CN102428187A - 植物中的多重病毒抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于遗传控制由多种植物病毒引起的植物疾病的基因靶标、构建体和方法。本发明涉及通过靶编码序列的识别以及使用转录后阻遏或抑制植物寄生病毒靶编码序列的表达的重组DNA技术实现植物保护效果。还可以利用基于蛋白表达的方法增强表型抗性。因此，包含一个或多个植物表达盒的单个转基因事件的转录可以允许植物广谱对抗双生病毒、蕃茄斑萎病毒和马铃薯X病毒中的多种植物病毒株和种。

Description

植物中的多重病毒抗性
相关申请的引用
本申请要求于2009年4月20日提交的美国临时申请序列号61/171,021的优先权，其公开的全部内容通过引用的方式并入到本申请中。
序列表的引入
所述序列表是本申请的一部分，它包括计算机可读的999KB的标题为“MONS213WO_ST25.txt”的文件，该文件包含通过EFS-Web提交的本发明的核苷酸和/或氨基酸序列。所述序列表的主题通过引用的方式全部并入到本申请中。
技术领域
本发明一般地涉及用于提高对多种植物病毒的抗性的方法和组合物。
相关技术的描述
茄科植物易受多种潜在致病剂的影响，包括造成全球主要农作物损失的病毒诱导疾病。对于许多RNA病毒，转基因外壳蛋白(CP)或复制酶的表达阻断病毒感染过程的发展。基于RNA的抗性利用植物的转录后基因沉默(PTGS)机制来降解病毒RNA。然而，这类方法可能产生基础窄和/或不耐久的抗性，特别是随着迅速蔓延/进化的新的病毒种或隔离群。在某些情况下，经典定义的(非转基因的)抗性性状可用于帮助开发病毒抗性植物。此外，控制植物害虫(例如用来传递植物病毒的昆虫)可以帮助限制由于植物的病毒感染造成的损失。
附图说明
图1：目标病毒的基因组组构的示意图。
图2A：显示用于识别对植物病毒控制有效的序列的途径的示意图。
图2B：典型的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)DNA-A基因组的示意图，显示了筛选在表达为反向重复序列时对病毒控制有效的区域的位置。编号的灰色箭头代表进行测试的基因组的部分。
图2C：典型的马铃薯X病毒(黄瓜花叶病病毒(Pepino mosaicvirus)；PepMV)的示意图，显示了筛选在表达为反向重复序列时对病毒控制有效的区域的位置。编号的灰色箭头代表进行测试的基因组的部分。
图2D：显示了筛选在表达为反向重复序列时对病毒控制有效的区域的位置的蕃茄斑萎病毒(例如，蕃茄斑萎病毒(Tomato spotted wiltvirus)(TSWV))的示意图。编号的灰色箭头代表进行测试的基因组的部分。
图3：转化的番茄植物中与siRNA产生相关的病毒抗性。
图4：赋予多重病毒抗性(“MVR”)的示例性人工dsRNA融合构建体。
图5：合适的21nt序列(SEQ ID NO：1-42中)，针对五种目标双生病毒进行分析(精确匹配：双下划线；G:U错配：单下划线；其它错配或没有利用：无下划线)。
图6：合适的21nt序列(SEQ ID NO：43-70中)，针对番茄斑萎病毒属进行分析(精确匹配：双下划线；G:U错配：单下划线；其它错配或没有利用：无下划线)。
图7A、7B：合适的21nt序列(SEQ ID NO：71-154中)，针对目标马铃薯X病毒进行分析(精确匹配：双下划线；G:U错配：单下划线；其它错配或没有利用：无下划线)。
图8：用于在一个转基因盒中配置多个工程化miRNA(例如，与相位siRNA(phased siRNA))的示例性构建体的示意图。
图9：显示配置病毒抗性的多种作用方式的表达盒的示意图。
图10：用于在一个转基因盒中配置多个工程化miRNA以及用于和dsRNA一起表达miRNA的另外的示例性构建体的示意图。
图11A、11B：限定可以表达为具有抗病毒效力的dsRNA的片段的番茄斑萎病毒基因组区域的扫描。X轴表示单个事件和靶区域(CP：外壳蛋白；GP：包膜糖蛋白；以及RdRP：RNA依赖性RNA聚合酶)。Y轴表示显示病毒抗性的转基因R1植物的％。图11A：TSWV结果；图11B：CaCV和GBNV结果。“CP4+”指的是R1植物中存在与dsRNA编码序列连接的选择标记基因。
图12：测试产生dsRNA介导的抗这一马铃薯X病毒的抗性的效力的PepMV基因组区域(CP：外壳蛋白；Mov：移动蛋白；RdRP或RdR：RNA依赖性RNA聚合酶；TGB：三基因块蛋白(Triple geneblock protein))。
图13A、13B：分析产生dsRNA介导的抗这一病毒组的抗性的效力的双生病毒基因组区域。(CP：外壳蛋白；Rep：复制蛋白)。其它的转基因植物包含草甘膦抗性基因。“0％-100％”表示为选择标记阳性和病毒抗性的R1植物的百分数。图13A：TYLCV和ToSLCV的代表性结果；图13B：PepGMV、PHYVV和ToLCNDV的代表性结果。对于PHYVV和ToLCNDV事件，“Spc”指的是存在赋予大观霉素抗性的选择标记基因。其它事件用包含赋予草甘膦抗性的选择标记基因的构建体转化(“CP4阳性”)。
图14：显示用于靶向多个病毒科中的多种病毒的代表性表达盒的示意图。
图15：对于实施例3中讨论的多重病毒抗性，使用靶向蕃茄斑萎病毒和PepMV(马铃薯X病毒)的CP表达的人工dsRNA融合构建体的结果。使用的构建体简要地示于图4B中，底部构建体：TSWV(160bp)、TSWV(296bp)、PepMV(231bp)、CaCV/GBNV(232bp)。
图16：描述所观察的抗接种的CP4阳性R1植物中接种的CaCV的抗性，该R1植物用包含蕃茄斑萎病毒末端重复序列(SEQ ID NO：167、168、376、377、378，如在SEQ ID NO：455中发现的)的构建体转化。
发明简述
本发明提供用于获得对多种植物病毒具有抗性的植物的方法和组合物。在一个方面中，本发明提供一种包含对多种植物病毒种具有抗性的番茄植物。在特定的实施方式中，所述抗性通过至少两种不同的选自dsRNA、miRNA和病毒颗粒组装抑制的作用方式提供。在其它实施方式中，所述抗性通过至少三种不同的作用方式提供。所述番茄植物的抗性可以包括抗菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性。
在特定实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的的抗性通过产生dsRNA的核酸构建体的表达提供。在一些实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过dsRNA融合构建体的表达提供。在本发明的一些实施方式中，所述dsRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。在特别的实施方式中，产生dsRNA的核酸构建体包含选自SEQ ID NO：379-455中的序列。
在其它实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供。因此，在特定实施方式中，抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过交叉重叠的(stacked)miRNA表达盒编码的序列提供。在再其它的实施方式中，所述miRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。在特别的实施方式中，所述miRNA包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列。
在特定的实施方式中，所述番茄植物包含：(a)抗菜豆金色花叶病毒的抗性，其通过干扰菜豆金色花叶病毒复制基因表达的dsRNA的表达提供；(b)抗蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性，其通过干扰病毒外壳蛋白基因或病毒移动蛋白基因表达的dsRNA的表达提供；(c)抗马铃薯X病毒的抗性，其通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供；或者(d)抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性，其通过交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
在其它实施方式中，提供一种番茄植物，其中对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段末端序列的表达提供。在特定实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装提供，其中病毒颗粒组装通过包含在核酸构建体内的序列抑制，该核酸构建体包含第一核酸片段和第二核酸片段，其中所述第一和第二片段是基本上彼此的反向重复序列并且通过第三核酸片段连接到一起，且其中所述第三片段包含至少一个抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段的末端序列。在特别实施方式中，所述第三核酸包含选自下组的蕃茄斑萎病毒基因组末端序列：CaCV或GBNV L基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV M基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV S基因组片段的末端序列、蕃茄斑萎病毒基因组末端重复序列、包含SEQ ID NO：167的核酸序列、包含SEQ ID NO：168的核酸序列、包含SEQ ID NO：376的核酸序列、包含SEQ ID NO：377的核酸序列、包含SEQ ID NO：378的核酸序列以及包含SEQ ID NO：455的核酸序列。
在特定实施方式中，所述番茄植物包含对双生病毒科(Geminiviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和弯曲病毒科(Flexiviridae)中的至少两科的病毒的抗性。因此，在一些实施方式中，所述病毒选自马铃薯X病毒属、蕃茄斑萎病毒属和菜豆金色花叶病毒属。在特别实施方式中，所述病毒选自：a)TYLCV、ToSLCV、ToLCNDV、PHYVV、PepGMV的至少一种；b)TSWV、GBNV、CaCV的一种或多种；以及c)PepMV。在更特别的实施方式中，所述马铃薯X病毒是黄瓜花叶病病毒。在特定实施方式中，所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV、ToLCNDV、PHYVV、ToSLCV或PepGMV。在一些实施方式中，所述蕃茄斑萎病毒为CaCV、GBNV或TSWV。在特别实施方式中，所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV，且所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病病毒；或者所述蕃茄斑萎病毒为TSWV，且所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病病毒；或者其中所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV，所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病病毒，且所述蕃茄斑萎病毒为TSWV。
在一些实施方式中，所述番茄植物可以包含选自SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166和363-375中的序列。在这些或其它实施方式中，所述番茄植物包含(或者进一步包含)选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127、141和379-454中的序列。因此，本发明的番茄植物可以包含：(a)至少一个选自SEQ ID NO：379-454中的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455中的序列；(b)至少一个选自SEQ ID NO：379-454中的序列和至少一个选自SEQ IDNO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列；或者(c)至少一个选自SEQ IDNO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455中的序列。
在再其它的实施方式中，所述番茄植物包含至少一个选自下组的赋予病毒抗性的异源核酸序列：a)编码与第一靶基因的全部或部分互补的RNA序列的核酸序列；b)包含至少一个反义DNA片段的多个拷贝的核酸序列，该反义DNA片段对所述至少一个第一靶基因的至少一个片段是反义的；c)包含来自至少一个靶基因的正义DNA片段的核酸序列；d)包含靶基因的至少一个正义DNA片段的多个拷贝的核酸序列；e)转录为用于通过形成双链RNA抑制靶基因的RNA并且包含至少一个对所述靶基因的全部或部分反义的片段和至少一个含有所述靶基因的片段的正义DNA片段的核酸序列；f)转录为用于通过形成单个双链RNA抑制靶基因的RNA，并且包含对所述靶基因的至少一个片段为反义的多个系列反义DNA片段和含有所述靶基因的至少一个片段的多个系列正义DNA片段的核酸序列；g)转录为用于通过形成多个双链RNA抑制靶基因的RNA，并且包含对所述靶基因的至少一个片段为反义的多个片段和所述靶基因的多个正义DNA片段的核酸序列，并且其中所述多个反义DNA片段和所述多个正义DNA片段以系列的反向重复序列排列；h)包含源自植物miRNA的核苷酸的核酸序列；以及i)编码至少一个干扰病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒末端序列的核酸序列。本发明还提供一种植物，其中所述至少一个异源核酸序列的表达导致对选自蕃茄斑萎病毒、菜豆金色花叶病毒和马铃薯X病毒中的两种或更多种病毒的抗性。所述植物还可以进一步包含非转基因植物病毒抗性性状。
在本发明的另一方面中，提供包含对多种植物病毒种的抗性的番茄植物的任何世代的转基因种子，其中所述抗性通过至少两种不同的选自dsRNA、miRNA和病毒颗粒组装抑制的作用方式提供。
在又另一方面中，本发明提供一种赋予番茄植物对多种植物病毒种的抗性的方法，所述方法包括在所述植物中表达至少两个共同提供对所述多种植物病毒种的抗性的核酸序列，其中利用至少两种不同的作用方式提供该抗性，包括至少两个选自dsRNA、miRNA和干扰病毒颗粒组装的序列中的序列的表达。在特定实施方式中，所述抗性包括对菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性。
所述对至少一种所述植物病毒种提供的抗性可以通过产生dsRNA的核酸构建体的表达提供。在特别实施方式中，对至少一种所述植物病毒种提供的抗性通过dsRNA融合构建体的表达提供。在更特别的实施方式中，所述dsRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。在又更特别的实施方式中，所述核酸构建体包含选自SEQ ID NO：379-455中的序列。
在其它实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供。在一个实施方式中，设想抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过由交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。所产生的miRNA可以进一步干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。在特别的实施方式中，所述miRNA包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列。
因此，在特定的实施方式中，(a)抗菜豆金色花叶病毒的抗性通过干扰菜豆金色花叶病毒复制基因表达的dsRNA的表达提供；(b)抗蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性通过干扰毒外壳蛋白基因或病毒移动蛋白基因表达的dsRNA的表达提供；(c)抗马铃薯X病毒的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供；或者(d)抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过由交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
在一些实施方式中，对至少一种植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段末端序列的表达提供。在特定实施方式中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装提供，其中病毒颗粒组装通过包含在核酸构建体内的序列抑制，该核酸构建体包含第一核酸片段和第二核酸片段，其中所述第一和第二片段是基本上彼此的反向重复序列并且通过第三核酸片段连接到一起，且其中所述第三片段包含至少一个蕃茄斑萎病毒基因组片段的末端序列，其表达抑制病毒颗粒组装。进一步地，在特别实施方式中，所述第三核酸可以包含选自下组的蕃茄斑萎病毒基因组末端序列：CaCV或GBNV L基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV M基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV S基因组片段的末端序列和蕃茄斑萎病毒基因组末端重复序列。在更特别的实施方式中，所述末端序列或末端重复序列包含SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ IDNO：376、SEQ ID NO：377或SEQ ID NO：378。
在本发明的其它实施方式中，所述多种植物病毒种选自双生病毒科、布尼亚病毒科和弯曲病毒科中的至少两科。因此，所述病毒可以选自马铃薯X病毒属、蕃茄斑萎病毒属和菜豆金色花叶病毒属。在特定的实施方式中，所述病毒选自：a)TYLCV、ToSLCV、ToLCNDV、PHYVV、PepGMV的一种或多种；b)TSWV、GBNV、CaCV的一种或多种；以及c)PepMV。
在其它实施方式中，所述核酸序列包含至少一个抑制至少一个第一靶基因的基因抑制元件。例如，所述方法可以包括在所述植物中表达：(a)至少一个选自SEQ ID NO：379-454中的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455中的序列；(b)至少一个选自SEQ ID NO：379-454中的序列和至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列；或者(c)至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455中的序列。
本发明的另一方面提供包含对多种植物病毒种抗性的番茄植物的转基因细胞，其中所述抗性通过至少两种不同的选自dsRNA、miRNA和病毒颗粒组装抑制的作用方式提供。
术语“大约”用于表示包括使用来测定该值的装置或方法的误差的标准差的值。虽然本公开支持仅涉及择一方案或涉及“和/或”的定义，但是权利要求中使用术语“或”是用于表示“和/或”，除非明确指出仅涉及择一方案或者所述择一方案互相排斥。在权利要求中未使用连接封闭的措辞或者以其它方式特别注明时，词语“一个”和“一”表示“一或多”。因此，例如术语“由一转基因赋予”包括一个或多个转基因。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式的系动词。这些动词的一个或多个的任何形式或时态也是开放式的，例如“包含”、“包含有”、“具有”、“有”、“包括”和“包括有”。例如，任何“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的方法不限于仅具有这一个或多个步骤，还涵盖其它未列出的步骤。同样，任何“包含”、“具有”或“包括”一个或多个性状的植物不限于仅具有这一个或多个性状，而是涵盖其它未列出的性状。
通过下面的详细描述，本发明的其它目的、特点和优点将变得明显。然而，应当理解，提供的详细描述和任何具体实施例(尽管给出了本发明的具体实施方式)仅以说明的方式给出，因此本发明的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员来说通过这些详细描述将变得显而易见。
发明详述
下面是提供用于帮助本领域技术人员实践本发明的本发明详细描述。本领域的普通技术人员可以在此处描述的实施方式中进行修改和变更而不脱离本发明的精神或范围。
本发明提供遗传控制植物的病毒性疾病的方法和组合物，包括茄科植物，例如番茄(即，番茄属(Lycopersicon)或茄属(Solanum)的种)、胡椒(即，辣椒属(Capsicum)的种)、牵牛花(即，矮牵牛属(Petunia)的种)以及马铃薯和茄子(即，茄属的种)。在一个实施方式中，RNA介导的基因抑制可以通过反向重复序列转基因盒的表达赋予，该反向重复序列转基因盒产生源自转基因转录物的dsRNA区域的小干扰RNA(siRNA)的群。另一RNA介导的基因抑制途径是通过一个或多个“靶向”特定转录物并导致它们降解的miRNA片段的表达。因此，根据本发明，可以利用包括工程化dsRNA、miRNA、ta-siRNA和/或相位siRNA的方法。例如，还可以利用菜豆金色花叶病毒源的或者其它病毒源的靶向于复制、外壳蛋白及C2和/或C3蛋白的序列。类似地，为了控制马铃薯X病毒如黄瓜花叶病毒，可以使用靶向外壳(衣壳)蛋白(“CP”)、复制蛋白如RNA依赖性RNA聚合酶(“RdRP”)和/或一种或多种移动蛋白(“MP”)(其可包括三基因块(“TGB”)或“30K”MP)的部分的序列。为了控制蕃茄斑萎病毒，可以类似地利用靶向于例如外壳蛋白(“CP”，也称作核壳，“N”蛋白)、RdRP、移动蛋白(“NsM”)和/或非结构糖蛋白(glyocoprotein)(由“G1”或“G2”基因编码)的序列。这类序列可以精确地对应于来自一个或多个病毒隔离群的序列，或者可以是变体，例如设计来提高它们的抗病毒效力，或者避免非靶向效应。
在特定实施方式中，多重病毒抗性(“MVR”)通过利用由单个转化构建体或者一个以上的构建体表达的dsRNA和/或miRNA实现。进一步地，单个构建体可以包含一个或多个产生靶向于植物病毒感染、繁殖和/或传播必需的一种或多种功能的dsRNA和/或miRNA的表达盒，以及在特定实施方式中，一个或多个产生编码被目标蛋白或蛋白的部分的至少一个mRNA的表达盒。因此，对多种植物病毒的抗性可以在单个转基因“事件”中实现。对于双生病毒抗体，RNA介导的抗性可以进一步通过基于蛋白质的途径提高，该途径利用抑制复制酶或复制相关蛋白、ssDNA结合蛋白如m13-G5的复制、表达或突变的适体(例如，美国专利6,852,907；Padidam等人，1999)，或者也可以使用干扰双生病毒复制的肽适体(例如，Lopez-Ochoa等人，2006)。
还设想病毒颗粒组装抑制(例如通过基于核酸的途径)可以用作对番茄植物提供病毒抗性的作用方式。例如，这一病毒颗粒组装抑制可以通过例如使用蕃茄斑萎病毒末端序列如末端重复序列提供。“病毒颗粒组装抑制”意指干扰可以共同形成病毒颗粒(“病毒体”)的病毒衣壳蛋白和核酸之间的相互作用。例如，这种干扰可以通过起到与逆转录酶竞争的人工底物作用的序列的表达发生，和/或可以通过干扰复制病毒基因组成分的正确环化发生。
此外，可以利用番茄、胡椒和其它茄科植物中用于耐受的经典遗传抗性基因座，例如通过经典育种方法。在特定实施方式中，还提供例如使用蕃茄斑萎病毒“N”基因(核壳；外壳蛋白)加/减反向重复序列和马铃薯X病毒(例如，黄瓜花叶病病毒)外壳蛋白(CP)和复制酶的基于蛋白质的方法。
基因抑制的方法可以包括使用反义、共抑制和RNA干扰。植物中的反义基因抑制由Shewmaker等人描述在美国专利5,107,065、5,453,566和5,759,829号中。细菌中使用与编码被抑制基因的mRNA互补的DNA的基因抑制由Inouye等人披露在美国专利5,190,931、5,208,149和5,272,065号中。RNA干扰或RNA介导的基因抑制已被例如Redenbaugh等人，1992；Chuang等人，2000；和Wesley等人，2001描述。
已经描述了RNA介导的基因抑制中涉及的数个细胞途径，各通过特征性的途径和特异性的成分区分。例如，参见Brodersen和Voinnet(2006)以及Tomari和Zamore(2005)的综述。siRNA途径包括双链RNA非相性裂解(non-phased cleavage)为小干扰RNA(“siRNA”)。微RNA途径包括微RNA(“miRNA”)、一般约19到约25个核苷酸(植物中通常约20-24个核苷酸)的非蛋白编码RNA，其指引目标转录物的反式裂解，从而反向调节各种调节和发育途径中涉及的基因的表达；参见Ambros等人(2003)。植物miRNA已通过一组特征进行定义，包括通过DCL1加工成单个特异性～21核苷酸的miRNA的配对茎环前体，单配对的来自具有两核苷酸的3′悬端的双链RNA前体的miRNA和miRNA*物质的表达，和反式特异性靶标的沉默(参见Bartel(2004)；Kim(2005)；Jones-Rhoades等人(2006)；Ambros等人(2003))。在所述反式作用siRNA(“ta-siRNA”)途径中，miRNA用于在需要用于产生双链RNA前体的RNA依赖性RNA聚合酶的过程中指引siRNA初级转录物的同相加工；反式作用siRNA由缺乏二级结构、启动双链RNA产生的miRNA靶位点，需要DCL4和RNA依赖性RNA聚合酶(RDR6)以及产生具有含2-核苷酸的3’悬端的精确匹配双链体的多个精确定相～21-nt小RNA(参见Allen等人，2005)定义。
许多微RNA基因(MIR基因)已被确认并在数据库向公众公开(“miRBase”，可通过www.microrna.sanger.ac.uk/sequences在线获得；还参见Griffiths-Jones等人(2003))。另外的MIR基因和成熟miRNA也描述在美国专利申请公开2005/0120415和2005/144669中，它们通过引用的方式并入到本申请中。MIR基因家族看起来是大量的，估计占至少一些基因组的1％，并能够影响或者调节大约全部基因的三分之一的表达(参见，例如Tomari等人(2005)；Tang(2005)；和Kim(2005))。已报道MIR基因出现在基因间区域，为分离的和在基因组的簇中的，但是也可以全部或部分位于其它基因(蛋白编码的和非蛋白编码的)的内含子内。最近的关于miRNA生物发生的综述参见Kim(2005)。MIR基因的转录可以(至少在一些情况中)由MIR基因自己的启动子控制。初级转录物(称作“pri-miRNA”)可以非常的大(数千个碱基)并且可以是多顺反子的，包含一个或多个pre-miRNA(含有加工为成熟miRNA的茎环排列的折叠结构)以及通常的mRNA的5’“帽”和多腺苷酸尾。例如，参见Kim(2005)中的图1。
还可以使用“相位小RNA基因座”，其转录为形成单个折叠结构的RNA转录物，该单个折叠结构在体内同相裂解成多个能够抑制靶基因的小双链RNA(称作“相位小RNA”)(例如，美国专利申请公开20080066206)。与siRNA相反，相位小RNA转录物是同相裂解的。与miRNA相反，相位小RNA转录物通过DCL4或DCL4样同源核糖核酸酶(非DCL1)裂解以产生能够沉默靶基因的多种丰富小RNA。与ta-siRNA途径相反，所述相位小RNA基因座转录为形成独立于RNA依赖性RNA聚合酶的杂交RNA并且不具有启动双链RNA产生的miRNA靶位点的RNA转录物。基于相位小RNA基因座设计的新型重组DNA构建体可用于抑制一个或多个靶基因，而不需要使用miRNA、ta-siRNA或设计为形成用于加工成siRNA的发夹结构的表达载体。此外，与相位小RNA对应的识别位点可用于抑制其中适当的相位小RNA内源性表达或作为转基因表达的细胞或组织中的靶序列。
A.病毒靶标
根据本发明，提供了赋予植物对多种病毒的抗性的方法和组合物，包括茄科植物，如番茄。本发明中抗性可以靶向的病毒包括但不限于来自双生病毒、蕃茄斑萎病毒和马铃薯X病毒中的两种或更多种病毒。图1显示这些病毒属的典型基因组组构。
1.菜豆金色花叶病毒
双生病毒科为大的、多样性的植物病毒科，其感染很多种植物并引起全球性的作物重大损失。它们的特征是双二十面体外壳和通过dsDNA中间体进行复制的圆形ssDNA基因组。双生病毒(此处“菜豆金色花叶病毒”和“双生病毒”可互换使用)依赖于植物的核DNA和RNA聚合酶进行复制和转录。这些病毒对于它们的复制和转录仅提供少数因素。双生病毒科包括三个主要的属(以前称作“亚组”)，其在昆虫媒介、宿主范围和基因组结构上不同。
双生病毒科亚组I(玉米线条病毒属(Mastrevirus))包括通常感染单子叶植物并具有单组分基因组的叶蝉传播病毒。
双生病毒科亚组III(菜豆金色花叶病毒属)包括感染双子叶植物病并最普遍具有二分基因组的粉虱传播病毒。
双生病毒科亚组II(曲顶病毒属(Curtovirus))病毒通过叶蝉传播并具有像亚组I的单组分基因组，但是像亚组III一样感染双子叶植物。
2.蕃茄斑萎病毒
蕃茄斑萎病毒属(Tospovirus)中的病毒引起严重的世界性农作物损失。属名来自蕃茄斑萎病毒(“TSWV”)。番茄的斑萎病最早于1915年在澳大利亚观察到，之后显示为病毒源的。直到20世纪90年代早期，TSWV被认为是植物病毒的番茄斑萎病组的唯一成员。几种相似病毒(包括凤仙花属坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus)(INSV)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus)(“CaCV”)、花生芽坏死病毒(Peanut budnecrosis virus)(也称作落花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus)，“GBNV”)和番茄枯黄斑点病毒(Tomato chlorotic spot virus))的识别和鉴定导致建立布尼亚病毒科内的植物感染蕃茄斑萎病毒属。该属包括一大群的主要动物感染的病毒。此后超过二十种蕃茄斑萎病毒被识别和鉴定，并且所述属的先前未知的种继续经常地被描述。
蕃茄斑萎病毒具有双义极性(ambisense polarity)的三分RNA基因组。所述基因组的三个部分称作“L”片段、“M”片段和“S”片段。发现所述RNA基因组的各个部分的共有末端序列，其由3’端的UCUCGUUAGC片段(SEQ ID NO：167)和5’端的AGAGCAAUCG片段(SEQ ID NO：168)限定。最大的RNA(所述“L片段”)编码复制酶。中等大小的RNA(“M片段”)编码互补-有义RNA中的糖蛋白G1和G2和基因组有义RNA中的非结构蛋白(NSm)。最小片段(“S片段”)编码互补-有义RNA中的核壳体蛋白(N)和基因组有义RNA中的细胞间运动(NSs)。所述病毒通过花蓟马属(Frankliniella)(5个种)和蓟马属(Thrips)(3个种)中的牧草虫传播。所述病毒的机械传播也是可能的。TSWV可以感染超过属于70个植物科的925个植物种，而其它蕃茄斑萎病毒种具有窄得多的宿主范围。
3.马铃薯X病毒
黄瓜花叶病病毒(PepMV)是弯曲病毒科中的代表性马铃薯X病毒，并以高度的可能性高度感染以引起受保护的番茄产量的损失。如果不采取行动消除感染，严重的农作物损失是可能的。所述病毒容易经过污染的工具、人的手或衣服，以及通过植物间直接接触而扩散。它还可以通过嫁接或当采用来自被感染的母本植物的接枝时被感染。使用外壳蛋白介导的抗性可以提供良好的抗性。然而，包括对于CP的反向重复序列可以增强耐抵线的产生。
B.核酸组成和构建体
本发明提供用于在转基因植物中实现对来自菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒和马铃薯X病毒中的多种(即，超过一种)病毒种和病毒株的抗性的重组DNA构建体和方法。在特定实施方式中，对选自菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒和马铃薯X病毒中的至少两组的2、3、4、5、6、7、8或者更多的病毒种赋予抗性。所述抗性可以通过产生siRNA或miRNA的指引，并且还可以通过基于蛋白的途径进行补充，例如通过表达的外壳蛋白或复制酶、复制酶的突变形式和适体的产生介导的抗性。还可以利用基于遗传的耐受性(即，如在经典育种方法中确定的)。
此处使用的术语“核酸”指的是单链或双链的从5’到3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的聚合物。所述“核酸”还可以任选地包含非天然存在的或改变的核苷酸碱基，其允许聚合酶正确阅读而不降低该核酸编码的多肽的表达。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”指的是作为单个单链或处于双链体中的核酸的正义和反义链。术语“核糖核酸”(RNA)包括dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、tRNA(转运RNA，不论是否携带或不携带相应的酰化氨基酸)以及cRNA(互补RNA)；术语“脱氧核糖核苷酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA及DNA-RNA杂合体。本领域技术人员可以理解词语“核酸片段”、“核苷酸序列片段”或更普遍的“片段”为包括表达或者可以适应于表达蛋白、多肽或肽的基因组序列、核糖体RNA序列、转运RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列和较小的工程化核苷酸序列的功能性术语。
此处使用的涉及核酸序列的术语“基本同源的”或“基本同源性”包括严格条件下与SEQ ID NO：169-455中任一杂交的核苷酸序列或者其部分或互补序列是使得能够在所述两个序列之间进行反平行比对的那些，然后所述两个序列能够在严格条件下与相对链上的对应碱基形成氢键从而形成双链分子，其在适当严格性(包括高严格性)条件下是充分稳定的，从而可使用本领域公知的方法检测。基本同源序列可以与序列表所列的参照核苷酸序列或其互补序列具有约70％～约80％的序列同一性，或者更优选约80％～约85％的序列同一性，或者最优选约90％～约95％的序列同一性，或约99％的序列同一性。
此处使用的术语“直系同源”指的是两种或更多种物种中从共同祖先核苷酸序列进化的基因，并且可以在所述两种或更多种物种中保持相同的功能。
此处使用的术语“序列同一性”、“序列相似性”或“同源性”用于描述两个或者更多个核苷酸序列之间的序列关系。两个序列之间“序列同一性”的百分数通过在比较窗口(例如所指SEQ ID NO的全长)内比较两个最佳对准的序列而确定，其中所述比较窗口中的序列部分可以包含与用于两个序列的最佳比对的参照序列(其不包括添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)。所述百分数通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口内总的位置数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分数。与参照序列比较，在每个位置相同的序列被认为与所述参照序列相同，反之亦然。如果沿5’到3’方向观察的第一核苷酸序列显示与沿3’到5’方向观察的第二或参照序列具有完全的互补性，所述第一核苷酸序列被认为是第二或参照核苷酸序列的“互补序列”，或者与第二或参照核苷酸序列互补。如此处使用的，当从5’到3’阅读的一个序列的每个核苷酸与从3’到5’阅读的另一序列的每个核苷酸互补时，核酸序列分子被认为显示“完全的互补性”。与参照核苷酸序列互补的核苷酸序列将显示与所述参照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和说明在本领域被很好地定义且很容易被本领域普通技术人员理解。
此处使用的“比较窗口”指的是至少6个、通常约50～约100个、更通常约100～约150个连续位置的概念片段，在其中在两个序列最佳对准后，将一个序列与相同数目连续位置的参照序列进行比较。对于所述两个序列的最佳对准，所述比较窗口可以包含与所述参照序列(其不包含添加或缺失)相比约20％或更少的添加或缺失(即，缺口)。本领域技术人员应当参考用于序列比对的详细方法，例如在Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0(Genetics Computer Group，575ScienceDrive Madison，Wis.，USA)中。
本发明提供一个或多个能够在细胞或微生物中表达为RNA转录物的DNA序列以抑制至少一种植物病毒的靶基因表达。所述序列包含用于编码一个或多个不同核苷酸序列的DNA分子，其中各个不同的核苷酸序列包含正义核苷酸序列和反义核苷酸序列。所述序列可以通过间隔序列连接。所述间隔序列可以构成所述正义核苷酸序列或所述反义核苷酸序列或无关核苷酸序列的部分，并且在所述正义和反义序列之间的dsRNA分子内形成。例如，所述间隔序列可以包含至少约10-100个核苷酸长度、或者至少约100-200个核苷酸长度、至少约200-400个核苷酸长度、或者至少约400-500个核苷酸长度的核苷酸的序列。所述正义核苷酸序列或所述反义核苷酸序列可以与靶基因或其衍生物或其互补序列的核苷酸序列基本相同。所述dsDNA分子可以可操作地置于一个或多个在表达所述dsDNA以产生RNA分子的宿主的细胞、组织或器官中起作用的启动子序列的控制下。此处使用的“表达的”或“表达”等指的是RNA分子从被转录的多核苷酸转录。所述RNA分子可以翻译或不翻译成多肽序列。
本发明还提供用于在植物细胞中表达的DNA序列，该植物在DNA表达为RNA和与植物病毒接触时实现靶病毒基因或病毒复制或症状(即，症状的表达)的抑制。在植物中表达基因抑制分子的方法是已知的(例如，美国公开2006/0200878 A1；美国公开2006/0174380；美国公开2008/0066206；Niu等人，2006)，并且可以用于表达本发明的核苷酸序列。
适合用于本发明的重组DNA构建体的非组成型启动子包括空间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包括细胞器、细胞、组织或器官特异性的启动子(例如，分别抑制质体、根、花粉或种子中的第一靶RNA表达的质体特异性、根特异性、花粉特异性或种子特异性启动子)。在许多情况下，种子特异性、胚胎特异性、糊粉特异性或胚乳特异性启动子是特别有用的。发育特异性启动子可以包括倾向于在植物生长周期的特定发育阶段过程中或者一年中的不同季节中促进表达的启动子。诱导型启动子包括通过化学物质或通过环境条件(例如，但不限于，生物或非生物应激(如，水分亏缺或干旱、热、冷、高或低营养或盐水平、高或低光水平或者害虫或病原体感染))诱导的启动子。关注的还有微RNA启动子，特别是具有发育特异性、空间特异性或诱导型表达模式的那些。表达特异性启动子还可以包括通常被组成型表达、但是以不同程度或“强度”表达的启动子，包括通常视为“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
因此，根据本发明的用于植物病毒控制的基因序列或片段可以克隆到一个或多个启动子的下游，该启动子在转基因植物细胞中是可操作的并在其中表达以在转基因植物细胞中产生形成dsRNA分子的mRNA。植物可表达启动子的很多实例在本领域中是公知的(例如，CaMV 35S；FMV 35S；PClSV(例如，美国专利5,850,019)；ScBV；AtAct7，及其它)。用于在植物中表达多肽的启动子包括Odell等人(1985)中描述的诱导型、病毒的、合成的或组成型的那些，和/或时间调节的、空间调节的和时间-空间调节的启动子。许多器官特异性启动子已被识别并在本领域中是已知的(例如，美国专利5,110,732；5,837,848；5,459,252；6,229,067；Hirel等人1992)。包含在植物组织中的dsRNA分子在植物中表达，由此实现目标病毒基因表达的预期抑制。花椰菜花叶病毒35S启动子(转基因植物应用中常见的原型强启动子)或相关的启动子(例如E35S或FMV启动子)可以用于驱动病毒抗性基因。启动子也已被确认指导组织特异性基因表达。
转基因转录元件包括编码目标基因的DNA序列。目标基因可以包括来自病毒种的任何编码或非编码序列。通过转基因转录元件表达的非编码序列的非限制性的实例包括但不限于5′非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区域、3′非翻译区、终止子、内含子、微RNA、微RNA前体DNA序列、小干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、小核仁RNA、能够结合配体的RNA适体和其它非编码RNA。
目标基因的非限制性的实例进一步包括但不限于可翻译(编码)序列，例如编码编码转录因子的基因和参与目标分子(例如，氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物以及次级代谢产物，包括生物碱、萜类、聚酮、非核糖体肽和混合的生物合成来源的次级代谢产物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。目标基因可以是本发明的重组DNA构建体在其中转录的细胞(例如，植物细胞)天然的基因，或者可以是非天然的基因。目标基因可以是标记基因，例如编码抗生素、抗真菌剂或除草剂抗性的选择标记基因，或者编码容易检测性状(例如，在植物细胞中的八氢番茄红素合酶或其它赋予植物特殊色素的基因)的标记基因，或者编码可检测分子(例如分别通过蛋白质或核酸检测方法可检测的荧光蛋白、萤光素酶或者独特的多肽或核酸“标签”)的基因。选择标记是在确认本发明的构建体的成功加工中特别有用的目标基因。
目标基因包括可以描述为“靶基因”的那些基因。所述靶基因可以包括靶向于抑制的单个基因或单个基因的部分，或者可以包括例如靶基因的多个连续片段、靶基因的多个非连续片段、靶基因的多个等位基因、或者来自一个或多个物种的多个靶基因。所述靶基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(例如非编码的调控序列)，或者同时是两者。所述转基因转录单元可以进一步包括所述转基因的转录需要的5’或3’序列或者这两者。在其它实施方式(例如，当希望跨多个株或种(例如病毒)抑制靶基因时的)中，它可能希望被设计为加工成用于抑制其中所述靶基因被沉默的多个株或种共有的靶基因序列的成熟miRNA的重组DNA构建体。因此，由所述重组DNA构建体加工的miRNA可以被设计为对一个分类单位是特异性的(例如，对属、科是特异性的)，但对其它分类单位不是特异性的。
序列表中的核酸分子或核酸分子的片段或其它核酸分子在特定情况下能够特异性地与其它的核酸分子杂交。如此处使用的，如果两个分子能够形成反平行的、双链的核酸结构，这两个核酸分子被认为能够特异性地相互杂交。如果一个核酸分子与另一核酸分子显示完全的互补性，一个核酸分子被认为是另一核酸分子的互补序列。如果两个分子可以以足够稳定性相互杂交以允许它们在至少常规的“低严格性”条件下保持相互退火，则它们被认为是“最低互补的”。类似地，如果分子可以以足够稳定性相互杂交以允许它们在常规的“高严格性”条件下保持相互退火，则它们被认为是互补的要。常规的严格性条件由Sambrook等人(1989)和Haymes等人(1985)描述。
因此，偏离完全互补性是允许的，只要该偏离不完全排除所述分子形成双链结构的能力。由此，为了使核酸分子或核酸分子的片段充当引物或探针，它仅需要在序列上充分互补以便能够在使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
例如，引起DNA杂交的适当的严格性条件用于需要高选择性、相对低盐和/或高温条件的应用，例如用约50℃～约70℃温度下的约0.02M～约0.15M NaCl提供。例如，高严格性条件为使用高严格性冲洗缓冲液(0.2×SSC或1×SSC，0.1％SDS，65℃)冲洗杂交过滤器至少两次。其它条件，例如在约45℃6.0×氯化钠/柠檬酸盐(SSC)之后在50℃用2.0×SSC冲洗，对本领域技术人员来说是已知的，或者可以在CurrentProtocols in Molecular Biology(1989)中找到。例如，冲洗步骤中的盐浓度可以选自50℃下约2.0×SSC的低严格性到50℃下约0.2×SSC的高严格性。此外，冲洗步骤中的温度可以从室温(约22℃)的低严格性条件增加到约65℃的高严格性条件。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度任一可以保持恒定，而另一变量改变。用于本发明的核酸可以在这些条件下特异性地与一个或多个来自植物病毒的核酸分子或其互补序列杂交，该植物病毒选自蕃茄斑萎病毒、菜豆金色花叶病毒和马铃薯X病毒。在特别的实施方式中，用于本发明的核酸将显示与序列表中给出的一个或多个核酸分子或其互补序列至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或甚至约100％的序列同一性。
本发明的核酸也可以通过本领域已知的方法全部或者部分合成，特别是当希望提供植物优先序列时。因此，本发明的核酸的全部或者部分可以使用所选择的宿主优先的密码子合成。例如，种优先密码子可以由在特定宿主物种中表达的蛋白质中最常使用的密码子确定。其它的核苷酸序列的修饰可以形成具有轻微改变的活性的突变体。
DsRNA或siRNA核苷酸序列包括聚合核糖核苷酸的双链，并可以包含对磷酸酯-糖骨架或核苷的修饰。RNA结构中的修饰可以特别调整以允许特异性的遗传抑制。在一个实施方式中，所述dsRNA分子可以经过酶学过程修饰，由此可以产生siRNA分子。或者，构建体可以工程化以表达用于miRNA或siRNA介导的抗性途径中的核苷酸片段。所述siRNA可以有效地介导对于一些病原体中的一些靶基因的下调效应。该酶学过程可以在真核RNAi途径中通过使用存在于昆虫、脊椎动物、真菌或植物的细胞中的RNAse III酶或DICER酶完成(Elbashir等人，2001；Hamilton和Baulcombe，1999)。该过程也可以利用通过本领域技术人员容易知晓的重组DNA技术引入到目标昆虫的细胞中的重组DICER或RNAse III。DICER酶和RNAse III(天然存在于病原体中或者通过重组DNA技术制备)将较大的dsRNA链裂解成较小的寡核苷酸。所述DICER酶特异性地将dsRNA分子切割成siRNA片段，其各为约19-25个核苷酸长度，而RNAse III酶通常将dsRNA分子裂解成12-15个碱基对的siRNA。通过所述的任一酶产生的siRNA分子具有2～3个核苷酸的3’悬端，以及5’磷酸酯和3’羟基末端。通过RNAse III酶产生的siRNA分子与在真核RNAi途径中通过Dicer酶产生的分子是相同的，且随后在它们解绕、分离成单链RNA并与靶基因转录的RNA序列杂交后通过固有的细胞RNA降解机制靶定和降解。该过程导致有效降解或消除病原体中靶基因的核苷酸序列编码的RNA序列。结果是所述病原体内特别靶定的核苷酸序列的沉默。酶学过程的详细描述可以在Hannon(2002)中找到。
本发明的核苷酸序列可以记录在计算机可读介质上。此处使用的“计算机可读介质”指的是任何可以通过计算机直接阅读和访问的实体表达介质。这些介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘、存储介质和磁带；例如CD-ROM的光存储介质；例如RAM和ROM的电存储介质；光学字符识别格式化计算机文件(optical characterrecognition formatted computer file)，和这些种类的混合例如磁/光存储介质。技术人员可以容易地理解：任何目前已知的计算机可读介质可以用于创建包含其上记录有本发明的核苷酸序列的计算机可读介质的产品。
此处使用的“记录”指的是在计算机可读介质上存储信息的过程。技术人员可以容易的采取任何目前已知的在计算机可读介质上记录信息的方法以产生包含本发明的核苷酸序列信息的介质。为了创建其上记录有本发明的核苷酸序列的计算机可读介质，技术人员可使用多种数据存储结构。数据存储结构的选择通常基于选择访问所储存信息的手段。此外，多种数据处理器程序和格式可以用于在计算机可读介质上储存本发明的核苷酸序列信息。所述序列信息可以描述在文字处理文本文件中，在例如WordPerfect和Microsoft Word的商购软件中格式化，或者以ASCII文本文件的形式描述，存储在数据库应用中，例如DB2、Sybase、Oracle等。技术人员可以容易地采取多种数据处理器结构格式(例如，文本文件或数据库)，以便获得在其上记录有本发明的核苷酸序列信息的计算机可读介质。
允许技术人员访问计算机可读介质中提供的序列信息的计算机软件是可公开获得的。在Sybase***上实施BLAST(Altschul等人，1990)和BLAZE(Brutlag等人，1993)检索算法的软件可以用于确认序列内的开放阅读框(ORF)，例如此处提供的并且包含与来自其它生物体的ORF或蛋白质的同源性的Unigenes和EST’s。这些ORF是本发明的序列内的蛋白质编码片段，且可用于产生商业上重要的蛋白质，例如氨基酸生物合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白质降解、蛋白质修饰以及DNA复制、限制性切割、修饰、重组和修复中使用的酶。
此处使用的“靶标”、“靶结构基序”或“靶基序”指的是任何合理选择的序列或序列的组合，其中所述一个或多个序列在需要时基于在靶基序或其核苷酸序列的折叠时形成的三维结构进行选择。存在本领域已知的多种靶基序。
C.核酸表达和靶基因抑制
本发明提供(作为实例)一种病原性目标生物体的转化宿主植物、转化植物细胞和转化植物及其后代。所述转化植物细胞和转化植物可以工程化以在异源启动子的控制下表达一个或多个dsRNA、miRNA或mRNA序列，从而如在此处描述的提供病原体保护效应。这些序列可以用于病原体中的基因抑制，从而在受保护的转化宿主生物体上降低病原体引起的疾病的水平的发病率。此处使用的词语“基因抑制”指的是作为基因转录为mRNA和随后mRNA的翻译的结果降低产生的蛋白质水平的任何公知方法。
基因抑制还意图表示降低基因或编码序列的蛋白质表达，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制通过靶向于抑制的基因或编码序列转录的mRNA的全部或部分与用于抑制的对应双链RNA之间的同源性来介导，并且指的是可用于细胞中核糖体结合的可用mRNA量的实质和可测量的降低或通过核糖体的翻译的阻止。所述转录RNA可以为正义方向的以实现所谓的共抑制；为反义方向的以实现所谓的反义抑制；或者为两个方向的从而产生实现所谓RNA干扰(RNAi)的dsRNA。
基因抑制也可以有效对抗可能与包含基因抑制剂的植物材料接触的植物病毒中的靶基因，该基因抑制剂特别地设计阻止或抑制病毒的一个或多个同源或互补序列的表达。通过反义或正义定向的RNA调节植物细胞中的基因表达的转录后基因抑制披露在美国专利5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020号中。使用dsRNA抑制植物的基因披露在WO 99/53050、WO 99/49029、美国公开2003/017596号、美国专利申请公开2004/0029283中。
对植物病毒的转录后基因抑制的有益方法同时使用正义定向和反义定向的转录RNA，其例如作为发夹或者茎和环结构被稳定(例如，美国公开2007/0259785)。用于实现转录后基因抑制的DNA构建体可以是其中第一片段编码显示与用于靶向抑制的基因的片段基本同一性的显示反义方向的RNA的构建体，其连接编码显示与所述第一片段的基本互补性的RNA的第二片段。这种构建体通过所述第一片段和第二片段的杂交和来自连接所述两个片段的核苷酸序列的环结构形成茎环结构(参见WO94/01550、WO98/05770、US2002/0048814和US2003/0018993)。如上面所说明的(例如，WO05/019408)，也可以使用与另外的靶基因片段的共表达。
根据本发明的一个实施方式，本发明提供一种外源性核苷酸序列(即，非天然存在于宿主植物细胞的基因组中的)，其表达导致序列上与选自蕃茄斑萎病毒、菜豆金色花叶病毒和马铃薯X病毒的植物病毒的靶基因的RNA分子基本相似的RNA序列的转录，其包含所述病毒的基因组内的核苷酸序列编码的RNA序列。基本相似意指所述外源RNA序列能够实现病毒基因组中靶序列的RNA介导的基因抑制。因此，实现了对应所述靶基因的核苷酸序列表达的下调。
在本发明的特定实施方式中，可以利用SEQ ID NO：169-455任一个的核酸序列或其互补序列的至少21个连续核苷酸的片段的表达，包括最高达21、36、60、100、550或1000个连续核苷酸的片段，或者显示与该序列或其互补序列90-100％同一性的序列的表达。在具体实施方式中，本发明提供的核苷酸序列可以包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中的序列。在其它具体实施方式中，本发明提供的核苷酸序列可以包含选自SEQ ID NO：379-455中的序列。在再其它实施方式中，本发明提供的核苷酸序列可以描述为包含一个或多个任意SEQ ID NO：169-455的序列的核苷酸1-21、22-50、51-100、101-150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-450、451-500、501-550、551-600、601-650、651-700、701-750、751-800、801-850、851-900、901-950、951-1000、1001-1050、1051-1100、1101-1150、1151-1200、1201-1250、1251-1300、1301-1350、1351-1400、1401-1450、1451-1500、1501-1550、1551-1600、1601-1650、1651-1700、1701-1750、1751-1800、1801-1850、1851-1900、1901-1950、1951-2000、2001-2050、2051-2100、23-75、76-125、126-175、176-225、226-275、276-325、326-375、376-425、426-475、476-525、526-575、576-625、626-675、676-725、726-775、776-825、826-875、876-925、926-975、976-1025、1026-1075、1076-1125、1126-1175、1176-1225、1226-1275、1276-1325、1326-1375、1376-1425、1426-1475、1476-1525、1526-1575、1576-1625、1626-1675、1676-1725、1726-1775、1776-1825、1826-1875、1876-1925、1926-1975、1976-2025、2026-2075、2076-2125、1-550、200-750、300-850、400-950、500-1050、600-1150、700-1250、800-1350、900-1450、1000-1550、1100-1650、1200-1750、1300-1850、1400-1950、1500-2050，直到该序列的全长中的一个或多个。可设想与SEQ ID NO：169-455或者SEQ IDNO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的任意一个或多个的全部或部分互补的序列，其中所述序列的表达抑制SEQ ID NO：169-455的核苷酸序列编码的任何一个或多个基因的表达。用于表达以产生dsRNA的排列序列可以与下述结合：(1)设计用于产生miRNA的序列，包括在交叉重叠的miRNA盒中；和/或(2)用于抑制病毒组装的序列，从而协同地抑制目标病毒。选择特异性亚序列作为miRNA或siRNA介导的基因抑制的靶标的方法在本领域是已知的(例如，Reynolds等人，2004)，
使用本发明的dsRNA技术的靶基因抑制是序列特异性的，其中对应所述RNA的双链体区域的核苷酸序列为抑制的靶标。含有与部分靶基因转录物相同的核苷酸序列的RNA通常优选用于抑制。相对于靶序列具有***、缺失和单点突变的RNA序列也已发现有效用于抑制。在本发明的实施中，抑制性dsRNA和靶基因的部分可以共有至少约80％序列同一性，或者约90％序列同一性，或者约95％序列同一性，或者约99％序列同一性，或者甚至约100％序列同一性。或者，RNA的双链体区域可以功能性地限定为能够与部分靶基因转录物杂交的核苷酸序列。显示更大同源性的小于全长的序列补偿更长的较低同源的序列。同一的核苷酸序列的长度可以为至少约18、21、25、50、100、200、300、400、500个或者至少约1000个碱基。通常，应当使用超过20-100个核苷酸的序列，虽然超过约200-300个核苷酸的序列可能是优选的，且根据靶基因的大小，超过约500-1000个核苷酸的序列可能是特别优选的。本发明的优点是能够容忍序列变异，这可能由于基因突变、株多态性或进化趋异而可预见的。所引入的核酸分子可以不需要与靶序列绝对同源，并且相对于靶基因的原始转录产物或完全加工的mRNA，它可以不需要是全长的。因此，本领域技术人员需要了解，如此处所述披露的，不需要RNA和靶基因之间的100％序列同一性来实施本发明。
靶基因表达的抑制可以通过测量内源性靶RNA或所述靶RNA的翻译产生的蛋白质而定量，且抑制的结果可以通过检验细胞或生物体的向外性质来确认。定量RNA和蛋白质的技术对于本领域普通技术人员来说是公知的。
在特定实施方式中，基因表达被抑制至少10％、至少33％、至少50％、或至少80％。在本发明的特别实施方式中，基因表达在病毒感染的宿主细胞内被抑制至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％，发生这种显著的抑制。显著抑制意指的是导致可检测的表型(例如，症状表达的降低，等)或可检测的对应于被抑制的靶基因的RNA和/或蛋白质减少的充分抑制。
dsRNA分子可以在体内或体外合成。DsRNA可以通过单个自身互补RNA链形成或者形成两个互补的RNA链。细胞的内源性RNA聚合酶可以介导体内的转录，或者克隆的RNA聚合酶可以用于体内或体外转录。抑制可以通过器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件的刺激(例如，感染、应激、温度、化学诱导物)和/或发育阶段或年龄的工程化转录而靶定。RNA链可以是或者不是聚腺苷酸化的；RNA链通过细胞的翻译器官可能能够或者不能够被翻译成多肽。
此处使用的术语“疾病控制剂”或“基因抑制剂”在特定实施方式中指的是由通过第三RNA片段连接的第一RNA片段和第二RNA片段组成的特定RNA分子。所述第一和第二RNA片段处于所述RNA分子的长度内并且为彼此的基本反向重复序列并通过所述第三RNA片段连接到一起。所述第一和第二RNA片段之间的互补性导致所述两个片段在体内和体外杂交以形成通过形成环的第三片段在各第一和第二片段的一个末端连接到一起的双链分子(即，茎)的能力，由此整个结构形成为茎和环结构，或者甚至更紧密杂交的结构可以形成为茎-环节结构。所述第一和第二片段不变地(但不是各自必然地)对应相对于从意图通过dsRNA分子抑制的靶病毒中的靶基因转录的靶RNA同源的正义和反义序列。
此处使用的术语“基因组”应用于植物病毒或宿主时不仅包括病毒DNA或RNA或者细胞核内发现的染色体DNA，而且包括细胞的亚细胞组分中发现的细胞器DNA。因此，引入到植物细胞内的本发明的DNA可以是染色体整合的或细胞器定位的。术语“基因组”应用于细菌时包括细菌宿主细胞内的染色体和质粒。因此，引入到细菌宿主细胞内的本发明的DNA可以是染色体整合的或质粒定位的。
设想本发明的组合物可以结合到植物物种的种子内，作为来自结合到所述植物细胞的基因组中的重组基因的表达产物。此处包含重组基因的植物细胞被认为是转基因事件。
D.重组载体和宿主细胞转化
重组DNA载体可以例如是线性的或闭合环状的质粒。载体***可以是单个载体或质粒或者两个或更多个载体或质粒，其共同包含被引入到细菌宿主的基因组中的总DNA。此外，细菌载体可以是表达载体。例如，如序列表中给出的核酸分子或其互补序列或片段可以适当地***到在合适的启动子的控制下的载体中，该启动子在一种或多种微生物宿主中起作用以驱动连接的编码序列或其它DNA序列的表达。为此目的许多载体是可用的，且适当载体的选择将主要取决于被***到载体中的核酸的大小和被载体转化的特定宿主细胞。各个载体包含取决于其功能(DNA的扩增或DNA的表达)和与其相容的特定宿主细胞的各种组分。用于细菌转化的载体组分通常包括但不限于下述的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个选择标记基因和使得外源DNA表达的诱导型启动子。
表达和克隆载体通常包含选择基因，也称作选择标记。该基因编码生长在选择培养介质中的转化宿主细胞生存或生长必需的蛋白质。典型的选择基因编码(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷或者(c)提供从复合培养基中无法得到的关键养分(例如编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因)的蛋白质。用异源蛋白性或其片段成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质并因此在选择方案中生存下来。
产生mRNA的表达载体还可以包含宿主生物体识别且可操作地连接核酸的诱导型启动子。在涉及调控序列和结构核苷酸序列时使用的术语“可操作地连接”意指所述调控序列引起所连接的结构核苷酸序列的受调切节的表达。“调控序列”或“控制元件”指的是位于结构核苷酸的上游(5’非编码序列)、之内或者下游(3’非翻译序列)的核苷酸序列，并且它影响转录的时机以及水平或量、RNA加工或稳定性或者相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可以包括启动子、翻译引导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合序列以及多聚腺苷酸化识别序列等。
包含一个或多个上面列出的组分的合适载体的构建使用标准的重组DNA技术。分离的质粒或DNA片段被切割、裁剪并以所需的形式重新接合以产生所需质粒。可获得的细菌表达载体的实例包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，例如BluescriptTM(Stratagene，LaJolla，CA)，其中，例如，核酸或其片段可以与用于β-半乳糖苷酶的氨基末端Met和随后的7个残基的序列同框地接合到所述载体中，由此产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke和Schuster，1989)等等。
本发明还设想本发明的核苷酸序列转化到植物中以实现一个或多个RNA分子的病毒抑制性水平的表达。转化载体可以容易地使用本领域可获得的方法制备。所述转化载体包含一个或多个核苷酸序列，该核苷酸序列能够被转录为RNA分子且基本上与一种或多种靶病毒的基因组编码的一个或多个核苷酸序列同源和/或互补，以使得在目标植物寄生病毒与由该一个或多个核苷酸序列转录的RNA接触，出现所述病毒的基因组中相应核苷酸序列中至少一个的表达的下调。
所述转化载体可以称作dsDNA构建体并且还可以定义为重组分子、疾病控制剂、遗传分子或嵌合遗传构建体。例如，本发明的嵌合遗传构建体可以包含编码一个或多个反义转录物、一个或多个正义转录物、一个或多个各上述各类的核苷酸序列，其中由其获得的转录物的全部或部分与包含植物病毒的基因组内的核苷酸序列编码的RNA序列的RNA分子的全部或部分同源。
在一个实施方式中，植物转化载体包含分离和纯化的DNA分子，其包含可操作地连接一个或多个本发明的核苷酸序列的异源启动子。所述核苷酸序列包括编码存在于靶RNA转录物内的RNA的全部或部分的片段，并且可以包含靶RNA的全部或部分的反向重复序列。包含所述表达载体的DNA分子还可以包含位于编码序列的上游或者甚至编码序列内的功能性内含子序列，并且还可以包含5个位于启动子和翻译起始点之间的五个起始(5’)未翻译前导序列(即，UTR或5’-UTR)。
植物转化载体可以包含来自一个以上基因的序列，因此允许产生一个以上用于抑制该一个以上靶病毒的基因的表达的dsRNA、miRNA或siRNA。例如，载体或构建体可以包含最高约8个或10个或者更多的用于抗病毒序列转录的核酸序列，如图10中所示。本领域技术人员将容易地理解：其序列对应于在不同基因中存在的序列的DNA的片段可以组合成用于在转基因植物中表达的单个复合DNA片段。或者，已经含有至少一个DNA片段的本发明的质粒可以通过增强子和启动子及终止子序列之间另外的DNA片段的顺序***而改变。在设计用于抑制多种基因的本发明疾病控制剂中，被抑制的基因可以从相同的植物病毒株或种获得以增强所述控制剂的效力。在特定实施方式中，基因可以来自不同植物病毒以扩展所述控制剂有效对抗的病毒的范围。当多个基因作为用于抑制或表达和抑制组合的靶标时，多顺反子DNA元件可以如成美国公开2004/0029283号中说明和披露的制备。
本发明的重组DNA载体或构建体可以包含赋予植物细胞选择表型的选择标记。选择标记也可以用于选择含有编码本发明的的多肽或蛋白的外源核酸的植物或植物细胞。所述标记可以编码抗生剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、G418博来霉素、潮霉素等)或者除草剂抗性(例如，草甘膦等)。选择标记的实例包括但不限于：编码卡那霉素抗性且可以使用卡那霉素、G418等选择的新基因；编码双丙氨膦抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变体EPSP合酶基因；赋予溴苯腈抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)；以及甲氨蝶呤抗性DHFR基因。多种选择标记是可用的，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草胺膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素、大观霉素、利福平和四环素等的抗性。这些选择标记的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中说明。
本发明的重组体载体或构建体也可以包含可筛选标记。可筛选标记可以用于监测表达。示例性的可筛选标记包括：β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其编码各种生色底物已知的酶(Jefferson等人，1987)；各种荧光蛋白(FP)基因(例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或者通常在特征性波长下发荧光的一大族蛋白中的任何一种)的一种或多种；R-基因座基因，其编码调节植物组织中花青素色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，1988)；β-内酰胺酶(Sutcliffe等人，1978)，编码各种生色底物已知的的酶的基因(例如，PADAC，生色头孢菌素)；萤光素酶基因(Ow等人，1986)，xylE基因(Zukowski等人，1983)，其编码可以转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(dopaquinone)(其随之缩合成黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，其催化生色α-半乳糖底物。
例如，用于本发明的植物转化载体可以包括来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒(例如，美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501,967和EP 0 122 791)的那些。毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)质粒(或“Ri”)也是可用的并且在本领域是已知的。其它优选的植物转化载体包括例如Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和EP 0 120 516披露的那些。
在特定实施方式中，可以在植物基因组的非特异性位置引入功能性重组DNA。在特殊情况下，它可以用于通过位点特异性整合***重组DNA构建体。存在几个已知在植物中起作用的位点特异性重组***，包括美国专利4,959,317中披露的cre-lox和美国专利5,527,695中披露的FLP-FRT。
据信用于本发明的宿主细胞转化的合适方法实际上包括任何通过它可以将DNA引入到细胞中的方法(参见，例如Miki等人，1993)，例如通过原生质体的转化(美国专利5,508,184号；Omirulleh等人，1993)、通过脱水/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)、通过电穿孔(美国专利5,384,253号)、通过与碳化硅纤维一起搅拌(Kaeppler等人，1990；美国专利5,302,523号；和美国专利5,464,765号)、通过土壤杆菌介导的转化(美国专利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；6,384,301号)和通过DNA包被颗粒的加速(美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；6,403,865号；Padgette等人，1995)等。通过应用例如这些技术，实际上任何物种的细胞可以稳定地转化。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可以再生为转基因生物体。
最广泛使用的将表达载体引入到植物中的方法是基于土壤杆菌的自然转化***(例如，Horsch等人，1985)。根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌是植物病原性土壤细菌，其遗传地转化植物细胞。根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物遗传转化的基因。土壤杆菌载体***的描述和土壤杆菌介导的基因转移的方法在很多的参考文献中提供，包括Gruber等人，1993；Miki等人，1993，Moloney等人，1989和美国专利：4,940,838和5,464,763号。可以修饰其它与植物天然相互作用的细菌(例如，中华根瘤菌属、根瘤菌属和中生根瘤菌属)以介导基因转移到众多的多样植物中。可以通过同时获得去武装的Ti质粒和适合的二元载体使得这些与植物相关的共生细菌对于基因转移是感受态的(Broothaerts等人，2005)。也可以使用将病毒序列引入到植物中的方法(例如，Grimsley，1990，Boulton，1996)。
转基因植物的建立和特别地植物中异源核酸表达的方法是已知的且可以用于此处提供的核酸以制备对植物病原性病毒显示降低的易感性的转基因植物。例如，可以通过将此处披露的dsRNA产生核酸***到植物转化载体并将这些载体引入到植物中来制备植物转化载体。已经通过改变根癌土壤杆菌的自然基因转移***得到一种已知的载体***。所述自然***包括包含大的片段(称作T-DNA，其被转移到转化的植物)的大Ti(肿瘤诱导)-质粒，。所述Ti质粒的另一片段(vir区域)负责T-DNA转移。T-DNA区域以末端重复序列为界。在修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已被删除且vir区域的功能被用于转移以T-DNA边界序列为界的外源DNA。T-区域也可以包含用于有效回收转基因植物和细胞的选择标记和用于***转移序列(例如dsRNA编码核酸)的多克隆位点。
用于转化番茄细胞的方案在本领域是已知的(例如，McCormick，1991)。在Boulton(1996)和Grimsley(1990)中讨论了替代的植物转化方案。用于其它植物(例如胡椒)的转化和再生方案在本领域是已知的(例如，Christopher和Rajam，1996；美国专利5,262,316；Liu等人1990)。例如，这种用于转化番茄的方案可以包括公知的种子消毒、种子萌发和生长、幼苗的外植、土壤杆菌培养物生长和制备、共培养、选择和再生的步骤。
E.转基因植物和细胞
使用土壤杆菌转化方法形成的转基因植物通常可以包含***到一个染色体中的单个简单的重组DNA序列，称作转基因事件。这类转基因植物可以称作是对于***的外源序列杂合的。可以通过将包含单个外源基因序列的独立隔离转基因植物与其自身(例如，F0植物)有***配(自交)以产生F1种子而获得对于转基因纯合的转基因植物。产生的F1种子的四分之一对于转基因是纯合的。使F1种子发芽得到可以用于测试杂合性的植物，通常使用SNP分析或热扩增分析，其允许区分杂合子和纯合子(即，接合性分析)。将杂合植物与其本身或另一杂合植物杂交得到杂合的后代以及纯合的转基因和纯合的空白后代。
除了植物用重组DNA构建体直接转化外，转基因植物可以通过将具有重组DNA构建体的第一植物与缺乏所述构建体的第二植物杂交来制备。例如，用于基因抑制的重组DNA可以引入到易受转化以产生转基因植物的第一植物株系中，该转基因植物可以与第二植物株系杂交以将用于基因抑制的重组DNA渐渗到所述第二植物株系中。
F.病毒抗性筛选
使用机械传染或农杆菌感染法进行病毒(例如，TSWV、TYLCV和PepMV)的接种和疾病测试(例如，Boulton，1996；Grimsley，1990)。机械方式完成TSWV感染，基本上如Kumar等人，(1993)所描述的，但有一些修改。植物的菜豆金色花叶病毒(例如，TYLCV)接种和疾病测试通过如下的农杆菌感染法完成：将番茄(西红柿(Lycopersiconesculentum))cvs.(抗性(R)：HP919；中间抗性(IR)：Hilario；易感(S)：Arletta)的种子播种，且用于各接种的大约20棵植物以及非接种的或模拟接种的对照植物生长7-10天到达看不见初生叶的子叶阶段。然后使用无针注射器渗透子叶的下面，然后通过在2-3真叶阶段(大约1-2星期后)注射到茎中进行另外的接种。渗透或注射利用乙酰丁香酮诱导的转化根癌土壤杆菌菌株，其包含从接种新鲜的培养物开始已在具有用于选择pBIN载体的抗生素的YEB肉汤中生长约15小时(在混合器(170RPM)上于28℃下)的病毒感染克隆。在28℃下生长后，将培养物离心并再悬浮在10ml MMA(每1升：20g蔗糖、5g MS盐、1.95g MES、pH 5.6(用NaOH调节)和1ml的200mM乙酰丁香酮原液；加蒸馏水到1升)中。植物在20-25℃(日/夜)下生长，16小时在温室中或生长箱的光照。6星期后，症状得分如下：
1、无可见的症状(抗性的)
2、非常轻微的症状(抗性的)
5、中度症状
7、强的症状
9、非常强的症状
马铃薯X病毒(黄瓜花叶病毒(PepMV))的接种如下完成：通过在将碳化硅粉末撒在叶子上后机械感染番茄幼苗(易感的cv.Apollo，9-12天龄)制备病毒接种物。收获感染的组织，并将1g感染的组织与5-10ml磷酸盐缓冲液(pH 9)一起匀浆。然后该制备的接种物用于在子叶阶段(播种后7-10天)机械接种试验植物。接种的植物在19-23℃(日/夜)的温室中生长，每24小时有16小时的光照，温室中的相对湿度为70％。在接种后11-21天评价植物，且得分如下：
1、无可见的症状(抗性的)
3、一些叶的褪绿
5、叶脉和/或叶斑块中褪绿
7、叶脉褪绿和长尖叶
9、叶脉褪绿和长尖叶和黄色斑块
G.RNA提取和siRNA的Northern印迹分析
使用Trizol
Figure BPA00001464047000341
基本根据制造商的说明(Invitrogen)提取RNA以用于小RNA的northern印迹分析。简言之，将大约100-200mg的新鲜叶组织在置于干冰上的1.5ml离心管中的液氮中于研磨。将样品从干冰移出，并在通风橱中添加1ml的Trizol。将其良好混合好后在室温(RT)下孵育10分钟。然后，添加0.2ml的氯仿，将所述样品人工振摇30秒并在冷冻台式离心机中于4℃下离心(13000rpm)15分钟。
将水相转移到新管中，添加0.5ml的异丙醇，并将管倒置几次，然后在RT下孵育10分钟，接着在冷冻台式离心机中于4℃下离心(13000rpm)15分钟。弃去上清液，通过添加0.75ml的75％乙醇洗涤沉淀物，然后于4℃下离心(13000rpm)10分钟。弃去上清液，将RNA在室温风干10分钟。
沉淀物通过添加100μl的无RNA酶的双蒸水再悬浮并涡旋几秒钟。将样品在干冰上冷冻，并通过使用快速真空(speed vacuum)约20分钟浓缩RNA：该步骤移除所有痕量的乙醇。RNA通过分光光度计定量(通常从番茄叶回收大约80-100μg)。加载约7μg的总RNA用于siRNA分析。
使用DIG标记探针的siRNA Northern印迹：将15％的TBE-尿素凝胶(Invitrogen EC68855BOX)在110伏下预跑30分钟。通过将7μl的Novex
Figure BPA00001464047000351
TBE-尿素样品缓冲液2x(Invitrogen LC6876)添加到7μl的总RNA(5-7μg)中制备用于加载的样品，将它们在94℃下变性约10分钟并立即在冰上冷却。如果需要在UV光下的样品可视化，向样品缓冲液添加溴乙啶(每100μl缓冲液1μl的0.624mg/ml EtBr)。加载到凝胶孔之前将样品短暂旋转，在0.5×BE中于180伏进行电泳约1.5小时，直到蓝色染料到达凝胶的底部。结束电泳之后，在UV光下观察凝胶。
凝胶转移到Nytran Supercharge尼龙膜(VWR 28151-318)上在Transblot半干转移室(BioRad 170-3940)中进行：将膜在水中预湿润并在0.5×TBE中与2片超厚纸(BioRad 170-3968)一起平衡。转移根据制造商的说明(阳极-印迹纸-膜-凝胶-印迹纸-阴极)设置并以380mAmp进行50分钟。转移后，将膜留下以风干约10分钟，然后在Stratalinker 1800(Stratagene)中将RNA与其交联。
杂交：在分子杂交仪中将膜在42℃下与10ml的PerfectHyb溶液(Sigma H7033)预杂交1小时。将200ng的DIG标记探针(按照制造商的说明用PCR DIG标记混合物(Roche 11585550910)制备)在94℃变性10分钟，在冰上冷却，并添加到10ml的新鲜杂交溶液中，其被添加到预杂交的膜上并在分子杂交仪中于42℃孵育过夜。
洗涤和检测：将杂交溶液弃去后，将膜在2×SSC 0.1％SDS中短暂清洗；然后在预热的2×SSC 0.1％SDS中于50℃下洗涤2次20分钟、在预热的1×SSC 0.1％SDS中于50℃下洗涤2次20分钟、在预热的0.5×SSC 0.1％SDS中于50℃下洗涤2次20分钟。根据DIG Wash andBlock Buffer试剂盒(Roche 11585762001)提供的说明进行检测。简言之，将膜在1×DIG洗涤缓冲液中清洗2分钟，然后在100mL DIG封闭溶液(10mL 10×封闭溶液+10mL 10×马来酸+80mL水)中室温下孵育1小时。然后于室温下在添加10μl的抗地高辛配基-AP抗体(Roche11093274910)的100mL新鲜DIG封闭溶液中孵育1小时。膜在RT下用100mL 1X DIG洗涤缓冲液洗涤15分钟两次并用100mL的1X DIG检测缓冲液平衡。将约1mL的CDP-star溶液(Roche 12041677001)分布在整个膜(其置于2块塑料板之间)的顶部，在RT下孵育5分钟并在显影前暴露于薄膜不同的时间。
H.转基因番茄植物中构建体的验证
将用于产生dsRNA或miRNA的工程化序列克隆到用于番茄转化的二元载体中。通过小RNA northern印迹分析及如上概述的且如实施例7中描述的抗性分析测试R0转基因植物的特异性～21-mer的产生和/或病毒抗性效力。其它选择的dsRNA产生序列或miRNA产生序列(例如来自SEQ ID NO：1-154中任一个或来自SEQ ID NO：169-455或其部分中)可以用于建立另外的有效构建体。因此，例如MIR骨架序列，例如来自大豆的MON1、来自大豆的MON5、来自大米的MON13、来自玉米的MON18、来自玉米的miR159a或者来自玉米的mi167g(SEQID NO：155、157、159、161、163或165)可以用于建立dsRNA产生或miRNA产生的序列。在特定实施方式中，所述dsRNA产生序列或miRNA产生序列可以包含SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、55、59、63、67、71、85、99、113、127、141或379-455中的任何一个。在特别实施方式中，所述序列可以包含SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374或375中的任何一个。
本发明包括与植物中其它疾病控制性状的组合，包括非转基因途径，以实现获得增强植物疾病控制的所需性状。使用明显不同作用方式的组合疾病控制性状相对于具有单一控制性状的植物来说可以向受保护的转基因植物提供优异的耐久性，因为抗性在该领域中发生的概率降低。因此，在特定实施方式中，使用至少两种或至少三种作用方式以赋予病毒抗性，其中这些作用方式选自dsRNA的表达、miRNA的表达、病毒颗粒组装的抑制、非转基因病毒抗性性状的表型表达和转基因蛋白质表达。在特别实施方式中，转基因蛋白质表达包括外壳蛋白编码核酸序列的表达、移动蛋白编码序列的表达或复制酶编码核酸序列的表达。
本发明还涉及包含本发明的一个或多个序列的，以及由包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组体植物或种子生产的商品，其特别地作为本发明的实施方式包括。包含本发明的一个或多个序列的商品意图包括但不限于粗粉、油、植物的破碎或完整的籽粒谷物或种子，或者包括包含本发明的一个或多个序列的任何粗粉、油或重组体植物的破碎或完整籽粒或种子的任何食品。本发明设想的一种或多种商品或商用产品中本发明的一个或多个序列的检测为所述商品或商用产品由设计为了达到使用dsRNA介导基因抑制方法控制植物疾病的目的而表达本发明的一个或多个核酸序列的转基因植物组成的实际证据。
I.核酸组合物
本发明提供用于获得包含用于产生dsRNA、miRNA或siRNA的核苷酸序列的核酸的方法。在一个实施方式中，这种方法包括：(a)分析一个或多个靶基因在dsRNA介导、或者mi-RNA或siRNA介导的植物病原性病毒基因的抑制下的表达、功能和表型；(b)用杂交探针探测核酸文库，其包含来自在dsRNA介导的抑制分析中显示出改变的表型的靶病毒的核苷酸序列或其同系物的全部或部分；(c)识别与所述杂交探针杂交的DNA克隆；(d)分离在步骤(b)中识别的DNA克隆；以及(e)测序包含步骤(d)中分离的克隆的核酸片段，其中所测序的核酸分子转录所述RNA核苷酸序列或其同系物的全部或主要部分。利用dsRNA、miRNA或siRNA的RNA介导的抗性途径可以通过将抗病毒序列置于dsRNA编码序列的环中或者通过将编码有效dsRNA或miRNA的序列***到多肽表达盒的内含子中(基因内dsRNA/miRNA；Frizzi等人，2008))中加以补充(例如，图9)。例如，病毒蛋白如外壳蛋白和/或复制酶可以通过将蛋白编码序列***到dsRNA的环中在也表达有效dsRNA、miRNA或siRNA的转基因植物中表达，而不使用另外的转基因盒。
在另一实施方式中，本发明的用于获得包含用于产生dsRNA或siRNA的实质部分的核苷酸序列的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其对应于来自靶病原体的核苷酸序列之一的部分；以及(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的核酸***序列，其中所扩增的核酸分子转录本发明的dsRNA或siRNA的该实质部分的实质部分。
在实施本发明时，靶基因可以源自菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒。可以设想，可以采用几种标准选择优选的靶基因。这些序列可以通过例如比对来自多个株和/或种的菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒序列来识别。生物信息学方法已经识别了很多在超过100个菜豆金色花叶病毒株和种中大部分保守的21-mer。在一些情况下，允许特定21-mer内的失配以获得较广泛的靶向作用。
此处使用的术语“源自”指的是可以从特别指定的来源或种获得的，而不是必须直接来自该指定的来源或种的指定的核苷酸序列。
在一个实施方式中，选择引起病毒复制和/或症状抑制的基因。其它的用于本发明的靶基因可以包括例如在病毒传播、植物中移动或病毒颗粒组装中发挥重要作用的那些基因(例如，蕃茄斑萎病毒末端序列，包含所述末端重复序列)。根据本发明的用于病毒控制的一个方面，所述靶序列可以主要源自所述靶植物病毒。一些克隆自菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的示例性靶序列可以在序列表中找到，例如在SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141中，以及SEQ ID NO：169-455中。
为了本发明的目的，所述dsRNA分子可以通过源自gDNA或cDNA文库的靶基因序列或其部分的聚合酶链(PCR)扩增获得。DNA文库可以使用本领域普通技术人员已知的方法制备，且DNA/RNA可以被提取。由目标生物体产生的基因组DNA或cDNA文库可以用于PCR扩增以产生dsRNA或siRNA。
然后可以使用本领域容易获得的方法PCR扩增和测序所述靶基因序列。本领域技术人员可以改变PCR条件以确保最佳的PCR产物形成。确认的PCR产物可以用作外转录的模板以产生具有包含的最小启动子的正义和反义RNA。在一个实施方式中，本发明包括分离和纯化的核苷酸序列，其可以用作植物病毒控制剂。所述分离和纯化的核苷酸序列可以包括序列表中给出的那些。
此处使用的短语“编码序列”、“结构核苷酸序列”或“结构核酸分子”指的是在适当的调控序列的控制下时翻译成多肽(通常经由mRNA)的核苷酸序列。编码序列的边界通过5’端的翻译起始密码子和3’端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于基因组DNA、cDNA、EST和重组核苷酸序列。
术语“重组DNA”或“重组核苷酸序列”指的是包含经过诱变、限制性内切酶等的操作进行遗传工程化修饰的DNA。
实施例
在此，本发明人已经确定了一种通过向植物中引入工程化的miRNA、ta-siRNA和/或相位siRNA控制植物的病毒感染的方法。这些属性的任何一个或任何组合可以导致有效地抑制植物感染、抑制植物疾病和/或降低疾病症状的严重性。
实施例1
多病毒抗性的靶标
目标病毒的序列从Genebank装配。图1简略地显示代表性目标病毒的基因组组构。对于目标菜豆金色花叶病毒，分析了番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus)(TYLCV)的58个隔离群、番茄卷叶新德里病毒(Tomato leaf curl New Delhi virus)(ToLCNDV)的30个隔离群、番茄严重卷叶病毒(Tomato severe leaf curl virus)(ToSLCV)的5个隔离群、胡椒金色花叶病毒(Pepper golden mosaic virus)(PepGMV)的5个隔离群和胡椒瓦斯特克黄脉病毒(Pepper huasteco yellow vein virus)(PHYVV)的2个隔离群。对于目标蕃茄斑萎病毒，蕃茄斑萎病毒(TSWV)、落花生芽坏死病毒(Groundnut bud necrosis virus)(GBNV)和辣椒褪症病毒(Capsicum chlorosis virus)(CaCV)，分析了6个L片段(TSWV：4；GBNV：1；CaCV：1)、23个M片段(TSWV：20；GBNV：2；CaCV：1)和45个S片段(TSWV：41；GBNV：2；CaCV：2)。对于目标马铃薯X病毒的隔离群，分析了黄瓜花叶病毒(PepMV)的13个隔离群(例如，López等人，2005；Cotillon等人，2002)。生物信息学方法用于识别大约20-24个核苷酸序列，其被用作抑制尽可能多的目标病毒的人工miRNA。
下表(表1)列出了进行了分析的序列，以寻求可能用于设计产生工程化miRNA的转基因构建体的序列、以及鉴别用于dsRNA介导的病毒抗性途径的序列：
表1.用于生物信息学分析的示例性序列(SEQ ID NO：169-362)
Figure BPA00001464047000411
Figure BPA00001464047000421
Figure BPA00001464047000431
实施例2
用于RNAi的病毒片段
将选择的病毒基因组***成～350-500bp的片段，部分地重叠约50bp(例如，图2A-2D)。收集单个序列在转基因植物中单独表达时控制特定病毒种的能力的效力数据。在最初研究中，筛选对应于2.7kB双生病毒DNA-A基因组中的大约2.3kB的片段(图2B；片段1-8)。同样，如图2C中所示，测试了代表6.5kB PepMV(马铃薯X病毒)基因组中的大约4kB的片段1-8。图2D显示效力测试的三分蕃茄斑萎病毒基因组的部分：8.9kB L vRNA(即，病毒RNA)中的大约1.5kB(片段1-3)；5.4kB M vRNA中的大约1.5kB(片段4-6)；以及2.9kB S vRNA中的大约1kB(片段7-8)。
在一个代表性的研究中，测试了对应于TSWV外壳蛋白(核壳)的一部分的核酸片段在表达为反向重复序列时的效力(图3)。发现病毒抗性与番茄植物中的siRNA产生相关。也是在TYLCV抗性筛选中，R1植物首先检验转基因的存在，然后用TYLCV传染性克隆感染。包括非转化的(野生型)番茄株系作为对照；这些野生型植物通常具有低于5％的“抗性”，即，在该分析中低于5％的植物避过了接种的感染。相反，CP4阳性植物(包含选择标记基因指定的对草甘膦的抗性，其与具有病毒序列的表达盒关联)中，56％的包含引入的靶向于复制蛋白的核酸片段的R1植物(3个构建体)、27％的包含引入的靶向于外壳蛋白的核酸片段的R1植物(3个构建体)以及38％的包含引入的靶向于编码区域的其它部分的核酸片段的R1植物(2个构建体)显示对TYLCV的抗性。
然后为了识别和确定可以介导对代表性病毒的与dsRNA相关病毒抗性的病毒基因组的部分，进行了另外的扫描蕃茄斑萎病毒基因组的这些或其它部分的研究。这些序列作为双链(dsRNA)产生构建体中的反向重复片段进行了测试，其中测试的构建体包含以反义定向可操作地连接给定序列的启动子(例如，如下描述的SEQ ID NO：379-442)，接着连接环序列，然后是正义定向的给定序列和转录终止子。所述反向重复序列的转录和碱基配对之后，通过Dicer或Dicer样RNA酶将所述双链RNA区域裂解以产生靶向并干扰病毒基因表达的特定抗病毒siRNA。
蕃茄斑萎病毒中还有辣椒褪绿病毒(CaCV)、落花生芽坏死病毒(GBNV)以及番茄斑萎病毒(TSWV)。转基因R1植物的病毒抗性测试显示，蕃茄斑萎病毒基因组的所有区域作为dsRNA的靶标具有同等效果。因此，随着使蕃茄斑萎病毒外壳蛋白(CP)以及糖蛋白编码病毒基因组片段GP1、GP2、GP3和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)蛋白片段的表达破坏的转录物的表达，可观察到显著的病毒抗性。图11A-B描述从转基因植物中看到的抗性结果。用各条表示单个转基因事件和靶区域，例如50-80％的表达靶向于CP区域的dsRNA的R1植物对CaCV有抗性，而～25-90％的表达靶向于病毒糖蛋白的dsRNA的R1植物显示病毒抗性(例如，图11B)。dsRNA介导的对TSWV的抗性特别有效，100％的R1植物显示来自具有靶向于外壳蛋白的构建体的所有测试事件的病毒抗性(图11A)。选择用于产生靶向蕃茄斑萎病毒基因表达的代表性的TSWV、CaCV和GBNV序列列于SEQ ID NO：419-436中(以反义方向列出)。
其它的研究显示PepMV基因组的所有区域在产生dsRNA介导的抗马铃薯X病毒抗性方面同样有效。图12显示在大部分情况下，所有包含靶向CP(外壳蛋白)、CP/MOV(外壳蛋白和移动蛋白序列)、RdRP、TGB(参与病毒在宿主植物中的细胞间和长距离移动的三基因块基序蛋白)或TGB/RdRP的病毒编码片段的转基因R1植物中95-100％对PepMV有抗性。选择用于产生靶向于马铃薯X病毒基因表达的代表性PepMV序列列于SEQ ID NO：437-442中，以反义方向列出。
同样，测试了菜豆金色花叶病毒(双生病毒)基因组的区域产生dsRNA介导的抗这一病毒组的抗性的能力。在生物测试中TYLCV、ToSLCV、PepGMV、PHYVV和ToLCNDV作为代表性菜豆金色花叶病毒进行测试。图13A-B显示当CP为dsRNA靶标时，最高至约70％的转基因R1植物显示对给定病毒的抗性；而当编码病毒复制蛋白的核酸片段为dsRNA靶标时，最高至约100％的转基因R1植物显示抗性。选择用于产生靶向菜豆金色花叶病毒基因表达的代表性蕃茄斑萎病毒序列列于SEQ ID NO：379-418中，以反义方向列出。
总之，对于这三个属(即，蕃茄斑萎病毒、马铃薯X病毒、菜豆金色花叶病毒)中的病毒的众多有效的dsRNA靶被识别。
基于这些RNAi结果，对于各个病毒选择靶向于有效靶区域的序列并融合到核酸构建体上的两个转基因盒中，从而以多种病毒科中的多种病毒为目标。这个途径的实施例显示于图14中。对于菜豆金色花叶病毒，使用Rep区域，而对于蕃茄斑萎病毒和马铃薯X病毒，选择CP区域，因为CP区域在相同病毒的不同株之间是相对更加保守的。在所述盒中使用的一些序列可进一步相对于预期的G::U碱基配对进行修饰以使得保护扩展到相关病毒株。选择用于产生靶向于盒中的病毒基因表达的代表性序列，对于图14的“盒1”列于SEQ ID NO：443-446中，对于图14的“盒2”列于SEQ ID NO：447-451中，所述序列表中其各以反义方向列出。因此，例如，在盒1中发现的靶向GBNV-CP1的核酸片段(SEQ ID NO：443)与SEQ ID NO：429中发现的靶向GBNV-CP1的片段相似，但是相对于初始测试相对效力的靶片段，可以具有如上所述的修饰，并且对于盒中使用的其它核酸片段也是如此。
实施例3
用于多重病毒抗性的人工dsRNA融合构建体
来自两个或三个不同病毒组(双生病毒、蕃茄斑萎病毒、马铃薯X病毒)的用于dsRNA表达的核苷酸片段也组合在单个表达盒中，并且植物从转化细胞产生并分析其对一种以上病毒的抗性。这通过融合经测试对产生赋予病毒抗性的siRNA有效的病毒基因组片段实现，例如如实施例2中所示。与实施例2类似，这些序列作为双链(dsRNA)产生构建体中反向重复片段进行测试，其中测试的构建体包含可操作地连接反义定向的给定序列的启动子(例如，如下描述的SEQ ID NO：452-454)，接着连接环序列，且然后是正义定向的给定序列和转录终止子。在转录和反向重复序列的碱基配对之后，通过Dicer或Dicer样RNA酶将双链RNA区域裂解以产生靶向并干扰病毒基因表达的特定抗病毒siRNA。在该途径中，对于各个目标病毒的特定dsRNA片段用于多重病毒抗性(图4A)。
或者，各种病毒基因组的保守区域可以提供对于种或密切相关种内的不同变种的更广谱的抗性。此外，可以设计包含与病毒基因组的靶片段高度相似(但是低于100％相同)的序列的反向重复序列并测试其效力。这一途径(即，部分地相似或“不完全”反向重复序列)可以扩展RNA介导的保护到相关病毒株和种。例如，由于RNA水平上G-U碱基配对具有与一些典型Watson-Crick碱基配对(例如，A-U)相当程度的热稳定性，一些不完全重复序列反而可以激活RISC并引导完全和不完全的病毒靶标的裂解。
在此情况下，为了刺激RNAi介导的病毒抗性，这些部分相似的反向重复序列也可以包含一个或多个显示与一个或多个病毒靶序列接近100％的同一性的长度至少21个核苷酸的亚序列。因此，例如，不完全重复片段与一个或多个病毒靶标的总体同一性可以低至75％，但是具有2-4个或者更多的显示与病毒靶标序列100％的同一性的21-24个核苷酸的亚序列。此外，这种“不完全”dsRNA的存在可以帮助增加dsRNA在植物中的积累并防止触发转录基因沉默。因此，来自一个以上病毒株或来自一种以上病毒的核苷酸片段可以在用于dsRNA表达的融合构建体的设计和制备中利用。
这类序列可以通过比对例如，来自多个株和/或种的双生病毒或蕃茄斑萎病毒序列进行识别。表2显示整个基因组水平上双生病毒靶标之间的相似性百分数。表3显示整个基因组水平上蕃茄斑萎病毒靶标之间的相似性百分数。
表2.双生病毒靶标之间的相似性百分数(整个基因组)
 TYLCV   ToLCNDV   PHYVV   ToSLCV   PepGMV
  TYLCV  -   71   64   63   60
  ToLCNDV  71   -   62   60   59
  PHYVV  64   62   -
  ToSLCV  63   60   67   -   76
  PepGMV  60   59   66   76   -
表3.蕃茄斑萎病毒靶标之间的相似性百分数(整个基因组)
Figure BPA00001464047000481
图4B简要地显示用于dsRNA表达的示例性融合构建体。选择包括缺乏与人或宿主植物基因组显著同一性的序列的编码序列用于产生反向重复序列。病毒源的片段可以被定向为，例如“反义-环-正义”以用于dsRNA表达。该途径可以减小多重病毒抗性所需的转基因dsRNA盒的大小。图4B的简要描述的人工融合构建体列为SEQ ID NO：452-453。SEQ ID NO：452人工外壳蛋白构建体包含如下序列：bp 1-157：用于环的TYLCV前外壳蛋白；靶向TYLCV和ToLCNDV CP的bp158-507(即，350bp的片段)；靶向ToSLCV、PepGMV和PHYVV CP表达的bp 508-851(即，344bp的片段)。SEQ ID NO：453包含如下片段：靶向用于环的TSWV外壳蛋白(CP)的bp 1-160；靶向TSWV CP的bp 161-456(即，296bp的片段)；靶向PepMV CP的bp 457-687(即，231bp的片段)；靶向CaCV和GBNV CP的bp 688-919(即，232bp的片段)。SEQ ID NO：453(抗多种蕃茄斑萎病毒和PepMV的人工CP序列)的效力结果示于图15中。另外的靶向五种双生病毒(TYLCV、ToLCNDV、ToSLCV、PepGMV和PHYVV)的Rep蛋白的人工dsRNA融合构建体如SEQ ID NO：454所示。在这个序列中，bp 1-150靶向用于环的TYLCV Rep蛋白；bp 151-500(即，350bp的片段)靶向TYLCV和ToLCNDV Rep蛋白；bp 501-860(即，360bp的片段)靶向ToSLCV、PepGMV和PHYVV Rep蛋白。
实施例4
工程化miRNA途径：合适序列的选择
实施例1中描述的生物信息学方法用于识别几个合适的序列，长度大约21nt，其靶向被认为可用于miRNA介导的双生病毒复制和/或症状表达的抵制的双生病毒序列(表4；图5)。
表4：合适的抗目标双生病毒的21nt序列
Figure BPA00001464047000491
实施例1中描述的生物信息学方法用于识别几个合适的序列，长度大约21nt，其靶向被认为可用于miRNA介导的蕃茄斑萎病毒复制和/或症状表达的抵制的蕃茄斑萎病毒序列(表5；图6)。
表5：合适的抗三种目标蕃茄斑萎病毒的各基因组片段的21nt序列
Figure BPA00001464047000501
实施例1中描述的生物信息学方法用于识别几个合适的序列，长度大约21nt，其靶向被认为可用于miRNA介导的蕃茄斑萎病毒复制和/或症状表达抵制的马铃薯X病毒序列(表6；图7A-7B)。
表6：合适的抗目标马铃薯X病毒的～21nt序列
 SEQ ID NO：   名称   miRNA序列(5’→3’)   靶标
 71   PepMV1   TCTTCATTGTAGTTAATGGAG   RdPR
 85   PepMV2   TTGGAAGAGGAAAAGGTGGTT   RdPR
 99   PepMV3   TCAATCATGCACCTCCAGTCG   RdPR
 113   PepMV4   TAAGTAGCAAGGCCTAGGTGA   TGBp1
 127   PepMV5   TTTGGAAGTAAATGCAGGCTG   TGBp2
 141   PepMV6   TAACCCGTTCCAAGGGGAGAAG   TGBp3
实施例5
MIR基因骨架中miRNA产生序列的并入
通过基因合成将表4-6的miRNA产生序列并入到转基因构建体中。例如，具有野生型21nt miRNA产生序列(本申请的SEQ ID NO：155)的来自大豆的野生型MIR基因骨架“MON1”(参见美国公开2007/0300329)经改变以用Gemini1靶标(SEQ ID NO：1)替代野生型miRNA产生序列，得到Gemini1/MON1构建体(SEQ ID NO：156)。因此，可以通过用表4-6的任何miRNA序列替代野生型21nt miRNA产生序列改变MIR骨架(例如，SEQ ID NO：155的MON1骨架)。
相似地，来自大豆的MON5(SEQ ID NO：157)、来自大米的MON13(SEQ ID NO：159)、来自玉米的MON18(SEQ ID NO：161)、来自玉米的miR159a(SEQ ID NO：163)或者miR167g(SEQ ID NO：165)用作表4-6的具有miRNA产生序列的骨架序列。由此，建立下面的序列(表7)：
表7：并入到MIR基因骨架中的示例性序列
其它选择的miRNA产生序列(例如来自SEQ ID NO：1-154之中任一个、或者来自SEQ ID NO：169-362或其部分中)可以与MIR骨架序列(例如来自大豆的MON1、来自大豆的MON5、来自大米的MON13、来自玉米的MON18、来自玉米的miR159a或者来自玉米的miR167g(SEQ ID NO：155、157、159、161、163或165))一起用于建立另外的有效miRNA产生构建体。此外，所述MIR骨架序列可以被修饰，例如通过用选择的病毒源或人工(例如，共有区)序列替代植物源骨架序列的指定miRNA的序列部分，和/或缩短，例如在3’和/或5’端进行删除，例如在miRNA产生序列和如下所述的SEQ ID NO：158、160、162、164、166、363、364、365、367、369、370、373、374和375的MIR骨架部分中所反映的。
单独地测试从SEQ ID NO：169-362内(例如，SEQ ID NO：1-154之间或之内)确定的21-mer，或者在一个表达盒中存在时，同时测试两个或更多个在转基因番茄植物中抗适当病毒(例如TYLCV和TSWV)的效力。使用多顺反子或相位siRNA骨架在一个转基因盒中表达多个有效21-mer(例如，图8)。来自该21-mer测试的病毒抗性分析的结果在实施例7中给出。
一旦确认有效的抗病毒miRNA，使用通过表达为单一转基因性状部署多个miRNA以实现转基因植物中的多重病毒抗性。这通过将上述的工程化MIR基因融合在一起(例如，以建立SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166、363-375)，或者使用可以传递多个抗病毒～21nt序列的ta-siRNA或相位siRNA基因结构(例如，图8)实现。所提到的后面的途径经过新一轮的基因合成以在ta-siRNA或相位siRNA骨架中用有效抗病毒21nt序列替代野生型siRNA来实现。
实施例6
补充的基于RNA的抗性
利用dsRNA或miRNA的RNA介导抗性途径可以通过将抗病毒序列(例如编码蛋白的抗病毒序列)置于dsRNA编码序列的环中，或者通过将编码有效dsRNA或miRNA的序列***到多肽表达盒的内含子中(内含的dsRNA/miRNA；Frizzi等人，2008)(例如，图9)进行补充。例如，病毒蛋白如外壳蛋白和/或复制酶可以通过将蛋白编码序列***到dsRNA的环中而不使用另外的转基因盒的情况下在也表达有效dsRNA、miRNA或siRNA的转基因植物中表达。还可以使用编码干扰双生病毒复制的肽适体的序列(例如，Lopez-Ochoa等人，2006)。
因此，为了增强病毒抗性表型，人工序列可以与dsRNA、miRNA或siRNA一起表达。例如，可以使用从蕃茄斑萎病毒基因组工程化的人工核苷酸环。蕃茄斑萎病毒(ssRNA)基因组由于在各个基因组成分的两个末端存在8-11nt的保守末端重复序列而包含“锅柄样”结构。来自基因组的各个成分(例如来自GBNV(落花生芽坏死病毒)或CaCV(辣椒褪绿病毒))的这些末端重复序列(SEQ ID NO：167-168)可以融合并用作植物转化构建体中环形成序列的部分。这种人工序列可以包含例如SEQ ID NO：376-378或SEQ ID NO：455，并可以充当竞争逆转录酶的人工底物，可以干扰复制病毒基因组成分的正常环化，可以经由RNAi自身产生有效核苷酸片段，或者上述的一种或多种，因此干扰病毒颗粒组装。
图16显示在产生dsRNA的构建体中包含蕃茄斑萎病毒末端序列导致可测量的对例如CaCV的病毒的抗性。在测试的构建体中，SEQ IDNO：376-378(它们自身包含SEQ ID NO：168)被融合以产生SEQ IDNO：455(即，SEQ ID NO：455的bp 1-247包含SEQ ID NO：376；bp248-303包含SEQ ID NO：377；和bp 304-369包含SEQ ID NO：378)。所述构建体以正义和反义方向测试，并将病毒抗性的水平与对照番茄植物(非转基因，但是另一方面是等基因的)表现的病毒抗性水平进行比较。
编码例如外壳蛋白或复制酶的序列，以及上述人工序列还可以嵌入到内含子序列内。因此，可以通过工程化以引入到单个表达盒中(例如，图9)或者一个以上表达盒中来部署多种作用方式。
实施例7
使用工程化miRNA的示例性病毒抗性分析的结果
测试表7中列出的工程化miRNA产生构建体的效力。双生病毒和马铃薯X病毒测定的生物分析结果示于表8-9中。观察由于miRNA表达导致的病毒抗性，并与给定的转基因转录物的表达和正确加工相关联。例如，对于SEQ ID NO：166，没有观察到PepMV6/mir167g的正确加工，对于这一构建体也没有观察到病毒抗性，因此miRNA的产生与转基因R1植物中病毒抗性相关。关于蕃茄斑萎病毒实验，观察到来自SEQ ID NO：370、371、373和375的转录物的表达和正确加工，其分别靶向RdRP、RdRP、NsM和N基因。当用TSWV感染时，CP4阳性R1植物显示症状减少。对于分别靶向NsM和N基因的SEQ IDNO：372和374，miRNA的正确加工没有观察到，并且没有注意到症状的减少。
合成miRNA抗PepMV最有效，并且对于双生病毒和蕃茄斑萎病毒产生延迟或减少的病毒感染症状。为了协同抑制目标病毒，构建体可以在迭加miRNA盒中组合。由于多个miRNA可以由单个表达盒表达，因此可以建立表达例如8或10个抗病毒miRNA的构建体(如图10A-10B中所示)。作为另外的途径，抗病毒miRNA表达盒可以作为dsRNA表达盒的“环”序列***(例如，图9)，以结合用于病毒控制的dsRNA和miRNA机制(参见图10C)。
表8：利用并入到MIR基因骨架中的工程化序列的双生病毒抗性测试结果。
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a转基因植物中检测的miRNA正确加工
bR1CP4-阳性隔离群对番茄黄曲叶病毒(TYLCV)、番茄卷叶新德里病毒(ToLCNDV)、胡椒金色花叶病毒(PePGMV)或胡椒瓦斯特克黄脉病毒(PHYVV)的抗性的平均百分数±s.d.。
表9：利用并入到MIR基因骨架中的工程化序列的黄瓜花叶病病毒(PepMV)抗性测试结果
a转基因植物中检测的miRNA的正确加工
bR1 CP4-阳性隔离群对PepMV抗性的平均百分数±s.d.。
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在本发明的启示下，无需过多试验就可以完成和实施此处披露和要求保护的所有组合物和方法。虽然本发明的组合物和方法已经通过上述说明性实施方式的形式进行了描述，但是对于本领域技术人员明显的是，可以对所述组合物、方法以及此处描述的方法的步骤或步骤中的序列进行变更、变化、改进和改变而不脱离本发明的真实概念、精神和范围。更具体而言，明显的是，化学和生理学相关的特定试剂可以替代此处描述的试剂而达到相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员来说是明显的相似替代和修改被认为在所附的权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
下面列出的参考文献通过引用的方式并入到本申请中，达到它们补充、解释、提供背景或者教导方法、技术和/或此处使用的组合物的程度。
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Claims (51)

1.一种包含对多种植物病毒种的抗性的番茄植物，其中，所述抗性由选自dsRNA、miRNA和病毒颗粒组装抑制的至少两种不同的作用方式提供。
2.根据权利要求1所述的植物，其中，所述抗性由至少三种不同的作用方式提供。
3.根据权利要求1所述的植物，其中，所述抗性包括对菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性。
4.根据权利要求1所述的植物，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生dsRNA的核酸构建体的表达提供。
5.根据权利要求4所述的植物，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过dsRNA融合构建体的表达提供。
6.根据权利要求4所述的植物，其中，所述dsRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。
7.根据权利要求4所述的植物，其中，所述产生dsRNA的核酸构建体包含选自SEQ ID NO：379-455的序列。
8.根据权利要求1所述的植物，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供。
9.根据权利要求8所述的植物，其中，对菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性是通过交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
10.根据权利要求8所述的植物，其中，所述miRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。
11.根据权利要求8所述的植物，其中，所述miRNA包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列。
12.根据权利要求1所述的植物，其中：
(a)抗菜豆金色花叶病毒的抗性通过干扰菜豆金色花叶病毒复制基因表达的dsRNA的表达提供；
(b)抗蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性通过干扰毒外壳蛋白基因或病毒移动蛋白基因表达的dsRNA的表达提供；
(c)抗马铃薯X病毒的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供；或者
(d)抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
13.根据权利要求1所述的植物，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段末端序列的表达提供。
14.根据权利要求1所述的植物，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装提供，其中病毒颗粒组装通过包含在核酸构建体内的序列抑制，该核酸构建体包含第一核酸片段和第二核酸片段，其中所述第一和第二片段基本上是彼此的反向重复序列并且通过第三核酸片段连接到一起，且其中所述第三片段包含至少一个抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段的末端序列。
15.根据权利要求14所述的植物，其中，所述第三核酸包含选自下组的蕃茄斑萎病毒基因组末端序列：CaCV或GBNV L基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV M基因组片段的末端序列、CaCV或GBNVS基因组片段的末端序列、蕃茄斑萎病毒基因组末端重复序列、包含SEQ ID NO：167的核酸序列、包含SEQ ID NO：168的核酸序列、包含SEQ ID NO：376的核酸序列、包含SEQ ID NO：377的核酸序列、包含SEQ ID NO：378的核酸序列和包含SEQ ID NO：455的核酸序列。
16.根据权利要求15所述的植物，其中，所述蕃茄斑萎病毒基因组片段末端重复序列包含SEQ ID NO：167或SEQ ID NO：168。
17.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物包含对双生病毒科、布尼亚病毒科和弯曲病毒科中的至少两科的病毒的抗性。
18.根据权利要求17所述的植物，其中，所述病毒选自马铃薯X病毒属、蕃茄斑萎病毒属和菜豆金色花叶病毒属。
19.根据权利要求18所述的植物，其中，所述病毒选自：
(a)TYLCV、ToSLCV、ToLCNDV、PHYVV、PepGMV中的至少一种；
(b)TSWV、GBNV、CaCV中的一种或多种；以及
(c)PepMV。
20.根据权利要求18所述的植物，其中，所述马铃薯X病毒是黄瓜花叶病毒。
21.根据权利要求18所述的植物，其中，所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV、ToLCNDV、PHYVV、ToSLCV或PepGMV。
22.根据权利要求18所述的植物，其中，所述蕃茄斑萎病毒为CaCV、GBNV或TSWV。
23.根据权利要求18所述的植物，其中，所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV，且所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病毒；或者所述蕃茄斑萎病毒为TSWV，且所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病毒；或者所述菜豆金色花叶病毒为TYLCV，所述马铃薯X病毒为黄瓜花叶病毒，且所述蕃茄斑萎病毒为TSWV。
24.根据权利要求1所述的植物，进一步包含选自SEQ ID NO：156、158、160、162、164、166和363-375的序列。
25.根据权利要求1所述的植物，进一步包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127、141和379-454的序列。
26.根据权利要求1所述的植物，包含：
(a)至少一个选自SEQ ID NO：379-454的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455的序列；
(b)至少一个选自SEQ ID NO：379-454的序列和至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列；
或者
(c)至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455的序列。
27.根据权利要求1所述的植物，其中，所述植物包含至少一个赋予病毒抗性的选自下述的异源核酸序列：
a)编码与第一靶基因的全部或部分互补的RNA序列的核酸序列；
b)包含至少一个反义DNA片段的多个拷贝的核酸序列，该反义DNA片段对所述至少一个第一靶基因的至少一个片段是反义的；
c)包含来自至少一个靶基因的正义DNA片段的核酸序列；
d)包含靶基因的至少一个正义DNA片段的多个拷贝的核酸序列；
e)转录为通过形成双链RNA抑制靶基因的RNA、并且包含至少一个对所述靶基因的全部或部分反义的片段和至少一个包含所述靶基因的片段的正义DNA片段的核酸序列；
f)转录为通过形成单个双链RNA抑制靶基因的RNA、并且包含对所述靶基因的至少一个片段为反义的多个系列反义DNA片段和含有所述靶基因的至少一个片段的多个系列正义DNA片段的核酸序列；
g)转录为通过形成多个双链RNA抑制靶基因的RNA、并且包含对所述靶基因的至少一个片段为反义的多个片段和所述靶基因的多个正义DNA片段的核酸序列，且其中所述多个反义DNA片段和所述多个正义DNA片段以系列的反向重复序列排列；
h)包含源自植物miRNA的核苷酸的核酸序列；以及
i)编码至少一个干扰病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒末端序列的核酸序列。
28.根据权利要求27所述的植物，进一步包含非转基因的植物病毒抗性性状。
29.根据权利要求27所述的植物，其中，所述至少一个异源核酸序列的表达导致对选自蕃茄斑萎病毒、菜豆金色花叶病毒和马铃薯X病毒的两种或更多种病毒的抗性。
30.一种权利要求1所述植物的转基因种子。
31.一种赋予番茄植物对多种植物病毒种的抗性的方法，所述方法包括在所述植物中表达至少两个共同提供对所述多种植物病毒种的抗性的核酸序列，其中利用至少两种不同的作用方式提供该抗性，包括选自dsRNA、miRNA和干扰病毒颗粒组装的序列的至少两个序列的表达。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述抗性包括对菜豆金色花叶病毒、蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性。
33.根据权利要求31所述的方法，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生dsRNA的核酸构建体的表达提供。
34.根据权利要求31所述的方法，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过dsRNA融合构建体的表达提供。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述dsRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。
36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述核酸构建体包含选自SEQ ID NO：379-455的序列。
37.根据权利要求31所述的方法，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
39.根据权利要求37所述的方法，其中，所述miRNA干扰病毒外壳蛋白基因、病毒移动蛋白基因或病毒复制基因的表达。
40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述miRNA包含选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列。
41.根据权利要求31所述的方法，其中，
(a)抗菜豆金色花叶病毒的抗性通过干扰菜豆金色花叶病毒复制基因表达的dsRNA的表达提供；
(b)抗蕃茄斑萎病毒或马铃薯X病毒的抗性通过干扰病毒外壳蛋白基因或病毒移动蛋白基因表达的dsRNA的表达提供；
(c)抗马铃薯X病毒的抗性通过产生miRNA的核酸构建体的表达提供；或者
(d)抗菜豆金色花叶病毒或蕃茄斑萎病毒的抗性通过交叉重叠的miRNA表达盒编码的序列提供。
42.根据权利要求31所述的方法，其中，对至少一种所述植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段末端序列的表达提供。
43.根据权利要求31所述的方法，其中，对至少一种植物病毒种所提供的抗性通过抑制病毒颗粒组装提供，其中病毒颗粒组装通过包含在核酸构建体内的序列抑制，该核酸构建体包含第一核酸片段和第二核酸片段，其中所述第一和第二片段基本上是彼此的反向重复序列并且通过第三核酸片段连接到一起，且其中所述第三片段包含至少一个其表达抑制病毒颗粒组装的蕃茄斑萎病毒基因组片段的末端序列。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述第三核酸包含选自下组的蕃茄斑萎病毒基因组末端序列：CaCV或GBNV L基因组片段的末端序列、CaCV或GBNV M基因组片段的末端序列、CaCV或GBNVS基因组片段的末端序列和蕃茄斑萎病毒基因组末端重复序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述末端序列或末端重复序列包含SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：376、SEQ ID NO：377或SEQ ID NO：378。
46.根据权利要求31所述的方法，其中，所述多种植物病毒种选自双生病毒科、布尼亚病毒科和弯曲病毒科中的至少两科。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述病毒选自马铃薯X病毒属、蕃茄斑萎病毒属和菜豆金色花叶病毒属。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述病毒选自：
(a)TYLCV、ToSLCV、ToLCNDV、PHYVV、PepGMV中的一种或多种；
(b)TSWV、GBNV、CaCV中的一种或多种；以及
(c)PepMV。
49.根据权利要求31所述的方法，其中，所述核酸序列包含至少一个用于抑制至少一个第一靶基因的基因抑制元件。
50.根据权利要求31所述的方法，包括在所述植物中表达：
(a)至少一个选自SEQ ID NO：379-454的序列和至少一个选自SEQID NO：167、168、376、377、378和455的序列；
(b)至少一个选自SEQ ID NO：379-454的序列和至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列；
或者
(c)至少一个选自SEQ ID NO：1、7、13、19、25、31、37、43、47、51、55、59、63、67、71、85、99、113、127和141的序列和至少一个选自SEQ ID NO：167、168、376、377、378和455的序列。
51.权利要求1所述植物的转基因植物细胞。
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