CN103130816A - 一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，属于化学物质或药品的制造方法，本发明采用强极性或极性大孔吸附树脂分离，解决现有制备银杏提取物银杏酸偏高的问题，并解决现有提取及制备银杏活性物质耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题。并能同时得到银杏多糖、银杏提取物、银杏总黄酮、银杏总内酯、银杏内酯A、B、C单体等多种活性物质。项目技术包括原料前处理步骤、提取步骤、多糖沉淀步骤、大孔树脂分离步骤、硅胶干柱分离步骤、反相层析精制步骤和结晶步骤等，节省了生产成本，提高了生产效率，且工艺简便并易于放大到工业化生产，同时能大大提高原料利用率。
Description
技术领域
本发明属于化学物质或药品的制造方法，具体涉及以银杏叶为原料，经过提取分离纯化，得到多种活性物质的方法。
背景技术
2亿年前银杏科植物广泛存在于亚、非、欧、南美洲和澳洲。几乎遍布于整个地球表面。由于第三纪和第四纪时期地球发生巨变，大部分银杏科植物灭绝，仅有银杏一种幸存，因而被称为“活化石”植物。银杏是我国特有的珍贵树种，尤其长江以南和台湾省，占世界银杏资源总量的70％以上。随着银杏叶中有效成分的药用、保健等综合价值的挖掘和开发，对银杏叶的***研究在世界范围内掀起了高潮，其银杏叶化学成分的药用机制和临床运用成为研究的热点。
中国很早就意识到了银杏的药用价值，明代李时珍在《本草纲目》中提到，银杏“人肺经，益肺气，定喘咳，缩小便”。20世纪60年代，德国科学家发现银杏黄酮能防治心脑血管疾病和降血脂。20世纪70年代，德国医学媒体报道，银杏叶提取物能增加中枢和外周血管血流量，可用于心、脑及外周血管缺血性疾病。20世纪80年代，法国科学家Brapuat发现了银杏叶的内酯成分有很强的拮抗血小板活化因子(PAF)的作用，随后银杏叶制剂作为第一个进入临床的PAF拮抗剂进行了三期临床观察，银杏叶制剂的研究和开发进入了一个新的领域。1991年，美国哈佛大学的学者因发现银杏内酯B的分子结构而荣获诺贝尔奖。至今在世界上同一种研究中，唯有银杏两次获诺贝尔奖。随后，银杏叶提取物的用途得到更深入、广泛的研究，如用来治疗慢性肾功能衰竭、冠心病、突发性耳聋、胃黏膜损伤、精神***症、阿尔茨海默症、脑血栓等病症，并可抗肿瘤。更进一步的研究也表明，银杏内酯B在临床上用于中风、器官移植排斥反应、休克等的治疗和血液透析，其效果明显优于银杏内酯混合物，于是国际市场又出现了银杏叶的纯化提取物B。
银杏叶中有效成分的制备工艺主要有以下类型：1、水蒸汽蒸馏法：将银杏叶干燥、粉碎后，100～120℃水蒸馏，蒸馏液冷却后，用非极性大孔树脂吸附、浓缩，然后用乙醇洗脱，蒸干即得到粉状结晶。该方法提取率很低；2、有机溶液萃取法：其提取工艺的专利也较多，可归纳为两种形式：一种是制备银杏叶粗提物，这类方法是把银杏叶干燥、粉碎后用有机溶剂(例如乙醇或丙酮、石油醚等)浸泡、萃取、过滤，滤液中的溶剂用减压蒸馏除去后，得银杏浸膏。这种方法的制备简单，产品的收率高(约12％～14％)，但产品中杂质含量较高，通常呈棕黑色。另一种是制备银杏叶精提物，这种方法通常在粗提物制备基础上，进一步精制，常用的精制方法有：液-液萃取(例如用二氯甲烷、氯仿或苯脱脂)，沉淀法(NH4OH或PbAc等沉淀剂)以及硅藻土或硅胶吸附法。再通过干燥、过滤、减压浓缩除去溶剂后，即可得到精提物。一般为黄褐色粉末，收率为1～3％，该类方法耗费大量有机试剂，且得到的产品纯度不高；3、超临界流体萃取法：近十年来，用该技术提取天然植物中的药用有效成分也越来越广泛。它和上述的提取工艺相比较，具有提取率高，无溶剂残留毒性、天然植物中活性成分和热不稳定性成分不易被分解破坏而保持其天然特征等优点，但是随着超临界流体萃取法的深入研究，该技术的不足在于不能得到需要分离的单组分纯品，对于银杏内酯A、B、C只是粗分离。
目前，还有许多关于采用柱分离提取、纯化、制备银杏提取物的方法，但这些方法基本上都耗大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低。
发明内容
本发明提供一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，采用强极性或极性大孔吸附树脂分离，解决现有制备银杏提取物银杏酸偏高的问题，并解决现有提取及制备银杏活性物质耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题。并能同时得到银杏多糖、银杏提取物、银杏总黄酮、银杏总内酯、银杏内酯A、B、C单体等多种活性物质。
本发明的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，包括：
(1)原料前处理步骤；银杏叶干品原料粉碎后，加入含有纤维素酶及果胶酶的水溶液进行破壁反应，烘干得到提取原料；
(2)提取步骤；在步骤(1)得到的提取原料，50～80％乙醇提取，60～90℃下提取，料液比1∶8～1∶20，提取2～4次，合并后得到提取液；
(3)多糖沉淀步骤；沉淀分离步骤；将步骤(3)中得到的提取液浓缩后，加入絮凝剂进行沉淀反应，过滤得到沉淀物银杏多糖；过滤得到的上清液为沉淀分离液；
(4)大孔树脂分离步骤；将步骤(3)中得到的沉淀分离液，经过极性或强极性大孔树脂分离，得到银杏提取物；
(5)硅胶干柱分离步骤；将步骤(4)中得到的银杏提取物湿法上样于硅胶干柱上，银杏提取物与硅胶的质量比为1/50～1/100，在常压下利用压力差以展开剂下行展开，分别获得银杏总黄酮与银杏总内酯；展开剂为甲醇与正己烷的混合液；
(6)反相层析精制步骤；对步骤(5)中得到的银杏总内酯，以C18填料为固定相，以甲醇与水的混合液为流动相，进行中低压反相层析，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分；
(7)结晶步骤；分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为60％～80％的甲醇水溶液，40℃～60℃下充分溶解后，趁热过滤后，冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述原料前处理步骤中，所述纤维素酶及果胶酶的水溶液为：水溶液的体积与原料的质量比为0.5～2∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为0.5～3∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为0.5～2∶1000(质量比)；所述破壁反应为：反应温度30～60℃，反应时间1～3小时。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述多糖沉淀步骤中，所述提取液浓缩为：将提取液浓缩至与银杏叶干品原料的体积质量比为2～5∶1(L/kg)；所述絮凝剂剂为：壳聚糖、聚苯烯酰胺、聚苯烯酸钠、聚苯烯酸钙中的一种；所述加入絮凝剂进行沉淀反应，过滤得到沉淀物金银花多糖，其过程为：在浓缩液中加入絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为0.05～2∶100(kg/L)，搅拌10～30min后，常温静置6～12小时，过滤得到沉淀物干燥后得到金银花多糖。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述大孔树脂分离步骤中，所述极性或强极性大孔树脂为：ADS-2、ADS-7、HPD-826、HPD-600中的一种；所述经过极性或强极性大孔树脂分离，其过程为：将沉淀分离液上样到大孔树脂上，用纯水或5％～15％的乙醇水溶液洗脱2～4柱体积，弃去洗脱液，再用40％～60％的乙醇水溶液洗脱2～4柱体积，收集洗脱液，干燥得到银杏提取物。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述硅胶干柱分离步骤中，所述硅胶干柱为：填装有硅胶基填料、高径比5∶1～20∶1的装置，硅胶基填料由硅胶和硅藻土组成，硅藻土与硅胶的质量百分比为10％～20％；硅胶粒径为30μm～80μm，硅胶活性为II～III级；
所述硅胶干柱的填装过程为：将硅胶基填料与等体积的有机溶剂混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填装到所需要高度；所述有机溶剂为正己烷、石油醚、正戊烷中的一种。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述硅胶干柱分离步骤中，所述展开剂的体积比为：甲醇∶正己烷＝90∶10～98∶2；所述下行展开的过程为：将展开剂从硅胶干柱顶加入，在常压下利用压力差下行展开，当展开剂流至硅胶干柱底部时，停止加入展开剂；分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，用三氯甲烷振荡洗脱10～20分钟，重复洗脱2～3次，将所获的三氯甲烷溶液减压蒸干，分别得到的固形物即为银杏总黄酮和银杏总内酯；所述富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段是参照相同展开剂条件下硅胶薄层实验得到的两者的比移值Rf确定。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述反相层析精制步骤中：固定相为C18填料，粒径为20～50μm，填装成高径比为20∶1～60∶1的层析柱；所述流动相中甲醇与水的体积比为60∶40～90∶10；所述中低压反相层析过程为：将所述银杏总内酯从层析柱顶加入，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.01～0.02∶1；层析柱压力为5～40bar；所述流动相流速为2～10ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述结晶步骤中，所述甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为0.5～2∶1(ml/g)；所述冷冻结晶温度为：-20℃～4℃。
本发明的优点在于，构想合理，方法简便，容易推广，本发明提供一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，采用强极性或极性大孔吸附树脂分离，解决现有制备银杏提取物银杏酸偏高的问题，并解决现有提取及制备银杏活性物质耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题。并能同时得到银杏多糖、银杏提取物、银杏总黄酮、银杏总内酯、银杏内酯A、B、C单体等多种活性物质。项目技术包括原料前处理步骤、提取步骤、多糖沉淀步骤、大孔树脂分离步骤、硅胶干柱分离步骤、反相层析精制步骤和结晶步骤等，节省了生产成本，提高了生产效率，且工艺简便并易于放大到工业化生产，同时能大大提高原料利用率。
具体实施方式
实施例1
(1)原料前处理步骤：
取银杏叶干品为原料，粉碎过筛后，准确称取1000g，加入含有纤维素酶0.50g、果胶酶0.50g的水溶液500ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为0.5∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为0.5∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为0.5∶1000(质量比)，加热到60℃，反应1小时，烘干得到提取原料；
(2)提取步骤
将步骤(1)中所得的提取原料，80％乙醇提取，60℃下提取，料液比1∶20，提取2次，合并提取液；
(3)多糖沉淀步骤
将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液5000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为5∶1(L/kg)，加入0.05kg壳聚糖为絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为1∶100(kg/L)，搅拌30min后，常温静置12小时，过滤得到沉淀物，干燥后得到银杏多糖71.15g；沉淀上清液为沉淀分离液。
(4)大孔树脂分离步骤
将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到ADS-2大孔吸附树脂后，5％乙醇水溶液洗脱4柱体积，丢弃后，40％乙醇水溶液洗脱2柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到银杏提取物45.90g；
(5)硅胶干柱分离步骤
取4590g，粒径50μm的III级活化硅胶硅胶，银杏提取物与硅胶的质量比为1/100，并添加459g的硅藻土(硅藻土与硅胶的质量百分比为10％)，加入等体积的正己烷搅拌混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高径比为5∶1；
将得到的银杏提取物45.90g湿法上样于硅胶干柱上，在常压条件下，采用甲醇∶正己烷＝90∶10(V/V)溶剂作为展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的银杏黄酮与银杏内酯Rf值，分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，三氯甲烷浸泡振荡洗脱2次，每次20分钟，将所获的三氯甲烷溶液于减压蒸干，分别得到银杏总黄酮5.56g，银杏总内酯2.40g。
(6)反相层析精制步骤
取粒径为20μm，240g C18填料，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.01∶1，填装成高径比为60∶1的层析柱；将得到的银杏总内酯2.40g上样后，甲醇∶水＝60∶40(V/V)洗脱液洗脱，层析柱压力为5bar，流速为2ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
(7)结晶步骤
分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为60％甲醇水溶液，所加甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为0.5∶1(ml/g)，60℃下充分溶解后，趁热过滤后，-20℃冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A0.27g、银杏内酯B0.30g、银杏内酯C0.25g。
实施例2
(1)原料前处理步骤：
取银杏叶干品为原料，粉碎过筛后，准确称取2000g，加入含有纤维素酶6.0g、果胶酶4.0g的水溶液4000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为2∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为3∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为2∶1000(质量比)，加热到30℃，反应3小时后，烘干，得到提取原料；
(2)提取步骤
将步骤(1)中所得的提取原料，50％乙醇提取，90℃下提取，料液比1∶8，提取4次，合并提取液；
(3)多糖沉淀步骤
将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液4000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为2∶1(L/kg)，加入0.08kg聚苯烯酰胺为絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为2∶100(kg/L)，搅拌10min后，常温静置6小时，过滤得到沉淀物，干燥后得到银杏多糖146.77g；沉淀上清液为沉淀分离液。
(4)大孔树脂分离步骤
将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到ADS-7大孔吸附树脂后，15％乙醇水溶液洗脱2柱体积，丢弃后，60％乙醇水溶液洗脱4柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到银杏提取物92.70g；
(5)硅胶干柱分离步骤
取7416g，粒径30μm的III级活化硅胶硅胶，银杏提取物与硅胶的质量比为1/80，并添加1483.2g的硅藻土(硅藻土与硅胶的质量百分比为20％)，加入等体积的石油醚搅拌混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高径比为20∶1；
将得到的银杏提取物92.70g湿法上样于硅胶干柱上，在常压条件下，采用甲醇∶正己烷＝98∶2(V/V)溶剂作为展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的银杏黄酮与银杏内酯Rf值，分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，三氯甲烷浸泡振荡洗脱3次，每次10分钟，将所获的三氯甲烷溶液于减压蒸干，分别得到银杏总黄酮11.90g，银杏总内酯5.10g。
(6)反相层析精制步骤
取粒径为50μm，255g C18填料，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.02∶1，填装成高径比为20∶1的层析柱；将得到的银杏总内酯5.10g上样后，甲醇∶水＝90∶10(V/V)洗脱液洗脱，层析柱压力为20bar，流速为10ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
(7)结晶步骤
分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为80％甲醇水溶液，所加甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为2∶1(ml/g)，40℃下充分溶解后，趁热过滤后，-10℃冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A0.55g、银杏内酯B0.57g、银杏内酯C0.43g。
实施例3
(1)原料前处理步骤：
取金银花干品为原料，粉碎过筛后，准确称取1000g，加入含有纤维素酶2.0g、果胶酶1.0g的水溶液1000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为1∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为2∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为1∶1000(质量比)，加热到45℃，反应2小时后，烘干，得到提取原料；
(2)提取步骤
将步骤(1)中所得的提取原料，70％乙醇提取，75℃下提取，料液比1∶12，提取3次，合并提取液；
(3)多糖沉淀步骤
将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液5000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为4∶1(L/kg)，加入0.05kg聚苯烯酸钠为絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为0.05∶100(kg/L)，搅拌20min后，常温静置8小时，过滤得到沉淀物，干燥后得到银杏多糖69.75g；沉淀上清液为沉淀分离液。
(4)大孔树脂分离步骤
将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到HPD-826大孔吸附树脂后，10％乙醇水溶液洗脱3柱体积，丢弃后，50％乙醇水溶液洗脱3柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到银杏提取物49.50g；
(5)硅胶干柱分离步骤
取2475g，粒径80μm的II级活化硅胶硅胶，银杏提取物与硅胶的质量比为1/50，并添加371.25g的硅藻土(硅藻土与硅胶的质量百分比为15％)，加入等体积的正戊烷搅拌混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高径比为15∶1；
将得到的银杏提取物49.50g湿法上样于硅胶干柱上，在常压条件下，采用甲醇∶正己烷＝95∶5(V/V)溶剂作为展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的银杏黄酮与银杏内酯Rf值，分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，三氯甲烷浸泡振荡洗脱3次，每次15分钟，将所获的三氯甲烷溶液于减压蒸干，分别得到银杏总黄酮5.92g，银杏总内酯2.65g。
(6)反相层析精制步骤
取粒径为30μm，176.67g C18填料，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.015∶1，填装成高径比为40∶1的层析柱；将得到的银杏总内酯2.65g上样后，甲醇∶水＝70∶30(V/V)洗脱液洗脱，层析柱压力为40bar，流速为5ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
(7)结晶步骤
分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为70％甲醇水溶液，所加甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为1∶1(ml/g)，50℃下充分溶解后，趁热过滤后，4℃冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A0.19g、银杏内酯B0.23g、银杏内酯C0.17g。
实施例4
(1)原料前处理步骤：
取银杏叶干品为原料，粉碎过筛后，准确称取2000g，加入含有纤维素酶8.0g、果胶酶8.0g的水溶液4000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为2∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为2∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为2∶1000(质量比)，加热到60℃，反应1小时后，烘干，得到提取原料；
(2)提取步骤
将步骤(1)中所得的提取原料，80％乙醇提取，70℃下提取，料液比1∶12，提取3次，合并提取液；
(3)多糖沉淀步骤
将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液6000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为3∶1(L/kg)，加入0.06kg聚苯烯酸钙为絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为1∶100(kg/L)，搅拌30min后，常温静置12小时，过滤得到沉淀物，干燥后得到银杏多糖143.19g；沉淀上清液为沉淀分离液。
(4)大孔树脂分离步骤
将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到HPD-600大孔吸附树脂后，纯水洗脱4柱体积，丢弃后，50％乙醇水溶液洗脱3柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到银杏提取物94.45g；
(5)硅胶干柱分离步骤
取9445g，粒径80μm的II级活化硅胶硅胶，银杏提取物与硅胶的质量比为1/100，并添加944.5g的硅藻土(硅藻土与硅胶的质量百分比为10％)，加入等体积的正己烷搅拌混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高径比为20∶1；
将得到的银杏提取物94.45g湿法上样于硅胶干柱上，在常压条件下，采用甲醇∶正己烷＝94∶6(V/V)溶剂作为展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的银杏黄酮与银杏内酯Rf值，分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，三氯甲烷浸泡振荡洗脱3次，每次20分钟，将所获的三氯甲烷溶液于减压蒸干，分别得到银杏总黄酮12.16g，银杏总内酯5.30g。
(6)反相层析精制步骤
取粒径为20μm，530g C18填料，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.01∶1，填装成高径比为60∶1的层析柱；将得到的银杏总内酯5.30g上样后，甲醇∶水＝80∶20(V/V)洗脱液洗脱，层析柱压力为20bar，流速为8ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
(7)结晶步骤
分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为70％甲醇水溶液，所加甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为0.5∶1(ml/g)，60℃下充分溶解后，趁热过滤后，-20℃冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A0.58g、银杏内酯B0.55g、银杏内酯C0.41g。
Claims (8)
1.一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，包括：
(1)原料前处理步骤；银杏叶干品原料粉碎后，加入含有纤维素酶及果胶酶的水溶液进行破壁反应，烘干得到提取原料；
(2)提取步骤；在步骤(1)得到的提取原料，50～80％乙醇提取，60～90℃下提取，料液比1∶8～1∶20，提取2～4次，合并后得到提取液；
(3)多糖沉淀步骤；沉淀分离步骤；将步骤(3)中得到的提取液浓缩后，加入絮凝剂进行沉淀反应，过滤得到沉淀物银杏多糖；过滤得到的上清液为沉淀分离液；
(4)大孔树脂分离步骤；将步骤(3)中得到的沉淀分离液，经过极性或强极性大孔树脂分离，得到银杏提取物；
(5)硅胶干柱分离步骤；将步骤(4)中得到的银杏提取物湿法上样于硅胶干柱上，银杏提取物与硅胶的质量比为1/50～1/100，在常压下利用压力差以展开剂下行展开，分别获得银杏总黄酮与银杏总内酯；展开剂为甲醇与正己烷的混合液；
(6)反相层析精制步骤；对步骤(5)中得到的银杏总内酯，以C18填料为固定相，以甲醇与水的混合液为流动相，进行中低压反相层析，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分；
(7)结晶步骤；分别将反相层析的三个正组分减压蒸馏至干得到固形物，各加入浓度为60％～80％的甲醇水溶液，40℃～60℃下充分溶解后，趁热过滤后，冷冻结晶，分别获得纯度大于98％的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C。
2.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述原料前处理步骤中，所述纤维素酶及果胶酶的水溶液为：水溶液的体积与原料的质量比为0.5～2∶1(体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为0.5～3∶1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为0.5～2∶1000(质量比)；所述破壁反应为：反应温度30～60℃，反应时间1～3小时。
3.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述多糖沉淀步骤中，所述提取液浓缩为：将提取液浓缩至与银杏叶干品原料的体积质量比为2～5∶1(L/kg)；所述絮凝剂剂为：壳聚糖、聚苯烯酰胺、聚苯烯酸钠、聚苯烯酸钙中的一种；所述加入絮凝剂进行沉淀反应，过滤得到沉淀物金银花多糖，其过程为：在浓缩液中加入絮凝剂，所加入絮凝剂与浓缩液的质量体积比为0.05～2∶100(kg/L)，搅拌10～30min后，常温静置6～12小时，过滤得到沉淀物干燥后得到金银花多糖。
4.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述大孔树脂分离步骤中，所述极性或强极性大孔树脂为：ADS-2、ADS-7、HPD-826、HPD-600中的一种；所述经过极性或强极性大孔树脂分离，其过程为：将沉淀分离液上样到大孔树脂上，用纯水或5％～15％的乙醇水溶液洗脱2～4柱体积，弃去洗脱液，再用40％～60％的乙醇水溶液洗脱2～4柱体积，收集洗脱液，干燥得到银杏提取物。
5.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述硅胶干柱分离步骤中，所述硅胶干柱为：填装有硅胶基填料、高径比5∶1～20∶1的装置，硅胶基填料由硅胶和硅藻土组成，硅藻土与硅胶的质量百分比为10％～20％；硅胶粒径为30μm～80μm，硅胶活性为II～III级；
所述硅胶干柱的填装过程为：将硅胶基填料与等体积的有机溶剂混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料表面始终被溶剂覆盖，直到填装到所需要高度；所述有机溶剂为正己烷、石油醚、正戊烷中的一种。
6.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述硅胶干柱分离步骤中，所述展开剂的体积比为：甲醇∶正己烷＝90∶10～98∶2；所述下行展开的过程为：将展开剂从硅胶干柱顶加入，在常压下利用压力差下行展开，当展开剂流至硅胶干柱底部时，停止加入展开剂；分别将富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段切割刮出，用三氯甲烷振荡洗脱10～20分钟，重复洗脱2～3次，将所获的三氯甲烷溶液减压蒸干，分别得到的固形物即为银杏总黄酮和银杏总内酯；所述富含银杏黄酮和银杏内酯的硅胶干柱段是参照相同展开剂条件下硅胶薄层实验得到的两者的比移值Rf确定。
7.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述反相层析精制步骤中：固定相为C18填料，粒径为20～50μm，填装成高径比为20∶1～60∶1的层析柱；所述流动相中甲醇与水的体积比为60∶40～90∶10；所述中低压反相层析过程为：将所述银杏总内酯从层析柱顶加入，银杏总内酯与C18填料的质量比为0.01～0.02∶1；层析柱压力为5～40bar；所述流动相流速为2～10ml/min，分别收集富含银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的正组分。
8.如权利要求1所述的一种从银杏叶中制备多种活性物质的方法，其特征在于：所述结晶步骤中，所述甲醇水溶液的体积与蒸干固形物的质量比为0.5～2∶1(ml/g)；所述冷冻结晶温度为：-20℃～4℃。
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