检验。图30D示出具有d80神经元(MAP2+)、野生型hPSC衍生的小神经胶质细胞(IBA1+)和星形胶质细胞(GFAP+)的同基因APPSWE+/+三培养物。图30E示出APPSWE+/+三培养物比同基因对照三培养物分泌更多的C3。n＝3，ANOVA，使用事后Sidak。图30F提供具有APPSWE+/+神经元的C3KOA三培养物与具有野生型星形胶质细胞的APPSWE+/+三培养物相比，显示出较低的C3分泌。C3KOM APPSWE+/+三培养物分泌低水平的C3。每组n＝3，ANOVA，使用事后Sidak。图30G示出，含有小神经胶质细胞的APPSWE+/+培养物与同基因对照培养物相比表达更高水平的C1QA沉积。图30H示出AD的体外模型中的神经炎症回路，其中APPSWE+/+神经元激活小神经胶质细胞，小神经胶质细胞激活星形胶质细胞，导致C3释放增加。
图31A-31C示出造血身份细胞的产生。图31A示出，从第6天开始加入***(EPO)允许在分化的第10天出现CD235A+红细胞。图31B示出，圆形造血细胞到第10天在半悬浮中逐渐增殖。图31C示出在分化培养物中存在VE-钙粘蛋白+造血内皮细胞。
图32A-32B示出从GPI-H2B-GFP hPSC系产生GFP+造血细胞。图32A示出在H2B之后含有GFP的靶向系在基因座PCR时产生1kb产物。图32B示出在多能阶段的GPI-H2B-GFP hPSC系在每个细胞中表达GFP。
图33A-33C示出小神经胶质细胞的代表性明场和免疫荧光图像。图33A示出在血清或无血清条件下在IL-34和M-CSF中培养11天后所有分化细胞都粘附并且细胞显示出伸长的形态。图33B示出所有细胞均表达骨髓转录因子PU.1。图33C示出小神经胶质细胞在共培养时上调IBA1，并形成了分枝的形态。
图34A-34B示出共培养的hPSC衍生的小神经胶质细胞的单细胞RNA测序结果。图34A示出小神经胶质细胞样品中细胞之间的成对距离落在均匀的单峰分布内。图34B示出异质第10天样品中的细胞之间的成对距离具有多个峰。
图35A-35B示出当用酵母-抗原酵母聚糖攻击时细胞的吞噬作用。图35A示出小神经胶质细胞在4小时内显示出与酵母聚糖结合的荧光珠作为内含物。图35B示出星形胶质细胞对照没有显示荧光珠内含物。
图36A-36B示出hPSC衍生的皮质神经元的突触前和突触后基因表达。图36A示出D70时hPSC衍生的皮质神经元，显示突触前SYNI和突触后HOMER1的点状分布，以及两者并排的推定突触(白色箭头)。图36B示出，D70 hPSC衍生的皮质神经元呈点状分布表达突触后标志物PSD95。
图37A-37C示出在不同条件下三培养物中C3的分泌。图37A示出在第7天(5x)铺板的星形胶质细胞数量增加(50K)的三培养物含有较少的小神经胶质细胞(IBA1+)。图37B示出在所有测试的细胞培养物中，三培养物NB/BAGC和NB：N2基础培养基配方中C3的分泌最低。图37C显示，经70％甲醇孵育30分钟杀死的hPSC衍生的神经元显示出明亮的CC3+，而活细胞则没有。
图38A-38C示出使用高内涵成像显微镜通过免疫荧光对IBA+细胞的定量。图38A示出，使用孔显示的9个视野的ImageExpress显微镜，与第7天的三培养物相比，M/N的小神经胶质细胞/神经元(M/N)培养物中的％IBA1+/DAPI的细胞评分更高。图38B示出用于细胞评分的孔的9个视野的量化的代表性图像，示出DAPI和IBA1染色。图38C示出细胞评分，该评分说明在不同的三培养物(TRI、C3KOM、C3KOA)之间IBA1+小神经胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞的数量相似。
发明内容
本公开涉及用于产生衍生自干细胞(例如人干细胞)的小神经胶质细胞的方法，从此类方法获得的小神经胶质细胞以及包括其的组合物，此类小神经胶质细胞用于疾病建模和用于治疗小神经胶质细胞相关病症的用途。
本公开提供用于诱导干细胞分化的体外方法。在某些实施方式中，该方法包括：a)使干细胞与至少一种Wingless(Wnt)信号传导激活剂接触至多约24小时；b)使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂和至少一种促造血细胞因子(hematopoiesis-promotingcytokine)接触以获得分化细胞群体，其中分化细胞选自表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞、表达至少一种前巨噬细胞(pre-macrophage)标志物的细胞及其组合；和c)诱导分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。
在某些实施方式中，c)诱导分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括将分化细胞与神经元一起培养至少约5天。在某些实施方式中，c)诱导分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括将分化细胞与神经元一起培养4天。在某些实施方式中，c)诱导分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括使分化细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子(macrophage-promoting cytokine)接触至少约5天；以及将细胞与神经元一起培养至少约5天。在某些实施方式中，该方法包括将细胞与神经元一起培养至少4天。
在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约20小时。在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触18小时。
在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约1天且至多约5天。在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少1天且至多4天。在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约2天。
在某些实施方式中，使细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约1天且至多约10天。在某些实施方式中，使细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少3天且至多11天。在某些实施方式中，使细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触7天、8天、9天、10天或11天。在某些实施方式中，将细胞与神经元一起培养约5天。在某些实施方式中，将细胞与神经元一起培养4天或5天。
在某些实施方式中，使干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触的步骤产生表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞。在某些实施方式中，所述至少一种中胚层祖细胞标志物选自Brachyury、KDR及其组合。在某些实施方式中，使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触的步骤产生表达至少一种原始造血前体标志物的细胞。在某些实施方式中，所述至少一种原始造血前体标志物选自KDR、CD235A及其组合。在某些实施方式中，使细胞与至少一种促造血细胞因子接触的步骤还产生表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞。在某些实施方式中，使细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约1天且至多约5天和/或至多约10天，以产生表达至少一种EMP标志物的细胞。在某些实施方式中，至少一种EMP标志物选自Kit、CD41、CD235A、CD43及其组合。在某些实施方式中，表达至少一种EMP标志物的细胞不表达CD45。在某些实施方式中，至少一种前巨噬细胞标志物选自CD45、CSF1R及其组合。在某些实施方式中，表达至少一种前巨噬细胞标志物的细胞不表达Kit。在某些实施方式中，至少一种小神经胶质细胞标志物选自CX3CR1、PU.1、CD45、IBA1、P2RY12、TMEM119、SALL1、GPR34、C1QA、CD68、CD45及其组合。在某些实施方式中，至少一种巨噬细胞标志物选自CD11B、DECTIN、CD14、PU.1、CX3CR1、CD45及其组合。
在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导激活剂降低糖原合成酶激酶3β(GSK3β)以激活Wnt信号传导。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导激活剂选自CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、WAY-316606、IQ1、QS11、SB-216763、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)、LY2090314、DCA、2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、(杂)芳基嘧啶、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导激活剂是CHIR99021。
在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导抑制剂选自XAV939、IWP2、DKK1、IWR1、肽(Nile等人的肽(Nile等Nat Chem Biol.2018Jun；14(6):582-590))、porccupine抑制剂、LGK974、C59、ETC-159、Ant1.4Br/Ant 1.4Cl、氯硝柳胺、apicularen、巴弗洛霉素、G007-LK、G244-LM、吡维胺(pyrvinium)、NSC668036、2,4-二氨基喹唑啉、槲皮素、ICG-001、PKF115-584、BC2059、Shizokaol D、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导抑制剂是IWP2。
在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子选自VEGF、FGF、SCF、白介素、TPO、及其组合。在某些实施方式中，白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、及其组合。在某些实施方式中，白介素选自IL-6、IL-3、及其组合。在某些实施方式中，FGF选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、及其组合。在某些实施方式中，FGF是FGF2。
在某些实施方式中，至少一种促巨噬细胞细胞因子选自M-CSF、IL-34、及其组合。
在某些实施方式中，使细胞与浓度为约1μM至约6μM的至少一种Wnt信号传导激活剂接触。在某些实施方式中，使细胞与浓度为约1μM至约10μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，使细胞与浓度为约1ng/mL至约50ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，使细胞与浓度为约1ng/mL至约400ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，使细胞与浓度为约1ng/mL至约200ng/mL的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。
另一方面，本公开提供表达至少一种小神经胶质细胞标志物的体外分化细胞的细胞群体，其中所述体外分化细胞根据本文本公开的分化方法衍生自干细胞。还提供包括此类细胞群体的组合物。
另一方面，本公开提供用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包括：(a)至少一种Wnt信号传导抑制剂；(b)至少一种Wnt信号传导激活剂；(c)至少一种促造血细胞因子；和(d)神经元。在某些实施方式中，试剂盒还包括(e)至少一种促巨噬细胞细胞因子。
在某些实施方式中，试剂盒还包括用于诱导干细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的说明书。
另一方面，本公开提供一种包括体外分化细胞群体的组合物，其中群体中包括的至少约50％的细胞表达至少一种小神经胶质细胞标志物，并且其中群体中包括的少于约25％的细胞表达至少一种选自以下的标志物：干细胞标志物、中胚层祖细胞标志物、原始造血前体标志物、EMP标志物、前巨噬细胞标志物、巨噬细胞标志物。
另一方面，本公开提供预防和/或治疗受试者的神经退行性疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用以下之一：(a)本文公开的分化的小神经胶质细胞群体；(b)本文公开的组合物；和(c)本文公开的组合物。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用集落刺激因子(CSF)。
在某些实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在某些实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
在某些实施方式中，CSF选自集落刺激因子(GM-CSF)和M-CSF。在某些实施方式中，CSF是GM-CSF。
另一方面，本公开提供用于预防和/或治疗神经退行性疾病的CSF。
另一方面，本公开提供CSF在制备用于预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
另一方面，本公开提供一种筛选用于治疗神经退行性疾病的治疗性化合物的方法，该方法包括：(a)使权利要求34的分化的小神经胶质细胞群体与测试化合物接触，其中小神经胶质细胞衍生自从患有神经退行性疾病的受试者获得的干细胞；和(b)测量小神经胶质细胞的功能活性，其中小神经胶质细胞的功能活性的改变表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。
在某些实施方式中，改变是降低或增加。在某些实施方式中，小神经胶质细胞的功能活性包括补体C3的释放。在某些实施方式中，从小神经胶质细胞释放的补体C3的减少表明该治疗性化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。在某些实施方式中，小神经胶质细胞的功能活性包括小神经胶质细胞对淀粉样蛋白-β的吞噬作用。在某些实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
另一方面，本公开提供一种筛选用于治疗神经退行性疾病的治疗性化合物的方法，该方法包括：(a)使测试化合物与包括本文所公开的分化的小神经胶质细胞、星形胶质细胞群体和神经元群体的组合物接触；和(b)测量神经元的神经毒性，其中在与测试化合物接触后神经元的神经毒性降低表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。在某些实施方式中，神经退行性疾病是ALS疾病。在某些实施方式中，小神经胶质细胞诱导反应性星形胶质细胞，其诱导对神经元的神经毒性。
具体实施方式
本公开提供逐步发育模式，其概括了卵黄囊原始造血作用，在成熟为巨噬细胞之前分离前巨噬细胞(pMac)，并在体外神经环境中培养这些细胞以在尽可能少至16天的时间内产生真正的人小神经胶质细胞。
出于清楚的公开而非限制的目的，具体实施方式分为以下小节：
5.1.定义；
5.2.干细胞分化方法；
5.3.包括小神经胶质细胞的组合物；
5.4.治疗方法；和
5.5.试剂盒；
5.6.筛选治疗性化合物的方法
5.1.定义
本说明书中使用的术语在本发明的上下文中和在使用每个术语的具体上下文中通常具有其在本领域中的通常含义。某些术语在下文或说明书中的其它地方讨论，以便向从业者提供对描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量体系的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在3个或多于3个标准偏差内。或者，“约”可以指给定值的至多20％例如至多10％、至多5％、或至多1％的范围。或者，特别是关于生物体系或过程，该术语可以指在数值的一个数量级内、例如在5倍以内或2倍以内。
如本文所用，涉及“信号传导蛋白”时术语“信号传导”是指通过配体结合膜受体蛋白质或一些其它刺激而得以激活或以其它方式影响的蛋白质。信号传导蛋白的实例包括，但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、SMAD、Wingless(Wnt)复合蛋白，包括β-连环蛋白、NOTCH、转化生长因子β(TGFβ)、激活素、Nodal和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白。对于许多细胞表面受体或内部受体蛋白质，配体-受体相互作用与细胞的应答没有直接联系。配体激活的受体可以首先与细胞内的其它蛋白质相互作用，然后产生配体对细胞行为的最终生理效应。通常，在受体激活或抑制后，一连串的数种相互作用的细胞蛋白质的行为发生改变。由受体激活诱导的整组细胞变化称为信号传导机制或信号传导通路。
如本文所用，术语“信号”是指控制细胞结构和功能变化的内部和外部因素。它们本质上可以是化学的或物理的。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子和蛋白质，例如TFGβ、激活素、Nodal、骨形态发生蛋白(BMP)等。
如本文所用的“抑制剂”是指干扰(例如，减少、降低、抑制、消除或阻断)分子或通路的信号传导功能的化合物或分子(例如，小分子、肽、拟肽(peptidomimetic)、天然化合物、siRNA、反义核酸、适体或抗体)。抑制剂可以是改变指定蛋白质(信号传导分子、与指定信号传导分子有关的任何分子、指定的相关分子，比如，Wingless(Wnt))(例如，包括但不限于本文所述的信号传导分子)的任何活性的任何化合物或分子，例如，通过直接接触Wnt信号传导、接触Wnt mRNA、引起Wnt的构象变化、降低Wnt蛋白水平、或干扰Wnt与信号传导配偶体的相互作用(例如，包括本文所述的那些)，并影响Wnt靶基因(例如本文所述的那些)的表达。抑制剂还包括通过拦截上游信号传导分子(例如，在细胞外结构域内，例如信号传导分子)间接调节Wnt生物活性的分子。除通过结合并影响指定信号传导分子上游的分子转而引起指定分子抑制而诱导的抑制以外，还就竞争性抑制(以排除或减少另一种已知结合化合物的结合的方式结合活性位点)和变构抑制(以干扰化合物与蛋白质活性位点结合的方式改变蛋白质构象的方式结合蛋白质)而言对抑制剂进行了描述。抑制剂可以是通过实际接触信号传导靶标来抑制信号传导靶标或信号传导靶通路的“直接抑制剂”。
如本文所用，“激活剂”是指增加、诱导、刺激、激活、促进或增强激活分子或通路(例如Wnt信号传导或FGF信号传导)的信号传导功能的化合物。
如本文所用，术语“衍生物”是指具有类似核心结构的化合物。
如本文所用，术语“细胞的群体”或“细胞群体”是指一组至少两个细胞。在非限制性实例中，细胞群体可以包括至少约10、至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000个细胞。群体可以是包括一种细胞类型的纯群体。或者，群体可以包括一种以上细胞类型，例如混合细胞群体。
如本文所用，术语“干细胞”是指能够在培养中无限期***并产生特化细胞的细胞。人干细胞是指来自人的干细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指衍生自植入前阶段的胚胎的原始(未分化)细胞，其能够在培养中长时期地***而不分化，并且已知会发育成三原胚层的细胞和组织。人胚胎干细胞是指来自人的胚胎干细胞。如本文所用，术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指衍生自早期人胚胎、直至并包括胚泡期的一类多能干细胞(“PSC”)，其能够在培养中长时期地***而不分化，并且已知会发育成三原胚层的细胞和组织。
如本文所用，术语“胚胎干细胞系”是指已经在体外条件下培养的胚胎干细胞群体，上述条件允许增殖而不分化高达数天、数月至数年。
如本文所用，术语“全能(totipotent)”是指产生身体的所有细胞类型加上构成胚外组织(例如胎盘)的所有细胞类型的能力。
如本文所用，术语“多潜能(multipotent)”是指发育成身体的一种以上细胞类型的能力。
如本文所用，术语“多能(pluripotent)”是指发育成有机体的三个发育胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的能力。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指一类与胚胎干细胞类似的多能干细胞，其通过将某些胚胎基因(例如OCT4、SOX2和KLF4转基因)(参见，例如，Takahashi和Yamanaka Cell 126,663-676(2006)，在此并入以供参考)引入体细胞而形成，例如CI 4、C72等。
如本文所用，术语“体细胞”是指配子(卵子或***)以外的体内的任何细胞；有时称为“成体”细胞。
如本文所用，术语“体细胞(成体)干细胞”是指在许多器官和分化组织中发现的相对罕见的未分化细胞，其具有有限的自我更新(在实验室中)和分化的能力。这些细胞的分化能力不同，但通常限于起源器官中的细胞类型。
如本文所用，术语“神经元”是指神经***的主要功能单元神经细胞。神经元由细胞体及其突起——轴突和至少一个树突组成。神经元通过在突触处释放神经递质将信息传递给其它神经元或细胞。
如本文所用，术语“增殖”是指细胞数量的增加。
如本文所用，术语“未分化”是指尚未发育成特化细胞类型的细胞。
如本文所用，术语“分化”是指非特化的胚胎细胞获得特化细胞如心脏、肝脏或肌肉细胞的特征的过程。分化受细胞基因与细胞外部的物理和化学条件的相互作用控制，通常是通过涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号传导通路。
如本文所用，术语“定向分化”是指操作干细胞培养条件以诱导分化成特定(例如，所期望的)细胞类型，比如EMP。
如本文所用，关于干细胞的术语“定向分化”是指使用小分子、生长因子蛋白和其它生长条件来促进干细胞从多能状态转变成更成熟或特化的细胞命运(例如pMac、巨噬细胞、小神经胶质细胞等)。
如本文所用，关于细胞的术语“诱导分化”是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞中的分化”是指诱导干细胞(例如，人干细胞)***成具有与干细胞不同的特征的子代细胞，上述特征例如基因型(例如，如通过遗传分析例如微阵列所确定的基因表达的变化)和/或表型(例如，蛋白质如小神经胶质细胞标志物的表达的变化)。
如本文所用，术语“细胞培养”是指在用于研究或医疗的人工培养基中细胞的体外生长。
如本文所用，术语“培养基”是指覆盖培养容器如培养皿、多孔板等中的细胞、并含有营养物以滋养和支持细胞的液体。培养基还可以包括添加以在细胞中产生所期望的变化的生长因子。
如本文所用，术语使细胞与化合物(例如，至少一种抑制剂、激活剂和/或诱导剂)“接触”是指将化合物置于允许其接触细胞的位置。接触可以使用任何合适的方法完成。例如，接触可以通过将化合物加入细胞的管中完成。接触也可以通过将化合物加入到包括细胞的培养基中完成。可以将每种化合物(例如，本文公开的抑制剂、激活剂和诱导剂)作为溶液(例如浓缩溶液)加入到包括细胞的培养基中。另外可选地或额外地，化合物(例如，本文公开的抑制剂、激活剂和诱导剂)以及细胞可以存在于配制的细胞培养基中。
如本文所用，术语“体外”是指人造环境以及在人造环境中发生的过程或反应。体外环境例示但不限于试管和细胞培养物。
如本文所用，术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应，如胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。
如本文所用，与基因或蛋白质相关的术语“表达”是指制备可以使用例如微阵列检定、抗体染色检定等的检定观察到的mRNA或蛋白质。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”是指识别特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。细胞的标志物可以不限于一种标志物，标志物可以指一种“模式(pattern)”标志物，使得指定组的标志物可以使细胞或细胞类型从另一种细胞或细胞类型中识别出。
如本文所用，当涉及本文公开的任何细胞时，术语“衍生自”或“建立自”或“分化自”是指使用任何操作从细胞系、组织(如解离的胚胎)或流体中的亲本细胞获得(例如，分离、纯化等)的细胞，上述操作例如，但不限于，单细胞分离，体外培养，使用例如蛋白质、化学品、辐射、病毒感染、用DNA序列转染例如用形态发生素等的处理和/或诱变，选择(如通过连续培养)所培养亲本细胞中含有的任何细胞。衍生的细胞可以借助对生长因子、细胞因子、细胞因子处理的选择进展、粘附性、粘附性的缺乏、分选程序等的应答从混合群体中选择。
本文的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、灵长类动物、家畜、运动动物(sport animal)、啮齿类动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，如猿和猴。
如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何症状或病症。
如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗性效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止在受影响或所诊断的受试者或疑似患有该病症的受试者中由病症导致的恶化，而且治疗也可以防止处于该病症风险或疑似患有该病症的受试者中病症或病症症状的发作。
5.2.干细胞分化方法
本公开提供用于诱导干细胞(例如人干细胞)分化的体外方法。人干细胞的非限制性实例包括人胚胎干细胞(hESC)、人多能干细胞(hPSC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)、人单性生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、外胚层干细胞、F-class多能干细胞、成体干细胞、癌肿干细胞或任何其它能够谱系特异性分化的细胞。在某些实施方式中，人干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在某些实施方式中，人干细胞是人诱导多能干细胞(hiPSC)。
本公开涉及干细胞衍生的小神经胶质细胞。在某些实施方式中，干细胞向小神经胶质细胞的分化包括干细胞体外分化为表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞，体外分化为表达至少一种原始造血前体标志物的细胞，体外分化为表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞，体外分化为表达至少一种前巨噬细胞(也称为巨噬细胞前体)(pMac)标志物的细胞，以及表达至少一种pMac标志物的细胞体外分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。在某些实施方式中，干细胞向小神经胶质细胞的分化还包括表达至少一种pMac标志物的细胞体外分化为表达至少一种巨噬细胞标志物的细胞，以及表达至少一种巨噬细胞标志物的细胞体外分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。
在某些实施方式中，本公开提供用于诱导干细胞分化的方法，包括：a)使干细胞与至少一种Wingless(Wnt)信号传导激活剂接触；b)使细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂和至少一种促造血细胞因子接触，以获得选自以下的分化细胞群体：表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞，表达至少一种前巨噬细胞标志物的细胞，及其组合；c)诱导分化的细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。在某些实施方式中，诱导分化的细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括与神经元一起培养分化的细胞。在某些实施方式中，诱导分化的细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括使分化的细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触；以及与神经元一起培养细胞。
5.2.1.干细胞向中胚层祖细胞的分化
在某些实施方式中，通过使干细胞(例如人干细胞)与至少一种Wnt信号传导激活剂(例如CHIR99021)(称为“Wnt激活剂”)接触，而从干细胞体外分化表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞。在某些实施方式中，还使干细胞与至少一种BMP活性剂例如BMP分子(例如BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如激活素A)接触。
中胚层祖细胞标志物的非限制性实例包括Brachyury、KDR及其组合。
如本文所用，关于配体的术语“Wnt”或“wingless”是指一组能够与Wnt受体例如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体家族中的受体相互作用的分泌蛋白(即人的Intl(integration 1))。如本文所用，关于信号传导通路的术语“Wnt”或“wingless”是指由Wnt家族配体和Wnt家族受体例如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体组成的经由或不经β-连环蛋白介导的信号通路。出于本文所述的目的，优选的Wnt信号传导通路包括通过β-连环蛋白例如WNT/-连环蛋白的介导。
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂减少糖原合成酶激酶3β(GSK3β)，以激活Wnt信号传导。因此，Wnt激活剂可以是GSK3β抑制剂。GSK3P抑制剂能够激活WNT信号传导通路，参见例如Cadigan,等,J Cell Sci.2006；119:395-402；Kikuchi等,CellSignaling.2007；19:659-671，其全部内容并入本文以供参考。如本文所用，术语“糖原合成酶激酶3β抑制剂”是指抑制糖原合成酶激酶3β酶的化合物，例如，参见Doble,等,J CellSci.2003；116:1175-1186，其全部内容并入本文以供参考。
Wnt激活剂或GSK3β抑制剂的非限制性实例公开于WO2011/149762、Chambers(2012)和Calder等,J Neurosci.2015Aug19；35(33):11462-81，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂是选自CHIR99021、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括CHIR99021。
“CHIR99021”(也称为“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚酮”)是指IUPAC名6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙基氨基)烟腈，其具有下式。
Figure BDA0003086720250000231
CHIR99021具有高度选择性，针对一组相关和不相关的激酶显示出近千倍的选择性，针对人GSK3β的IC50＝6.7nM，针对啮齿类动物GSK3β同源物为纳摩尔IC50值。
Wnt激活剂的非限制性实例包括CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、WAY-316606、IQ1、QS11、SB-216763、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)、LY2090314、DCA、2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、(杂)芳基嘧啶、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，Wnt激活剂是CHIR99021。
在某些实施方式中，BMP活性剂是BMP分子。BMP的非限制性实例包括BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP11、BMP15、其衍生物、及其混合物。在某些实施方式中，BMP活性剂是BMP4。
激活素蛋白的非限制性实例包括激活素A、激活素AB、激活素C、激活素B和激活素AC、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，激活素蛋白是激活素A。
对于干细胞向表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞的体外分化，干细胞可与至少一种Wnt信号传导激活剂接触至多约10小时、至多约15小时、至多约20小时或至多约25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触至多约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时或至少约25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约10小时至约25小时、约10小时至约15小时、约10小时至约20小时、约15小时至约25小时、或约15小时至约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约10小时至约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约15小时至约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约10小时、约15小时或约20小时、或约25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触约15小时或约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触16小时、17小时、18小时、19小时或20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂接触18小时。
在某些实施方式中，对于干细胞向表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞的体外分化，干细胞还可与至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)接触。在某些实施方式中，干细胞还与至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)接触。在某些实施方式中，干细胞与Wnt激活剂、BMP活性剂和激活素蛋白同时接触。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt激活剂、至少一种BMP活性剂和至少一种激活素蛋白同时接触至多约10小时、至多约15小时、至多约20小时或至多约25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触至少约10小时、至少约15小时、至少约20小时或至少约25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触约10小时至约25小时、约10小时至约15小时、约10小时至约20小时、约15小时至约25小时或约15小时至约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触约15小时至约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt激活剂、至少一种BMP活性剂和至少一种激活素蛋白同时接触约15小时或约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt激活剂、至少一种BMP活性剂和至少一种激活素蛋白同时接触10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或25小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触约20小时。在某些实施方式中，干细胞与至少一种Wnt信号传导激活剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触18小时。
在某些实施方式中，干细胞与浓度为约1μM至约100μM、约1μM至约20μM、约1μM至约15μM、约1μM至约10μM、约1μM至约6μM、约6μM至约10μM、约6μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约40μM、约40μM至约50μM、约50μM至约60μM、约60μM至约70μM、约70μM至约80μM、约80μM至约90μM、或约90μM至约100μM的至少一种Wnt信号传导激活剂接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约1μM至约6μM的至少一种Wnt信号传导激活剂接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约3μM的至少一种Wnt信号传导激活剂接触。
在某些实施方式中，干细胞与浓度为约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL或约90ng/mL至约100ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约20ng/mL至约40ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约30ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。
在某些实施方式中，干细胞与浓度为约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL或约90ng/mL至约100ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约5ng/mL至约10ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约7.5ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。
5.2.2.中胚层祖细胞向原始造血前体的分化
在某些实施方式中，通过使表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂(称为“Wnt抑制剂”)(例如IWP2)接触，而自表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞体外分化表达至少一种原始造血前体标志物的细胞。在某些实施方式中，干细胞还与至少一种BMP活性剂(例如，BMP分子，例如BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)接触。原始造血前体标志物的非限制性实例包括KDR、CD235A、及其组合。
如本文所用的术语“Wnt信号传导的抑制剂”或“Wnt抑制剂”不仅指可以通过直接抑制Wnt蛋白的正常功能而起作用的任何试剂，而且还指抑制Wnt信号传导通路因此概括了Wnt的功能的任何试剂。Wnt抑制剂的实例包括XAV939(Huang等Nature 461:614-620(2009))、维生素A(视黄酸)、锂、类黄酮、Dickkopf1(Dkk1)、***结合蛋白(IGFBP)(WO2009/131166)、以及针对β-连环蛋白的siRNA。
Wnt抑制剂的非限制性实例包括XAV939、IWR化合物、IWP化合物(例如IWP-2)、DKK1(Dickkopf蛋白1)、IWR1、肽(Nile等的肽(Nile等Nat Chem Biol.2018Jun；14(6):582-590))、porccupine抑制剂、LGK974、C59、ETC-159、Ant1.4 Br/Ant 1.4Cl、氯硝柳胺、apicularen、巴弗洛霉素、G007-LK、G244-LM、吡维胺、NSC668036、2,4-二氨基喹唑啉、槲皮素、ICG-001、PKF115-584、BC2059、Shizokaol D、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，Wnt抑制剂是IWP2。
Wnt抑制剂也可以是在WO09155001和Chen等,Nat Chem Biol 5:100-7(2009)中描述的那些，将其全文引入以供参考。
XAV939是一种强力的端锚聚合酶(TNKS)1和2的小分子抑制剂，IC50值分别为11nM和4nM。Huang等,Nature 461:614-620(2009)。通过抑制TNKS活性，XAV939增加了axin-GSK3β复合物的蛋白质水平，并促进SW480细胞中β-连环蛋白的降解。已知的Wnt抑制剂还包括Dickkopf蛋白、分泌的Frizzled相关蛋白(sFRP)、Wnt抑制因子1(WIF-1)和Soggy。Dickkopf相关蛋白家族(Dkk-1至-4)的成员是分泌蛋白，具有两个富含半胱氨酸的结构域，被一个接头区域隔开。Dkk-3和-4也有一个前动力蛋白(prokineticin)结构域。Dkk-1、-2、-3和-4通过与LRP5/6结合来充当经典Wnt信号传导的拮抗剂，从而阻止LRP5/6与Wnt-Frizzled复合物相互作用。Dkk-1、-2、-3和-4也结合细胞表面Kremen-1或-2，并促进LRP5/6的内化。Dkk-3的拮抗活性尚未得到证明。Dkk蛋白在成人和胚胎组织中具有不同的表达模式，并且对组织发育和形态发生具有广泛的影响。
Dkk家族还包括Soggy，它与Dkk-3同源，但与其它家庭成员不同源。sFRP是五种Wnt结合糖蛋白的家族，类似于膜结合Frizzled。Wnt抑制剂的最大家族，分为两组，第一组由sFRP1、2和5组成，第二组包括sFRP3和4。所有这些都是从独特的基因分泌和衍生的，没有一个是Frizzled家族的替代剪接形式。每个sFRP都包括一个N端富含半胱氨酸的结构域(CRO)。其它Wnt抑制剂包括与Wnt蛋白结合并抑制其活性的分泌蛋白WIF-1(Wnt抑制因子1)。
“IWP2”或“WNT产生-2(WNT Production-2)抑制剂”是指IUPAC名N-(6-甲基-1,3-苯并噻唑-2-基)-2-[(4-氧代-3-苯基-6,7-二氢噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺”，具有下式：
Figure BDA0003086720250000271
IWP-2在通路激活剂Porcupine的水平上抑制WNT通路(IC50＝27nM)。Porcupine是一种膜结合的酰基转移酶，其将WNT蛋白棕榈酰化，从而引起WNT分泌和信号传导能力。
在某些实施方式中，对于向表达至少一种原始造血前体标志物的细胞的体外分化，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约1天或至少约2天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约2天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至多约1天、至多约2天、至多约3天或至多约4天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至多4天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天或约1天至约2天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触2天至约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触1天至3天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触约1天、约2天、约3天或约4天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触1天、2天、3天或4天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触约2天。
在某些实施方式中，对于表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞向表达至少一种原始造血前体标志物的细胞的体外分化，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞还可与至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)接触。在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞还与至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)接触。在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与Wnt抑制剂、BMP活性剂和激活素蛋白同时接触。在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天或至少约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触至多约1天、至多约2天、至多约3天、至多约4天或至多约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂接触约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天或约1天至约2天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触1天至约3天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触约1天、约2天、约3天、约4天或约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触1天、2天、3天、4天或5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂、至少一种BMP活性剂(例如，BMP4)和至少一种激活素蛋白(例如，激活素A)同时接触约2天。
在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与浓度为约1μM至约100μM、约1μM至约20μM、约1μM至约15μM、约1μM至约10μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约5μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约40μM、约40μM至约50μM、约50μM至约60μM、约60μM至约70μM、约70μM至约80μM、约80μM至约90μM或约90μM至约100μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约1μM至约10μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约1μM至约5μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约2μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，细胞每天、每隔一天或每两天与上述任一浓度的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。在某些实施方式中，细胞每天与浓度为约2μM的至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。
在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与浓度为约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL或约90ng/mL至约100ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，干细胞与浓度为约30ng/mL至约50ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约40ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，细胞每天、每隔一天或每两天与上述任一浓度的至少一种BMP活性剂接触。在某些实施方式中，细胞每天与浓度为约40ng/mL的至少一种BMP活性剂接触。
在某些实施方式中，表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞与浓度为约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、或约90ng/mL至约100ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约5ng/mL至约15ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约10ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，细胞每天、每隔一天或每两天与上述任一浓度的至少一种激活素蛋白接触。在某些实施方式中，细胞每天与浓度为约10ng/mL的至少一种激活素蛋白接触。
5.2.3.原始造血前体向EMP、pMac、及其组合的细胞群体的分化
在某些实施方式中，通过使细胞与至少一种促造血细胞因子接触，自表达至少一种原始造血前体标志物的细胞体外分化出分化细胞的细胞群体，其中分化细胞选自表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞、表达至少一种pMac标志物的细胞、及其组合。在某些实施方式中，促造血细胞因子包括但不限于VEGF以及FGF信号传导的激活剂。在某些实施方式中，促造血细胞因子包括VEGF和FGF2。
在某些实施方式中，分化涉及两个阶段：(1)原始造血前体向红系骨髓祖细胞(EMP)的分化；和(2)EMP向pMac的分化。在某些实施方式中，诱导分化的两个阶段的分子是促造血细胞因子。例如，第一阶段中涉及的促造血细胞因子包括但不限于VEGF以及FGF信号传导的激活剂。在某些实施方式中，第一阶段中涉及的促造血细胞因子包括VEGF和FGF2。第二阶段中涉及的促造血细胞因子包括但不限于干细胞因子(SCF)、白介素(IL)和血小板生成素(TPO)。在某些实施方式中，第二阶段中涉及的促造血细胞因子包括SCF、IL-6、IL-3和TPO。
发现包括KDR+CD235A-和KDR+CD235A+细胞群体的未分选样品产生造血细胞的效率与分选的KDR+CD235A+细胞群体几乎相同，这表明KDR+CD235A+细胞对于造血细胞的稳健产生无需纯化。在某些实施方式中，包括表达至少一种原始造血前体标志物的细胞的细胞群体与至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞群体包括不表达至少一种原始造血前体标志物的细胞。在某些实施方式中，在细胞群体与至少一种促造血细胞因子接触之前，不从细胞群体中分选或分离表达至少一种原始造血前体标志物的细胞。
EMP标志物的非限制性实例包括Kit、CD41、CD235A、CD43、及其组合。在某些实施方式中，表达至少一种EMP标志物的细胞不表达CD45。
前巨噬细胞(pMac)标志物的非限制性实例包括CD45、CSF1R及其组合。
促造血细胞因子的非限制性实例包括VEGF、FGF信号传导的激活剂、SCF、白介素、TPO及其组合。FGF信号传导的激活剂(称为“FGF激活剂”)的非限制性实例包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、其衍生物、及其混合物。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂是FGF2。白介素的非限制性实例包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-15。在某些实施方式中，白介素是IL6、IL-3、其衍生物、及其混合物。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子选自VEGF、FGF2、SCF、IL-6、IL-3、TPO或其组合。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括VEGF和FGF2。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括SCF、IL-6、IL-3和TPO。
对于表达至少一种原始造血前体标志物的细胞向表达至少一种EMP标志物的细胞的体外分化，表达至少一种原始造血前体标志物的细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天或至少约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约1天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至多约1天、至多约2天、至多约3天、至多约4天、或至多约5天、或至多约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至多约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约1天至约5天、约1天至约10天、或约5天至约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约1天至约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触5天至约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约1天、约2天、约3天、约4天、或约5天、或约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约2天或约5天或约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触2天、6天或8天。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括VEGF、FGF信号传导的激活剂、或其组合。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括VEGF和FGF2。
对于表达至少一种EMP标志物的细胞向表达至少一种pMac标志物的细胞的体外分化，表达至少一种EMP标志物的细胞与至少一种促造血细胞因子接触至多约2天、至多约3天、至多约4天、至多约5天或至多约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至多约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至多6天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天或至少约6天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触至少约2天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约2天至约10天、约2天至约5天、或约5天至约10天、约2天至约3天、约3天至约6天、或约3天至约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约2天至约5天、或约5天至约10天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约2天、约3天、约4天、约5天或约6天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种促造血细胞因子接触4天或6天。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括SCF、白介素和TPO。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括SCF、IL-6、IL-3和TPO。
在某些实施方式中，细胞与浓度为约1ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约00ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、或约90ng/mL至约100ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约1ng/mL至约10ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约5ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约1ng/mL至约50ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL或约50ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约50ng/mL至约150ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约100ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约150ng/mL至约250ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约200ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞每天、每隔一天或每两天与上述任一浓度的至少一种促造血细胞因子接触。在某些实施方式中，细胞每天与浓度为约5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约30ng/mL、约50ng/mL、约100ng/mL或约200ng/mL的至少一种促造血细胞因子接触。
在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括VEGF、FGF2或其组合。在某些实施方式中，至少一种促造血细胞因子包括SCF、IL3、IL-6、TPO或其组合。在某些实施方式中，VEGF的浓度为约5ng/mL至约50ng/mL。在某些实施方式中，VEGF的浓度为约15ng/mL。在某些实施方式中，FGF2的浓度为约1ng/mL至约50ng/mL。在某些实施方式中，FGF2的浓度为约5ng/mL。在某些实施方式中，SCF的浓度为约50ng/mL至约400ng/mL。在某些实施方式中，SCF的浓度为约100ng/mL。在某些实施方式中，SCF的浓度为约200ng/mL。在某些实施方式中，IL-6的浓度为约2ng/mL至约200ng/mL。在某些实施方式中，IL-6的浓度为约10ng/mL。在某些实施方式中，IL-6的浓度为约20ng/mL。在某些实施方式中，IL-3的浓度为约1ng/mL至约50ng/mL。在某些实施方式中，IL-3的浓度为约30ng/mL。在某些实施方式中，TPO的浓度为约3ng/mL至约50ng/mL。在某些实施方式中，TPO的浓度为约30ng/mL。
5.2.4.EMP和/或pMac向小神经胶质细胞的分化
在某些实施方式中，通过与神经元一起培养根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)，自该分化细胞体外分化表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。
在某些实施方式中，通过使根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触(例如，产生表达至少一种巨噬细胞标志物的细胞，例如巨噬细胞)；并与神经元一起培养细胞(例如巨噬细胞)，自该分化细胞体外分化表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。在某些实施方式中，表达至少一种巨噬细胞标志物的细胞(例如，巨噬细胞)包括表达至少一种原始巨噬细胞标志物的细胞(例如，原始巨噬细胞)。
在某些实施方式中，通过使细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触并与神经元一起培养细胞来产生/生成表达至少一种小神经胶质细胞标志物的纯的同步的细胞群体。在某些实施方式中，细胞群体中至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％的细胞表达至少一种小神经胶质细胞标志物。在某些实施方式中，和与神经元一起培养细胞而不使细胞与一种以上促巨噬细胞细胞因子接触的操作相比，使细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触然后与神经元一起培养细胞的操作产生具有更高纯度的小神经胶质细胞群体。
小神经胶质细胞标志物的非限制性实例包括CX3CR1、PU.1、CD45、IBA1、P2RY12、TMEM119、SALL1、GPR34、C1QA、CD11B、CD68、CD45、及其组合。
巨噬细胞标志物的非限制性实例包括CD11B、DECTIN、CD14、PU.1、CX3CR1、CD45、及其组合。
原始巨噬细胞标志物的非限制性实例包括CX3CR1、CD11B、及其组合。
神经元的非限制性实例包括皮质投射神经元、运动神经元、多巴胺能神经元、中间神经元和周围感觉神经元。
促巨噬细胞细胞因子的非限制性实例包括M-CSF、IL-34、GM-CSF、IL-3、及其组合。在某些实施方式中，至少一种促巨噬细胞细胞因子包括M-CSF和IL-34。
在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)和巨噬细胞与神经元一起培养至少约5天、至少约10天、或至少约15天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养至少约5天，例如4天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养至多约5天、至多约10天或至多约15天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养至多约10天或约15天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养约5天至约10天、约10天至约15天、或约5天至约15天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养约5天至约10天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养约5天或约10天或约15天。在某些实施方式中，分化细胞和巨噬细胞与神经元一起培养4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天。
在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触至少约5天、至少约10天(例如，至少9天或至少11天)、或至少约15天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触至少约5天或至少约10天(例如，至少11天)。在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触至多约5天、至多约10天或至多约15天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触至多约10天或至多约15天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触约5天至约15天、约5天至约10天、或约10天至约15天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节中所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触约5天至约10天、或约10天至约15天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触约7天至约11天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触约5天或约10天。在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天。
在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)与浓度为约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、或约150ng/mL至约200ng/mL的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。在某些实施方式中，分化细胞与浓度为约5ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、或约50ng/mL至约100ng/mL、或约80ng/mL至约100ng/mL的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。在某些实施方式中，分化细胞与浓度为约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL或约100ng/mL的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。在某些实施方式中，分化细胞每天、每隔一天或每两天与上述任一浓度的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。在某些实施方式中，分化细胞每天与浓度为约10ng/mL、约20ng/mL、约50ng/mL或约100ng/mL的至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。在某些实施方式中，至少一种促巨噬细胞细胞因子包括M-CSF、IL-34、或其组合。在某些实施方式中，M-CSF的浓度为约1ng/mL至约100ng/mL。在某些实施方式中，M-CSF的浓度为约10ng/mL或约20ng/mL。在某些实施方式中，IL-34的浓度为约5ng/mL至约250ng/mL。在某些实施方式中，IL-34的浓度为约100ng/mL。
在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)在补充有至少一种促巨噬细胞细胞因子的无血清培养基中培养。在某些实施方式中，无血清培养基包括约75％的IMDM(Iscove'sModified Dulbecco's Medium)、约25％的F12培养基。在某些实施方式中，无血清培养基还包括B27、L-谷氨酰胺。
在某些实施方式中，根据第5.2.3节所述的方法获得的分化细胞(即表达至少一种pMac标志物的细胞和/或表达至少一种EMP标志物的细胞)在补充有血清和至少一种促巨噬细胞细胞因子的培养基中培养。
细胞培养基
在某些实施方式中，将上述抑制剂、激活剂和细胞因子添加至包括本文公开的细胞的细胞培养基中。合适的细胞培养基包括，但不限于，
Figure BDA0003086720250000381
血清替代物(“KSR”)培养基、N2培养基、Essential
Figure BDA0003086720250000382
Figure BDA0003086720250000383
(“E8/E6”)培养基和Neurobasal(NB)培养基(例如补充有N2和
Figure BDA0003086720250000384
补充剂的NB培养基)。KSR培养基、N2培养基、E8/E6培养基和NB培养基都是市售的。
KSR培养基是一种经过优化以在培养中使未分化的hESC细胞生长和保持的限定的无血清制剂。KSR培养基的组分公开于WO2011/149762。在某些实施方式中，KSR培养基包括Knockout DMEM、Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、Pen/Strep、MEM和13-巯基乙醇。在某些实施方式中，1升KSR培养基可以包括820mL的Knockout DMEM、150mL的Knockout血清替代物、10mL的200mM L-谷氨酰胺、10mL的Pen/Strep、10mL的10mM MEM和55μΜ13-巯基乙醇。
E8/E6培养基是一种支持人多能干细胞的生长和扩增的无饲养层(feeder-free)和无异源(xeno-free)培养基。E8/E6培养基已经证明支持体细胞重编程(reprogramming)。此外，E8/E6培养基可以用作配制PSC培养的定制培养基的基质。E8/E6培养基的一个实例描述于Chen等,Nat Methods.2011May；8(5):424-9，其全部内容并入以供参考。E8/E6培养基的一个实例公开于WO15/077648，其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，E8/E6细胞培养基包括DMEM/F12、抗坏血酸、硒、胰岛素、NaHCO3、转铁蛋白、FGF2和TGFβ。E8/E6培养基与KSR培养基的不同之处在于E8/E6培养基不包括活性BMP或Wnt成分。
N2补充剂是化学上限定的、不含动物成分的、用于在培养中扩增未分化神经干和祖细胞的补充剂。N2补充剂适用于与DMEM/F12培养基一起使用。N2培养基的组分公开于WO2011/149762。在某些实施方式中，N2培养基包括补充有葡萄糖、碳酸氢钠、腐胺、***、***钠、转铁蛋白和胰岛素的DMEM/F12培养基。在某些实施方式中，1升N2培养基包括985mL具有DMEM/F12粉末的蒸馏H2O、1.55g葡萄糖、2.00g碳酸氢钠、腐胺(1.61g溶于100mL蒸馏水中的100μL等分试样)、***(0.032g溶于100mL 100％乙醇中的20μL等分试样)、***钠(0.5mM蒸馏水溶液的60μL等分试样)、100mg转铁蛋白和10mL 5mM NaOH中的25mg胰岛素。
5.3包括小神经胶质细胞的组合物
本公开提供包括通过本文例如第5.2节所述的体外分化方法产生的分化的小神经胶质细胞群体的组合物。
此外，本公开的主题提供包括体外分化细胞群体的组合物，其中群体中包括的至少约50％(例如至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％)的细胞表达至少一种小神经胶质细胞标志物，并且其中群体中包括的小于约25％(例如小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％或小于约0.1％)的细胞表达至少一种选自以下的标志物：干细胞标志物、中胚层祖细胞标志物、原始造血前体标志物、EMP标志物、前巨噬细胞标志物、巨噬细胞标志物。
干细胞标志物的非限制性实例包括OCT4、NANOG、SSEA4和SSEA3。
中胚层祖细胞标志物的非限制性实例包括Brachyury、KDR、及其组合。
原始造血前体标志物的非限制性实例包括KDR、CD235A及其组合。
EMP标志物的非限制性实例包括Kit、CD41、CD235A、CD43、及其组合。
前巨噬细胞标志物的非限制性实例包括CD45、CSF1R及其组合。
小神经胶质细胞标志物的非限制性实例包括CX3CR1、PU.1、CD45、IBA1、P2RY12、TMEM119、SALL1、GPR34、C1QA、CD11B、CD68、CD45、及其组合。
巨噬细胞标志物的非限制性实例包括CD11B、DECTIN、CD14、PU.1、CX3CR1、CD45、及其组合。
在某些实施方式中，该组合物包括约1x 104至约1x 1010、约1x 104至约1x 105、约1x 105至约1x 109、约1x 105至约1x 106、约1x 105至约1x 107、约1x 106至约1x 107、约1x106至约1x 108、约1x 107至约1x 108、约1x 108至约1x 109、约1x 108至约1x 1010、或约1x109至约1x 1010的本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞。在某些实施方式中，该组合物包括约1x 105至约1x 107的本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞。
在某些实施方式中，所述组合物是冷冻的。在某些实施方式中，所述组合物还可以包括至少一种冷冻保护剂，例如，但不限于，二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖(dextrose)或其组合。
在某些非限制性实施方式中，组合物还包括生物相容性支架(scaffold)或基质(matrix)，例如生物相容性三维支架，其在将细胞植入或移植到受试者时促进组织再生。在某些非限制性实施方式中，生物相容性支架包括细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原、多肽或蛋白质、多糖，包括纤连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶和/或水凝胶。(参见，例如U.S.公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433和2008/0268019号，将其各自的全部内容并入以供参考)。
在某些实施方式中，组合物是药物组合物，其包括药学上可接受的载体。组合物可以用于外周神经***(以下称“PNS”)和/或中枢神经***(以下称“CNS”)的再生，用于预防和/或治疗小神经胶质细胞相关病症。
本公开的主题还提供包括如本文所公开的分化细胞或包括其的组合物的装置。装置的非限制性实例包括注射器、细玻璃管、立体定向针和套管。
5.4治疗方法
体外分化的小神经胶质细胞可用于治疗神经退行性疾病。本公开提供用于预防和/或治疗神经退行性疾病的方法。神经退行性疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、帕金森氏症、精神***症、成胶质细胞瘤、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症和多发性硬化症(MS)。
在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的以下至少一者：(a)本文所述的分化的小神经胶质细胞群体；和(b)包括此类分化的小神经胶质细胞的组合物。
此外，本公开的主题提供以下至少一者在预防和/或治疗神经退行性疾病中的用途：(a)本文所述的分化的小神经胶质细胞群体；和(b)包括此类分化的小神经胶质细胞的组合物。
本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物，可以全身或直接向受试者施用或提供。在某些实施方式中，将本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物直接注射到目标器官(例如，受小神经胶质细胞缺陷相关病症影响的器官)中。本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物可以直接施用(注射)于受试者身体的任何具有有效神经的部位，包括但不限于脑。
本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物可以以任何生理学上可接受的载体施用。另外提供包括药学上可接受的载体和本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞的药物组合物。本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物或药学上可接受的载体可以通过局部注射、正交(orthotropic)(OT)注射、全身注射、静脉内注射或肠胃外给药来施用。在某些实施方式中，本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物通过局部注射施用于受试者。
本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、混悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在一定程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制到适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。通过将本公开的主题的组合物、例如包括本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞的组合物掺入到根据需要具有各种量的其它成分的所需量的适当溶剂中，可以制备无菌可注射溶液。这些组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂混合，比如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖(dextrose)等。组合物也可以冻干。组合物可以含有助剂，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等，这取决于给药途径和期望的制剂。可以翻阅标准文本，例如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985，并入本文以供参考，以制备合适的制剂而无需过多的实验。
可以加入各种提高组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开的主题，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞或包括其的组合物相容。
本领域技术人员将会认识到，组合物的组分应选择为化学惰性的，并且不会影响本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞的活力或功效。这对于化学和药学原理方面的技术人员来说不会产生问题，或者通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及过度实验)，根据本公开和本文引用的文献可以容易地避免问题。
在某些非限制性实施方式中，本文所述的小神经胶质细胞包括在组合物中，该组合物还包括生物相容性支架或基质，例如，当细胞植入或移植到受试者时促进组织再生的生物相容性三维支架。在某些非限制性实施方式中，生物相容性支架包括细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原、多肽或蛋白质、多糖，包括纤连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶和/或水凝胶(参见例如美国公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433和2008/0268019号，将其各自的全部内容并入以供参考)。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗时实现有益或期望的临床结果的量。有效量可以以至少一个剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓神经退行性疾病的进展，或以其它方式减少神经退行性疾病的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重程度以及所施用细胞的形式和有效浓度。
在某些实施方式中，本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞的有效量是足以预防神经退行性疾病的量和/或足以治疗神经退行性疾病(例如减缓症状进展、缓轻和/或减少症状)的量。待施用的本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞的量将会根据所治疗的受试者而变化。在某些实施方式中，将约1x 104至约1x 1010、约1x 104至约1x 105、约1x 105至约1x 109、约1x 105至约1x 106、约1x 105至约1x 107、约1x 106至约1x 107、约1x 106至约1x108、约1x 107至约1x 108、约1x 108至约1x 109、约1x 108至约1x 1010或者约1x 109至约1x1010个本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞施用于受试者。在某些实施方式中，将约1x105至约1x 107个本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞施用于受试者。什么会被视作有效剂量的精准确定可以基于每个受试者个体的因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况。本领域技术人员可以根据本公开内容和本领域的知识容易地确定剂量。
在某些实施方式中，预防和/或治疗神经退行性疾病的方法包括向受试者施用有效量的集落刺激因子(CSF)。此外，本公开的主题提供CSF在预防和/或治疗神经退行性疾病中的用途。
CSF的非限制性实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF、__IL-34。在某些实施方式中，CSF是GM-CSF，也称为集落刺激因子2(CSF2)。
CSF能够减少从小神经胶质细胞释放的补体C3。因此，CSF可用于预防和/或治疗神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)。
5.5试剂盒
本公开的主题提供用于诱导干细胞分化的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒包括(a)至少一种Wnt信号传导抑制剂；(b)至少一种Wnt信号传导激活剂；(c)至少一种促造血细胞因子；和(d)神经元。在某些实施方式中，试剂盒还包括(e)至少一种促巨噬细胞细胞因子。在某些实施方式中，试剂盒还包括(f)用于诱导干细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的说明书。
在某些实施方式中，说明书包括使干细胞与如本公开(参见上文，第5.2节)的方法所述的抑制剂、激活剂、细胞因子和分子接触。
在某些实施方式中，本公开提供以单位剂型包括有效量的本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞群体或包括其的组合物的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括含有治疗性组合物的无菌容器；这些容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管子、袋子、小袋(pouches)、泡罩包装或者本领域已知的其它合适容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适用于保持药物的其它材料制成。
在某些实施方式中，该试剂盒包括用于将本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞群体或包括其的组合物施用于患有神经退行性疾病的受试者的说明书。说明书可以包括关于使用细胞或组合物用于治疗和/或预防神经退行性疾病的信息。在某些实施方式中，说明书包括以下的至少一种：治疗剂的说明；用于治疗或预防神经退行性疾病或其症状的剂量方案和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。说明书可以直接打印在容器(如果存在的话)上，或者作为应用于容器的标签，或者作为容器中或与容器一起提供的单独的纸、册、卡或折叠印刷品。
5.6筛选治疗性化合物的方法
本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞可用于对神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS))进行建模。
本公开的干细胞衍生的小神经胶质细胞也可以用作筛选可以克服疾病细胞表型的候选化合物的平台。候选化合物减轻神经退行性疾病的能力可以通过检定候选化合物挽救引起神经退行性疾病的生理或细胞缺陷的能力来确定。
在某些实施方式中，该方法包括：(a)使本公开的小神经胶质细胞群体与测试化合物接触，其中小神经胶质细胞衍生自从患有神经退行性疾病的受试者获得的干细胞；和(b)测量小神经胶质细胞的功能活性，其中小神经胶质细胞的功能活性的改变表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。该改变可以是减少或增加。在某些实施方式中，该改变是减少。在某些实施方式中，使小神经胶质细胞与测试化合物接触至少约24小时(1天)、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。在某些实施方式中，使小神经胶质细胞与测试化合物接触至少约24小时(1天)。
在某些实施方式中，小神经胶质细胞的功能活性包括补体C3的释放。在某些实施方式中，该改变是减少。补体C3的增加已显示在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中，并与疾病状态下突触的异常修剪有关。在某些实施方式中，从小神经胶质细胞释放的补体C3的减少表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病或ALS。
发明人发现，相对于无害淀粉样蛋白β-40，野生型干细胞衍生的小神经胶质细胞针对病原性淀粉样蛋白β-42具有选择性。在某些实施方式中，小神经胶质细胞的功能活性包括小神经胶质细胞对淀粉样蛋白β的吞噬作用。在某些实施方式中，该改变是增加。在某些实施方式中，由小神经胶质细胞引起的淀粉样蛋白β吞噬作用的增加表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病。
发明人发现小神经胶质细胞表达最高水平的C9ORF22，该基因以ALS的早发基因遗传形式突变。发明人还发现，在C9ORF22突变干细胞衍生的小神经胶质细胞中补体C3的释放增加。激活的小神经胶质细胞可以诱导神经毒性反应性星形胶质细胞，其可以诱导运动神经元的神经毒性。参见Liddelow等,“Neurotoxic reactive astrocytes are induced byactivated microglia”,Nature(26January 2017)；541:481–487。在某些实施方式中，该方法包括：(a)使测试化合物与包括本公开的小神经胶质细胞、星形胶质细胞群体和神经元群体的组合物接触；和(b)测量神经元的神经毒性，其中在与测试化合物接触后神经元的神经毒性的降低或减少表明该测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。在某些实施方式中，神经元是运动神经元，并且该方法用于筛选用于治疗ALS的化合物。神经元神经毒性的非限制性实例包括突触损失、轴突变性和凋亡。在某些实施方式中，使组合物与测试化合物接触至少约24小时(1天)、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天。在某些实施方式中，使组合物与测试化合物接触至少约4天。
实施例
通过参照以下实施例将更好地理解本公开的主题，实施例作为本公开的主题的示例提供，而不是作为限制。
6.1实施例1从人干细胞分化小神经胶质细胞
对Wnt信号传导的抑制使后原条的早期中胚层细胞偏向产生KDR+CD235a+原始造血前体(Sturgeon等,Nat.Biotechnol.(2014)；32,554–561)。这些前体将继续在卵黄囊中引发原始的造血作用，从而产生早期的EMP。在该小神经胶质细胞分化方案中，本实施例使Wnt抑制适于以单层策略从hPSC诱导原始造血作用。特别地，本实施例显示Wnt激动剂Chir099021激活Wnt十八小时产生了早期中胚层，通过免疫荧光经Brachyury(T)标示(图1A)。到分化的第4天，通过流式细胞术，这些细胞也是KDR+和CD235a+(原始造血前体)。对分化方案中Chir099021暴露浓度和时机进行优化，其中在3uM下暴露18小时，然后通过3uM的IWP2进行Wnt抑制，通过流式细胞术显示获得最高百分比的原始造血前体(KDR+CD235a+)(图1B)。接下来，本实施例制定了造血内皮细胞和造血细胞的时间线。造血内皮细胞在对所分选的KDR+CD235A+原始造血前体重新铺板1天后发育。这些细胞在培养7天内产生悬浮的造血细胞，并在培养中逐渐变得更多(图2)。为了通过VE-钙粘蛋白+染色验证造血内皮细胞，在分选后第1天，细胞通过免疫荧光检测为VE-钙粘蛋白阳性，证实它们是造血内皮细胞，悬浮的细胞具有特征性的造血细胞小核(图3)。在对原始造血前体重新铺板后的第5天，出现Kit+细胞，它们是早期的红系骨髓祖细胞(EMP)，即小神经胶质细胞的前体。这些细胞然后通过流式细胞术获得CD45+，表明完全的造血归属(图4)。在分选后培养的第8天，在存在混合的EMP群体处，这些细胞被识别为小神经胶质细胞和巨噬细胞祖细胞，而不是成熟的巨噬细胞(图6)。只有一小部分表达成熟的巨噬细胞标志物，例如CX3CR1、CD14、Cd11b和MRC。然而，大多数细胞表达CD45，表明它们归于造血谱系。通过流式细胞术检查所有标志物。
在分选后第8天，将含有pMac的细胞与神经元一起悬浮培养，仅到共培养的第4天就产生了早期的小神经胶质细胞(图7)。这些细胞通过Iba1+和Pu.1+染色识别。所有CD45+细胞也均为Pu.1+，这表明任何在培养中持续存在的造血细胞(以CD45+表示)都归于骨髓/小神经胶质细胞谱系(以PU.1表示)。这表明通过免疫荧光该策略是高效的。与皮质神经元共培养14天后，在共培养物中小神经胶质细胞(通过免疫荧光检测的Iba1+)仍然持续存在，表明Iba1+细胞在培养中是稳定的(图8)。培养21天后，在与神经元共培养物中小神经胶质细胞(通过免疫荧光检测的Iba1+、PU.1+)仍然持续存在(图9)。
在产生小神经胶质细胞的第二种策略中，伴随10％血清和M-CSF和IL-34，EMP成熟为巨噬细胞。它们到培养的第4天发育出成熟的巨噬细胞标志物Cd11b，并到第11天发育出成熟的纺锤形态(图10)。在11天后在血清和M-CSF和IL-34中的培养物中持续存在的所有细胞均为CD45+，表明它们均为造血细胞。通过流式细胞术分析，大多数还对于成熟的巨噬细胞标志物如CX3CR1、CD14、Cd11b和Dectin呈阳性(图11)。与M-CSF和IL-34一起使用IMDM/F12/N2/B27代替血清，在没有血清的情况下也可以使pMac成熟为巨噬细胞(图12)。添加M-CSF与IL-34通过鼓励细胞***而提高了产量。GM-CSF的添加也允许细胞***，但是所得细胞似乎更粒状并且被激活。与神经元共培养的巨噬细胞产生具有分枝形态和增加的Iba1免疫荧光染色的小神经胶质细胞(图13)。Iba1在来自巨噬细胞的小神经胶质细胞中增加，因此通过与神经元共培养，细胞已转变为小神经胶质细胞身份。共培养的pMac衍生的小神经胶质细胞(EMP共培养)和pMac巨噬细胞衍生的小神经胶质细胞(EMP-巨噬细胞共培养)与人胎儿小神经胶质细胞共享关键的小神经胶质细胞基因的表达(图14)。对来自用于衍生小神经胶质细胞的两种不同策略的RNA进行定量PCR，其与来自人胎儿小神经胶质细胞(商业来源)的RNA共享一组关键的小神经胶质细胞基因的基因表达。相比之下，代表外周巨噬细胞的单核细胞衍生的巨噬细胞不表达这些标志物。值得注意的是，当单独培养EMP衍生的巨噬细胞时，它们下调关键的小神经胶质细胞基因TMEM119和SALL1，表明共培养对于保持小神经胶质细胞身份是必要的。
总之，本实施例使Wnt抑制适于以单层策略从hPSC诱导原始造血作用(图5)。首先，本实施例通过小分子CHIR99021进行Wnt激活，将hPSC模式化为Brachyury+(T+)后原条早期中胚层细胞。然后，本实施例通过小分子抑制剂IWP2阻断Wnt信号传导，诱导这些细胞稳健地产生KDR+CD235a+原始造血前体。本实施例确定，用CHIR99021处理准确的18小时，然后进行IWP2处理，是发育出相当大比例的KDR+CD235A+细胞的唯一条件。尽管先前发表的论文已使用Wnt激活来诱导中胚层细胞，但他们并未尝试使这种中胚层朝向KDR+CD235A+前体模式化，因此不限于18小时的处理窗口，而超过之后，本实施例已确定形成这种群体的潜力大大降低。此外，在确认KDR+CD235A+前体是原始造血前体细胞的先前研究中，作者允许该群体通过拟胚体方法产生，在该方法中内源性信号传导起着更大的作用，因此它们只能单独使用Wnt抑制(Sturgeon等,Nat.Biotechnol.(2014)；32,554–561)。因此，本实施例首先通过使用Wnt激活的18小时处理以诱导中胚层，然后进行Wnt抑制，而从hPSC诱导KDR+CD235A+原始造血前体，并且是在限定的单层体系中的新方法。
接下来，本实施例通过添加以下促造血细胞因子混合物，驱动KDR+CD235A+原始造血前体形成EMP：首先是VEGF/FGF2，以诱导VE-钙粘蛋白+造血内皮细胞，然后是SCF、IL-6、IL-3和TPO，以鼓励以逐步的方式转变为CD34+，然后是CD45+造血细胞，历时8天。然后从第8天培养物中收获漂浮的CD45+pMac，用于与神经元共培养以直接转变为小神经胶质细胞，或者成熟为巨噬细胞，然后与神经元共培养以转变为小神经胶质细胞。第一种方法特别新，因为它是唯一一种显示小神经胶质细胞可以在与神经元共培养后4天内从最早的pMac直接发育的方法，就像小鼠体内的发育一样(Mass等,Science(2016)；353(6304)aaf4238)。
现有的在体外产生人小神经胶质细胞的策略并不遵循这种发展模式，未能首先朝向原始造血前体模式化。这些策略要么从外周单核细胞开始(Noto等,Neuropathol.Appl.Neurobiol.(2014)；40,697–713；Ohgidani等,Sci.Rep.(2014)；4,4957)，其源于确定的造血作用，因此在体内不产生小神经胶质细胞，要么使用未针对原始的造血作用预先模式化的拟胚体方法，对于发育细胞命运的决定是黑盒(Etemad等,Neurosci.(2012)；209,79–89；Hinze等,Inflamm.(2012)；9,12；Lachmann等,Stem CellReports(2015)；4,282–296；Noto等,Neuropathol.Appl.Neurobiol.(2014)；40,697–713；Ohgidani等,Sci.Rep.(2014)；4,4957；van Wilgenburg等,PLoS One(2013)；8.；Muffat等,Nature Medicine(2016)；22(11),1358–1367；Bahrini等,Sci.Rep.(2015)；5,7989)。从hPSC衍生小神经胶质样细胞的单层步骤中(Abud等,Neuron,(2017)；94(2),278–293；Takata等,Immunity.(2017)；47(1),183-198)，这些细胞也不再朝向原始造血KDR+CD235A+细胞模式化，因此无法确定这些策略是通过早期EMP(是小神经胶质细胞的真正前体)还是晚期EMP(是确定的造血作用的前体)。而且，所有这些策略在与神经元共培养之前(如果共培养的话)首先从CD45+pMac产生完全分化的巨噬细胞，因此并不代表先定殖于大脑的前体细胞(pMac)发育成组织定居小神经胶质细胞的体内发育轨迹(Mass等,Science(2016)；353(6304),aaf4238)。本策略是新的，因为它采用了逐步发育模式，概括了卵黄囊原始造血作用，在成熟为巨噬细胞之前分离pMac，并在体外神经环境中培养这些细胞以在尽可能少至16天的时间内产生真正的人小神经胶质细胞。
用于从人干细胞分化小神经胶质细胞的示例性方案在以下示出：
阶段I：pMac产生(无血清)
1)第0天：将ES细胞以60,000个细胞/cm^2+Y铺在以1:30基质胶包被的24孔或6孔组织培养板的ABC*培养基中。
2)第1天：18小时后，将培养基更换为ABi培养基。细胞应为T+(Brachyury+)。
3)第2天：将培养基更换为ABi+FGF2。
4)第3天：将细胞分离并以60,000个细胞/cm^2+Y铺在基质胶上的VEGF/FGF2培养基中。至少30％的细胞应为KDR+CD235A+。
5)第4天：取出Y药物，然后留在VEGF/FGF2中。
6)第5天：添加Cyto 1培养基。10-20％的细胞应为Kit+(EMP)。
7)第6天：检查看是否有小的圆形细胞集落形成。
8)第7天：添加Cyto 2培养基。
9)第8天：圆形细胞应汇合。收集悬浮细胞并旋下。培养物应含有VE-钙粘蛋白+造血内皮细胞，以及Kit+(EMP)或Kit-CD45+CSF1R+(pMac)圆形细胞悬液。
阶段IIa.与神经元共培养直接转化为小神经胶质细胞(无血清)
1)仅收集第8天培养物中的悬浮细胞并旋下。
2)将悬浮细胞与神经元以1：5的比例铺上小神经胶质细胞培养基#1中。
3)每隔一天更换培养基。
第4天后，培养物中应已存在许多Pu.1+CD45+、Iba1+、CX3CR1+小神经胶质细胞。
4)在共培养10-14天后，细胞应准备好被检定。
按CX3CR1+分选时的小神经胶质细胞应为P2RY12+、Tmem119+、Sall1+、GPR34+和C1QA+。
阶段IIb.分化为巨噬细胞，然后与神经元共培养
1)将悬浮细胞以1：2的比例铺在TC处理过的塑料上的RPMI培养基中。
2)每隔一天更换培养基(M-W-F)，周末可以留在培养基中。
3)11天后，细胞应看起来呈纺锤状和颗粒状。将细胞消化(accutase)10分钟，并与神经元以1：5的比例铺板。
细胞应为Cd11b+、Dectin+、CD14+(成熟巨噬细胞)。
4)在小神经胶质细胞共培养基中与神经元一起培养，并在10-14天后检定。
表1提供本实施例中使用的细胞培养基中某些成分的浓度和浓度范围。
表1
Figure BDA0003086720250000501
Figure BDA0003086720250000511
6.2实施例2：产生的小神经胶质细胞的应用
通过本发明的发育策略衍生的hPSC衍生的小神经胶质细胞将可用于在疾病建模期间体外调查小神经胶质细胞与神经元之间的相互作用。这些混合的培养物可用于多细胞类型药物筛选，其中靶向细胞交换而不是单独的单个细胞类型(Hoing等,Cell Stem Cell(2012)；11,620–632；Schwartz等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2015)；112(40),12516–21)。
可以将本公开衍生的小神经胶质细胞与星形胶质细胞共培养以构建包含CNS的三个成分的体系：神经元、小神经胶质细胞和星形胶质细胞。小神经胶质细胞以RFP标记，星形胶质细胞通过免疫荧光为GFAP+(图15和16)。三培养体系可用于研究细胞类型之间的相互作用。炎症刺激或引起炎症刺激的疾病状态影响具有串扰的小神经胶质细胞和星形胶质细胞两者(图17)。这种串扰是一种反馈或前馈回路，然后会导致对神经元的毒性。这种相互作用可以使用与hPSC衍生的星形胶质细胞和神经元三培养的本公开的hPSC衍生的小神经胶质细胞来研究，以在体外检查完整的人体系。三培养中的LPS刺激导致反应性细胞因子释放(图18)。将1μg/mL的LPS加入至含有小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的三培养的细胞中、或仅含有小神经胶质细胞和神经元、或仅含有星形胶质细胞和神经元、或仅含有神经元的培养物中。只有含有小神经胶质细胞的培养物才对LPS作出应答，因为它们是表达LPS受体(TLR4)的唯一细胞类型，但是在三培养物中，与仅含有小神经胶质细胞和神经元的培养物相比，C3的释放增加。该效果可能归因于来自激活的小神经胶质细胞的反应性细胞因子反馈到星形胶质细胞，引起它们的反应性和星形胶质细胞C3的释放。LPS刺激的三培养物和仅小神经胶质细胞/神经元的培养物还分泌其它反应性细胞因子，包括IL-6、TNFα、GM-CSF、IL1B和IFNγ。通过ELISA测量细胞因子。
由于小神经胶质细胞参与神经发育和神经退行性疾病(一些实例是精神***症、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、成胶质细胞瘤)等许多疾病的发病机制，因此提供了强大的工具。另外，本发明的小神经胶质细胞也可以用于移植到患者的大脑中以治疗各种疾病。
将hPSC衍生的小神经胶质细胞用来模拟两种神经退行性疾病，阿尔茨海默氏病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。hPSC衍生的小神经胶质细胞和阿尔茨海默氏病iPSC衍生的神经元的混合培养可以观察到疾病培养物中小神经胶质细胞激活，特别是在补体C3释放增加方面。本实施例发现，与H9对照相比，与阿尔茨海默氏病的神经元的三培养显示出C3增强和C3释放增加(图19)。与APP/SWe突变神经元(家族性阿尔茨海默氏病的遗传模型)共培养的三培养物，与仅小神经胶质细胞和神经元的培养物相比，显示C3增加，并且与神经元衍生自H9对照胚胎干细胞系的培养物相比，其水平增加。相比之下，与H9对照中的小神经胶质细胞/神经元培养物相比，三培养物中的C3水平没有增加，表明在没有疾病刺激的情况下不会发生C3增强。通过ELISA测量C3。此外，GM-CSF减少所有培养物即阿尔茨海默氏病和对照两者中的C3释放(图20)。通过免疫荧光，在添加GM-CSF的条件和对照条件之间的细胞数目也相当，表明这种效果不是由于较少的小神经胶质细胞。在对淀粉样蛋白42肽具有选择性的小神经胶质细胞共培养物中淀粉样蛋白β的负荷降低(图21)。小神经胶质细胞与阿尔茨海默氏病的神经元的共培养通过ELISA显示总淀粉样蛋白β降低，特别是与40和38肽相比的淀粉样蛋白β42肽。小神经胶质细胞内部42-488的荧光增加表明摄取增加(图22)。为了检定小神经胶质细胞是否吞噬淀粉样蛋白β，将荧光标记的淀粉样蛋白β42肽与alexa fluor 4888一起使用，通过免疫荧光发现2小时后，大多数小神经胶质细胞在其内部包含淀粉样蛋白β42。另一方面，淀粉样蛋白β40(通过555标记)在小神经胶质细胞内部未发现明亮，表明它没有被高效吞噬。这证明小神经胶质细胞对淀粉样蛋白β42的选择性。切换荧光团产生相似的结果：淀粉样蛋白β42被小神经胶质细胞吸收得更多(图23)。切换代表淀粉样蛋白42和40的荧光团，以确保细胞内42亮度增加的效果不是由于技术上的荧光团亮度效果。即使使用切换的荧光团，在该实验中，42标记为555，40标记为488，通过免疫荧光，小神经胶质细胞内存在更多的42的亮度，这证实了先前的结果，即小神经胶质细胞选择性吞噬淀粉样蛋白β42。FACS分析示出基线处对淀粉样蛋白42的选择性以及在GM-CSF处理时摄取的增加(图24)。GM-CSF处理增加小神经胶质细胞内淀粉样蛋白β42以及40的吞噬作用，并且使用流式细胞术对其内具有淀粉样蛋白β肽的细胞数量进行了定量。
总之，在阿尔茨海默氏病的小鼠模型中已显示出补体C3的增加，并且与疾病状态下突触的异常修剪有关。本实施例调查了可抑制本发明共培养物中小神经胶质细胞C3的这种增加的细胞因子，并已识别GM-CSF是潜在的候选者。本实施例还研究了hPSC衍生的小神经胶质细胞对淀粉样蛋白β的吞噬作用。本实施例发现，相对于无害淀粉样蛋白β-40，野生型hPSC衍生的小神经胶质细胞对病原性淀粉样蛋白β-42具有选择性，并且本实施例产生小神经胶质细胞受体TREM2的CRISPR敲除物，以查看其是否与这种选择性有关。本实施例计划对候选免疫基因和细胞表面受体进行CRISPR筛选，以确定哪些基因和通路与淀粉样蛋白β吞噬作用最密切相关。
本发明使用hPSC衍生的小神经胶质细胞的第二种疾病模型是ALS。本实施例发现基线处ALS小神经胶质细胞和星形胶质细胞显示补体C3释放增加(图25)。SOD1突变iPSC衍生的ALS星形胶质细胞和小神经胶质细胞单独或一起培养，通过ELISA定量，与同基因、野生型对照细胞系衍生的星形胶质细胞或小神经胶质细胞相比，表现出C3水平更高。这表明C3反应性并非阿尔茨海默氏病所独有，本公开的体系可用于研究其中小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间也可能存在回路的其它神经退行性疾病。
本实施例注意到，小神经胶质细胞表达最高水平的C9ORF22，该基因以ALS的早发基因遗传形式突变。本实施例还注意到，在C9ORF22突变的iPSC衍生的小神经胶质细胞中补体C3的释放增加，并且本实施例测试了这些细胞与iPSC衍生的星形胶质细胞一起对iPSC衍生的运动神经元是否具有神经毒性。本实施例计划在ALS模型中使用本发明iPSC衍生的小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的三培养体系进行药物筛选，以找到可以通过作用于神经炎症体系而非单独的神经元来挽救这种神经毒性的候选物。
6.3实施例3：完全限定的人PSC衍生的小神经胶质细胞和三培养体系揭示了阿尔 茨海默氏病模型中补体产生的细胞类型特异性增强作用。
中枢神经***(CNS)的异常炎症已被认为是人类神经退行性疾病发病机理的主要参与者。但是，每种细胞类型对体内神经炎症轴的具体贡献仍不清楚，关键信号传导通路中的物种特异性差异使挑战更加复杂。
近年来，神经炎症已越来越多地参与各种神经退行性病症的进展，例如阿尔茨海默氏病(Deczkowska,A.等Cell 173,1073-1081(2018)；Keren-Shaul,H.等Cell 169(2017))、帕金森氏症(Lecours,C.等Front Cell Neurosci 12(2018)；Olanow,C.W.等Brain 142,1690-1700(2019))、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(Geloso,M.C.等Front AgingNeurosci 9(2017))以及衰老。小神经胶质细胞被认为是引发大脑炎症状态的关键因素，炎症状态可能促成或加剧疾病病理。其它神经胶质细胞如星形胶质细胞与小神经胶质细胞相互作用，可能进一步促进异常炎症并引起神经毒性(Liddelow,S.A.等Nature 541,481-487(2017)；Rostalski,H.等Front Neurosci 13(2019))。然而，在体内解析细胞串扰并理解神经炎症应答中物种特异性的差异(Smith,等,Trends Neurosci37,125-135(2014))是该领域的主要挑战。人类多能干细胞(hPSC)技术具有克服这些挑战的潜力，并提供一个完全人的、限定的、可扩展的平台来研究神经炎症。这种基于hPSC的模型的基本要求是分化策略，该策略可以以同步、高效和及时的方式可再现地生成小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的纯群体。基于双重SMAD抑制的方案(Chambers,S.M.等Nat Biotechnol 27,275-280(2009)；Qi,Y.等Nat Biotechnol 35,154-163(2017))允许从hPSC高效产生高纯的神经前体和有丝***后神经元。同样，最近报道了一种从hPSC快速衍生出纯星形胶质细胞群体的策略(Tchieu,J.等Nat Biotechnol 37,267-275(2019))。相比之下，已经公开了几种用于从hPSC产生小神经胶质细胞样细胞的方案(Muffat,J.等Nat Med 22,1358-1367(2016)；Abud,E.M.等Neuron 94,278-293.e279(2017)；Douvaras,P.等Stem Cell Reports 8,1516-1524(2017)；Haenseler,W.等Stem Cell Reports 8,1727-1742(2017)；Takata,K.等Immunity 47,183-198.e186(2017)；Pandya,H.等Nat Neurosci 20,753-759(2017)；Brownjohn,P.W.等Stem Cell Reports10,1294-1307(2018))；但是这些方法通常依赖于拟胚体的形成，并且在个体发育方面限定不清(Muffat,J.等Nat Med 22,1358-1367(2016)；Haenseler,W.等Stem Cell Reports 8,1727-1742(2017))，需要进行操作比如低氧以模式化(Abud,E.M.等Neuron 94,278-293.e279(2017))，或者需要进行细胞分选以获得纯度(Douvaras,P.等Stem Cell Reports 8,1516-1524(2017))。重要的是，没有一种小神经胶质细胞分化方案显示出明确的朝向原始造血作用模式化，如通过诱导KDR+CD235A+成血管细胞所限定的(Sturgeon,等,Nat Biotechnol 32,554-561(2014))。在体外概括这些早期发育步骤非常重要，因为小神经胶质细胞的独特之处在于它们的谱系完全可以追溯到原始的造血作用(Ginhoux,F.等Science 330,841-845(2010))。
为了构建研究神经炎症的完全的人类平台，一种明确概括小神经胶质细胞个体发育的从人多能干细胞(hPSC)衍生小神经胶质细胞的新方法已被识别，并通过单细胞RNA测序和阶段特异性映射到正在发育的小鼠小神经胶质细胞的数据集进行了验证。使用这些细胞，建立了第一个限定的完全的人三培养体系，该体系包含hPSC衍生的小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元的纯群体，以在体外解析沿神经炎症轴的细胞串扰。通过使用具有APPSWE+/+突变的同基因hPSC，产生了三培养体系来模拟阿尔茨海默氏病中的炎症。本公开的数据表明，在炎症条件下增加并参与突触损失的蛋白补体C3的产生，在三培养条件下被增强，并且在APPSWE+/+三培养中进一步增强。使用细胞类型特异性的消融研究，发现C3增强是由于神经炎症回路的存在，其中小神经胶质细胞是激活星形胶质细胞产生过量C3的关键引发剂。本公开的研究限定了促进AD中C3增加的主要细胞因子，并提供了广泛适用的研究人类疾病中的神经炎症的平台。
设计本公开的策略以将hPSC分化为小神经胶质细胞前体(图26A)。首先，用GSK3b抑制剂CHIR99021(Lindsley等,Development(2006)；133,3787-3796)处理细胞，并通过激活WNT信号传导朝向原条中胚层模式化。然后，由porcupine抑制剂IWP2诱导WNT抑制，并同时激活Nodal信号传导，通过暴露于激活素A来模拟。遵循Sturgeon等(Sturgeon等,NatureBiotechnol.(2014)；32,554-561)提出的模式，这些条件相对于KDR+CD235A-确定造血前体偏向于产生KDR+CD235A+原始造血成血管细胞。已经发现WNT抑制必须在非常窄的发育窗口内发生，限于在WNT激活后18小时，以高效地产生KDR+CD235A+群体(图26B)。优化细胞密度和小分子暴露条件(参见材料和方法)后，进行WNT激活18小时，然后进行WNT抑制，并进行Nodal激活2天，到分化的第3天产生约30％KDR+CD235A+细胞(图26C)。接下来，确定在这些培养条件下，KDR+CD235A+成血管细胞与KDR+CD235A-确定前体是否产生造血细胞。观察到分选的KDR+CD235A+成血管细胞群体，在存在最小造血细胞因子的情况下，它们在重新铺板(hPSC分化的第6天)后3天内产生了CD41+CD235A+CD43+造血细胞(图26D)。相比之下，KDR+CD235A-成血管细胞群体不产生造血细胞(图26D)。本公开的数据证明，确定前体仅在分化的后期、在低氧条件下或在存在其它造血细胞因子的情况下才产生造血细胞。重新铺板后第7天，KDR+CD235A+级分产生41％CD45+细胞，该群体随后产生小神经胶质细胞。其它细胞群体包括未定型的CD41+CD235A+CD43+红系骨髓祖细胞(EMP)、CD41+巨核细胞和CD235A+红细胞(仅在用***处理时)(图31A)。EMP、巨核细胞和红细胞都是原始造血过程中产生的谱系(Palis等,FEBS Lett.(2016)；590,3965-3974)。确定的KDR+CD235A-群体仍未产生造血细胞，这表明到分化第10天产生的所有造血细胞均来自KDR+CD235A+成血管细胞。有趣的是，同时包含KDR+CD235A-和KDR+CD235A+群体的未分选样品产生造血细胞的效率几乎与分选KDR+CD235A+群体相同。这些结果表明KDR+CD235A+细胞不需要纯化就可以稳健地产生造血细胞(图26D)。这一发现通过消除细胞分选步骤，简化了分化过程，取而代之的是在存在造血细胞因子的情况下，在第3天对混合群体进行简单的重新铺板。分化第10天时，近60％的细胞具有造血身份，在VE-钙粘蛋白+造血内皮细胞上方半悬浮地形成漂浮集落(Raffi等,Blood(2013)；121,770-780)(图31B和31C)。
接下来，在分化的第6天和第10天进行单细胞RNA测序实验，以全面表征细胞的异质性，并在当前文献中缺乏人类原始造血作用的数据的情况下，识别过渡细胞状态的发育轨迹。将分化的组成和轨迹与衍生自体内小鼠发育的那些进行比较，以验证本公开的方法是否确实在培养皿中产生了原始的造血作用。在扩散作图分析之后，将合并的第6天和第10天单细胞RNA测序数据沿限定的轨迹分成离散的簇(图27A)。红细胞(ERY)、巨核细胞(MK)和巨噬细胞前体(PMAC)的更成熟的造血群体出现于来自共同的EMP群体的三个不同臂，它们模拟了原始造血的轨迹。使用Palantir算法(Setty等,Nat.Biotechnol.(2019)；57,451-460)在拟时间内沿轨迹计算了细胞的分化潜能，结果表明最高的分化潜能落在位于图中心的造血内皮簇和EMP样细胞内，最低的分化潜能落在位于三个臂末端的更成熟的造血簇(图27B)。还沿着每个臂的轨迹在拟时间内计算关键基因的表达(图27C)。红细胞臂表达胚胎血红蛋白(HBE1)和GYPA的签名基因，而巨核细胞臂表达关键的巨核细胞基因ITGA2B、ITGB3和GP1BA，巨噬细胞前体臂表达CSF1R、PTPRC和CX3CR1(Kierdorf等,Nat.Neurosci.(2013)；16,273-280)。仅沿巨噬细胞前体臂分离轨迹，并将其基因表达与衍生自小鼠小神经胶质细胞发育的体内概况的EMP和巨噬细胞前体(PMAC)的基因签名进行比较(Mass等,Science(2016)；353)(图27D)。在对应于早期EMP和EMP/PMAC簇的0.44-0.8的拟时间处，本公开的数据富集了小鼠EMP签名，并在对应于成熟PMAC1/2簇的0.84及更高的拟时间处，数据富集了小鼠pMAC签名(Mass等Science(2016)；353)。但是，在小鼠EMP和pMAC签名中分别存在的90和51个基因中，本公开的scRNAseq数据集中存在81个和49个基因，而这些基因中只有一部分在人类EMP或pMAC簇中单独表达，有一些基因在两者中都表达(图27D)，这可能代表人与小鼠之间的差异。这些数据还被映射到整个小鼠原肠胚形成单细胞RNA测序数据上(Pijuan-Sala等,Nature(2019)；566,490-495)，并指出造血细胞簇与小鼠造血细胞紧密匹配。具体而言，PMAC簇映射在小鼠原肠胚形成骨髓簇附近(图27E)。当与从发育中的小鼠原肠胚的多个时间点获得的数据进行比较时，本公开的数据所包含的群体与小神经胶质前体细胞最初植入小鼠脑部前1天E8.5出现的群体最为相似(图27F)。综上所述，这些数据表明，本公开的培养物中EMP和EMP衍生的pMAC的存在与早期小神经胶质细胞发育时的小鼠骨髓细胞紧密匹配，这表明本公开的人体外培养体系遵循小神经胶质细胞发育的假定发育路线图。
本公开中建立了可以使EMP或pMAC功能性地成熟为小神经胶质细胞的两种单独方法(图28A)。第一种方法模拟了体内发育轨迹，在此过程中，小神经胶质细胞前体植入大脑，并在神经环境内发育为小神经胶质细胞(Pijuan-Sala等,Science 2016；353)。为了概括这一模式，在第10天收集悬浮细胞并在存在对于小神经胶质细胞的存活和成熟至关重要的细胞因子IL-34和M-CSF的情况下将其与第30天的hPSC衍生的皮质神经元直接共培养(Wang等,Nat.Immunol.(2012)；13,753-760)(图28A，图i)。相对于每300,000个皮质神经元，铺板50,000个悬浮细胞，在铺板时每个培养物中产生约16％的造血细胞。值得注意的是，在共培养的4天内，出现了粘附、分枝和小神经胶质细胞样的细胞，表达IBA1和PU.1(图28B)。这些细胞还表达CX3CR1+，占共培养物的多于30％，表明细胞的增殖与向小神经胶质细胞谱系的分化平行进行(图28C)。为了解决在这些共培养物中是否出现其它原始的造血谱系，生成了来自GPI-H2B-GFP hPSC系的GFP+造血细胞(图32A-32B)，并将它们与hPSC衍生的皮质神经元共培养。在共培养的第6天，大多数GFP+细胞为CD45+，这表明它们沿小神经胶质细胞而不是巨核细胞或红细胞的轨迹分化。这些CD45+细胞中的82％表达CX3CR1，这表明大多数CD45+细胞已转变为小神经胶质细胞命运(图28D)。大约10％的GFP+细胞不是CD45+。这些细胞中的一半是未成熟的CD41+CD235A+EMP，而另一半对于这些标志物是阴性的，可能表明更早的造血谱系。这些数据表明，将第10天EMP和PMAC与皮质神经元共同培养可在4天内产生小神经胶质细胞群体，尽管少量未定型造血细胞可能会持续存在。
开发了第二种从祖先阶段成熟小神经胶质细胞的策略，以衍生出一个完全纯且同步的小神经胶质细胞群体(图28A，图ii)。在第10天，将大量造血细胞合并到悬浮液中，然后暴露于含血清的培养基(RPMI+10％的血清，添加IL-34和M-CSF)或通过使用限定的无血清条件(IMDM/F12，添加IL-34和M-CSF)持续7-11天。在培养的第4天，一半的细胞已转变为原始的巨噬细胞阶段，其中50-60％表达CD11B(成熟的巨噬细胞/小神经胶质细胞标志物)和CX3CR1(限于组织定居的巨噬细胞，如小神经胶质细胞)。到培养的第11天，接近99％的细胞表达CD11B，超过85％的细胞表达CX3CR1(图28E)。在这个阶段，所有细胞都粘附，表现出伸长的形态，并且是PU.1+(图33A和33B)。相比之下，原代人外周血单核细胞(PBMC)在相同的培养条件下平行成熟并表达CD11B，但很大程度上缺乏CX3CR1表达(图28E)。将所得的原始巨噬细胞纯群体与hPSC衍生的皮质神经元共培养，以将这些细胞完全转变为小神经胶质细胞命运。共培养4天后，小神经胶质细胞显示出分枝和IBA1上调(图28F和图33C)。相比于与神经元共培养的成熟PBMC，小神经胶质细胞样细胞的CD45水平较低，并保持CX3CR1表达，而PBMC衍生的细胞表达CD45而不存在CX3CR1(Greter等,Front Immunol.(2015)；6)(图28G)。为了确定转录身份，在共培养开始后2周，使用CD45+CX3CR1+分选出hPSC衍生的小神经胶质细胞。观察到签名小神经胶质细胞基因的表达水平与人类胎儿小神经胶质细胞相似(Butovsky等,Nat.Neurosci.(2014)；17,131-143；Bennett等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2016)；113,E1738-1746)(图28H)。有趣的是，TMEM119和SALL1在神经元共培养时显著增加(Gosselin et al.,Science(2017)；356)(图28H)。共培养的hPSC衍生的小神经胶质细胞的单细胞RNA测序表明，这些细胞代表了没有未分化前体的同质细胞群体(图34A-34B)。小神经胶质细胞样品中细胞之间计算的成对距离落入干净的单峰分布，表明细胞之间几乎没有差异(图34A)。相比之下，在共培养前第10天细胞之间计算的成对距离在分布中显示多个峰，表明细胞的异质性(图34B)。接下来，确定两种衍生方法中的任何一种是否都在转录上产生与原代人小神经胶质细胞更相似的细胞。与皮质神经元共培养14天后，使用CD45+CX3CR1+分选出小神经胶质细胞，并通过大量RNA测序将其基因表达与原代成人人小神经胶质细胞进行比较。在无监督的分级聚类之后，这两种方法都产生了小神经胶质细胞，这些小神经胶质细胞与从死后皮质脑组织(额和颞，年龄为60-77岁)获得的原代人小神经胶质细胞聚类(图28I)。但是，这两种方法都无法与原代人小神经胶质细胞精确落在同一亚分支中，这可能是由于细胞的年龄(胚胎与年老)和/或体外培养的结果。
hPSC衍生的小神经胶质细胞与体内小神经胶质细胞共享功能相似性。观察到，与神经元共培养的hPSC衍生的小神经胶质细胞调查其环境，收缩和扩展其过程以对周围的神经元进行采样，类似于体内的稳态小神经胶质细胞(Nimmerjahn等,Science(2005)；308,1314-1318)。当用酵母-抗原酵母聚糖攻击时，该细胞与星形胶质细胞对照相比能够执行更高效的吞噬作用(Wake等,Neuron Glia Biol(2011)；7,1-3)(图35A-35B)。最后，小神经胶质细胞的另一个作用是在发育中的大脑中修剪突触(Stevens等,Cell(2007)；131,1164-1178)。当与形成突触的成熟hPSC衍生神经元共培养时(D70以上(图36A-36B))，在共聚焦成像时，小神经胶质细胞显示出包含突触物质的内含物(图28J，图i)。尽管存在包含以RFP标记的一般神经元物质的内含物，但专门由突触物质组成的内含物数量为1-2％(图28J，图ii)。该数量与稳态期间原代小神经胶质细胞报告的基础突触摄取水平相匹配(Schafer等,Neuron(2012)；74,691-705)。
在该阶段设定了在分化的21天之内生成具有与其原代对应物相匹配的特性的几乎纯的小神经胶质细胞的能力，以构建一个功能性的、完全由hPSC衍生的、由人小神经胶质细胞与人星形胶质细胞(Tchieu等,Nat Biotechnol(2019)；37,267-275)和皮质神经元(Chambers等,Nat Biotechnol(2009)；27,275-280；Qi等,Nat.Biotechnol.(2017)；35,154-163)类似纯群体组成的三培养平台(图29A)。hPSC衍生的星形胶质细胞如最近所述(Tchieu等,Nat Biotechnol(2019)；37,267-275)产生，并且均表达GFAP+，子集表达AQP4+(图29B)。同样，本公开的实施例产生纯hPSC衍生的神经元，其具有表达皮质层标志物TBR1和CTIP2和端脑标志物FOXG1的皮质神经元身份(图29C和29D)。为了建立三培养平台，在初次铺板时以2：1：8识别了每种细胞类型的最佳比例，其中每平方厘米50,000个小神经胶质细胞：25,000个星形胶质细胞：200,000个神经元。这些条件允许在存在星形胶质细胞的情况下小神经胶质细胞稳健的附着和存活，因为星形胶质细胞数量增加会干扰小神经胶质细胞的附着(图37A)。对在存在IL-34和M-CSF的情况下的基础培养基的培养条件进一步优化，以减少集中于补体C3产生的基线炎症细胞因子的产生(图37B)。NB/BAGC(参见方法)条件导致基线C3诱导非常低，并且神经元存活和保持较优异(Qi等,Nat.Biotechnol.(2017)；35,154-163)。一周后，三培养显示与MAP2+皮质神经元相互作用的分枝的IBA1+小神经胶质细胞和许多GFAP+星形胶质细胞过程(图29E)。三培养在很大程度上没有任何凋亡，并且CC3+细胞证实所有三种细胞类型的存活均较优异(图29F和图37C)。
为了测试三培养体系是否可以概括小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间的神经炎症轴，测量了补体C3作为替代标志物的产生。首先，通过ELISA在以下各种共培养条件下评估C3分泌：仅神经元(200,000个细胞/cm2)、星形胶质细胞和神经元(25,000+200,000个细胞/cm2)、小神经胶质细胞和神经元(50,000+200,000个细胞/cm2)以及三培养(50,000个小神经胶质细胞/cm2+25,000个星形胶质细胞/cm2+200,000个神经元/cm2)。在基线处，C3仅存在于含有小神经胶质细胞的培养物中，而在星形胶质细胞/神经元共培养物中，C3水平极低，且在仅神经元的培养物中未检测到。有趣的是，在三培养中，基线C3水平显著高于仅小神经胶质细胞/神经元的培养物，这表明在同时存在小神经胶质细胞和星形胶质细胞的情况下，通过细胞串扰可以增强C3分泌(图29G)。在用炎症蛋白脂多糖(LPS)刺激培养物以药理学模拟神经炎症状态(Chen等,J.Neurosci.(2012)；32,11706-11715)后，测量C3分泌。LPS处理后，C3的水平在所有含有小神经胶质细胞的培养物中均增加，但在三培养条件下再次大大增强(图29G)。为了排除这种增强作用可能简单反映小神经胶质细胞数量增加的可能性，使用高内涵成像显微镜通过免疫荧光对IBA+细胞进行定量。有趣的是，与小神经胶质细胞/神经元共培养相比，三培养中的IBA1+阳性细胞实际上减少了，排除了小神经胶质细胞数量增加是C3水平较高的原因(图38A和38B)。LPS刺激诱导了C3分泌以外的炎症状态以及通过ELISA的经典炎症细胞因子例如IL-6、TNF和IL-10的水平增加(图29H)。
使用CRISPR/Cas9产生了C3 KO hPSC系，其显示完全缺乏C3产生(图29I)。该系分化为C3 KO星形胶质细胞和C3 KO小神经胶质细胞，并产生了包含C3 KO星形胶质细胞、野生型小神经胶质细胞和神经元(C3KOA)，或野生型星形胶质细胞、C3 KO小神经胶质细胞和神经元(C3KOM)的三培养物。在野生型三培养、C3KOA和C3KOM培养中，以％IBA1/DAPI评分的小神经胶质细胞数量和以％GFAP/DAPI评分的星形胶质细胞数量相似(图38C)。在基线处，C3KOA培养与WT三培养相比显示出降低的C3水平，但比小神经胶质细胞/神经元培养C3水平更高(图29J)。有趣的是，在C3KOM培养中，C3水平非常低，表明小神经胶质细胞必须表达C3，以在三培养中有效诱导星形胶质细胞产生C3(图29J)。该小神经胶质细胞C3是直接作用于星形胶质细胞还是间接通过小神经胶质细胞的自分泌刺激尚待确定。LPS刺激后获得了可比的结果。LPS刺激的C3KOA培养物的C3水平低于LPS刺激的WT培养物，但高于LPS刺激的仅小神经胶质细胞/神经元培养物。用LPS刺激的C3KOM培养物显示出非常低的C3水平(图29J)。这些数据表征了炎症回路中的小神经胶质细胞与星形胶质细胞之间的细胞串扰，该炎症回路在基线处存在并且在药理学诱导神经炎症状态时加剧(图29K)。在这个回路中，产生C3的小神经胶质细胞是向星形胶质细胞发出信号以产生C3的起始细胞。C3KOA结果表明，星形胶质细胞反过来再诱导小神经胶质细胞产生更多的C3。
鉴于本公开的体外三培养体系具有梳理神经炎症轴的细胞成分的能力，该平台用于在疾病状态阿尔茨海默氏病中模拟神经炎症。使用了含有APPSWE+/+突变的靶向的同基因人ESC系(Paquet等,Nature2016；533,125-129)。通过FOXG1和MAP2表达以及用于皮层身份的TBR1和CTIP2，验证了分化的AD和同基因对照hPSC衍生的神经元(图30A和图30B)。APPSWE+/+神经元显示出淀粉样蛋白β产生增加，这是阿尔茨海默氏病APPSWE模型的标志(Paquet等,Nature 2016；533,125-129)(图30C)。将与成熟的第80天APPSWE+/+神经元或同基因对照神经元共培养的WT分化的星形胶质细胞(GFAP+)和WT分化的小神经胶质细胞(IBA1+)铺板以构建三培养物(图30D)。在三培养的第8天，通过ELISA测量含有APPSWE+/+神经元的三培养物与含有同基因对照神经元的培养物的C3水平。有趣的是，与衍生自同基因对照的那些相比，APPSWE+/+三培养中的C3水平更高(图30E)。与同基因对照星形胶质细胞/神经元和仅神经元的培养物相比，C3在APPSWE+/+星形胶质细胞/神经元和仅APPSWE+/+神经元的培养物中不以高水平产生或增加，表明小神经胶质细胞必须存在于培养中以便稳健产生C3。
为了确定APPSWE+/+三培养物中C3增加的来源是由于星形胶质细胞还是小神经胶质细胞，产生了来自C3 KO hPSC的小神经胶质细胞和星形胶质细胞，并建立了含有C3 KO星形胶质细胞、野生型小神经胶质细胞以及APPSWE+/+神经元或同基因对照神经元(C3KOA)，或野生型星形胶质细胞、C3 KO小神经胶质细胞以及APPSWE+/+神经元或同基因对照神经元(C3KOM)的三培养物。显著地，在C3KOA AD三培养物中，观察到C3水平大大降低，与同基因对照三培养物相当(图30F)。但是，与C3KOA同基因三培养物相比，C3KOA AD三培养物仍显示出增加的C3水平。在C3KOM培养物中，C3产生水平较低，必须存在表达C3的小神经胶质细胞以便在APPSWE+/+三培养物中诱导C3表达(图30F)。
接下来，通过蛋白质印迹评估C1Q沉积水平。C1Q是C3上游的补体蛋白，其与补体C3的切割产物复合，并且还标记突触物质以清除(Hong,S.等Science(2016)；352,712-716)。突出地，APPSWE+/+培养物中发现的C1Q蛋白增加，而C1Q仅存在于含有小神经胶质细胞的培养物中(图30G)。C1Q已显示在AD体内积聚(Hong,S.等Science(2016)；352,712-716；Afagh,Exp.Neurol.(1996)；138,22-32)，此处为这种表型在AD体外模型中进行了概括。注意到在APPSWE+/+和同基因对照培养物中，与小神经胶质细胞/神经元、C3KOA和C3KOM培养物相比，三培养物中的C1Q水平降低了(图30G)。表明C3水平和C1Q之间可能存在负反馈，因为与C3较低的培养物(小神经胶质细胞/神经元、C3KOM、C3KOA)相比，C3水平较高的培养物(三培养)显示较低的C1Q。但是，这种相反关系的确切机制仍有待未来的研究确定。
基于本公开的体外三培养体系的结果，提出了针对补体C3的细胞对阿尔茨海默氏病中神经炎症的贡献的模型(图30H)。与同基因对照三培养相比，AD中的C3水平增加，并且这种增加可以解释为是由于小神经胶质细胞诱导的星形胶质细胞C3以及星形胶质细胞再诱导的小神经胶质细胞C3。结果显示，涉及APPSWE+/+神经元的炎症回路触发小神经胶质细胞，诱导小神经胶质细胞和星形胶质细胞两者之间的双向相互作用。此外，仅在存在小神经胶质细胞的情况下，才检测到AD培养物中C1Q的沉积增加，并且与它们的C3状态无关。
本公开的三培养体系使得能够通过遗传操作解析细胞串扰，并且允许研究在LPS刺激时在三培养中和在AD模型中补体C3产生增加的机制。关注C3是因为最近的文献表明C3在衰老过程(Shi等,J.Neurosci.(2015)；35,13029-13042)和神经退行性病症如AD(Wu等,Cell Rep.(2019)；28,2111-2123；Rasmussen等,Alzheimer’s Dement.(2018)；14,1589-1601)中会增加并与引起异常突触修剪有关(Hong等,Science(2016)；352,712-716；Shi等,Sci.Transl.Med.(2017)；9)。但是，该技术可以很容易地适于研究任何其它与疾病相关的神经炎症靶通路。识别对人类神经炎症轴有贡献的关键细胞参与者，应能开发定向的、细胞类型特异性的治疗策略。实际上，hPSC衍生的三培养体系可以作为可扩展平台，用于筛选具体靶向阿尔茨海默氏病或其它神经退行性病症中小神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间的串扰的治疗性化合物。
材料与方法
从hPSC衍生小神经胶质细胞
将保持在Essential 8培养基中的hPSC通过Accutase进行解离以获得单细胞悬液。将60,000个细胞/cm2铺板在包被有基质胶的板上的含有激活素A(R&D 338-AC)(7.5ng/mL)、BMP4(R&D)(30ng/mL)、CHIR 99021(Tocris)(3μM)和ROCK抑制剂(Y-27632)(10μM)的E8培养基中。18小时后，将培养基换成含有激活素A(10ng/mL)、BMP4(40ng/mL)和IWP-2(Selleck)(2μM)的Essential 6培养基。在第2天，将培养基更换为含有激活素A(10ng/mL)、BMP4(40ng/mL)、IWP-2(2μM)和FGF2(R&D)(20ng/mL)的Essential 6培养基。在第3天，将培养物用Accutase解离，并在含有VEGF(R&D)(15ng/mL)、FGF2(5ng/mL)和ROCK抑制剂(Y-27632)(10μM)的Essential 6培养基中以60,000细胞/cm2重新铺板。在第4天，去除ROCK抑制剂，将培养基更换为Essential 6(含VEGF(15ng/mL)和FGF2(5ng/mL))。在第5天和第6天，向培养物中供应含有VEGF(15ng/mL)、FGF2(5ng/mL)、SCF(200ng/mL)和IL-6(20ng/mL)的Essential 6培养基。在第7天和第9天，将培养基更换为含有SCF(100ng/mL)、IL-6(10ng/mL)、TPO(30ng/mL)和IL-3(30ng/mL)的Essential 6。收集第10天的悬浮细胞，并进行以下操作之一：1)与皮质神经元在含有B27、L-谷氨酰胺和BDNF、抗坏血酸、GDNF、cAMP和IL-34(100ng/mL)和M-CSF(20ng/mL)的Neurobasal中共培养5天，以直接转变为小神经胶质细胞，或2)在含有10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉亲和素以及IL-34(100ng/mL)和M-CSF(10ng/mL)的RPMI中培养7-11天，直到细胞粘附并伸长以转变为原始巨噬细胞。对于无血清培养，收获第10天的悬浮细胞，并在含有B27、L-谷氨酰胺和IL-34(100ng/mL)和M-CSF(20ng/mL)的75％IMDM、25％F12培养基中培养7-11天。然后将转变的巨噬细胞与皮质神经元在添加IL-34和M-CSF的情况下共培养7天，以上调小神经胶质细胞特异性标志物。
皮质神经元方案
将hPSC用Accutase解离，并以200,000个细胞/cm2铺在包被有基质胶的板上含有ROCK抑制剂(Y-27632)(10μM)的Essential 8培养基中。用含有LDN193189(100nM)和SB431542(10μM)的Essential6培养基处理细胞12天，并在分化的前4天加入XAV939(2μM)。对培养物供应含有1：1000B27补充剂的N2培养基持续另外一周，以发育神经祖细胞(NPC)。然后将NPC解离并重新铺在聚鸟氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白包被的板上，并保持在Neurobasal、BDNF、抗坏血酸、GDNF、cAMP、L-谷氨酰胺和B27补充剂中，以用于神经元分化和成熟。
星形胶质细胞方案
根据Tchieu等将hPSC分化为星形胶质细胞。简而言之，将皮质神经干细胞通过可诱导的慢病毒构建体用NFIA脉冲5天，然后将CD44+祖细胞分选并重新铺板并保持在含有N2、HB-EGF(10ng/mL)和LIF(10ng/mL)的星形胶质细胞诱导培养基中持续至少4周。
FACS分析
将细胞用Accutase解离20分钟，然后重悬于在PBS中含有1％BSA、2mM EDTA、30μg/mL DNAse I和Normocin的FACS缓冲液中。洗涤细胞，并将其在黑暗中在4摄氏度在冰上在具有抗体的分选缓冲液中孵育30分钟。使用FlowJo软件进行门控和后续分析。
基于液滴的scRNA-seq文库的制备和测序
制备了四个样品，用于在小神经胶质细胞分化的不同天进行单细胞测序：分化第6天为“第6天”，分化第10天为“第10天”，仅包括分化第10天的悬浮细胞的“第10天悬浮液”，以及包括与神经元一起培养14天的末期小神经胶质细胞的“小神经胶质细胞”。“第6天”和“第10天”样品通过用Accutase处理培养物20分钟以获得单细胞悬浮液来制备。“第10天悬浮液”通过将悬浮细胞收集并经40μM过滤器过滤以获得单细胞悬浮液来制备。“小神经胶质细胞”通过针对CX3CR1+分选小神经胶质细胞-神经元共培养物来制备。测序前，所有样品均以1000个细胞/μL重悬于FACS缓冲液中。根据制造商的方案，使用10X基因组学ChromiumSingle Cell 3’Library&Gel bead Kit V2进行单细胞测序。将8700个细胞的输入添加到每个10x通道。在Illumina NovaSeq装置上对文库进行测序。
scRNA-seq数据预处理
使用SeQC处理管线处理scRNA-seq数据(Azizi等,Cell(2018)；174,1293-1308)。SeQC在读取对齐、多映射读取分辨率、细胞条形码和UMI校正后生成按基因的计数细胞矩阵。SEQC包括第一个过滤步骤，该步骤去除1)基于每个条形码的分子计数的累积分布的推定空液滴；2)基于>20％的衍生自线粒体的分子的推定凋亡细胞；以及(3)去除被识别为其中检测到的分子与一小部分基因对齐的细胞的低复杂性细胞。SEQC处理后，每个样品的细胞数为：5253、4320、5555和4961。中位数文库大小为每个细胞19,195、4039、10,126和16,716个分子(分别为第6天、小神经胶质细胞、第10天、第10天悬浮液)。通过将每个基因分子计数除以细胞中检测到的分子总数，将计数针对文库大小归一化，然后乘以10,000，以将原始计数转换为相对于每10,000的转录本。然后使用自然对数和伪计数1对数据进行对数转换。使用Scanpy平台(v1.4)进行数据分析(Wolf等,Genome Biol.(2018)；19,15)。
细胞过滤
对于每个样品，使用PhenoGraph聚类算法对细胞进行聚类(Levine等,Cell(2015)；162,184-197)。将检测到的基因数量少(约200个)、线粒体RNA含量低或没有的细胞簇作为假定的空液滴除去。将具有高线粒体RNA和少量检测到的基因的簇作为假定的垂死细胞除去。三个与造血分化无关的簇被除去，包括两个表达低水平的MESP1和PDGFRA但不表达KDR、PECAM1或CDH5的早期中胚层簇和一个属于表达NKX2.5和ISL1的心脏谱系的簇。
最近邻图构造
将主成分用于计算细胞之间的欧几里得距离。如Haghverdi等(Haghverdi等,Bioinformatics(2015)；31,2989-2998)所述，使用自适应高斯核来将细胞的k个最近邻居之间的欧几里得距离转换为亲和力。通过使用高斯核，细胞之间的亲和力随其距离呈指数下降，从而与原始欧几里得距离相比，对附近细胞的亲和力增大，而对远处细胞的亲和力减小。而且，通过使用具有细胞适应宽度的内核，说明了数据流形各区域之间密度的差异。最近的邻图被用作力导向图布局和扩散图嵌入的基础。
聚类和力导向图布局
收集来自第6天、第10天和第10天悬浮液样品的数据以进行轨迹建模。对数据进行主成分分析，然后选择前20个主成分进行进一步分析，以减少由于scRNAseq中高度缺失(dropouts)导致的噪音(Stegle等,Nat.Rev.Genet.(2015)；16,133-145)。使用ForceAtlas2算法(Jacomy等,PLoS One(2014)；9,e98674)，基于如上所述构造的数据的30个最近邻图，计算力导向图布局。使用默认参数设置通过PhenoGraph进行聚类(Levine等,Cell(2015)；162,184-197)。
扩散图嵌入
为了接近表示分化轨迹的低维数据流形，使用基于自适应高斯核的最近邻图(k＝20，如上所述)构造扩散图嵌入(Haghverdi等,Bioinformatics(2015)；31,2989-2998)。构造扩散图是一种概括高维观测所依据的低维结构的非线性方法。选择扩散图的前四个扩散分量进行轨迹建模。随后将细胞之间的扩散距离(即“扩散图空间”中细胞之间的欧几里德距离)转换为单个细胞之间的拟时间距离，如Haghverdi等人所述(Haghverdi等,NatMethods(2016)；13,845-848)。尽管标准扩散图中的距离与沿着“亲和力图”边缘的长度为1的随机马尔可夫(Markov)步相关，但多尺度空间中的扩散距离会概括所有长度的随机步，从而更好地捕获细胞之间的相似度和距离(Haghverdi等,Nat.Methods(2016)；13,845-848)。
轨迹表征
为了进一步表征轨迹，使用了Palantir(Setty等(Nat.Biotechnol.(2019)；37,451-460)。Palantir是一种工具，其使用拟时间距离来识别分化细胞数据中的轨迹终点，并且还测量细胞表型的熵，以测量其可塑性和对特定细胞命运的归属(commitment)。作为Palantir轨迹的输入近似起始细胞，使用了CDH5高、KDR高和PECAM1高造血内皮细胞簇的随机细胞。邻居数设置为k＝20，扩散分量数设置为4。对于所有其它参数，使用默认设置。
计算拟时间内的基因趋势
为了恢复拟时间内单个基因的表达趋势，首先使用MAGIC估算处理后的计数矩阵(van Dijk等,Cell(2018)；174,716-729)。MAGIC是一种通过数据扩散跨相似细胞共享信息来对细胞计数矩阵进行去噪并填充零的方法。使用邻居数k＝40，随机步长度t＝6和默认的其它设置运行MAGIC。根据估算的计数矩阵，使用广义加性模型(GAM)计算基因趋势，如Setty等人所述。
分支基因模块的定义
为了识别与所有其它分支和早期簇相比在一个分支中上调的基因模块，在pMAC簇(“PMAC1”、“PMAC2”)、红细胞簇(“EARLY ERY”、“LATE ERY”)、巨核细胞簇(“MK”)和造血内皮细胞簇(“HE1”、“HE2”)之间使用MAST(Finak等,Genome Biol.(2015)；16,278)进行了差异表达分析。与其它每个组相比，分支模块的簇中log2倍增加至少0.25的基因(Bonferroni校正的p值<0.05)包括在分支模块中。
将分支基因模块分为早期和晚期模块
对于每个分支，如先前所述，计算所有分支模块基因在拟时间内的基因趋势。从轨迹的起点到正在考虑的模块分支的终端细胞计算趋势。为了识别每个基因的“激活点”，即基因开始增加其表达的拟时间点，首先将计算出的基因趋势归一化为介于0和1之间的表达范围。然后，计算拟时间的第一个点，在该处，基因趋势的斜率(一阶导数)为0.8：这被认为是激活点。为了将每个基因模块分为“早期基因”(早激活的基因)和晚期基因，查明拟时间中的最早时刻(范围从0到1)，在该处，细胞偏离起始分支概率，如Palantir所识别的，大于0.025。在这个三叉点，细胞开始向三种细胞命运之一分化。在三叉发生之前至少0.3拟时间被激活的基因被认为是早期基因(即，对于骨髓臂，拟时间＝0.40)。所有其它基因均被认为是晚期基因。
与小鼠基因签名的比较
为了与先前发布的EMP和pMAC的小鼠签名进行比较(Mass等,Science(2016)；353)，将其翻译为具有与人类基因名称一对一小鼠人类直系同源物(由Ensembl BioMarts(Kinsella等,Database(Oxford)(2011)定义)的签名小鼠基因名称。所有其它基因均排除在分析之外。此外，还排除了本公开的数据中未检测到转录本的基因。显示签名基因的拟时间表达趋势的热图(图27D和图28I)是基于估算的表达值。对于每个基因，估算的基因表达被归一化为0到1之间的范围。所有具有最小骨髓分支概率为0.1的细胞都包括在热图中。通过拟时间对细胞进行排序，并使用质心聚类对基因进行聚类。对于巨噬细胞基因签名，将来自小神经胶质细胞样品的细胞添加到轨迹细胞中，并给出人工拟时间为1.1。
整合到单细胞小鼠胚胎形成图集
为了将轨迹数据整合到最近发布的小鼠原肠胚形成和早期器官形成的单细胞转录组学图集(Pijuan-Sala,B.等Nature(2019)；566,490-495)中，使用数据集中的注释为血(haemato)-内皮细胞谱系的所有细胞的数据(15875个细胞)。分析中仅包括具有一对一小鼠人类直系同源物的基因(如前所述)。为了进一步限制与有机体有关的偏差，基因集仅限于参考小鼠数据中高度可变的基因。高度可变的基因如Satija等人所述(Satija等,Nat.Biotechnol.(2015)；33,495-502)来定义。最终包括的基因数为1,356。为了进行进一步的批量校正，使用了相互最近邻居批量校正的快速实现(Haghverdi等,Nat.Biotechnol.(2018)36,421-427)。fastMNN(https://rdrr.io/github/LTLA/batchelor/man/fastMNN.htmL)对主成分矩阵而不是基因表达矩阵执行批量校正。将合并数据的前20个主成分用于批量校正。首先对同一时间点内的样品进行批量校正，然后在时间点之间进行批量校正。用于fastMNN的样品顺序为：小鼠数据、晚到早、然后是人的第10天和第10天悬浮液样品(合并)，最后是第6天样品。如前所述，计算力导向图布局。使用PAGA构建了小鼠和人类数据簇的图(Wolf等,Genome Biol.(2019)；20,59)。仅将权重为0.2或更高的图形边缘用于图形的力导向布局(Jacomy等,PLoS One(2014)；9,e98679)。
免疫组织化学、活/死检定和高内涵成像
在室温下将细胞固定在4％PFA中10分钟，用0.1％Triton渗透5分钟，用0.2％Tween-20的PBS溶液洗涤5分钟，并用PBS中的0.2％Tween-20中的5％驴血清封闭30分钟。将一抗在封闭溶液中稀释，并与样品在4度孵育过夜。将二抗(Alexa 488、555和647)在封闭溶液中稀释，并在室温与样品孵育45分钟。使用DAPI染色来识别细胞核。用CC3进行活/死检定，其中将hPSC衍生的皮质神经元的对照与70％甲醇孵育30分钟。使用ImageExpressMicro共聚焦高内涵成像***来对培养物中的小神经胶质细胞数量进行定量(Chambers等,Nat.Biotechnol.(2009)；27,275-280)。以5倍放大倍率拍摄视野，以扫描整个96孔培养孔。
吞噬突触蛋白成像
将小神经胶质细胞与D70+神经元在ibidi培养皿上共培养至多30天，并用PSD95和IBA1染色成像。将培养物在配备有白光激光技术和标准氩激光(458、476、488、496和514nm)的Leica SP8共聚焦显微镜上以40倍的放大倍率成像。使用Imaris处理和分析数据：在IBA1通道中生成表面体积遮罩，在其中对于PSD95通道生成另一个遮罩，以确定给定Z堆中PSD95内含物的体积/IBA1的体积。
吞噬作用检定和调查检定
对于吞噬作用检定，将小神经胶质细胞或星形胶质细胞对照和与Alexa fluor488缀合的酵母聚糖A生物颗粒在Olympus Vivaview荧光培养箱显微镜中孵育5小时。对于调查测定，将小神经胶质细胞用表达GFP的慢病毒构建体感染，并与D50皮质神经元共培养7天，然后在Olympus Vivaview荧光培养箱显微镜中孵育16小时。延时成像以2分钟/帧进行编辑。
RNA测序
通过CX3CR1+从神经元共培养物中分选来自3种不同的hPSC系H1、H9和iPSC系SA241-1的50,000-100,000hPSC衍生的小神经胶质细胞。使用Zymo RNA Micro Kit提取RNA。在对60-77岁患者的额叶和颞叶的死后组织进行分选后，从原代人小神经胶质细胞中获得了RNA。所有样品均提交给MSKCC集成基因组核心，用于配对末端SMARTER测序和30-40百万次读取。分析是通过MSKCC生物信息学核心通过标准管线完成的。
三培养体系和LPS检定
在包被有聚鸟氨酸/纤连蛋白/层粘连蛋白的板上，以150,000个细胞/cm2从hPSC分化皮质神经元，并使其在含有BDNF、抗坏血酸、GDNF和cAMP(NB/BAGC)的Neurobasal中成熟50-70天。将从hPSC分化的星形胶质细胞用Accutase解离20-30分钟，然后以25,000个细胞/cm2在神经元的顶部铺板，并在NB/BAGC中静置4天。然后将从hPSC分化的小神经胶质细胞用Accutase解离10分钟，然后以50,000细胞/cm^2铺板在具有IL-34(100ng/mL)和M-CSF(20ng/mL)的NB/BAGC中的的星形胶质细胞/神经元培养物的顶部。每隔一天更换培养基，新鲜添加IL-34和M-CSF。将三培养物培养至少7天后，将LPS以1μg/mL加入培养物中，持续72小时。收集培养基并以2000rpm旋下5分钟，然后将上清液冷冻在-80摄氏度，直到进一步分析。
细胞因子ELISA
使用FlexMap 3D***上的Millipore Luminex Multiplex Kit分析培养物上清液中的C3。来自+/-LPS检定的上清液也被送至Eve Technologies，以使用人类高灵敏度T细胞发现阵列14-plex对14种炎症细胞因子进行多重分析。
C3的CRISPR/Cas9 KO
将PX458载体核转染到H1 hESC中。根据GFP表达对细胞进行分选，并在具有cloneR补充剂的E8培养基中作为单细胞克隆进行培养。将克隆挑选到复制板上，并使用BradleyLysis Buffer和Proteinase K处理提取基因组DNA。在gRNA切割位点附近扩增450bp的PCR产物。然后将PCR产物连接至原始质粒，并通过Sanger测序筛选克隆的***缺失。随后挑出具有得***缺失的克隆，进行扩增，核型分析并分化为小神经胶质细胞，以便通过ELISA进一步验证C3蛋白分泌的缺乏。
本公开的主题的实施方式
根据前面的描述将显而易见的是，可以对本公开的主题进行变型和修改以将其应用于各种用途和条件。这样的实施方式也在所附权利要求的范围内。
本文对变量的任何定义中的要素列表的叙述包括将该变量定义为所列要素的任何单个要素或组合(或子组合)。本文对实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合。
本说明书中提到的所有专利和出版物都以如同每个独立的专利和出版物均被具体地和单独地指出并入以供参考一样相同的程度并入本文以供参考。

Claims (59)

1.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括：
a)使干细胞与至少一种Wingless(Wnt)信号传导激活剂接触至多约24小时；
b)使所述细胞与至少一种Wnt信号传导抑制剂和至少一种促造血细胞因子接触以获得分化细胞的群体，其中所述分化细胞选自表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞、表达至少一种前巨噬细胞标志物的细胞、及其组合；以及
c)诱导所述分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中c)诱导所述分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括将所述分化细胞与神经元一起培养至少约5天，任选地4天。
3.根据权利要求1所述的方法，其中c)诱导所述分化细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的步骤包括使所述分化细胞与至少一种促巨噬细胞细胞因子接触至少约5天；以及将所述细胞与神经元一起培养至少约5天，任选地将所述细胞与神经元一起培养至少4天。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导激活剂接触约20小时，任选地18小时。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约1天且至多约5天，任选地至少1天且至多4天。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导抑制剂接触至少约2天。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种促造血细胞因子接触至少约1天且至多约10天，任选地至少3天且至多11天。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种促巨噬细胞细胞因子接触7天、8天、9天或11天。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将所述细胞与所述神经元一起培养约5天，任选地4天或5天。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使所述干细胞与所述至少一种Wnt信号传导激活剂接触的步骤产生表达至少一种中胚层祖细胞标志物的细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种中胚层祖细胞标志物选自Brachyury、KDR、及其组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导抑制剂接触的步骤产生表达至少一种原始造血前体标志物的细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一种原始造血前体标志物选自KDR、CD235A、及其组合。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种促造血细胞因子接触的步骤还产生表达至少一种红系骨髓祖细胞(EMP)标志物的细胞。
15.根据权利要求12所述的方法，其中使所述细胞与所述至少一种促造血细胞因子接触至少约1天且至多约5天或至多约10天，以产生表达至少一种EMP标志物的细胞。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述至少一种EMP标志物选自Kit、CD41、CD235A、CD43、及其组合。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述表达至少一种EMP标志物的细胞不表达CD45。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种前巨噬细胞标志物选自CD45、CSF1R、及其组合。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述表达至少一种前巨噬细胞标志物的细胞不表达Kit。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少一种小神经胶质细胞标志物选自CX3CR1、PU.1、CD45、IBA1、P2RY12、TMEM119、SALL1、GPR34、C1QA、CD68、CD45、及其组合。
21.根据权利要求3-20中任一项所述的方法，其中至少一种巨噬细胞标志物选自CD11B、DECTIN、CD14、PU.1、CX3CR1、CD45、及其组合。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导激活剂降低糖原合成酶激酶3β(GSK3β)以激活Wnt信号传导。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导激活剂选自CHIR99021、Wnt-1、WNT3A、Wnt4、Wnt5a、WAY-316606、IQ1、QS11、SB-216763、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)、LY2090314、DCA、2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、(杂)芳基嘧啶、其衍生物、及其组合。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导激活剂是CHIR99021。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导抑制剂选自XAV939、IWP2、DKK1、IWR1、肽(Nile等人的肽(Nile等Nat Chem Biol.2018Jun；14(6):582-590))、porccupine抑制剂、LGK974、C59、ETC-159、Ant1.4Br/Ant 1.4Cl、氯硝柳胺、apicularen、巴弗洛霉素、G007-LK、G244-LM、吡维胺、NSC668036、2,4-二氨基喹唑啉、槲皮素、ICG-001、PKF115-584、BC2059、Shizokaol D、其衍生物、及其组合。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导抑制剂是IWP2。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述至少一种促造血细胞因子选自VEGF、FGF、SCF、白介素、TPO、及其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述白介素选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、及其组合。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述FGF选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF10、FGF18、及其组合。
30.根据权利要求3-29中任一项所述的方法，其中所述至少一种促巨噬细胞细胞因子选自M-CSF、IL-34、GM-CSF、IL-3、及其组合。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中使所述细胞与浓度为约1μM至约6μM的所述至少一种Wnt信号传导激活剂接触。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中使所述细胞与浓度为约1μM至约10μM的所述至少一种Wnt信号传导抑制剂接触。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中使所述细胞与浓度为约1ng/mL至约50ng/mL的所述至少一种促造血细胞因子接触。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中使所述细胞与浓度为约1ng/mL至约400ng/mL的所述至少一种促造血细胞因子接触。
35.根据权利要求3-34中任一项所述的方法，其中使所述细胞与浓度为约1ng/mL至约200ng/mL的所述至少一种促巨噬细胞细胞因子接触。
36.一种表达至少一种小神经胶质细胞标志物的体外分化细胞的细胞群体，其中所述体外分化细胞根据权利要求1-35中任一项所述的方法衍生自干细胞。
37.一种组合物，其包括根据权利要求36所述的细胞群体。
38.一种用于诱导干细胞分化的试剂盒，其包括：
(a)至少一种Wnt信号传导抑制剂；
(b)至少一种Wnt信号传导激活剂；
(c)至少一种促造血细胞因子；和
(d)神经元。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其还包括(e)至少一种促巨噬细胞细胞因子。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的试剂盒，其还包括用于诱导干细胞分化为表达至少一种小神经胶质细胞标志物的细胞的说明书。
41.一种组合物，其包括体外分化细胞的群体，其中所述群体中包括的至少约50％的细胞表达至少一种小神经胶质细胞标志物，并且其中所述群体中包括的少于约25％的细胞表达至少一种选自以下的标志物：干细胞标志物、中胚层祖细胞标志物、原始造血前体标志物、EMP标志物、前巨噬细胞标志物、巨噬细胞标志物。
42.一种预防和/或治疗受试者的神经退行性疾病的方法，包括向受试者施用以下之一：
(a)根据权利要求36所述的分化小神经胶质细胞的群体；
(b)根据权利要求37所述的组合物；和
(c)根据权利要求41所述的组合物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病或肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
44.一种预防和/或治疗神经退行性疾病的方法，其包括向受试者施用集落刺激因子(CSF)。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述CSF选自集落刺激因子(GM-CSF)、M-CSF、IL-34。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述CSF是GM-CSF。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
48.一种用于预防和/或治疗神经退行性疾病的CSF。
49.CSF在制备用于预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
51.一种筛选用于治疗神经退行性疾病的治疗性化合物的方法，其包括：
(a)使根据权利要求34所述的分化小神经胶质细胞的群体与测试化合物接触，其中所述小神经胶质细胞衍生自从患有神经退行性疾病的受试者获得的干细胞；和
(b)测量所述小神经胶质细胞的功能活性，
其中所述小神经胶质细胞的功能活性的改变表明所述测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述改变是降低或增加。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述小神经胶质细胞的所述功能活性包括补体C3的释放。
54.根据权利要求53所述的方法，其中从所述小神经胶质细胞释放的补体C3的降低表明所述治疗性化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。
55.根据权利要求51或52所述的方法，其中所述小神经胶质细胞的所述功能活性包括所述小神经胶质细胞对淀粉样蛋白β的吞噬作用。
56.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病。
57.一种筛选用于治疗神经退行性疾病的治疗性化合物的方法，其包括：
(a)使测试化合物与包括根据权利要求34所述的分化小神经胶质细胞、星形胶质细胞群体和神经元群体的组合物接触；和
(b)测量所述神经元的神经毒性，
其中在与所述测试化合物接触后所述神经元的神经毒性降低表明所述测试化合物倾向于能够治疗神经退行性疾病。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述神经退行性疾病是ALS疾病。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述小神经胶质细胞诱导反应性星形胶质细胞，其诱导对神经元的神经毒性。
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