CN111117951A - 通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用 - Google Patents

通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用，涉及细胞分化技术领域。通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法包括：外源性激活CK2信号通路以促进hPSC分化为心外膜细胞，并抑制hPSC向心肌细胞的分化；外源性抑制IGF/胰岛素下游通路以促进hPSC分化为心肌细胞，并抑制hPSC向心外膜细胞的分化，该方法通过干扰胰岛素/IGF介导的CK2通路影响心外膜以及心肌细胞的分化效率。通过影响IGF/胰岛素通路的方法改变多能干细胞向心肌或心外膜方向分化的应用具体包括：激活CK2信号通路的物质或抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在促进hPSC分化为心外膜细胞或心肌细胞中的应用。

Description

通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞分化技术领域，且特别涉及一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用。
背景技术
人体多能干细胞(human pluripotential stem cells，hPSC)具有向人体所有体细胞分化的潜能，而最终的分化命运往往受到各种特定生长因子的影响。hPSC可用于体外研究多种信号通路的相互作用对细胞最终命运的影响，这对开发相关药物具有重要的指导作用。
相关研究表明，胰岛素(Insulin)和类胰岛素增长因子(insulin-like growthfactors，IGF)对于hPSC的维持至关重要，并且它们还是所有的干细胞培养基必不可少的成分。在没有胰岛素的情况下，细胞的存活或增殖均会受到巨大影响。在细胞多能性的维持上，胰岛素和IGF通过激活PI3K/AKT通路从而活化mTOR，通过与MAPK/ERK的相互作用影响β-catenin依赖性基因的表达，从而辅助多能性的维持。在细胞分化过程中，胰岛素/IGFs激活PI3K也是神经分化方向所需要的，当PI3K被抑制后，会导致内胚层和中胚层方向的分化，PI3K抑制剂，如LY294002和wortmannin均常用于调节信号通路以达到特定方向分化的目的。除了PI3K通路之外，CK2也是胰岛素/IGFs信号通路下游之一，CK2在AKT通路的调节上也有至关重要的作用，然而CK2在hPSC分化中的作用并未被提及。
另外，在没有外源性药物干扰的情况下，部分hPSC诱导的中胚层细胞可自发性分化为心肌细胞，因此通过不同细胞因子和小分子化合物对细胞内信号通路的干扰可以显著性提高心肌细胞的最终产量。当前主流手段均是通过干扰Wnt/β-catenin通路诱导心肌细胞的产生：在前期激活Wnt/β-catenin通路可以诱导中胚层的发生，其后抑制即可促进心肌细胞的生成。但是相反地，在中胚层形成后，适当的Wnt/β-catenin信号是诱导心外膜形成所必备的，以往的研究表明，分化培养基中添加胰岛素可以通过提高GSK3β的磷酸化而激活Wnt/β-catenin通路，从而抑制中胚层向心肌的分化，而该心肌抑制效果在外源性添加Wnt抑制剂时无效。
因此，需要一种能稳定促进hPSC分化为心肌细胞分化或促进心外膜细胞分化的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，该方法通过干扰胰岛素/IGF介导的CK2通路影响心外膜以及心肌细胞的分化效率。
本发明的目的在于提供一种通过影响IGF/胰岛素通路的方法改变多能干细胞向心肌或心外膜方向分化的应用具体包括：激活CK2信号通路的物质或抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞或心肌细胞的药物中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，外源性激活CK2信号通路以促进hPSC分化为心外膜细胞，并抑制hPSC向心肌细胞的分化；外源性抑制IGF/胰岛素下游通路以促进hPSC分化为心肌细胞，并抑制hPSC向心外膜细胞的分化。
进一步地，在本发明较佳实施例中，激活CK2信号通路的方法包括：通过激活胰岛素受体或IGF受体。
进一步地，在本发明较佳实施例中，激活胰岛素受体或IGF受体的方法是：使用胰岛素、IGF家族生长因子，或者其他通过激活胰岛素受体或IGF受体激活CK2信号通路的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
进一步地，在本发明较佳实施例中，IGF/胰岛素下游通路包括PI3K信号通路和CK2信号通路；抑制IGF/胰岛素下游通路的方法包括：抑制PI3K信号通路，或者抑制CK2信号通路。
进一步地，在本发明较佳实施例中，抑制PI3K信号通路的方法是：使用Wortmannin、PI103、BEZ235、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
进一步地，在本发明较佳实施例中，抑制CK2信号通路的方法是：使用CX4945、PI103、Apigenin、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
进一步地，在本发明较佳实施例中，抑制CK2信号通路的方法包括：通过阻断胰岛素、阻断IGF受体、阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法。
进一步地，在本发明较佳实施例中，阻断胰岛素受体的方法是：使用可结合游离胰岛素的天然或人工修饰产品，可拮抗胰岛素受体的天然或人工修饰产品；阻断IGF受体的方法是：使用可结合游离IGF的天然或人工修饰产品，可拮抗IGF受体的天然或人工修饰产品；阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法是：在hPSC分化过程中加入有效剂量的CK2抑制剂。
激活CK2信号通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞的药物中的应用。
抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在制备促进hPSC分化为心肌细胞的药物中的应用。
本发明实施例的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用的有益效果是：本发明实施例的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法包括：外源性激活CK2信号通路以促进hPSC分化为心外膜细胞，并抑制hPSC向心肌细胞的分化；外源性抑制IGF/胰岛素下游通路以促进hPSC分化为心肌细胞，并抑制hPSC向心外膜细胞的分化，该方法通过干扰胰岛素/IGF介导的CK2通路影响心外膜以及心肌细胞的分化效率。本发明实施例的通过影响IGF/胰岛素通路的方法改变多能干细胞向心肌或心外膜方向分化的应用具体包括：激活CK2信号通路的物质或抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞或心肌细胞的药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为在中胚层自发性分化中细胞的免疫荧光图，Hoechst标志细胞核，CTNT标志心肌细胞，WT1标志心外膜细胞；
图2为不同浓度下胰岛素对心外膜细胞的诱导流式细胞图，WT1标志心外膜细胞；
图3为IGF抗体和LY294002对心肌细胞的诱导流式细胞图，CTNT标志心肌细胞，WT1标志心外膜细胞；
图4为LY294002处理下心肌细胞基因NKX2.5和TNNT2的表达结果图；
图5为LY294002处理下的免疫荧光图，Hoechst标志细胞核，NKX2.5和TNNT2标志心肌细胞；
图6为LY294002诱导心肌细胞的结构图；
图7为IGF抗体抑制CK2蛋白水平的结果图；
图8为LY294002，PI103抑制CK2蛋白水平的结果图，Wortmannin，BEZ235为不对CK2产生影响的PI3K抑制剂，PI103为PI3K抑制剂同时可抑制CK2；
图9为PI103处理下心肌细胞标志物NKX2.5和CTNT，MEF2C的表达结果图；
图10为CK2抑制剂CX4945处理下心肌细胞标志物NKX2.5和CTNT，MEF2C的表达结果图；
图11为CK2抑制剂Apigenin处理下心肌细胞标志物NKX2.5和CTNT，MEF2C的表达结果图；
图12为CK2抑制剂Apigenin处理下的流式细胞图，CTNT标志心肌细胞；
图13为在使用WNT抑制剂诱导心肌细胞分化过程中加入LY294002、Wortmannin、CX4945对代谢相关基因OXCT1、ECH1、NDUFB10、IDH3G的表达结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法及应用进行具体说明。
本发明实施例提供一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，外源性增加IGF/胰岛素通路强度，主要通过激活CK2信号通路以促进hPSC分化为心外膜细胞，并抑制hPSC向心肌细胞的分化；外源性抑制IGF/胰岛素下游通路，主要通过抑制PI3K信号通路或CK2信号通路以促进hPSC分化为心肌细胞，并抑制hPSC向心外膜细胞的分化。
本实施例中，增加IGF/胰岛素通路强度的具体方法包括：通过激活胰岛素受体或IGF受体，以激活CK2信号通路。
优选的，激活胰岛素受体或IGF受体的方法是：使用胰岛素、IGF家族生长因子，或者其他通过激活胰岛素受体和IGF受体激活CK2信号通路的生物制品、化学合成物质或天然提取物质，通常使用胰岛素，胰岛素的浓度为100ng/mL-1μg/mL。
优选的，外源性添加胰岛素能促进中胚层向心外膜发展并抑制心肌分化。
为了解中胚层细胞自发性分化趋势，并对其内源性信号通路展开研究，本申请使用GSK3β抑制剂CHIR99021打开Wnt/β-catenin通路诱导hPSCs向中胚层分化，并观察下游自发性的分化趋势。发现中胚层的自发性分化过程中，心肌、内皮细胞、心外膜和平滑肌的基因表达均呈现出时间依赖性变化，骨骼肌变化不明显。通过免疫荧光成像分析和流式细胞术检测心肌标志物CTNT和心外膜标志物WT1，本申请发现中胚层具有自发分化为心肌细胞和心外膜细胞的潜能。
本申请在分化***中检测了加入胰岛素是否可以达到心肌抑制效果，发现在分化头两天加入胰岛素(Stage 1)可以显著性降低心肌特征性基因NKX2.5和TNNT2的表达，在IGF1的处理中结果亦然。然而，在中胚层向心肌分化过程中添加胰岛素(Stage 2)并未对心肌分化产生显著性影响。在心外膜方向的检测中，本申请发现Stage 1胰岛素处理过的细胞心外膜的趋向性增强，胰岛素在Stage 1的处理未对IWP2的心肌诱导造成显著性影响。
本实施例中，当使用胰岛素/IGF下游通路抑制剂抑制IGF/胰岛素下游通路时，可改变心肌细胞的代谢功能，以及成熟度。可改变心肌细胞代谢功能的抑制IGF/胰岛素下游通路包括PI3K信号通路和CK2信号通路，相应的，抑制IGF/胰岛素下游通路的方法包括：抑制PI3K信号通路，或者抑制CK2信号通路；胰岛素/IGF下游通路抑制剂包括可抑制PI3K信号通路的物质、可抑制CK2信号通路的物质。
其中，抑制PI3K信号通路的方法是：使用可抑制PI3K信号通路的物质，包括Wortmannin、PI103、BEZ235、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
其中，抑制CK2信号通路的方法是：使用可抑制CK2信号通路的物质，包括CX4945、PI103、Apigenin、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
抑制CK2信号通路的方法的具体方法包括：通过阻断胰岛素、阻断IGF受体、阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法，以抑制CK2信号通路，对应使用可抑制CK2信号通路的化学物质及生物制品。
通常情况下，阻断胰岛素受体的方法是：使用可结合游离胰岛素的天然或人工修饰产品，可拮抗胰岛素受体的天然或人工修饰产品等生物制品，优选使用胰岛素抗体、胰岛素受体的阻断抗体。
通常情况下，阻断IGF受体的方法是：使用可结合游离IGF的天然或人工修饰产品，可拮抗IGF受体的天然或人工修饰产品等生物制品，优选使用IGF抗体，IGF受体的阻断抗体。
通常情况下优选的，阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法是：将hPSC与有效剂量的CK2抑制剂接触。CK2抑制剂包括：LY294002、PI103、CX4945、Apigenin、芹菜素及其他可抑制CK2活性的化学合成物质和天然提取物质，优选为LY294002、Apigenin。
优选的，抑制内源性IGFs下游能促进中胚层向心肌方向分化。
因为胰岛素在Stage 1表现出的作用远大于Stage 2，本申请重新审阅了micro-array中关于IGF相关基因在自发性分化中随时间的变化，其结果通过qPCR重新验证。结果表明，无论是IGF1还是IGF2均呈现出随分化进展的高表达。
本申请对前5天细胞内存在的IGF蛋白水平进行WB检测，其亦显示出随发展过程逐渐升高的趋势。此外，部分***结合蛋白(Insulin-like growth factorbinding protein，IGFBP)也表现出逐渐升高的趋势，这对于IGF的细胞外稳定具有重要作用。当在分化第二天加入IGF抗体后，AKT的磷酸化显示出被抑制，这也表明内源性IGF的分泌对细胞内在信号通路产生了影响。
为了阻断内源性IGF的影响，本申请在Stage 2使用经典的PI3K抑制剂LY294002处理发现其显著性促进了心肌方向分化，同时心外膜分化方向被抑制。为了验证LY294002诱导心肌分化的可行性，本申请对两组胚胎干细胞(H1和H9)以及一组诱导多能干细胞(NL-4)进行实验，结果均显示LY294002对心肌细胞的分化具有促进作用。之后，本申请对整个分化过程进行基因表达的分析。结果显示，介导心肌与造血的前期标志物PDGFRα、KDR、TAL1并未受到显著性影响。HHEX前期标志内胚层的分化，后期标志造血祖细胞，受LY294002影响，显示出先升后降的趋势。心肌分化标志物NKX2.5、TNNT2、MEF2C在LY294002处理下均显示持续性升高。心内膜标志物PECAM和心外膜标志物WT1以及TBX18在LY294002处理下均显示被抑制。平滑肌标志物CNN1和ACTA2显示出一定升高趋势。在第10天对LY294002诱导的心肌细胞进行传代，并继续培养20天后可观察到有组织的辅肌动蛋白(ACTN)和肌钙蛋白(CTNT)的结构。
本申请发现，LY294002阻断内源性IGF的下游促进心肌分化主要是通过CK2途径。
已知中胚层向心肌方向分化高度依赖于低活性的Wnt/β-catenin信号通路。本申请检查了外源性添加胰岛素或LY294002 24h后的非磷酸化β-catenin(活化β-catenin)的表达，结果表明胰岛素并未显示出增强作用，而LY294002可显著性抑制非磷酸化β-catenin的量，其作用与Wnt抑制剂IWP2相仿。同理，本申请提取了总核蛋白并对其中β-catenin的含量进行分析，结果与上述一致。
为了确认β-catenin通路的改变是否是由于PI3K通路的活化引起，本申请使用多种PI3K抑制剂(Wortmannin、PI103、BEZ235)，并包含浓度梯度(10nM、100nM、1μM)，尝试性诱导心肌分化。然而，在非致死浓度下，只有PI103可以达到与LY294002相似效果，而Wortmannin和BEZ235则不具备诱导心肌分化的能力。为了寻找LY294002和PI103之间存在的有其他PI3K抑制剂所不具有的共性，本申请注意到CK2，这也是在以往的研究中广泛报道的与Wnt/β-catenin通路调控相关的靶点之一。进一步研究表明，当使用IGF抗体阻断内源性IGF的作用时，CK2α的蛋白水平也会随之下调。同理，在四种PI3K抑制剂中，仅有LY294002和PI103显示出对CK2α的抑制而非另外两种PI3K的抑制剂。本申请加入了另外一种CK2抑制剂Apigenin，其显示出良好Dvl抑制，并显著性诱导心肌细胞的分化。
基于上述IGF/胰岛素通路对心肌或心外膜分化的影响，可寻找活化或抑制该通路的化学物质或生物制品，用于促进心肌细胞或心外膜细胞的分化，具体应用包括：激活CK2信号通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞的药物中的应用，其中的激活CK2信号通路的物质包括胰岛素、IGF家族生长因子，及其他可激活胰岛素受体和IGF受体的化学合成物质及天然提取物质。
抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在制备促进hPSC分化为心肌细胞的药物中的应用，其中，抑制IGF/胰岛素下游通路的物质包括LY294002、PI103、Apigenin、CX4945及其他可抑制CK2活性的化学合成物质和天然提取物质；还包括可结合游离IGF和胰岛素的天然或人工修饰产品，可拮抗胰岛素受体和IGF受体的天然或人工修饰产品等生物制品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例目的是研究外源性适度增加IGF/胰岛素通路强度对心外膜细胞分化的影响，研究过程和结果如下：
已知IGF和胰岛素的下游通路相同，均通过胰岛素受体或IGF受体发挥作用。在分化培养基中加入适量胰岛素，采用流式细胞术检测胰岛素对心外膜细胞的诱导作用，图1为在中胚层自发性分化中细胞的免疫荧光图，图2为不同浓度下胰岛素对心外膜细胞的诱导结果图，胰岛素的浓度为100ng/mL-10μg/mL，WT1为心外膜标志物。
由图1可以看出，多能干细胞向中胚层分化后，细胞命运大幅度自发性走向心肌细胞和心外膜细胞。由图2可以看出，当胰岛素处于中低浓度(100ng/mL-1μg/mL)时，胰岛素可以适当诱导心外膜细胞分化；而当胰岛素浓度继续增高(1ng/mL-10μg/mL)，反而会抑制心外膜细胞分化。由此可知，一定浓度胰岛素刺激可以增加IGF/胰岛素通路强度，从而促进心外膜细胞分化。
实施例2
本实施例目的是研究外源性抑制IGF/胰岛素下游通路对心肌细胞分化的影响，研究过程和结果如下：
A、采用流式细胞术检测IGF抗体和LY294002对心肌细胞的诱导作用，图3为IGF抗体和LY294002对心肌细胞的诱导结果图，CTNT标志心肌细胞，WT1标志心外膜。
B、采用qPCR检测LY294002处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2的表达，图4为LY294002处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2的表达结果图。
C、采用免疫荧光染色检测LY294002处理下心肌细胞标志物NKX2.5和CTNT的表达，图5为LY294002处理下心肌细胞标志物NKX2.5和CTNT的表达结果图。
D、采用免疫荧光染色检测LY294002诱导心肌细胞的结构，图6为LY294002诱导心肌细胞的结构图，ACTN和CTNT为α辅肌动蛋白和心肌钙蛋白T。
由图3-图6可以看出，当使用IGF抗体去结合游离分泌的IGF时，会对心肌细胞分化具有一定诱导作用；而进一步使用较为强效的下游抑制剂LY294002时，可观察到显著的心肌细胞分化效果(图2)。同时，可以观察到心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2的显著性提高(图3)；也可以在LY294002处理的细胞中检测到NKX2.5和CTNT双阳性的细胞(图4)。当对LY294002诱导的心肌细胞传代并继续培养20天后，可以观察到明显的心肌结构(图5)。CK2抑制剂Apigenin亦可诱导心肌细胞分化(图6)。结合IGF/胰岛素/LY294002介导心外膜/心肌细胞分化通过CK2(见全文)，由此可知，通过生物制剂或化学制剂抑制IGF/胰岛素下游通路时，可以促进心肌细胞分化。
实施例3
本实施例目的是研究不同抑制CK2信号通路的化学物质及生物制品对心肌细胞分化的影响，研究过程和结果如下：
由图7可以看出，通过抑制IGF后，CK2α的水平也随之下降，表明了内源性IGF在细胞通路调控中的作用。而外源性加入可抑制IGF/胰岛素通路下游的化学物质结果表明，仅有LY294002和PI103两种可导致CK2α的抑制(图8)。进一步研究表明，PI103可诱导心肌分化(图9)。CK2抑制剂CX4945和Apigenin也可以诱导心肌分化(图10-12)。
A、图7为蛋白质免疫印迹检测IGF抗体处理后CK2α的蛋白水平，GAPDH为内参。
B、图8为蛋白质免疫印迹检测PI3K抑制剂处理后CK2α的蛋白水平，GAPDH为内参。
C、采用qPCR检测PI103处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达，图9为PI103处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达结果图。
D、采用qPCR检测CX4945处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达，图10为CX4945处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达结果图。
E、采用qPCR检测Apigenin处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达，图11为Apigenin处理下心肌细胞标志物NKX2.5和TNNT2，MEF2C的表达结果图。
F、采用流式细胞术检测Apigenin处理下心肌细胞标志物CTNT的表达，图12为Apigenin处理下心肌细胞标志物CTNT的流式结果图。
实施例4
本实施例的目的是研究抑制胰岛素/IGF下游信号通路在于经典的使用WNT抑制剂联合使用时是否会造成心肌细胞的差异性。由图3可以看出，当使用LY294002抑制胰岛素/IGF下游PI3K和CK2信号通路时，可以看到代谢相关基因OXCT1，ECH1，NDUFB10，IDH3G表达的增高。而通过Wortmannin单独抑制PI3K通路或CX4945单独抑制CK2通路时均能达到类似效果(图13)。
G、采用qPCR检测在使用WNT抑制剂诱导心肌细胞分化过程中加入LY294002、Wortmannin、CX4945对代谢相关基因OXCT1、ECH1、NDUFB10、IDH3G的表达，图13为在使用WNT抑制剂诱导心肌细胞分化过程中加入LY294002、Wortmannin、CX4945对代谢相关基因OXCT1、ECH1、NDUFB10、IDH3G的表达结果图。
CK2是IGF/胰岛素下游通路中的一个靶点。当使用IGF抗体结合游离内源性IGF时，CK2可被抑制(图7)。而胰岛素和IGF广泛报道于PI3K通路的活化。因此使用PI3K通路抑制剂Wortmannin、PI103、BEZ235，仅有PI103于LY294002一致表现出CK2的抑制作用(图8)。并且PI103可诱导心肌标志物NKX2.5、TNNT2、MEF2C的升高(图9)。本实施例继续拓展至其他CK2抑制剂表现为，CK2抑制剂CX4945可诱导心肌标志物NKX2.5，TNNT2，MEF2C的升高(图10)。CK2抑制剂Apigenin可诱导心肌标志物NKX2.5，TNNT2，MEF2C的升高(图11)。在Apigenin的处理下可显著提高CTNT阳性心肌细胞的产率(图12)。进一步研究表明，LY294002可改变由WNT抑制剂诱导的心肌细胞的代谢特征，可观察到代谢相关基因OXCT1、ECH1、NDUFB10、IDH3G的表达升高。而使用Wortmannin阻断胰岛素/IGF下游PI3K通路，或使用CX4945阻断胰岛素/IGF下游CK2通路均能达到类似效果(图13)。
综上所述，本发明实施例的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法通过干扰胰岛素/IGF介导的CK2通路影响心外膜以及心肌细胞的分化效率；本发明实施例的通过影响IGF/胰岛素通路的方法改变多能干细胞向心肌或心外膜方向分化的应用具体包括：激活CK2信号通路的物质或抑制CK2信号通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞或心肌细胞的药物中的应用。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，外源性激活CK2信号通路以促进hPSC分化为心外膜细胞，并抑制hPSC向心肌细胞的分化；外源性抑制IGF/胰岛素下游通路以促进hPSC分化为心肌细胞，并抑制hPSC向心外膜细胞的分化。
2.根据权利要求1所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，所述激活CK2信号通路的方法包括：通过激活胰岛素受体或IGF受体。
3.根据权利要求2所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，激活胰岛素受体或IGF受体的方法是：使用胰岛素、IGF家族生长因子，或者其他通过激活胰岛素受体或IGF受体激活CK2信号通路的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
4.根据权利要求1所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，IGF/胰岛素下游通路包括PI3K信号通路和CK2信号通路；所述抑制IGF/胰岛素下游通路的方法包括：抑制PI3K信号通路，或者抑制CK2信号通路。
5.根据权利要求4所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，抑制PI3K信号通路的方法是：使用Wortmannin、PI103、BEZ235、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
6.根据权利要求4所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，抑制CK2信号通路的方法是：使用CX4945、PI103、Apigenin、LY294002，或者其他具有类似性能的生物制品、化学合成物质或天然提取物质。
7.根据权利要求4所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，抑制CK2信号通路的方法包括：通过阻断胰岛素、阻断IGF受体、阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法。
8.根据权利要求7所述的通过IGF/胰岛素通路调节hPSC分化方向的方法，其特征在于，阻断胰岛素受体的方法是：使用可结合游离胰岛素的天然或人工修饰产品，可拮抗胰岛素受体的天然或人工修饰产品；阻断IGF受体的方法是：使用可结合游离IGF的天然或人工修饰产品，可拮抗IGF受体的天然或人工修饰产品；阻断CK2以及其他类似可抑制Dvl和pGSK3β水平的方法是：在hPSC分化过程中加入有效剂量的CK2抑制剂。
9.激活CK2信号通路的物质在制备促进hPSC分化为心外膜细胞的药物中的应用。
10.抑制IGF/胰岛素下游通路的物质在制备促进hPSC分化为心肌细胞的药物中的应用。
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