CN101186912A - 采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种生物技术领域的采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法。本发明从银杏中克隆香叶基香叶基焦磷酸合成酶GGPPS基因，构建含ggpps基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ggpps基因导入银杏幼胚并诱导出愈伤组织，PCR和半定量RT－PCR检测外源目的基因ggpps的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定银杏愈伤组织中萜内酯含量，筛选获得银杏萜内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。本发明获得转基因银杏愈伤组织中萜内酯的含量显著提高，从而提供了一种提高银杏细胞培养物中银杏萜内酯的方法，也为生产具重要临床需求的银杏萜内酯提供了一种新方法。

Description

采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种采用转化香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因ggpps提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)是侏罗纪的孑遗植物，基本保持了1.5亿年前的生态特征，因而成为一科一属一种的特殊植物，被达尔文称为“活化石”。银杏标准提取物是广泛用于治疗早期阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的植物药。银杏叶提取物中具有药理作用和治疗效力成分主要为黄酮类和萜内酯类化合物，后者包括银杏内酯和白果内酯。目前从银杏中分离得到的二萜内酯有5个，即银杏内酯A、B、C、J、M。银杏内酯具有独特的二十碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺[4，4]壬烷，一个四氢呋喃环和三个内酯环，是一类罕见的天然化合物，至今尚未发现存在于其他植物中。银杏内酯是在银杏中含量很低的一类组分，一般在千分之几左右，且提取分离手续复杂。白果内酯还有抗孢子原虫作用，能杀灭卡氏肺囊虫，但在银杏中的含量也很低。由于银杏萜内酯的分子立体结构复杂，人工合成途径的技术难度很大，因此，它们主要是从天然银杏植株中提取，但天然植物体内含量极其微少，使得银杏萜内酯来源困难。银杏中萜内酯的含量还受到植株发育阶段、细胞分区、组织分化和环境的影响，仅从天然植物中提取萜内酯远远不能满足市场需求。愈伤组织和细胞培养***为生产这些有价值的萜内酯带来了希望。

经对现有技术的文献检索发现，国内外科学家尝试了采用各种方法，包括优化培养条件(Boonkaew，Boonkaew T.In vitro culture of Ginkgo biloba L.，PhDThesis，2001，UMI 3031078，ETH，Ann Arber，USA)、加入前体物质和使用化学或生物诱导子(戴均贵等.前体及真菌诱导子对银杏悬浮培养细胞产生银杏内酯B的影响.药学学报，2000，35：151-155)来提高银杏组织培养物中银杏内酯的含量。如Boonkaew对银杏组织培养的培养基条件进行了研究，比较了不同的激素配比和培养基类型，选择了MS培养基和1.0mg/Lα-萘乙酸和1.0mg/L激动素作为最优培养条件，发现使用0.8％植物凝胶作为凝结剂培养愈伤组织能提高根衍生愈伤中的叶绿素、银杏内酯和白果内酯，根衍生的愈伤组织比叶衍生的愈伤组织中的含量高，叶衍生愈伤中总银杏内酯的含量为25μg/g干重，根衍生愈伤中为34μg/g干重，而使用其他凝结剂如琼脂等几乎检测不到银杏内酯的存在。

虽然尝试了多种办法来提高银杏愈伤组织和细胞培养物中的萜内酯含量，但到目前为止，通过愈伤组织和细胞培养***来产生萜内酯，其含量依然太低不具商业前景。代谢工程为改变植物细胞或愈伤组织的组成成份和增加植物细胞或愈伤组织萜内酯产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产银杏萜内酯，开展银杏萜内酯生物合成途径及其催化酶基因的表达与调控研究，以及开展银杏萜内酯代谢工程研究将是提高银杏萜内酯含量并最终解决银杏萜内酯产品稀缺的有效方法。香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)是银杏萜内酯生物合成途径中的关键酶，是萜内酯代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将所述的关键酶基因ggpps转化银杏，将打破萜内酯生物合成限速瓶颈，获得银杏萜内酯高产的银杏愈伤组织。目前尚未发现与本发明主题所提及的转化ggpps关键酶基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、萜内酯提取及含量测定、半定量RT-PCR分析用于本发明，建立了提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，为银杏愈伤组织大规模工厂化生产奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从银杏中克隆ggpps基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ggpps基因导入银杏细胞并再生出愈伤组织；PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ggpps的整合和表达情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)银杏愈伤组织中萜内酯含量，筛选获得萜内酯含量显著提高的转基因银杏愈伤组织。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得银杏关键酶基因ggpps；

(2)把ggpps基因可操作性地连于表达调控序列，形成含ggpps基因的植物表达载体；

(3)将含ggpps基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ggpps基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏细胞，获得经PCR检测的转基因愈伤组织；

(5)半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中ggpps基因的表达；

(6)对获得的转基因愈伤组织中萜内酯含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得萜内酯含量显著提高的转基因银杏愈伤组织。

所述的经PCR检测的转基因愈伤组织是指，分别设计合成ggpps基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性组织即为转基因银杏愈伤组织。

所述的对获得的转基因愈伤组织中萜内酯含量进行HPLC-ELSD测定，方法为：色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈∶甲醇∶水，乙腈∶甲醇∶水的体积比为8∶69∶23，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，蒸发光散射检测器漂移管温度为50℃，放大系数(gain)为9，空气气压4.5PSI。银杏内酯A、B、C和白果内酯含量根据峰面积由标准品曲线换算。

所述的半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中ggpps基因的表达，方法为：设计合成ggpps基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。

与现有技术相比，本发明采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织萜内酯含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因ggpps导入银杏愈伤组织中，获得了萜内酯含量显著提高的银杏愈伤组织，转ggpps基因愈伤组织中总萜内酯含量为0.089mg/gDW，是非转化对照的2.3倍(0.038mg/g DW)。本发明对解决银杏萜内酯药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。

所述的根癌农杆菌的公开方式为：市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司(CAMBIA，GPO Box 3200，Canberra，ACT 2601，Australia。商品名称：根癌农杆菌菌株如EHA105，商品编号：Gambar 1)购得。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

银杏ggpps基因的克隆

1.组织分离

将银杏种子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaCl0浸泡10min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、12h/12h光照培养，即可获得银杏无菌苗，待苗长至5cm左右后，切取叶片和茎段用于RNA提取。

2.RNA的分离

称取0.5g所述的银杏无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL CTAB缓冲液[3％CTAB(W/V)，3％PVP(W/V)(Mw 40000)，25mM EDTA，2.0M NaCl，100 mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5g/L spermidine和0.1％DEPC(V/V)]的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3.基因克隆

将所获的银杏总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述银杏ggpps基因的编码序列(序列表中的序列1)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的银杏ggpps基因的编码序列(序列表中的序列1)一致。

本实施例采用基因克隆方法从银杏中获得序列正确的银杏萜内酯生物合成关键酶基因ggpps，为通过转ggpps基因提高银杏愈伤组织中银杏萜内酯含量提供了一个重要关键酶基因。

实施例2

含ggpps基因的植物表达载体pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos的构建

1.中间载体pCAMBIA1304⁺的构建

选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件，构建植物表达载体pCAMBIA1304⁺。具体地，HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA1304；回收pBI121的GUS表达盒和pCAMBIA1304大片段；连接回收产物，转化筛选，抽质粒酶切验证。

2.植物表达载体pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos的构建

以所述的pCAMBIA1304⁺为表达载体，用实施例1中ggpps替换其上的gfp+gus基因。具体地，XbalI/SacI双酶切pMDT-simple+ggpps和pCAMBIA1304⁺，回收ggpps和pCAMBIA1304⁺大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。结果表明，ggpps基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304⁺中，从而获得含ggpps的植物表达载体pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos。

本实施例将萜内酯生物合成途径关键酶基因ggpps可操作性地连于表达调控序列，形成含ggpps基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高银杏萜内酯的含量。

实施例3

含ggpps基因植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含ggpps基因的植物表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌(如EHA105)：摇根癌农杆菌至菌液0.D₆₀₀＝0.5，将菌液冰浴30min后，取菌于1.5ml Eppendorf管中，于4℃ 5000rpm离心5min，去上清；用抽滤灭菌的0.1M CaCl₂(预冷)400μl悬浮菌体(用移液枪轻轻打匀)后于冰上放置30min，5000 rpm离心5min，去上清，用100μl预冷的0.1M CaCl₂悬浮菌体后于4℃保存10h备用。然后，采用以下方法获得含ggpps基因的植物表达载体(pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos)的根癌农杆菌工程菌株：取一管100μl的感受态，加10μl质粒DNA(pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos)，轻轻混匀后，于冰上放置5min和液氮中放置8min后，放入37℃水浴中热激5min；加入800μl无抗生素的YEB液体培养基，轻轻混匀；振荡培养活化(28℃，200rpm)4h后，于室温离心(4000rpm)10min，去上清，余下200μl菌液重悬菌体混匀；将混匀的200μl重悬活化菌液均匀涂布到加相应抗生素[卡那霉素(Kan)100μg/ml+链霉素(Str)25μg/ml+利福平(Rif)40μg/ml]的YEB固体培养基平板上，于28℃培养箱中倒置培养2天后，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后做目的基因ggpps的PCR检测。结果表明，含ggpps基因植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

实施例4

1.根癌农杆菌介导ggpps基因转化银杏

1.1.外植体的预培养

剥去白果的中种皮(硬壳)，在超净台内用75％(V/V)酒精消毒1分钟，再用15％(V/V)次氯酸钠溶液浸泡消毒8分钟，剥开胚乳用镊子取出幼胚置于预培养基(MS+3％蔗糖+4g/L植物凝胶)上，25℃暗培养1d。

1.2.农杆菌与外植体的共培养

挑取含所述的含ggpps基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于培养基[YEB液体培养基+20μM乙酰丁香酮+10mM MES(pH＝5.8)+卡那霉素(Kan)100μg/ml+利福平(Rif)40μg/ml]中在28℃摇床上180rpm摇过夜，第二天当菌液浓度达到OD600＝0.5时，5000rpm离心10分钟后倒掉上层培养液，重悬沉淀在底部的农杆菌，在28℃摇床上180rpm活化30分钟，把在预培养24h的银杏幼胚从根部剪成两半，把每一半再横剪成两半，把剪好的外植体放进上述菌液中侵染15分钟，把菌液倒掉，用无菌吸水纸洗干胚上多余的菌液，置于共培养培养基(MS+3％蔗糖+琼脂10g/L)上于25℃暗培养3天，使农杆菌充分侵染银杏幼胚。以浸泡在不带有根癌农杆菌的幼胚外植体为对照。

1.3.愈伤组织的诱导和继代培养

共培养后，把胚外植体转接到恢复培养基(MS+蔗糖3％+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+4g/L植物凝胶+250mg/L羧苄霉素)上进行愈伤组织诱导和脱菌培养，于25℃暗培养4周后转接到筛选培养基(MS+蔗糖3％+1.0mg/L NAA+0.2mg/L6-BA+4g/L植物凝胶+250mg/L羧苄霉素+10mg/L潮霉素)上进行抗性愈伤组织的筛选培养，将起源于不同细胞的每个愈伤组织作为一个无性系，接种于继代培养基(MS+蔗糖3％+1.0mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+4g/L植物凝胶+10mg/L潮霉素)上继代筛选，每三周继代培养一次。

2.转基因银杏愈伤组织的PCR检测

首先采用常规CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化胺)方法提取转基因银杏潮霉素抗性愈伤组织的DNA，然后，根据目的基因所在表达盒pCAMBIA1304::p35S-ggpps-nos序列p35s和ggpps分别设计正向引物T35SF和反向引物TGPR，用PCR方法对转基因银杏抗性愈伤组织中的目的基因ggpps进行检测。PCR反应条件为：94℃变性5min→30循环(94℃45sec→58℃45sec→72℃1min)→72℃6min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增转基因银杏愈伤组织DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段(0.5kb)，而以非转化银杏基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明ggpps基因已经整合到银杏基因组中。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ggpps基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏细胞，获得经PCR检测的转基因愈伤组织。转基因银杏愈伤组织的获得为筛选获得银杏萜内酯含量提高的银杏愈伤组织提供了直接素材。

实施例5

半定量RT-PCR检测转基因银杏愈伤组织中ggpps基因的表达

1.引物的设计和合成

设计合成ggpps基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，PCR产物凝胶电泳后与对照愈伤组织对比其表达量。

2.RNA的提取

参照实施例1中所述方法，从银杏愈伤组织中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因组DNA，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成，再以第一链cDNA为模板进行半定量RT-PCR。

3.半定量RT-PCR检测看家基因18S rRNA基因的表达

为调整各样品间在RNA抽提和逆转录过程中反应效率的差异，检测目的基因表达量的同时需检测看家基因18S rRNA基因的表达。

4.半定量RT-PCR检测转基因银杏愈伤组织中ggpps基因的表达

用非转化普通愈伤组织作对照，用半定量RT-PCR测定ggpps基因的表达量。半定量RT-PCR反应条件为：50℃30min→94℃2min→30个循环(94℃45sec→58℃30sec→72℃30sec)。结果表明，在相同的总RNA量和18s rRNA基因表达水平下，相比未转化的愈伤组织，大多数转基因愈伤组织中的ggpps基因转录水平有明显升高，表明目的基因ggpps的转入显著提高了银杏愈伤中的ggpps的表达量。

实施例6

利用HPLC-ELSD测定转基因银杏愈伤组织中萜内酯含量

1.HPLC-ELSD条件及***适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695***，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250□4.6mm，Waters)，流动相为乙腈∶甲醇∶水，乙腈∶甲醇∶水的体积比为8∶69∶23，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，灵敏度(AUFS＝1.0)。

ELSD：采用water alliance 2420***，蒸发光散射检测器漂移管温度50℃，空气气压4.5PSI，放大系数(gain)为9。

分别精密称取银杏内酯A、B、C和白果内酯标准品(Sigma公司)20 mg用甲醇溶解并定溶于20ml，得到浓度为1mg/mL的银杏内酯A、B、C标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为乙腈∶甲醇∶水，比例为8∶69∶23时，银杏内酯A、B、C和白果内酯的保留时间分别为15.757min、17.642min、7.735min和8.461min，峰型良好，可保证四种萜内酯的良好分离。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液分别稀释1、2、5、10倍，在相应色谱条件下进样，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，mg/L)进行回归分析。银杏内酯A、B、C和白果内酯对照品的线性回归方程分别为：

YGA＝1.38e+000X+8.68e-001  r＝0.9993

YGB＝3.67e-001X+3.44e+000  r＝0.9991

YGC＝1.18e+000X+1.18e+000  r＝0.9995

YBB＝1.27e+000X+8.68e-001  r＝0.9998

3.样品的制备和萜内酯含量的测定

将愈伤组织置于烘箱中60℃干燥至恒重。每次称取研碎的愈伤组织0.5g进行定量分析。用20ml甲醇超声1个小时后，布氏漏斗过滤，提取液在旋转蒸发仪中蒸干，再用1ml 40∶60的甲醇∶水复溶，上100mg的C18小柱(SUPELCO，USA)，依次2ml水、0.5ml 20∶80的甲醇∶水冲洗，再用0.4ml 60∶40的甲醇∶水洗脱后收集，过0.45μm微孔滤膜，取20μl上样，用HPLC-ELSD法测量萜内酯含量。

分别吸取所述对照品溶液和供试样品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品萜内酯含量。

在本发明中转ggpps基因显著提高银杏愈伤组织中萜内酯的含量。结果表明转基因愈伤组织大多数在不同程度上银杏内酯C含量比对照有所增加，部分愈伤组织中白果内酯的含量也有所增加，但均检测不到银杏内酯A、B，是由于愈伤组织中这两种内酯含量太低，达不到最低检测范围。转ggpps基因的转基因愈伤组织中银杏内酯C和白果内酯的平均含量为0.064mg/gDW和0.025mg/gDW，对照分别为0.038mg/gDW和检测不到，其中银杏内酯C含量最高的无性系1含量为0.139mg/gDW，比对照提高了3.7倍，白果内酯含量最高的无性系16含量为0.13mg/gDW，而对照组检测不到。转ggpps基因愈伤组织中总萜内酯含量为0.089mg/g DW，是非转化对照的2.3倍(0.038mg/gDW)。在所测试的转ggpps银杏愈伤组织无性系中，G16中总萜内酯含量最高(0.204mg/g DW)。

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因银杏愈伤组织中萜内酯含量。采用转ggpps基因的代谢工程策略获得了萜内酯含量提高的银杏愈伤组织，为规模化生产银杏萜内酯并最终解决萜内酯匮乏提供了一种方法。

本发明涉及的序列表：

<110>上海交通大学

<120>转ggpps基因提高银杏愈伤组织萜内酯含量的方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1176

<212>DNA

<213>银杏(Ginkgo biloba)

<400>1

atggctgcca gtgcaatgac agcaagttac caaagcctgc acttttgttt gcagtcaaag     60

aatatggctt ctccagaatg cattttgaag agtttttccc ttccatgtag tcgttttaat    120

ggagcttcaa cctcgttagg agcttcaaat ggtcagtata tgggttttcg tggccatttg    180

agaaaggggt tactgtcgtc cagaggtgta atgtcgtctg gctctttaaa cacagttgct    240

caattggtta gcgaggctga aacggtcaag gagaagaagg attttgaatt tgatttcaaa    300

aaatatatgt attccaaggc gatatcagtg aatgaggcgc tagacaaggc tgttcctacg    360

cattaccctg agaaaataca cgaatcaatg agatattcgc ttctagcagg agggaagcgt    420

gtccggccaa cgctctgtat tgcagcgtgt gaacttgtag gaggaacgga ggatctggcc    480

atgccagctg cctgtgcaat ggaaatgatc catacaatga cattaataca tgatgatttg    540

ccttgcatgg acaatgataa tttacgtaga ggaaagccca caaatcacaa ggcatttggc    600

gaagacactg ctgtacttgc aggagatgca ctcctttctt ttgcatttga acatattgca    660

aggtctacaa gcaaaactgt ggaaagtgag agggttttga gggtgatatg tgaactgggt    720

aaatcgatgg gatctgaagg gcttgtagct ggacagattg ttgatattgc aagtgaaggt    780

gatacttcgg ttgaccttaa aactctggaa tatattcatc ttcacaaaac tgcagtgcta    840

ttggagtgtt cggttgtgtc tggagcaatc atcggaggtg cctctgagga agagattgag    900

agaacaagaa ggtatgcccg atgtgtgggt cttttgtttc aggtggttga tgatatacta    960

gatgtcacaa aaacatcaga agaattgggt aagactgcag ggaaggatct catcagtgat   1020

aaagctactt atcccaagct gatgggtctt gagaaagcaa aggaatttgc tgttgaattg   1080

gtcaacaagg ccaaggaaga actgtcttac tttgatccag taaaggctgc acctttgtta   1140

ggtcttgcag attatattgc cttcagacaa aactag                             1176

Claims (5)

1.一种采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，其特征在于，从银杏中克隆香叶基香叶基焦磷酸合成酶GGPPS基因，构建含ggpps基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ggpps基因导入银杏幼胚并诱导出愈伤组织，PCR和半定量RT-PCR检测外源目的基因ggpps的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定银杏愈伤组织中萜内酯含量，筛选获得银杏萜内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。

2.根据权利要求1所述的采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，其特征是，包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得银杏关键酶基因ggpps；

(2)把ggpps基因可操作性地连于表达调控序列，形成含ggpps基因的植物表达载体；

(3)将含ggpps基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化银杏的含ggpps基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化银杏幼胚，获得经PCR检测的转基因愈伤组织；

(5)半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中ggpps基因的表达；

(6)对获得的转基因愈伤组织中萜内酯含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定，筛选获得银杏萜内酯含量提高的转基因银杏愈伤组织。

3.根据权利要求2所述的采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，其特征是，所述的经PCR检测的转基因愈伤组织，设计合成ggpps基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性愈伤组织即为转基因银杏愈伤组织。

4.根据权利要求2所述的采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，其特征是，所述的对获得的转基因愈伤组织中萜内酯含量进行高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定，方法为：色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈∶甲醇∶水，乙腈∶甲醇∶水的体积比为8∶69∶23，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，蒸发光散射检测器漂移管温度为50℃，放大系数为9，空气气压4.5PSI，银杏内酯A、B、C和白果内酯含量根据峰面积由标准品曲线换算。

5.根据权利要求1所述的采用转ggpps基因提高银杏愈伤组织中萜内酯含量的方法，其特征是，所述的半定量RT-PCR测定银杏愈伤组织中ggpps基因的表达，方法为：设计合成ggpps基因和看家基因18S rRNA的引物，进行半定量RT-PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。