KR101798474B1 - 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, GDF_8, GDF_11 또는 GDF_15와 같은 TEF_베타 수용체 작용제를 이용하여 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화{DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS TO THE PANCREATIC ENDOCRINE LINEAGE}
본 발명은 2008년 10월 31일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/110,278호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
제 1형 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포 대체 치료법의 발전으로, 생착(engraftment)에 적합한 인슐린 생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되어 왔다. 한 가지 접근법은 예를 들어, 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터 기능성 β 세포를 생성하는 것이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성 (gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층 (three germ layers) (외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF-3베타, GATA4, Mixl1, CXCR4 및 Sox-17과 같은 많은 마커를 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, Pdx1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 생쥐의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등 (문헌[Science 292:1389, 2001])은 생쥐 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린-분비 구조로 분화한 것을 보고한다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 생쥐 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 생쥐에서 혈당을 정상화시킴을 보고한다.
한 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 생쥐 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나아제의 억제제(SLY294002)로 처리하여 β 세포와 닮은 세포를 생성하였음을 개시한다.
다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등 (문헌[PNAS 100:998, 2003])은 Pax4를 구성적으로 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생산 세포를 생성하는 것을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 레틴산이 PDX1 양성 췌장 내배엽을 형성하는 배아 줄기 세포의 의무를 조절할 수 있음을 보고한다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포주를 보고한다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나아제, 뉴로제닌3, P48, Pax6, 및 HNF6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다 (문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈(activin) A(TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아즈) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고한다. 최대 효과는 1 nM 액티빈 A를 이용할 때 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만, 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다 (문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 Pdx1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).
고든(Gordon) 등은 혈청의 부재 하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에서 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키우리(brachyury)+/HNF-3베타+ 내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든(Gordon) 등(문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primative streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 생쥐 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(인간 배아 생식, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다 (미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기 (hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내 (in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다(미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 먼저, 인간 배아 줄기 세포는 부티르산나트륨과 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화되었다. 이어서, EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGF-β 길항제를 이용하여 세포를 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로의 분화능을 보유하면서, 현재의 임상적 필요성에 대처하도록 확장될 수 있는 만능 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키기 위해 대안적인 접근법을 취하였다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
일 실시 형태에서, 본 발명은 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 TGF-β 수용체 작용제를 포함하는 배지로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
<도 1>
도 1은 본 발명에 이용된 분화 프로토콜의 개요를 나타낸다.
<도 2>
도 2는 본 발명에 이용된 분화 프로토콜의 다양한 시기와 관련된 마커의 발현을 나타낸다. 패널 a)는 제1기로 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포에 있어서 FACS에 의해 결정할 때 CXCR4의 발현을 나타낸다. 패널 b)는 제1기로 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정할 때 제1기와 관련된 마커의 발현을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 본 발명에서 이용된 분화 프로토콜의 제6기로 분화된 그리고 후속적으로 액티빈 A로 처리된 (제7기) 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포의 디티존 염색을 나타낸다. 패널 a)는 40㎛의 세포 여과기(strainer)에 통과시키기 전에 디티존으로 염색된 세포의 위상차를 나타낸다. 패널 b)는 40㎛의 세포 여과기를 통과할 수 있었던, 디티존으로 염색된 세포의 위상차를 나타낸다. 패널 c는 40㎛의 세포 여과기 통과가 가능하지 않았던, 디티존으로 염색된 세포의 위상차를 나타낸다.
<도 4>
도 4는 실시예 2에서 설명된 방법에 따라 본 발명에서 이용된 분화 프로토콜의 제6기로 분화된 그리고 제6기로의 분화 이후 액티빈 A로 처리된 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포에 있어서 실시간 PCR에 의해 결정할 때 pdx-1 (패널 a), nkx6-1 (패널 b), Pax4 (패널 c), nkx2.2 (패널 d), 인슐린 (패널 e) 및 글루카곤 (패널 f)의 발현을 나타낸다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정 특징, 실시 형태 또는 응용을 기재 또는 예시하는 하기 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 레벨에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포 (progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 만능 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은 ("미결정된 (uncommitted)") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화 유도된 세포는 세포 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된 (committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 서브세트로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화는 세포가 세포 계통 내의 덜 특화된 (또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포 계통은 세포의 유전, 즉, 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포를 발생시킬 수 있는지를 규정한다. 세포 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포 표현형과 특이적으로 관련되며, 미결정된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
"β-세포 계통"은 하기 전사 인자들 중 적어도 하나 및 전사 인자 PDX-1에 대해 양성 유전자 발현을 갖는 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "제1기 세포", 또는 "제1기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달(Nodal), FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin)(EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(gut tube) 세포, 및 후방 전장 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포" 또는 "제5기 세포" 또는 "제5기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통에 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스 (Cerberus), OTX2, 구스코이드 (goosecoid), C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "배아외 내배엽"은 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 레벨 증가 및 음성 마커의 레벨 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내분비 세포", 또는 ,"췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 세포" 또는 "제4기 세포" 또는 "제4기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, PAX-4, NKX2.2.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 생산 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 생산할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 호르몬 분비 세포" 또는 "제6기 세포" 또는 "제6기"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "후방 전장 세포" 또는 "제3기 세포" 또는 "제3기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1, PTF-1A, HNF-6, HB-9, PROX-1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시 장관 세포" 또는 "제2기 세포" 또는 "제2기"는 하기 마커 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: HNF-1 또는 HNF-4A.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, 혼합형 호메오박스 단백질, 또는 FGF4.
만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 시기-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson 등, Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재하는 경우)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사 (미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때 Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체 (embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양세포의 부재하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (BresaGen (Athens, GA))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995]에 기재된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 문헌[Reubinoff et al., Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)] 및 문헌[Thompson et al, Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147]은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 사용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등, (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는: "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다."라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하였으며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는데 유용한 한정 배지 (defined medium)를 개시하고 있다. 용액 중에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 소정의 배양액에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 기질 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다."고 진술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는 (바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하였으며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호에는 미분화 줄기 세포의 유지 방법이 개시되어 있는데, 상기 방법은 줄기 세포를 원하는 결과를 성취하기에 충분한 양의 시간 동안 미분화 상태로 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타 (transforming growth factor-beta, TGF-β) 패밀리의 단백질류의 구성원, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 패밀리의 단백질류의 구성원 또는 니코틴아미드 (NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적절한 배양 기재는 매트리젤 (Matrigel)(등록상표) (벡턴 디킨슨(Becton Dickenson))이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특성은 시딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
만능 줄기 세포로부터의 췌장 호르몬 생성 세포의 형성
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기세포로부터 췌장 호르몬 생성 세포를 생성하는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 생성 세포이다. 다른 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 전사 인자들 중 적어도 하나 및 Pdx1을 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β-세포이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FoxD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX-17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들은 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 전사 인자들 중 적어도 하나 및 Pdx1을 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이러한 방법의 한 예는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.(LifeScan, Inc.)에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때에 검출된다.
분화 효율은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치(in situ) 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 발현을 포함한다: ABCG2, 크립토, FoxD3, 커넥신43, 커넥신45, Oct4, Sox2, 나노그, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
만능 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 라이프스캔 인크.에 양도된, 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 레틴산 및 적어도 하나의 섬유아세포 성장 인자로 소정 기간 동안 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 추가로, 미국 특허 출원 제60/990,529호에서 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여, 췌장 내배엽 계통의 특징을 나타내는 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내배엽 계통 특이적 마커는 예를 들어, Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6, HNF-1베타와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
분화 효율은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 한 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 한 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이러한 방법의 한 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 라이프스캔 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 노치 시그널링 경로를 억제하는 인자로 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 추가로, 미국 특허 출원 제60/990,529호에서 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 TGF-β 수용체 작용제를 포함하는 배지로 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하는 것을 포함하는, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
TGF-β 수용체 작용제는 TGF-β 수용체에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 일 실시 형태에서, TGF-β 수용체 작용제는 액티빈 A, 액티빈 B, 및 액티빈 C로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, TGF-β 수용체 작용제는 액티빈 A의 펩티드 변이체일 수 있다. 그러한 펩티드 변이체의 예는 센토코 알앤디, 인크.(Centocor R&D, Inc.)에 양도된 미국 특허 출원 일련 번호 제 61/076,889 호에 개시된다.
일 실시 형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 1일 내지 약 5일 동안 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 액티빈 A로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 3일 내지 약 5일 동안 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 액티빈 A로 처리된다. 대안적으로, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 약 5일 동안 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 액티빈 A로 처리된다.
다른 실시 형태에서, TGF-β 수용체 작용제는 GDF-8, GDF 11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 GDF-8, GDF 11 및 GDF-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 TGF-β 수용체 작용제 및 적어도 하나의 기타 인자로 처리된다. 일 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 기타 인자는 환형 아닐린-피리디노트라이아진 화합물이다. 그러한 환형 아닐린-피리디노트라이아진 화합물류의 예는 센토코 알앤디, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시되어 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 기타 인자는 아닐린-피리디노트라이아진 화합물이다. 그러한 아닐린-피리디노트라이아진 화합물류의 예는 센토코 알앤디, 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제61/076,908호에 개시되어 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 적어도 하나의 기타 인자는 센토코 알앤디 인크.에 양도된 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 화합물이다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 후속적으로 농축된다. 농축 단계는 TGF-β 수용체 작용제를 이용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리하기 전에 실시될 수 있다. 대안적으로, 농축 단계는 TGF-β 수용체 작용제를 이용하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 처리한 후에 실시될 수 있다.
일 실시 형태에서, 농축은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 현탁물을 얻고 이 세포 현탁물을 40㎛ 세포 여과기에 통과시킴으로써 성취된다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 검출
췌장 내분비 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 췌장 내분비 계통의 특징을 나타내는 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 췌장 내분비 계통의 특징적인 특성을 획득한 것을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 췌장 내분비 계통 특이적 마커는 예를 들어, NGN-3, NeuroD, Islet-1과 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다.
β 세포 계통의 세포의 특징적인 마커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, β 세포 계통의 특징적인 추가의 마커는 계속 확인되고 있다. 이들 마커는 본 발명에 따라 처리된 세포가 분화하여 β-세포 계통의 특징적인 특성을 획득했는지를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. β 세포 계통 특이적 특징은 예를 들어, 다른 것들 중에서도 Pdx1 (췌장 및 십이지장 호메오박스 유전자-1), Nkx2.2, Nkx6.1, Isl1, Pax6, Pax4, NeuroD, Hnf1b, Hnf-6, Hnf-3베타, 및 MafA와 같은 하나 이상의 전사 인자의 발현을 포함한다. 이들 전사 인자는 내분비 세포의 확인을 위해 당업계에 잘 수립되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002))]을 참조한다.
분화 효율은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제 (예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다. 대안적으로, 분화의 효능은 처리된 세포군을, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인지하는 제제(예컨대, 항체)에 노출시킴으로써 측정될 수 있다.
배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 원위치 혼성화(예컨대, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS) (예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 처리 이후의 주어진 세포 배양물 중 인슐린 양성 세포의 백분율을 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 100% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 90% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 80% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 70% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 60% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 50% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 40% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 30% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 20% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 10% 인슐린 양성 세포를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 주어진 배양물 중 약 5% 인슐린 양성 세포를 생성한다.
본 발명의 일 태양에서, 분화 효율은 세포에 의해 분비된 C-펩티드의 양을 측정함으로써 검출되는 바와 같이, 포도당-자극된 인슐린 분비를 측정함으로써 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 1000 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 900 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 800 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 700 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 600 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 500 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 400 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 300 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 200 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 100 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 90 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 80 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 70 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 60 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 50 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 40 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 30 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 20 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포는 약 10 ng C-펩티드/pg DNA를 생성한다.
치료법
일 태양에서, 본 발명은 제I형 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 만능 줄기 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, β-세포 계통의 세포를 환자에 이식하는 것을 수반한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓고 있거나, 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, β-세포 계통의 세포를 환자에 이식하는 것을 수반한다.
적절하다면, 환자는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 약학 제제 또는 생물활성제로 추가로 처리될 수 있다. 이들 제제는 예를 들어 다른 것들 중에서도 인슐린, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β 패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유래 성장 인자(VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린을 포함할 수 있다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 글루카곤 유사 펩티드-I (GLP-1) 및 II, GLP-1 및 2 미메티바디, 엑센딘-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 수령체 내로 이식하기 전에 인슐린-생성 세포로 분화될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 수여자에게 이식되기 전에, β-세포로 완전히 분화된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미분화 또는 부분 분화 상태로 수령체 내로 이식될 수 있다. 추가 분화는 수령체 내에서 일어날 수 있다.
완성 내배엽 세포 또는, 대안적으로, 췌장 내배엽 세포, 또는, 대안적으로, β 세포는 분산된 세포로서 이식되거나, 또는 간문맥으로 융합될 수 있는 클러스터로 형성될 수 있다. 대안적으로, 세포는 생체적합성 분해성 중합체성 지지체, 다공성 비분해성 장치로 제공되거나 또는 피막화되어 숙주 면역 반응으로부터 보호될 수 있다. 세포는 수령체에서 적절한 부위 내로 이식될 수 있다. 이식 부위는 예를 들어, 간, 천연 췌장, 신장 피막하 공간, 장막, 복막, 장막하 공간, 장, 위, 또는 피하 주머니를 포함한다.
추가 분화, 이식된 세포의 생존 또는 활성을 향상시키기 위하여, 성장 인자, 산화방지제 또는 항염증제와 같은 추가 인자를 세포의 투여 전에, 세포의 투여와 동시에, 또는 세포의 투여 후에 투여할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 성장 인자는 투여된 세포를 생체 내에서 분화시키는 데 이용된다. 이들 인자는 내인성 세포에 의해 분비되고, 투여된 세포에 원위치에서 노출될 수 있다. 이식된 세포는 내부 및 외부 투여된 당업계에 알려진 성장 인자의 임의의 조합에 의해 분화되도록 유도될 수 있다.
이식에 사용되는 세포의 양은 환자의 상태 및 치료에 대한 반응을 포함한 많은 다양한 인자에 좌우되고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 태양에서 본 발명은 당뇨병을 앓고 있거나 상기 당뇨병이 발병될 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 만능 줄기 세포를 배양하고, 배양된 세포를 시험관 내에서 β-세포 계통으로 분화시키고, 세포를 3차원 지지체 내로 혼입하는 것을 수반한다. 세포는 환자 내로 이식되기 전에 이 지지체 상에서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 대안적으로, 세포를 함유한 지지체는 추가의 시험관 내 배양 없이 환자에서 직접 이식될 수 있다. 지지체에는 이식된 세포의 생존과 기능을 촉진하는 적어도 하나의 약학 제제가 선택적으로 혼입될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 사용하기에 적합한 지지체 물질은 조직 복구에 유용한 조직 주형, 도관, 장벽, 및 저장부를 포함한다. 구체적으로, 생물학적 조직을 재구성하거나 재생시키기 위해서뿐만 아니라 조직 성장을 유도하기 위한 주화성 제제를 전달하기 위해 시험관 내 및 생체 내에서 사용된 폼, 스펀지, 젤, 하이드로젤, 직물, 및 부직 구조체 형태의 합성 및 천연 물질이 본 발명의 방법의 실시에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 미국 특허 제5,770,417호, 미국 특허 제6,022,743호, 미국 특허 제5,567,612호, 미국 특허 제5,759,830호, 미국 특허 제6,626,950호, 미국 특허 제6,534,084호, 미국 특허 제6,306,424호, 미국 특허 제6,365,149호, 미국 특허 제6,599,323호, 미국 특허 제6,656,488호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0062753 A1호, 미국 특허 제4,557,264호 및 미국 특허 제6,333,029호에 개시된 물질을 참고한다.
약학 제제가 혼입된 지지체를 형성하기 위하여, 약학 제제는 지지체를 형성하기 전에 중합체 용액과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 약학 제제는 바람직하게는 약학적 담체의 존재 하에서, 제작된 지지체 상에 코팅될 수 있다. 약학 제제는 액체, 미분 고체, 또는 임의의 다른 적절한 물리적 형태로 존재할 수 있다. 대안적으로, 부형제는 약학 제제의 방출 속도를 변경하기 위하여 지지체에 첨가될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 지지체에는 항-염증성 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물, 예컨대, 예를 들어 미국 특허 제6,509,369호에 개시된 화합물이 혼입된다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,793,945호에 개시된 화합물과 같은 항-아폽토시스 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 예를 들어, 미국 특허 제6,331,298호에 개시된 화합물과 같은 섬유증 억제제인 적어도 하나의 약학적 화합물이 또한 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0220393호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호에 개시된 화합물과 같은 혈관신생을 향상시킬 수 있는 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171623호에 개시된 화합물과 같은 면역억제 화합물인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입될 수 있다.
지지체에는 또한, 성장 인자, 예컨대, 다른 것들 중에서도, 예를 들어, TGF-β 패밀리의 구성원(TGF-β1, 2, 및 3 포함), 골 형성 단백질(BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11, -12, 및 -13), 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 혈소판-유도 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부한 혈장, 인슐린 성장 인자 (IGF-I, II) 성장 분화 인자 (GDF-5, -6, -8, -10, -15), 혈관 내피 세포-유도 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀, 엔도텔린인 적어도 하나의 약학적 화합물이 혼입된다. 다른 약학적 화합물은 예를 들어, 니코틴아미드, 저산소증 유도성 인자 1-알파, 글루카곤 유사 펩티드-I(GLP-1), GLP-1 및 GLP-2 미메티바디, 및 II, 엑센딘-4, 노달, 노긴, NGF, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 테나신-C, 트로포엘라스틴, 트롬빈-유래 펩티드, 카텔리시딘, 데펜신, 라미닌, 피브로넥틴 및 비트로넥틴과 같은 부착성 세포외 매트릭스 단백질의 세포- 및 헤파린-결합 도메인을 함유한 생물학적 펩티드, MAPK 억제제, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0209901호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0132729호에 개시된 화합물을 포함할 수 있다.
스캐폴드(scaffold) 내로 본 발명의 세포를 혼입시키는 것은 스캐폴드 상에 세포를 간단히 침적시키는 것에 의해 성취될 수 있다. 세포는 간단한 확산에 의해 스캐폴드 내로 들어갈 수 있다 (문헌[J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)]. 세포 접종의 효율을 향상시키기 위하여 몇몇 다른 접근법이 개발되었다. 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flasks)가 폴리글리콜산 스캐폴드 상에 연골세포를 접종하는 데 사용되었다 (문헌[Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)]). 세포를 접종하기 위한 다른 접근법은 원심분리를 사용하는 것이며, 이것은 접종된 세포에 대해 최소의 스트레스를 생성하며 접종 효율을 향상시킨다. 예를 들어, 양(Yang)등은 세포 접종 방법을 개발하였다(문헌[J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)]).
본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
소 태아 혈청의 부재 하에서의 세포주 H1의 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화
52 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고(1:30 희석) 2% BSA (카탈로그 번호 152401, 엠피 바이오메디칼(MP Biomedical), 미국 오하이오주) 및 100 ng/ml 액티빈-A(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 20 ng/ml WNT-3a(카탈로그 번호 1324-WN-002, 알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에 더하여 8 ng/ml의 bFGF(카탈로그 번호 100-18B, 페프로테크(PeproTech), 미국 뉴저지주)가 보충된 RPMI 배지에 1일간 노출시키고, 이어서 2% BSA 및 100 ng/ml 액티빈-A에 더하여 8 ng/ml의 bFGF가 보충된 RPMI 배지로 추가 2일간 처리하였다. 다음, 배양물을 DMEM/F12 + 2% BSA + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 ㎛ 사이클로파민-KAAD(#239804, 칼바이오캠(Calbiochem), 미국 캘리포니아주)로 2일간 처리하고 이어서 4일간 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 μM 사이클로파민- KAAD + 2 μM 레틴산(RA)(시그마, 미국 미주리주) + 100 ng/ml의 노긴(Noggin)(알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 인큐베이션하였다.
세포를 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml 노긴 + 1 μM DAPT (감마-시크리타아제 억제제) (카탈로그 번호 565784, 칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (카탈로그 번호 616452, 칼바이오켐, 미국 캘리포니아주) + 100 ng/ml의 네트린(Netrin)-4 (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)에서 3일간 인큐베이션하고, 이어서 DMEM/F12 + 1% B27 (인비트로젠, 미국 캘리포니아주) + 1 μM ALK5 억제제 II (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주)에서 추가로 7일간 인큐베이션함으로써 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시켰다. 내분비계 배양물을 더욱 성숙시키기 위해 DMEM/F12 + 1% B27(인비트로젠, 미국 캘리포니아주)에서 7일간 처리하는 것으로 이루어진 최종 시기를 추가하였다. 최종 시기를 제외하고는, 모든 다른 시기들은 매일 배지를 교환해 주는 것을 포함하였다. 이 절차의 개요가 도 1에 도시되어 있다. 각 시기에서 세포 개수를 혈구계(hemocytometer)를 이용해 계산하였고 PCR 분석을 위해 RNA를 수집하였다. 모든 샘플을 삼중으로 수집하였다.
도 2의 패널 a 및 패널 b는 FACS에 의해 측정할 때 세포에서의 CXCR4 발현 및 제1기에 상응하는 3일의 시점에 있어서의 실시간 PCR 데이터를 나타낸다. 발현의 변화 배수는 미분화 H1 ES 세포에 관해 도시된다.
실시예 2
액티빈 A를 제6기 배양물에 첨가하면 췌장 내분비 마커의 발현이 유의하게 향상됨
43 계대에서 인간 배아 줄기 세포주 H1 세포를 매트리젤™ 코팅된 디쉬 상에서 배양하고 (1:30 희석), 실시예 1에 설명한 방법에 따라 췌장 내분비 세포로 분화시켰다. 제6기에서, 배양물 중 일부를 10 ng/ml의 액티빈 A (알앤디 시스템즈, 미국 미네소타주)로 7일간 처리하였다. 7일에 세포를 실온에서 5분간 1X 아쿠타아제(Accutase) (시그마, 미국 미주리주)로 처리하고, 이어서 아쿠타아제를 제거하고 DMEM/12 + 1% B27을 첨가하였다. 부착된 세포를 세포 스크레이퍼를 이용하여 제거하고, 부드럽게 재현탁시키고, 40 ㎛ 세포 여과기에 통과시켰다. 관통물(flow through) 및 상기 여과기 상에 보유된 세포를 옮기고, PCR 및 디티존에 대한 염색을 위하여 샘플을 수집하였다. 디티존(DTZ)은 췌도 내에 존재하는 것으로 밝혀진 아연에 선택적으로 결합하는 염료이다. 도 3의 패널 a 내지 패널 c는 40 ㎛ 세포 여과기를 이용하여 분리하기 이전 및 이후의 DTZ 염색된 배양물을 나타낸다. 40 ㎛보다 큰 클러스터의 상당한 (대략 80%) 부분이 DTZ에 대하여 양성으로 염색되었다. 이는 내분비계 풍부 클러스터의 신속하고 간단한 농축 방법을 제공한다. 도 4의 패널 a 내지 패널 f는 제6기에서 +/- 10 ng/ml의 액티빈 A로 처리하고 후속적으로 40 ㎛ 필터를 이용하여 농축시킨 세포의 유전자 발현 프로파일을 보여준다. 제6기의 것에 액티빈 A를 첨가하는 것은 모든 주요 췌장 내분비 마커의 발현을 유의하게 장려하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시 형태를 참조로 하여 상기 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해서가 아니라 특허법의 원리 하에 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 정의되는 것으로 이해될 것이다.

Claims (15)

  1. 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키기에 충분한 양의 TGF-β 수용체 작용제를 포함하는 배지로 인간 췌장 내분비 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    TGF-β 수용체 작용제는 액티빈(activin) A, 액티빈 B, 액티빈 C, GDF-8, GDF-11, GDF-15 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그리고
    췌장 내분비 계통과 관련된 마커는 NKX2.2, NKX6.1, PAX4 및 PDX-1로부터 선택되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커를 발현하는 세포를 농축시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 췌장 내분비 세포의 현탁물을 얻고 그리고 세포의 현탁물을 여과기에 통과시켜 분리하는 것에 의해 세포가 농축되며, 췌장 내분비 계통과 관련된 마커의 발현이 증가된 췌장 내분비 세포가 여과기에 의해 남겨지는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PDX-1, NKX6.1, 및 PAX4의 발현을 증가시키는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, NKX2.2의 발현을 또한 증가시키는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 췌장 내분비 세포는 인간 췌장 호르몬 발현 또는 인간 췌장 호르몬 분비 세포인 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 인슐린 또는 글루카곤의 발현을 또한 증가시키는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 췌장 내분비 세포는 분화된 인간 만능 줄기 세포로부터 유래하는 것인, 방법.
  9. 충분한 양의 액티빈(activin) A 를 포함하는 배지로 췌장 내분비 세포 집단을 처리하는 단계를 포함하는, 분화된 인간 배아 만능 줄기 세포로부터 유래한 췌장 내분비 세포 집단에서 췌장 내분비 세포와 관련된 마커의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    췌장 내분비 세포와 관련된 마커는 NKX2.2, NKX6.1, PAX4 및 PDX-1로부터 선택되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, PDX-1, NKX6.1, 및 PAX4의 발현을 증가시키는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, NKX2.2의 발현을 또한 증가시키는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 또는 췌장 호르몬 분비 세포인 것인, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 인슐린 또는 글루카곤의 발현을 또한 증가시키는, 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장 내분비 세포를 농축시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 췌장 내분비 세포의 현탁물을 얻고 그리고 세포의 현탁물을 여과기에 통과시켜 분리하는 것에 의해 세포가 농축되며, 췌장 내분비 세포와 관련된 마커의 발현이 증가된 췌장 내분비 세포가 여과기에 의해 남겨지는 것인, 방법.
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