CN1252102A - 能赋予植物多种性状的dna构建体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由融合基因形成的DNA构建体,所述融合基因包括一个性状DNA分子和一个沉默子DNA分子。该性状DNA分子具有的长度不足以将期望的性状传递给用该性状DNA分子转化的植物。沉默子DNA分子与该性状DNA分子操作偶联,性状和沉默子DNA分子联合具有足够的长度将性状传递给用该DNA构建体转化的植物。公开了表达***,宿主细胞,植物和包含该DNA构建体的植物的种子。本发明也涉及将多种性状传递给植物。
Description
发明领域
本申请请求美国临时系列申请第60/035,350号和第60/062,870号的优先权(benefit)。
本发明涉及能赋予植物多种性状的DNA构建体。
发明背景
1986年，发现烟草花叶病毒(“TMV”)外壳蛋白基因在转基因烟草中的表达可赋予烟草对TMV的抗性(Powell-Abel，P.，et al.，“在转基因植物中表达烟草花叶病毒外壳蛋白基因可延缓此疾病的发生”Science，232：738-43(1986))，过去的十年中，对植物病毒性疾病的控制已取得了很大的进步。大约在上述发现的同时，人们提出了病原体诱导的抗性(“PDR”)的概念，即病原体基因在转基因植物中的表达，可赋予植物对同源或相关病原体感染的抗性(Sanford，J.C.，et al.“寄生虫诱导的抗性的概念-从寄生虫自身基因组中衍生出抗性基因，”J.Theor.Biol.，113：395-405(1985))。从那时起，大量的报道证实，PDR是一种开发抵抗多种不同病毒的转基因植物的有用策略(Lomonossoff，G.P.，“病原体诱导的对植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33：323-43(1995))。
仅仅在Beachy及其同事的报道发表八年之后(Powell-Abel，P.，et al.，“在转基因植物中表达烟草花叶病毒外壳蛋白基因可延缓此疾病的发生，”Science，232：738-43(1986))，Grumet，R.在PlantBreeding Reviews，12：47-49(1994)中，以“用基因工程的方法产生抗病毒植物”为题，综述了关于PDR的文献，并列举了对至少11种不同类群(group)的植物病毒具有抗性的成功的抗病毒转基因植物。其中的绝大多数报道都利用了目标控制病毒的外壳蛋白基因。尽管转基因植物的尝试目前大部分还仅限于实验室和温室实验中，但日益增加的报道表明，这种抗性在大田条件下也是有效的(例如，Grumet，R.，“用基因工程的方法产生抗病毒植物，”Plant Breeding Reviews，12：47-49(1994))。APHIS/USDA已对两种抗病毒作物解除管制，允许其在USA境内的自然环境中不受限制地种植。对西瓜花叶病毒2和小胡瓜黄色花叶病毒具有抗性的倭瓜已成功地实现了商品化(Fuchs，M.，et al.，“表达西瓜花叶病毒2和小胡瓜黄色花叶病毒外壳蛋白基因的转基因杂交倭瓜ZW-20具有对两种马铃薯病毒混合感染的抗性”，Bio/Technology，13：1466-73(1995)；Tricoli，D.M.，et al.，“包含一种或多种病毒外壳蛋白基因构建体的转基因倭瓜对黄瓜花叶病毒，西瓜花叶病毒2和小胡瓜黄色花叶病毒抗性的大田评估，”Bio/Technology 13：1458-65(1995))。此外，抗木瓜环斑病毒的转基因木瓜也已开发(Fitch，M.M.M.，et al.，“来自于用木瓜环斑病毒外壳蛋白基因轰击的组织得到木瓜具有病毒抗性，”Bio/Technology，10：1466-72(1992)；Tennant，P.F.，et al.，“转入外壳蛋白基因的木瓜和经典交叉保护的木瓜对木瓜花叶病毒分离株保护性的差异”，Phytopathology，84：1359-66(1994))。最近，USDA/APHIS对这种抗性转基因木瓜已经解除管制。此转基因木瓜之所以能及时的解除管制，是由于夏威夷的木瓜业正遭受木瓜环斑病毒的毁灭性破坏。毫无疑问，在不远的将来，更多的作物将被解除管制和实现商品化。
令人感兴趣的是，尽管对各种形式病原体诱导的抗性的作用机理知之甚少，但在抗病毒转基因植物的开发上却已经取得很大的进步(Lomonossoff，G.P.，“病原体诱导的对植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33：323-43(1995))。虽然大量的报道是用赋予抗性的外壳蛋白基因进行的，但越来越多的报道表明，病毒复制酶(Golemboski，D.B.，et al.，“用烟草花叶病毒非结构基因序列转化的植物具有病毒抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6311-15(1990))、移动蛋白(例如，Beck，D.L.，et al.，“破坏病毒移动可赋予植物对三基因块(triple Gene block)植物病毒的***感染的广谱抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10310-14(1994))、马铃薯Y病毒组的NIa蛋白酶(例如，Maiti，I.B.，et al.，“表达马铃薯Y病毒组蛋白酶基因的植物具有对病毒感染的抗性，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6110-14(1993))，以及其他的病毒基因也是行之有效的。由此可得出植物病毒基因组的任何一部分都可引致PDR的结论。而且，以可翻译和不可翻译的有义链的形式以及罕见的反义链形式存在的病毒基因都是行之有效的(例如，Baulcombe，D.C.，“转基因植物中病原体诱导的抗病毒机理，”Plant Cell，8：1833-44(1996)；Dougherty，W.G.，et al.，“转基因和基因抑制：告诉我们一些新东西？，”Current Opinion in Cell Biology，7：399-05(1995)；Lomonossoff，G.P.，“病原体诱导的对植物病毒的抗性，”Ann.Rev.Photopathol.，33：323-43(1995))。
RNA介导的抗性是PDR的一种形式，其中明确表明病毒蛋白在赋予转基因植物抗性中不起作用。第一批RNA介导的抗性的明显实例是1992年报道的烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus)(“TEV”)马铃薯Y病毒组(Lindbo，et al.，“在表达马铃薯Y病毒组外壳蛋白核苷酸序列的变体的转基因烟草中表现出的针对该病毒免疫的病原体诱导抗性以及抗性表型，”Mol.Plant Microbe Interact.，5：144-53(1992)、Van Der Vlugt，R.A.A.等，“在转化病毒燕麦蛋白顺反子的烟草中由有义RNA介导的对PVY的保护的证明”PlantMol.Biol.，20：631-39(1992)中描述的马铃薯病毒Y(“PVY”)马铃薯病毒组、de Hann，P.，et al.，“RNA介导的对番茄斑萎病毒具有抗性的转基因烟草的特征研究，”Bio/Technology，10：1133-37(1992)中描述的番茄斑萎病毒(“TSWV”tospovirus)。其他人进一步证实了针对以下病毒的RNA介导的抗性的存在：马铃薯Y病毒组(Smith，H.A.，et al.，“不可翻译的有义RNA介导的转基因植物的病毒抗性：表达，调控和非必需RNA的命运，”Plant Cell，6：1441-53(1994))、马铃薯X病毒组病毒(Muller，E.，et al.，“同源依赖性抗性：植物的转基因病毒抗性与同源依赖性的基因沉默有关，”Plant Journal，7：1001-13(1995))及番茄斑萎病毒和其他topsoviruses(Pang，S.Z.，et al.，“转基因Benthamiam烟草植物对蕃茄斑萎病毒和凤仙花坏死斑Tospo-viruses病毒的抗性：N蛋白和N基因RNA参与抗性的证据，”Phvtopathology，84：243-49(1994)；Pang，S.-Z.，et al.，转基因烟草抗番茄斑萎病毒和凤仙花坏死斑Tospo-viruses病毒的不同保护机制，”Bio/Technology11：819-24(1993))。更近期的工作表明，RNA介导的抗性也发生在豇豆花叶病毒组的豇豆花叶病毒(comovirus cowpea mosaic virus)(Sijen，T.，et al.，“RNA介导的病毒抗性：重复转基因的作用和靶区域描绘”，Plant Cell，8：2227-94(1996)))和SMV南瓜花叶病毒(Jan，F.-J.，et al.，“转化了SMV南瓜花叶病毒外壳蛋白基因的南瓜植物的遗传学和分子生物学分析，”Phytopathology，86：S16-17(1996))。
Dougherty及其同事对TEV和PVY进行的一系列实验在阐明RNA介导的抗性机制方面取得了很大进展。使用TEV，Lindbo，J.A.，“在表达马铃薯Y病毒组外壳蛋白核苷酸序列一种变体的转基因烟草中表现出的针对该病毒免疫的病原体诱导抗性以及抗性表型，”Mol.PlantMicrobe Interact.，5：144-53(1992)和Lindbo，J.A.et al.，“烟草蚀刻病毒外壳蛋白基因序列不可翻译的转录能够干扰烟草蚀刻病毒在转基因植物和原生质体中的复制”Virology，189；725-33(1992)，两篇文献利用TEV表明，接种TEV后，表达可翻译的全长外壳蛋白基因、截短的可翻译的外壳蛋白基因、反义外壳蛋白基因和不可翻译的外壳蛋白基因的转基因植物的表型反应各不相同。转基因植株呈现出了抗性、康复(接种过的植株开始表现为***性感染但随后生出的叶子则无症状且抗病毒)或易感染表型。进一步，他们还指出，同易感植株叶子相比，抗性植株的叶子和康复植株的无症状叶子具有相对低水平的稳定状态的RNA(Lindbo，J.A.，et al.，“转基因植物中诱导产生的高特异性抗病毒状态：基因表达调控和病毒抗性有关，”Plant Cell，5：1749-59(1993))。但是，核失控(run off)实验表明，与那些易感植物相比(具有较高稳定状态的RNA水平)，具有较低水平的稳定状态RNA的植物中来自病毒的所转基因的转录水平更高。为了解释这些现象，提出了“抗性状态和所转基因转录本积累稳定态水平的降低，是由细胞水平上的旨在使特定RNA序列失活的细胞质活性介导的”(Lindbo，J.A.，et al.，“转基因植物中诱导产生的高特异性抗病毒状态：基因表达调控和病毒抗性有关，”PlantCell，5：1749-59(1993))。该现象也表明，低水平的稳定态RNA可能是由于转录后基因沉默形成的，为了解释纯合的转基因植物中β-1，3-葡聚糖酶转基因的表达抑制，de Carvalho，F.，等人在“纯合的植物中的β-1，3-葡聚糖酶转基因的表达抑制，”EMBOJ.，11：2596-602(1992)一文中，首次提出了转录后基因沉默这种现象。
一个RNA阈值模型被用来解释上述发现(Lindbo，J.A.，et al.，“转基因植物中诱导的高特异的抗病毒状态：基因表达调控和病毒抗性有关，”Plant Cell，5：1749-59(1993))。基本来说，该模型认为存在一种细胞质的细胞降解机制限制植物细胞中的RNA水平，当转基因转录的转录本高于阈值水平时，该机制被激活。降解机制对高于阈值水平的转录是特异的；如果高于某一阈值水平的转录本是一病毒转基因，因为降解机制也可以使入侵病毒的特异性序列失活，因而转基因植物表现出抗病毒状态。该模型还解释了转基因植物的“康复”现象，***入侵的病毒RNA在一些具有两个转基因拷贝的转基因植物中激发这种现象。具有三个以上转基因拷贝的植物无须病毒的入侵就可使之超过阈值水平(Goodwin，J.，et al.，“遗传和生化分析转基因RNA介导的病毒抗性，”Plant Cell，8：95-105(1996)；Smith，H.A.，et al.，“不可翻译的有义RNA介导的转基因植物对病毒的抗性：表达，调控和非必需RNA的命运，”Plant Cell，6：1441-53(1994))。尽管降解机制尚不明了，但有人提出了这样一种观点：细胞内依赖于RNA的RNA聚合酶(”RdRp”)结合于转录本，生成多个小片段的反义RNA，然后反义RNA再结合别的转录本形成双链，从而被特异识别RNA-RNA双链的核酸酶降解。该降解机制的序列特异性解释了RNA介导的抗性的特异性。
Baulcombe及其同事就PVX所做的工作(English，J.J.，et al.，“表现出核基因沉默的转基因植物中病毒积累的抑制，”Plant Cell，8：179-88(1996)；Mueller，E.，et al.，“同源依赖性抗性：植物的转基因病毒抗性与同源依赖性基因的沉默有关，”Plant Journal，7：1001-13(1995))进一步证实和拓展了Dougherty及其同事的研究成果。提出了一个由Dougherty及其同事提出的RNA阈值模型改进而得到的异常RNA模型。该模型的特点与Dougherty的模型大体相似，不同之处在于，前者认为RNA的水平并不是激活细胞降解机制的唯一促因，转基因转录产生的异常RNA在激活能够降解特异性RNA的细胞质的细胞降解机制中发挥重要作用。异常RNA的产生可以通过转基因在染色体上的位置和通过转基因DNA的甲基化作用而加强。异常RNA的确切实质还不清楚，但它的一个特征使它成为与宿主编码的RdRp结合生成反义RNA的优选模板(Baulcombe，D.C.，“转基因植物中病原体诱导的抗病毒机理，”Plant Cell，8：1833-44(1996)；English，J.J.，et al.，“表现出核基因沉默的转基因植物中病毒积累的抑制，”Plant Cell，8：179-88(1996))。因此该模型也认为RdRp和反义分子参与降解机制。Baulcombe及其同事证实表现低稳定状态转基因水平的植物含有多个拷贝的转基因，而低稳定状态的RNA和伴随的抗性状态是由于转录后基因的沉默形成的。同源依赖性抗性，这一术语被提出来描述表现出同源依赖性基因沉默的植株的抗性(Mueller，E.，et al.，“同源依赖性抗性：植物的转基因病毒抗性与同源依赖性的基因沉默有关，”Plant Journal，7：1001-13(1995))。
用TSWV tospovirus(Pang，S.Z.，et al.，“转基因莴苣中转录后转基因沉默和由此引起的tospovirus抗性受转基因剂量和植物发育的影响，”Plant Journal，9：899-09(1996)；Prins，M.，et al.，“基因工程RNA介导的抗TSWV是序列特异的，”Mol.Plant MicrobeInteract.，9：416-18(1996))和豇豆花叶病毒(Sijen，T.，et al.，“RNA介导的病毒抗性：重复转基因和靶区域花纹化的作用，”PlantCell，8：2227-94(1996))的实验在转基因植物也表现抗性是转录后基因沉默的结果。Pang，S.Z.，et al.，“转基因莴苣中转录后基因沉默和由此产生的tospovirus抗性受转基因剂量和植物发育的影响，”Plant Journal，9：899-09(1996)表明，表达TSWV N基因的转基因莴苣转录后基因的沉默受基因的剂量和植物发育阶段的影响。对于表达病毒基因的转基因植物，此前虽然没有报道过，发育阶段对所转基因的转录后基因沉默以及转录后基因沉默对抗性的影响，但是在表达其它基因的植物中却有相关报道(de Carvalho，F.，et al.，“纯合的植物中的β-1，3-葡聚糖酶转基因的表达抑制，”EMBO J.，11：2595-602(1992))。转录后基因沉默也可以解释转基因烟草中低水平稳定状态的N基因RNA与高而特异的抗性之间的正比相关(Pang，S.Z.，et al.，“转基因烟草保护烟草不受TSW和INST侵害的不同机制，”Bio/Technology，11：819-24(1993))。Prins，M.，et al.，“基因工程RNA介导的抗TSWV是序列特异的，”MolecularPlant Microbe Interacttions，9：416-18(1996))也报道了表达N基因和mRNA非结构基因的转基因烟草中转录后基因沉默的现象。令人感兴趣的是，发现用TSWV基因组其他部分转化的烟草无抗性。作为一种解释，他们认为，那些不能赋予抗性的基因片段不符合能诱导转录后基因沉默的条件。Sijen，T.，et al.，“RNA介导的病毒抗性：重复转基因和靶区域花纹化的作用，”Plant Cell，8：2227-94(1996)一文中指出，表达移动蛋白、复制酶或外壳蛋白的转基因植物的抗性是由于转录后基因的沉默。这些资料还指出，移动蛋白转基因的mRNA的3’端区域是沉默机制的初始靶区域。
本发明涉及生产改良的抗病植物。
发明概述
本发明涉及一个由包括一个性状DNA分子和一个沉默子DNA分子(silencer DNA moleculer)的融合基因形成的DNA构建体。性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。所述沉默子DNA分子可操作地偶联到上述性状DNA分子上，使得二者的联合长度足以把预期性状赋予该DNA构建体所转化的植物。本发明公开了表达***、宿主细胞、植株和包含有DNA构建体的植物种子。
本发明的另一实施方案是，该DNA构建体可以是一个包括多个性状DNA分子的融合基因，并且其中至少有一些性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。但是，上述多个性状DNA分子联合长度足以把预期性状赋予该DNA构建体所转化的植物，并导致该融合基因的转录后沉默。本发明公开了表达***、宿主细胞、植株和包含有该实施方案的DNA构建体的植物种子。
本发明具体涉及制备能抵抗多种病毒的植物。众所周知，特定的植物类型常常对不止一种病毒易感。尽管PDR能很好地控制植物病毒带来的危害，但是要把抗多种病毒的抗性引入到特定的植物中却面临着许多挑战。例如，鉴定和获得用来转化植物的病毒全长基因费用昂贵且费时。而且，由于这些基因可能太大而不得不将其装入到不同的表达***中，因而必须分开转入植物。
本发明没有试图用全长的病毒基因转化植物，而是用这些基因中短的片段把能够抵抗多个病毒病原体的抗性赋予所转化的植物。与全长基因相比，获取这些短的基因片段更加容易且节省费用，所有这些基因片段的自身长度都不足以把预期形状赋予植物。不必要把每个片段所对应的独立启动子都引入到植物中；而只需要单一的启动子。而且，这些病毒基因片段可以优选地整合入一个载体***，从而使转化一次产生转基因植物。
这种制备对多种病毒具有抗性的转基因植物的简单策略可能会给农业生产带来深远的影响。一个例子就是木瓜环斑病毒(papayaringspot virus)(“PRV”)。已经用来自夏威夷的木瓜环斑病毒株的外壳蛋白基因转化得到了转基因木瓜，该转基因木瓜在温室和长期大田条件下具有高度的抗病毒性。但是，此木瓜对来自世界其它地方的病毒株仍高度易感，如牙买加，泰国和巴西等。显然，PRV在木瓜中的抗性是高度特异的，要在世界范围控制该病毒需要用各国靶病毒株的外壳蛋白基因做大量的转基因木瓜系。利用本发明，用总共小于1000bp的病毒基因片段加上一个大约400bp的沉默子DNA就可培育出抗所有PRV病毒株的转基因木瓜；相比而言，单个PRV外壳蛋白基因就长达约1000bp。
本发明的另一个用途是可赋予抗多种不同病毒的抗性。例如，在马铃薯中，利用本发明可赋予抗马铃薯卷叶病毒，马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒的抗性。为达到这种抗性效果，根据本发明，可以构建出一个受单一启动子作用的包含马铃薯卷叶病毒复制酶的部分编码基因，马铃薯Y病毒外壳蛋白的部分编码基因和马铃薯X病毒移动蛋白的部分编码基因的构建体，并用其转化马铃薯。结果，一次转化就可得到具有抗马铃薯卷叶病毒，马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒抗性的转基因马铃薯。与把每一个全长基因加各自的启动子一起整合到一个表达载体或不同载体形成的构建体的方法相比，本发明取得了巨大进步。
本发明的另一个用途是赋予葫芦科植物抗大量病毒的抗性。例如，对于倭瓜，可利用本发明赋予其对zuccinni黄化叶病毒、木瓜环斑病毒、西瓜花叶病毒II和倭瓜花叶病毒的抗性。例如，可构建一个受单一启动子控制的包含来自上述每种病毒的外壳蛋白的部分编码基因或复制酶的部分编码基因的构建体，并将其转化入倭瓜。得到的转基因倭瓜能够抵抗上述所有病毒。
除了赋予植株对多种病毒病的抗性以外，利用本发明能够赋予植物其他性状。常希望能够把大量疾病抗性之外的其它性状通过转基因转入植物。例如，颜色，酶的产生等都可以是所希望赋予植物的性状。但是，把多种这样的性状转化植物时同样会遇到上述的转化疾病抗性时所遇到的困难。同样，利用本发明能够消除在转化疾病抗性以外的其他性状时所遇到的这些问题。
在用多种性状转化植物时，可能会遇到的这样一个问题，即并非所有的性状都能转化成功。例如，要赋予转基因植物以4种新性状，因为每一个表达事件发生的可能性是10％，所以使得根据本发明生产出获得所有这些性状的植株的可能性远高于用受各自启动子控制的全长性状基因转化植物时的可能性。更具体地说，后者表达所有这四个性状的概率是0.0001(即，0.1×0.1×0.1×0.1)，而本发明的概率是0.1。
附图简述
图1给出的是就TSWV-BL的N基因而言时所转基因的图例。
图2显示了转基因植物抗TSWL-BL感染的保护。用nptII ELISA试剂盒(5 prime到3 prime，Inc)，通过DAS-ELISA实验对所选择品系R1植株(一个1/2N高表达子8-127和一个1/2N低表达子8-2，经Northern印迹分析确定的)进行nptII活性分析。用ELISA阴性非转基因的分离子(nptII ELISA的读数为0.00-0.02OD405nm)作为对照。随后用TSWV-BL对同一植株攻击。每隔一天检测植株是否出现***感染，任何在未接种叶子上表现症状的植株被记录为***感染。
图3A-B显示1/2N低表达子8-2中所转基因的沉默。图3A为8-2和8-127 R1植株的Northern印迹分析。从转基因植株中分离总RNA(每泳道15μg)并用Northern印迹分析。泳道1-6为沉默的8-2R1植株；泳道7-12为未沉默的8-127 R1植株；泳道13为非转基因的对照。图3B为对R1植株的核失控转录分析。琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶解消化的N基因、nptII和肌动蛋白片段，并转移到膜上然后与标记过的核RNA杂交。本分析所用的胞核分离自8-2 R1和8-127 R1植株。
图4比较了表达不同长度N基因片段的植株中的转录本积累。泳道1和2为具有全长N基因的病毒易感R1植株，基因未沉默；泳道3为具有2/2N基因的沉默了的病毒抗性的R1植株；泳道4为具有2/2N基因的未沉默的病毒易感R1植株；泳道5～8为4个具有3/4N基因的未沉默的病毒易感R1植株；泳道9～12为具有5/8N基因的未沉默的病毒易感R1植株。
图5显示的是包括GFP/N融合基因的R1植株的Northern分析。当植株在5～6叶阶段时，收集叶片分离RNA。每泳道加10μg总RNA用于Northern分析，其中所用探针为TSWV-BL的N基因(上排)或GFP基因(下排)。摘去用于RNA分析的叶片样品之后，用TSWV-BL接种该植株，并根据在接种后14天是否出现***性症状而分别标记为抗性(“R”)和易感(“S”)。泳道1～2，为GFP+5/8N-1 R1植株；泳道3～6，为GFP+3/4N-5 R1植株；泳道7，为GFP+3/4N-6 R1植株；泳道8，为GFP+3/4N-23 R1植株；泳道9～10和12，为GFP+3/4N-8 R1植株；泳道11为未转化的植株。
图6为用于本研究的所转基因的图例。一个不可翻译的N基因片段同GFP或CP-TuMV基因转录融合。每一个转基因都受双加强的CaMV35S启动子、苜蓿花叶病毒的5’端非翻译前导序列和胭脂碱合成酶基因的3’端非翻译区控制。把这个完整的表达******植物转化载体pBIN19(Clontech Labotatories，Inc.)，然后，利用根癌土壤杆菌Agrobacterium tumafaciens LBA4404通过叶盘转化将其导入到nicotiana benthamiana。2/2N是第二个半长基因片段，3/4N是第3个1/4长的基因片段，5/8N为第5个TSWV-BL的N基因的1/8长片段。Pang et al.，“非靶DNA序列可减少在转基因植物中产生RNA介导的Tospovirus抗性所必需的所转基因的长度，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：8261-66(1997)，该文献在此引入作为参考。
图7为TMV-GFP和TMV-GFP-NP的模式图。TMV-GFP由C.A.Holt博士提供。在NotI位点处，把TSWV的N基因序列与GFP转录融合。体外转录按Casper et al.，“来自烟草花叶病毒载体的绿色荧光蛋白编码基因的表达，”Gene，173；69-73(1996)中描述的方法进行，该文献在此引入作为参考。
发明详述
本发明涉及一个由包括一个性状DNA分子和一个沉默子DNA分子的融合基因形成的DNA构建体。性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。所述沉默子DNA分子操作偶联到上述性状DNA分子上，使得二者的联合长度足以把预期性状赋予该DNA构建体所转化的植物。
本发明的另一实施方案是，该DNA构建体可以是一个包括多个性状DNA分子的融合基因，并且其中至少有一些性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。但是，上述多个性状DNA分子联合长度足以把预期性状赋予该DNA构建体所转化的植物，并影响该融合基因的转录后沉默。
本发明的一个具体优选方面是，该DNA构建体包括多个性状DNA分子，其中各个性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子单独所转化的植物。可能其中一些性状DNA分子的长度足以赋予植物它们相应的性状，但是，决非所有这样的DNA分子都有如此长度。
本发明的一个方面涉及与植物异源的性状DNA分子的用途--例如，可以把疾病抗性赋予该DNA构建体所转化植物的DNA分子。本发明在赋予植株抗各种病原体抗性方面是有用的，这些病原体包括病毒、细菌、真菌、类病毒、植物原生质、线虫和昆虫。本发明也可以用于赋予哺乳动物遗传性状。按本发明的方法可以赋予抗特别是以下病毒的抗性：番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、番茄斑点病毒(tomato nottle virus)、番茄黄色卷叶病毒或其组合。按本发明的方法可以赋予植物抗特别是以下细菌的抗性：青枯假单胞菌、丁香假单胞菌烟草致病变种、野油菜黄单孢菌天竺葵致病变种和根癌土壤杆菌。按本发明的方法可以赋予植物抗特别是以下细菌的抗性：尖孢镰孢和蔓延疫霉。适合的DNA分子包括一个编码外壳蛋白的DNA分子、一个编码复制酶的DNA分子、一个非编码蛋白的DNA分子、一个编码病毒基因产物的DNA分子或其组合。
赋予植物疾病抗性的DNA分子在DNA构建体中可以是有义方向。可替代地，也可以是反义方向。反义RNA技术涉及产生互补于靶基因信使RNA分子的RNA分子；反义RNA可潜在地阻断所有靶基因的表达。就抗病毒而言，植物表达相对于病毒RNA的反义RNA分子(也就是说，反义RNA是一种与被感染病毒编码的正义RNA互补的RNA分子)。这些植物可以表现出对该病毒易感性的轻微减轻。这样的互补RNA被称之为反义RNA。
本发明也可以用于赋予植株抗病性状以外的其他性状。例如，能赋予植物遗传性状的DNA分子能够用做本发明所述的DNA性状分子。在本发明的这一方面，合适的性状DNA分子可以编码预期的颜色、酶的生成及其组合。
用于本发明的沉默子DNA分子可以选自任何实际上能导致基因沉默的核酸。这涉及到降解与所转基因mRNA同源的mRNA的细胞机制。沉默子DNA分子可以同植株异源，无需与性状DNA分子在植物中相互作用，沉默子DNA分子可以位于性状DNA分子的3’端。例如，沉默子DNA分子可以是一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子或其组合。
尽管不希望受理论的束缚，但通过使用本发明的构建体，可以确信实现转录后基因沉默。更具体地说，相信沉默子DNA分子可以促进细胞内异源RNA的水平超过阈值。这样就激活了降解机制，从而成功地获得病毒抗性。
有可能适当地组配本发明的DNA构建体，可以使本发明的性状和沉默子DNA分子编码出可翻译的RNA分子。因此，RNA分子就能在核糖体中翻译生成由所述DNA构建体编码的蛋白。把编码感兴趣的DNA构建体的克隆基因和作为病毒调控序列的合成双链寡核苷酸(即，一5’端非翻译序列)连接在一起，可以增加以这种方式生产的蛋白的产量。参见Gehrke的第4,820,639号美国专利和Wilson的第5,849,527号美国专利，这两篇文献在此引入作为参考。
替代地，适当地组配本发明的DNA构建体可以使本发明的性状和沉默子DNA分子编码出不可翻译的mRNA。通过向所述DNA分子中导入一个或多个提前终止密码子、添加一个或多个(多个3联碱基除外)使阅读框移位、除去翻译起始密码子等手段，可以成功实现这一点。参见Dougherty等人的第5,583,021号美国专利，该文献在此引入作为参考。
利用传统的重组DNA技术可以把目的DNA构建体整合入细胞。通常，这种操作涉及把DNA构建体***与该构建体异源的表达***(即不是正常出现的情况)。可以把该异源DNA构建体以合适的有义方向和正确的读框***表达***或载体。载体包含有转录***序列的必须元件。
Cohen和Boyer的第4,237,224号美国专利，在此引入作为参考，该专利描述了用限制酶切割和DNA连接酶连接构建以重组质粒形式存在的表达***。然后，通过转化把这些重组质粒导入单细胞培养物中并复制，单细胞培养物包括原核有机体和生长在组织培养物中的真核细胞。
也可以把重组基因导入病毒，如痘苗病毒。可通过将质粒转染已感染病毒的细胞来获得重组病毒。
合适的载体包括，但不限于下面的病毒载体和质粒载体，病毒载体包括lambda载体***gt11、gtWES.tB、Charon4等，质粒载体是指PBR322、PBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluscript II SK+/-或KS+/-(参照“StrataGene cloning system”目录(1993)，StrataGene，La Jolla，Calif，在此引入作为参考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参见F.W.Studier等，“用T7RNA聚合酶指导的克隆基因的表达，”Gene Expression Technology vol.185(1990)，在此引入作为参考)及其任意衍生物。可通过转化，具体地说是通过转导、细胞接合、带动转移或电穿孔，把重组分子导入细胞。用本领域标准的克隆方法，把DNA序列克隆入载体中，该方法的具体描述见Sambrook等，分子克隆：实验指南，冷泉实现室，冷泉港，纽约(1989)，该文献在此引入作为参考。
各种宿主-载体***可以用来实施此发明。基本的一条是，载体***必须与所用的宿主细胞兼容。宿主载体***包括，但不限于以下：噬菌体DNA、质粒DNA、粘粒DNA转化的细菌；含有酵母载体的酵母等微生物；病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)转染的哺乳动物细胞***；病毒(如杆状病毒)转染的昆虫细胞；细菌感染的植物细胞。这些载体的表达元件在强度和特异性上是不同的。根据所用的宿主载体***的不同，可以从大量合适的转录并且也可能是翻译的元件中任意选用一种。
不同的遗传信号和加工过程控制着基因表达中的许多阶段(例如，DNA的转录和信使RNA(mRNA)的翻译)。
DNA的转录依赖于启动子的存在，启动子是一段能引导RNA聚合酶结合从而启动mRNA合成的DNA序列。真核生物的启动子序列与原核生物不同。而且，真核生物的启动子和伴随的遗传信号在原核***内可能不被识别或不能发挥作用，反之，原核生物的启动子在真核细胞中也不被识别且不能发挥作用。
相似地，原核生物mRNA翻译依赖于合适的不同于真核生物的原核信号。原核生物mRNA的有效翻译需要mRNA上的一个称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。该序列是位于起始密码子之前的一小段mRNA短核苷酸序列，起始密码子通常是编码蛋白质氨基端甲硫氨酸的AUG。SD序列互补于16SrRNA(核糖体RNA)的3’端，它可能是通过与rRNA形成双链来启动mRNA与核糖体的结合从而使核糖体正确定位。关于最大基因表达的详细综述，请参见Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68：473(1979)，该文献在此引入作为参考。
启动子的强度(即它们启动转录的能力)各不相同。在表达一个克隆的基因时，如果要想获得基因的高水平转录和表达，就需要选用强的启动子。根据所用宿主细胞体系的不同，可以从大量合适的启动子中任意选用一种。例如，当在E.coli、它的噬菌体或质粒中克隆时，可以使用以下启动子来指导邻接DNA片段的高水平转录：如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、入大肠杆菌噬菌体的PR和PL启动子及其他包括但不限于，lacUV5、ompF、bla、lpp等。此外，杂合启动子trp-lacUV5(tac)以及通过重组DNA或其它合成DNA技术得到的其他E.coli启动子可以用于***基因的转录。
可以选用这样的细菌宿主细胞和表达载体，即它们能够抑制除特意诱导的启动子之外的其他启动子的活性。在某些操作中，加入特异的诱导物是实现***DNA有效转录所必须的条件。例如，lac操纵元受乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的诱导。其它各种操纵元如trp，pro等均受不同的控制。
原核细胞基因的有效转录也需要特异的起始信号。通过分别测量基因特异mRNA和合成的蛋白质的数量，可以发现转录起始信号的“强度”各不相同。一个含有启动子的DNA表达载体中也可以包含各种“强度”的转录起始信号的任一组合。
一旦将DNA构建体克隆入表达载体，下一步就是转入宿主细胞。根据所用载体/宿主***的不同，可以用上述各种转化形式完成转入。适合的宿主细胞包括，但不限于，细菌、病毒、植物及类同的细胞。
本发明也可以利用操作偶联在融合基因的末端的终止序列来终止转录。合适的终止序列包括3’端非翻译区的终止区。这可导致转录的终止和在转录的mRNA序列的3’端后面加聚腺苷酸化核糖核苷酸。终止区或3’端非翻译区是另外一个便利条件。终止区可以同启动子区域同源，也可有别的来源，优选地包含一个终止子和为聚腺苷酸化编码的序列。合适的3’端非翻译区包括但不限于：(1)3’端转录但不翻译的区域，其中包含有土壤杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒基因如胭脂碱合成酶(NOS)基因或35S启动子终止子基因的聚腺苷化信号；(2)植物基因，如大豆7S储藏蛋白基因和豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶氧化酶(ssRUBISCO)E9基因小的亚单位。
在生产转基因植物时，可以用微量加液器把上述位于载体中的DNA构建体直接微注射到植物细胞中，从而实现用机械方法转化重组的DNA。Crossway，Mol.Gen.Genetics，202：179-85(1985)，在此引入作为参考。也可用聚乙二醇把遗传物质转入植物细胞。Krens等，Nature，296：72-74(1982)，其在此引入作为参考。
DNA构建体转化植物细胞的另一种方法是微粒轰击(也称为biolistic转化)宿主细胞。这可通过几种方式中的一种来完成。第一种是向细胞发射惰性或生物活性微粒。该技术公开于Sanford等人的美国专利US4,945,050，US5,036,006和US5,100,792，在此引入作为参考。通常，该程序涉及在能有效穿过细胞外表面并整合入细胞内部的条件下，向细胞发射惰性或生物活性微粒。当用惰性微粒时，可以通过用含有异源DNA构建体的载体包裹微粒，把含有DNA构建体的载体导入细胞。可替代地，用载体包裹，当微粒活化靶细胞后载体得以进入细胞。也可用生物活性微粒(例如包含有载体和异源DNA构建体的干细菌细胞)来轰击植物细胞。
另一种导入方法是原生质体与其他实体的融合，该实体可以是微细胞、细胞、溶酶体或其它脂类物质包裹的可融合微体。Fraley，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：1859-63(1982)，在此引入作为参考。
也可以用电穿孔把DNA分子导入植物细胞。Fromm et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824(1985)，在此引入作为参考。在此技术中，在含有表达***的质粒存在的条件下，通过电穿孔导入植物原生质体。高场强的电脉冲可以反复使生物膜可通透从而允许质粒导入。电穿孔的原生质体重整细胞壁、***并再生。
将DNA分子引入植物细胞的另一种方法是用所转基因后的根癌土壤杆菌和发根病土壤杆菌感染植物细胞。在本领域公知的合适条件下，转化的植物细胞发育形成芽或根，并进一步发育成植株。通常，该程序涉及用细菌悬液接种植物组织，并把该组织在25-28℃的无抗生素的再生培养基中孵育48-72小时。
土壤杆菌属为革兰氏阴性的根瘤菌科的代表属。它可以引起细菌性根癌病(A.tumefaciens)和毛根病(A.rhizoGenes)。患这两种病的植物细胞被诱导生成称为冠瘿碱的氨基酸衍生物，该衍生物只能被细菌代谢。负责表达冠瘿碱细菌基因是嵌合表达***控制元件的一个方便的来源。此外，可以用检测冠瘿碱存在与否来鉴定被转化的组织。
异源的遗传序列可通过根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根病土壤杆菌的Ri质粒转入合适的植物细胞。土壤杆菌属细菌感染植物细胞时，Ti或Ri质粒可以被传递给植物细胞，并稳定地整合入植物基因组。J.Schell，Science，237：1176-83(1987)，在此引入作为参考。
转化后，转化的植物细胞必须能够再生。
植株从培养的原生质体中再生的描述参见Evans et al.，的描述，Handbook Of Plant Cell Culture，Vol 1：(MacMillan PublishingCo.，New York，1983)；和Vasil I.R.(ed.)Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants.Acad.Press，Orlando，Vol.1，1984，和Vol.III(1986)，在此引入作为参考。
众所周知，实际上所有的植株可以从培养的细胞和组织再生，包括但不限于，甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆类的所有主要种。
再生方法随不同的植物种而各不相同，但一般首先需要提供所转化原生质体的悬浮液和包含外植体的培养皿。愈伤组织(callustissue)首先形成，愈伤组织被诱导发芽并接着植根。可替代地，愈伤组织也可诱导生成胚胎。这些胚胎可象天然胚胎一样发芽形成植株。培养基一般包括各种氨基酸和激素如茁长素和细胞***素。向培养基加谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是对玉米和苜蓿。有效的再生依赖于培养基、基因型和培养史。如果控制这三个可变因素，再生则可以产生和重复。
在表达***被稳定地整合入转基因植株后，可以通过有性杂交转化给其它植株。根据杂交种类的不同，可从大量标准育种技术中选用任何一种。
一旦产生了这种类型的转基因植株，植株自身就可以用常规培养方法来培养，从而使DNA构建体出现在得到的植株中。可替代地，可从转基因植株中回收转基因种子。然后，用传统的方法把这些种子种植在土壤中并培养生成转基因植株。
本发明可以与各种植物或其种子结合使用。合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物。更具体地说，有用的作物包括：苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜和甘蔗。合适的观赏植物的实例是：拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨和百日菊。
实施例
实施例1-克隆和转化
以番茄斑萎病毒(TSWV-BL)莴苣分离株的N基因(Pang，S.-Z.，et al.，“表达番茄斑萎病毒核衣壳蛋白的转基因植物对该病毒异源分离株的抗性，”Phytopathology，82：1223-29(1992)，在此引入作为参考)为模板，用表1所列引物来构建不同长度N基因片段。
表1.克隆所用的引用
名称 位置 序列
用于N基因片段
91-84 2776-2744 5′-AGCTAATCTAGAACCATGGATGACTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC
(SEQ.ID.NO.1)
93-89 2669-2650 5′-TACAGTTCTAGAACCATGGTCTGGAAAACCTTGACCAG
(SEQ.ID.NO.2)
93-85 2576-2556 5′-TACAGTTCTAGAACCATGGTAAAGCGATTTTACTTTTGGTA
(SEQ.ID.NO.3)
92-55 2373-2354 5′-AGATTCTCTAGACCATGGTGACTTGATGAGCAAAGTCTGTGAGGCTTGC
(SEQ.ID.NO.4)
93-91 2266-2248 5′-TACAGTTCTAGAACCATGGAAAATACAAGGATCTCGGG
(SEQ.ID.NO.5)
93-87 2153-2133 5′-TACAGTTCTAGAACCATGGTAGAAGGGGAAAGAGTATGCTG
(SEQ.ID.NO.6)
90-47 1918-1937 5′-AGCATTGGATCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC
(SEQ.ID.NO.7)
93-86 2158-2177 5′-TCTTGAGGATCCATGGCTGATCTTCATTCATTTCAA
(SEQ.ID.NO.8)
93-90 2269-2288 5′-TCTTGAGGATCCATGGATCCTGATATATAGCCAAGA
(SEQ.ID.NO.9)
92-53 2383-2402 5′-TACAGTGGATCCATGGTTAAGGTAATCCATAGGCTTGAC
(SEQ.ID.NO.10)
93-84 2577-2597 5′-TCTTGAGGATCCATGGCTTAATAACCTTCATTATGC
(SEQ.ID.NO.11)
93-88 2671-2690 5′-TCTTGAGGATCCATGGAAAAGTCTTGAAGTTGAATG
(SEQ.ID.NO.12)
94-265 2556-2530 5′-AGCTAATCTAGAACCATGGATGAAAAATTACCATAAAGAAAACTTCAGAC
(SEQ.ID.NO.13)
94-266 2182-2206 5′-AGCATTGGATCCATGGTTAGTTACCTAGTTTTCTTTTCAGCACAGTGCAAACT
(SEQ.ID.NO.14)
5′TuMV -- 5′-TTGACTCCATGGCAGGTGAAACGCTTGAGG
(SEQ.ID.NO.15)
3′TuMV -- 5′-GTCGTACCATGGCGAGAATACTAACGAGTAAAC
(SEQ.ID.NO.16)
用于GFP基因
5′gfp NA 5′-TGAACATCTAGAACCATGGGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG
(SEQ.ID.NO.17)
3′gfp NA 5′-TGAACAGGATCCATGGTCTACGAATGCTATTATTTGTATAGTTC
(SEQ.ID.NO.18)
扩增N基因片段所用各种引物的核苷酸位置公开于Pang et al.，“表达番茄斑萎病毒核衣壳蛋白的转基因植物对该病毒异源分离株的抗性，”Phytopathology，82：1223-29(1992)中，该文献在此引入作为参考。N基因片段的正向引物设计包含一个读框外的ATG和/或终止密码子以保证产生不可翻译的N基因转录本。PCR扩增的N基因片段(表2)以有义方向克隆到植物表达载体pBI525的NcoI位点(Pang，S.-Z.，et al.，“表达番茄斑萎病毒核衣壳蛋白的转基因植物对该病毒异源分离株的抗性，”Phytopathology，82：1223-29(1992)，在此引入作为参考)。
表2 表达N基因片段的R1植株对接种TSWV-BL分离株的反应
将TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的叶片抽提物的30倍稀释液用于5-7叶龄植株的三个顶叶上。在至少45天的观察期间内每隔一天记录数据。反应可分为三种表型：1)高度易感(”HS”)，接种后5-10天可观察到一般***症状；2)高度耐受(“HT”)，***症状明显推迟(接种后超过10天)；3)高度抵抗(“HR”)，植株整个生活周期无症状。关于TSWV-BL的N基因的说明参见图1。为构建各种N基因片段同绿色荧光蛋白(“GFP”)的融合体，用GFP引物(表1)从pGFP质粒(Clontech，Palo Alto，CA)扩增可翻译的GFP开放阅读框并转录融合(transcriptionalfusion)克隆在pBI525中N基因片段2/2N，3/4N和5/8N的5’端NcoI位点内。得到的GFP/N融合体含有可翻译的GFP开放阅读框和接着的作为GFP基因的3’端非翻译区的不同长度的N基因片段。
| #测试的 | #抵抗的 | 测试植株的反应a | |||||
| 基因 | 大小(bp) | 品系 | 植株 | 品系 | HS | HT | HR |
| 对照 | 239 | 239 | |||||
| 2/2N | 453 | 7 | 118 | 5 | 63 | 26 | 29 |
| m1/2N | 411 | 6 | 108 | 6 | 36 | 17 | 55 |
| 1/2N | 387 | 5 | 99 | 2 | 75 | 4 | 20 |
| 4/4N | 235 | 7 | 89 | 0 | 89 | ||
| 3/4N | 218 | 12 | 145 | 0 | 145 | ||
| 1/4N | 194 | 12 | 134 | 0 | 134 | ||
| 2/4N | 193 | 5 | 64 | 0 | 64 | ||
| 5/8N | 110 | 7 | 85 | 0 | 85 | ||
| 6/8N | 108 | 13 | 162 | 0 | 162 | ||
| 1/8N | 102 | 14 | 170 | 0 | 170 | ||
| 2/8N | 92 | 8 | 63 | 0 | 63 | ||
上述得到的植株表达载体用HindIII和EcoRI(如果需要可部分消化)消化，分离包含有相应基因表达框的HindIII-EcoRI片段并***pBIN19的相同位点。得到的二元载体转入根癌土壤杆菌LBA4404，然后用包含该载体的该根癌土壤杆菌接种N.benthamiana植株的叶盘，基本上按照Horsch等描述的方法进行。(Horsch，R.B.，et，al.，“一种将基因转入植物的简便和常用方法，”Science、227：1229-31(1985)，在此引入作为参考)。
实施例2-转基因植物的ELISA实验和Northern blot分析。
用nptII ELISA试剂盒，通过双抗夹心酶联免疫吸附实验(”DAS-ELISA”)来检测转基因植物中的nptII酶(5 Prime to 3Prime，INC)。RNA印迹具体操作参见以前文献(Pang，S.Z.，et al.，“转基因烟草保护烟草不受番茄斑萎病毒和凤仙花坏死环斑病毒感染的不同机制，”Bio/Technology，11：819-24(1993)，在此引入作为参考)。
实施例3-转基因植株的接种
根据以前文献(Pang，S.-Z.，et al.，“表达番茄斑萎病毒核衣壳蛋白的转基因植物对该病毒异源分离株的抗性，”Phytopathology，82：1223-29(1992)，在此引入作为参考)进行接种。在至少两个月的期间内，每隔一天记录***症状。
实施例4-分离核和核失控转录实验
分离核和核失控转录实验的具体操作参见以前文献(Pang，S.Z.，et al.，“转基因莴苣中的转录后基因沉默以及由此导致的抗tospovirus抗性受转基因剂量和植物发育的影响，”Plant Journal，9：899-09(1996)，在此引入作为参考)。
实施例5-小的N基因片段(92-235bp)不能诱发RNA介导的tospovirus抗性。
不可翻译的长度为92-453bp的N基因片段(表2)用合适的5’端和3’端引物(表1)PCR扩增。为了防止截短的N蛋白的翻译，5’端引物设计为包含一个读框外的ATG并在其后加终止密码子。把代表整个N基因不同区段的N基因片段(图1；表2)以有义方向克隆到植物表达载体pBI525中。该载体使用了双加强的CaMV 35S启动子，苜蓿花叶病毒(“AIMV”)的5’端非翻译区和胭脂碱合成酶基因的3’端非翻译区。通过土壤杆菌介导的转化，用获得的表达***获得转基因的N.benthamiana植株。
为了从R1转基因群体中鉴别出非转基因分离株，首先用nptIIELISA对R1转基因种子进行筛选。为了排除接种期间遗漏和人为偏差的可能性，来自每一品系的非转基因分离株与转基因的R1植株一起接种作为内对照。此外，每一个接种实验还包含未转化的N.benthamiana植株。图2和表2总结了接种后的R1植株对TSWV-BL的反应。与阴性对照植株对病毒绝对易感不同，表达大的N基因片段(387-453bp，N基因的一半)可以使20-51％的R1植株中具有高度的抗TSWV-BL抗性，使4-22％的R1植株对tospovirus感染产生耐受。此外还表明，R1植株对密切相关的TSWV-10W分离株有抗性，而对关系远的凤仙花坏死环斑病毒(“INSV”)(Law，M.D.，et al.，”凤仙花坏死环斑病毒的M RNA具有双义基因组结构，”Virologv.188：732-41(1992)，在此引入作为参考)或落花生环斑病毒(“GRSV”)(Pang，S.Z.，et al.，“一株典型的(distinct)tospovirus的生物学特性及其mRNA的序列分析，”Phytopathology，83：728-33(1993)，在此引入作为参考)分离株则无抗性。所选品系的Northern分析表明，抗性表型与N基因片段转录本的低水平积累相关(图3A)。为进一步证实N基因片段的稳定态mRNA积累水平的降低是由于所转基因的转录后负调节导致的，进行了核失控转录分析。用内源性的肌动蛋白作为对照，发现N基因片段在沉默的子代中的转录效率高于非沉默的高表达子代(图3B)。这些结果一起表明，观察到的抗性是转录后所转基因沉默的结果，这种现象影响了稳定态mRNA的积累但不影响转录效率。
类似地，用TSWV-BL和其他的tospovirus分离株接种表达小的N基因片段(92-235bp，1/4到1/8 NP)的R1植株，所有的植株都对tospovirus易感(表2)。对所选R1植株的RNA印迹分析表明，N基因片段的转录水平同所转基因的长度相关。如图4所示，非沉默的R1植株中，较大的所转基因的转录本的积累水平通常远远高于那些较小的所转基因的转录本的积累水平(图4)。该结果表明，小的N基因片段在核中没有被有效地转录，或者虽以近似的效率转录但在胞质中未经正确的加工、转运或不稳定。因此，在那些转入了小的所转基因的植株中，没有诱导形成所转基因的沉默。事实上，用核失控转录分析对大量表达小的N基因片段的代表品系进行的分析表明，没有得到任何证据能够证明在任何一个所测试系中发生了转录后基因沉默。
实施例6-小的N基因片段与GFP的融合体可赋予RNA介导的tospovirus抗性。
小的N基因片段不能赋予RNA介导的抗性可能是由于转基因太小而不能表达和不能高水平的积累(例如，无效转录、加工、转运或低稳定性)或着是由于N基因片段太小而低于入侵病毒基因组反式失活所需同源区的最低长度。按照上述方法，把各种N基因片段(110、218和453bp)融合到GFP基因的3’端区域。该融合体在植物细胞中的表达可产生包括功能性GFP开放阅读框以及作为3’端非翻译区紧接其后的各种N基因片段的转录本。用同源分离株TSWV-BL接种表达这些融合体R0植株，接种结果总结于表3。作为对照，单独表达GFP的转基因R0植株在接种后5～10天呈现典型的***症状。另一方面，所有的GFP/N融合体可赋予不同水平的抗TSWV-BL的抗性(表3)，包括那些单独在植株中表达时不能提供对TSWV-BL保护的小的N基因片段(110bp～218bp)(表2)。表3表达GFP/N融合体的R0植株对接种TSWV-BL分离株的反应
a 将TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的叶片抽提物的30
| 实验植株的反应a | |||||
| 基因 | 大小(bp) | #品系 | HS | HT | HR |
| GFP | 720+0 | 8 | 8 | ||
| GFP+5/8N | 720+110 | 13 | 11 | 1 | 1 |
| GFP+3/4N | 720+218 | 8 | 2 | 6 | |
| GFP+2/2N | 720+453 | 14 | 5 | 1 | 8 |
倍稀释液用于5-7叶龄植株的三个顶叶上。在至少45天的观察
期间内每隔一天记录数据。反应可分为三种表型：1)高度易感
(”HS”)，接种后5-10天可观察到***症状；2)高度耐受
(“HT”)，***症状明显推迟(接种后超过10天)；3)高
度抵抗(“HR”)，植株整个生活周期无症状。
用类似的方法接种来自所选R0品系的R1子代，它们表现出类似水平的对TSWV-BL的保护(表4)。表4.表达GFP/N融合体的R1植株对接种TSWV-BL分离株的反应
a 将TSWV-BL感染后的N.Benthamiana植株的叶片抽提物的30
| 实验植株的反应a | |||||
| 基因 | 品系# | #所测植株 | HS | HT | HR |
| GFP+5/8N | 1 | 18 | 10 | 7 | 1 |
| 3 | 14 | 14 | |||
| GFP+3/4N | 5 | 17 | 8 | 9 | |
| 6 | 18 | 6 | 12 | ||
| 7 | 18 | 15 | 3 | ||
| 22 | 20 | 20 | |||
| 23 | 20 | 16 | 1 | 3 | |
| 24 | 16 | 16 | |||
| GFP+2/2N | 8 | 15 | 9 | 1 | 5 |
| 9 | 18 | 18 | |||
| 10 | 16 | 16 | |||
| 26 | 22 | 19 | 3 | ||
| 27 | 19 | 19 | |||
| 28 | 21 | 18 | 1 | 2 | |
| 29 | 21 | 1 | 20 | ||
倍稀释液用于5-7叶龄植株的三个顶叶上。在至少45天的观察
期间内每隔一天记录数据。反应可分为三种表型：1)高度易感
(”HS”)，接种后5-10天可观察到***症状；2)高度耐受
(“HT”)，***症状明显推迟(接种后超过10天)；3)高
度抵抗(“HR”)，植株整个生活周期无症状。
这些R1植株也表现出对密切相关的TSWV-10W分离株有抗性，而对关系远的INSV或GRSV分离株则无抗性。这些结果说明GFP基因引起基因沉默，从而降解GFP、小的目标N基因片段以及那些来自入侵病毒的激发起植株抗性的同源序列。但是，最小的GFP-5/8N的融合体(有110bp同源)几乎无法激起抗TSWV-BL的抗性，这一点可以从被保护R0植株的数目较少及保护质量上反映出来(表3和4)，这一点说明，110bp的核苷酸序列接近反式失活以及由此获得抗病毒抗性所需的最短同源序列。此外，用N基因和GFP基因两者作为探针，通过RNA印迹分析一些表达融合体的R1植株(图5)。RNA印迹分析结果表明所观察到的抗性又与融合基因转录本的低水平积累相关，这就表明在单独表达N基因片段的植株体内或表达GFP/N融合体的植株体内所运行的抗性机制相同。
已经获得了许多单独表达TSWV N基因不同区段或者与非病毒序列，GFP，融合表达的植株品系。所转基因的长度小于N基因的1/4(235bp)时，单独表达虽然无效，但它与GFP基因融合表达就能使侵入的同源的tospovirus转录后反式失活。该结果表明小N转基因单独不能诱导同源依赖性的病毒抗性并不是由于它们与被沉默的所转基因(此处为病毒基因组)之间的同源长度不够，而是因为它们不能诱导基因沉默。这样，本研究就把诱导所转基因沉默的能力与提供同源依赖性的反式失活的能力区分了开来。
实施例7-小的N基因片段与GFP或TuMV-CP的融合体可赋予RNA介导的多种抗性
与GFP的3’端的融合的各种N基因片段(2/2N，3/4N和5/8N)可以赋予转基因植物的R0和R1子代抗Tospovirus的抗性(表3和4)。English，et al.，“表现为核基因沉默的转基因植物可抑制病毒的积累，”Plant Cell，8：179-88(1996)，在此引入作为参考，该文献报道由于被沉默的植物中的降解机制可识别入侵的嵌合病毒中的被沉默序列，所以带有被沉默的所转基因的转基因植物可使含有所转基因序列的嵌合病毒失活。因为GFP和N片段在TSWV抗性植株中都被沉默(图5)，所以为了测定具有GFP/N融合体的转基因植物是否对TSWV和具有GFP序列的嵌合病毒都具有抗性，分别用TSWV、TMV-GFP和TMV-GFP-NP接种具有GFP/N融合体的R2转基因植物(图7)。如表5所示，具有GFP/N融合体的转基因植株对TSWV和TMV-GFP有抗性。该资料表明连有沉默子(此处为GFP)的小N片段可赋予转基因植物多种抗性。
表5表达GFP-2/2N，GFP-3/4N和GFP-5/8N的转基因植株R2子代对TSWV、TMV-GFP和TMV-GFP-NP的反应
TSWV TMV-GFP TMV-GFP-NP
n R S n R S n R SGFP-2/2N4-11(8)373 21 12 9 NT NTGFP-3/4N3-10(5)193 26 26 0 4 4 0 4 4 03-10(6)250 35 35 0 NT NTGFP-5/8N2-6(1)3 38 38 0 4 4 0 4 4 0
对照 12 0 12 12 1 11 12 1 11
把TSWV-BL感染的叶片抽提物(1/30)(Pang et al.，“非靶DNA序列可减小RNA介导的Tospovirus抗性转基因植物必需的转基因长度，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：8261-66(1997)，在此引入作为参考)或体外转录产生的TMV-GFP的传染性转录本(Casper etal.，“在基于烟草花叶病毒的载体上表达绿色荧光蛋白编码基因，”Gene，173：69-73(1996)，在此引入作为参考)施加到5～7叶龄的N.Benthamiana的3个顶叶上。当用TMV-GFP感染时，易感(S)植株在TSWL接种5-10天后表现出典型的***症状或者当用TMV-GFP感染时，在被注射叶上表现2-5 DPI的绿色荧光或在顶叶上表现4-6DPI的绿色荧光。抗性(R)植株在30 DPI时仍无症状。
其他的DNA所转基因(除GFP DNA以外)也可以用来与N基因片段连接并诱导沉默。如果“沉默的”DNA来源于病毒，它可以作为赋予抗性、导致多种抗性的病毒源的所转基因。这一点可以通过连接到turnip mosaic potyvirus(TuMV)外壳蛋白基因上并转移入N.Benthamiana中的TSWV的1/4和1/8N基因片段来检测(图6)。用TuMV和TSWV接种R1子代。接种过的R1植株对TSWV-BL和TuMV的反应总结于表6。同阴性对照植物完全对病毒易感不同的是，用TuMVCP-3/4N转化的转基因植物中有4个品系以及用TuMV CP-5/8N转化的转基因植物中有1个品系具有抗TuMV和TSWV的抗性。表6连接在TuMV的CP上的节段对接种TuMV ESC8和TSWV-BL的反应
对TSWV的反应 对TuMV的反应
#测试总数 S D R #测试总数 S D RCP-3/4N55-3 10 10 0 0 10 7 3 055-4 11 5 4 2 12 7 2 355-23 12 12 0 0 12 12 0 055-6 8 2 4 2 10 1 2 755-10 12 12 0 0 10 3 7 055-9 28 18 7 3 29 8 8 1355-17 16 14 1 1 16 6 2 855-21 13 13 0 0 21 5 3 1355-15 17 17 0 0 11 11 0 055-20 14 14 0 0 17 4 0 1355-14 16 16 0 0 16 16 0 055-19 17 17 0 0 18 18 0 055-8 16 16 0 0 20 3 9 855-13 16 16 0 0 20 15 5 055-16 16 16 0 0 19 10 7 255-12 20 20 0 0 13 13 0 055-2 17 17 0 0 15 15 0 055-11 19 19 0 0 23 4 12 7CP-5/BN125-7 19 11 8 0 19 18 1 0125-8 15 15 0 0 16 16 0 0125-9 18 18 0 0 17 17 0 0125-10 24 24 0 0 21 21 0 0125-11 12 12 0 0 14 14 0 0125-12 20 14 4 2 19 15 2 2125-13 14 14 0 0 14 14 0 0125-14 21 21 0 0 21 21 0 0125-15 11 11 0 0 12 12 0 0125-17 17 17 0 0 11 11 0 0125-18 11 11 0 0 10 10 0 0125-19 11 11 0 0 9 9 0 0125-20 16 16 0 0 8 8 0 0125-21 12 12 0 0 12 12 0 0
将TuMV-ESC8或TSWV-BL的30倍稀释的叶片抽提物施用到5-7叶龄植株的3个顶叶上。在至少45天的观察期间内每隔一天记录数据。反应可分为三种表型：1)易感(S)，接种后5-8天可观察到***性症状；2)推迟(D)，***性症状的出现明显推迟(同对照易感的植株相比推迟3-16天)；3)抵抗(R)，植株在整个生活周期内生长和发育正常，即使在一些新生叶上出现了弱的花十病的症状，但当叶片发育到后期阶段完全伸展开后症状就消失了。这些弱的花十病的症状似乎并不影响任何阶段植株的正常生长和发育。
该数据说明了以下几点：1)基因沉默可以被GFP、TSWV和TuMV所转基因诱导；2)1/2N的基因长度而不是1/4和1/8N的基因长度可赋予抗性；3)当将病毒基因连接到一个可诱导转录后基因沉默的DNA分子(即GFP)之后，可显著减小赋予抗性所需的病毒所转基因(TSWV N基因)的最小长度(即减少到1/8N基因以下)；4)诱导所连接病毒基因片段沉默的DNA本身可以是病毒基因，如所示的TuMV。这些结果为发展一种用于构建抗多种病毒抗性的简便有效的新策略打下了基础，即将几个小的病毒DNA片段和一沉默子DNA(GFP，病毒序列以及来自植物、动物和其它有机体的任何感兴趣的基因)相连接。这些资料也提出了发展一种简便、有效的新策略，用来控制和调控基因表达、酶和蛋白的生成以及转基因植物中的任何感兴趣的表型的可能性。
小的N基因片段不能诱导所转基因沉默可能是由于细胞核中的无效转录、加工、转运或细胞质中转录本的低稳定性。该结论同RNA印迹分析的结果一致，表明小的所转基因片段的转录本在细胞质中的积累水平远低于大的所转基因(图4)。小的所转基因转录本积累水平的降低可能是由于转录起始机器(machinery)和转录终止机器之间的空间干扰而产生的。可替代地，小的N基因的转录本可能丢失了有效mRNA加工、转运和/或保持稳定所必须的严格的BNA序列元件，导致细胞质中成熟mRNA的积累大大减少(Caponigro，G.，et al.，“mRNA在芽殖酵母中转换的机制和控制”Microbiological Reviews.60：233-49(1996)，在此引入作为参考)。把GFP基因连接加到小的所转基因上，可能只是增强了对于所转基因长度的转录能力，或者是GFP基因为成熟mRNA的积累提供了所需的RNA序列元件。
另一方面，被沉默的所转基因的反式失活需要同源序列短的多。这样，短至110bp的转基因与GFP表达为融合体时，可以使入侵病毒的基因组反式失活。这种短的同源序列可能是与入侵病毒相互作用形成RNA双链，从而成为细胞降解的靶序列。最小的融合体所转基因GFP-5/8N不足以赋予病毒抗性(表3和4)，这个观察结果表明110bp(1/8NP)的同源序列可能接近了被沉默的基因(本例中为病毒基因组)的反式失活所需的同源序列的最短长度。这同最近的观察结果一致：Sijen，T.，et al.，“RNA介导的病毒抗性：重复转基因的作用和靶区域描绘”，Plant Cell，8：2227-94(1996)，在此引入作为参考。他们表明只有60个核苷酸的小的同源序列就足以导致一个重组的PVX分子遭受基因沉默介导的消除过程。他们还表明抗性的频率和质量似乎取决于同源序列的长度以及接种剂量这两个因素。
N基因的任何部分(前半段，中段，后半段)都可以赋予转录后基因沉默介导的病毒抗性(表2)。这一结果表明，N基因序列的特异性的RNA二级结构对于诱导转基因沉默和病毒抗性并非必需。小片段(110-235bp)单独表达时虽无效，但与GFP基因融合后却可诱导转录后基因沉默和病毒抗性。总之，转录后基因沉默介导的病毒抗性依赖于所转基因的长度。似乎N基因中的任何大于110bp的片段与GFP的融合都可以赋予抗性。这些结果也表明，大于某一长度的病毒基因组的任何部分与沉默子DNA(如GFP)的融合都可以赋予抗性。
本研究表明通过将小的病毒基因序列与GFP基因融合可以获得同源依赖性的病毒抗性。这个观察结果可以得出以下观点：任何大于110bp的病毒序列与稳定表达的正常长度的非病毒所转基因融合都能赋予RNA介导的抗性。如果真是这样，将会大大加快基因工程病毒抗性的研究，因为分离特异的病毒基因如外壳蛋白基因或复制酶基因是非常费力的，尤其是在那些病毒基因组结构尚未完全定性的情况下。应该指出，外壳蛋白基因仍将是RNA介导的抗性的最佳选择之一，因为它高度表达且它的转录本在感染细胞中可能非常稳定。
表现出转录后基因沉默介导的抗性的转基因植株可以建立起高度的抗性状态并阻止病毒复制。赋予病毒抗性优选含有一个与各种小的不可翻译片段病毒基因组融合的沉默子DNA的嵌合所转基因。这样做有几个优势。第一，沉默子DNA可增加被诱导基因的沉默。第二，多个基因可嵌合在一起将会提供多种病毒抗性。第三，不可翻译的构建体不产生蛋白，从而减少自然发生的突变体与其他病毒的反向包衣壳作用(transencapsidation)之间互补的可能。第四，小片段还可以减少同别的病毒基因组重组的可能性。
尽管为了说明的需要已对本发明作了详细描述，但是应该理解的是这些详细描述仅仅是为了这个目的，本领域的技术人员可以在不脱离由以下权利要求限定的本发明的实质和范围的条件下做某些变通。
序列表(1)一般信息(i)申请人：Cornell Research Foundation，Inc.(ii)发明名称：能赋予植物多种性状的DNA构建体(iii)序列数：18(iv)通讯地址：(A)地址：Nixon，Hargrave，Devans & Doyle LLP(B)街道：Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市：Rochester(D)洲：纽约(E)国家：U.S.A.(F)邮政区号：14603(v)计算机可读形式(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)当前申请资料：(A)申请号：(B)申请日：(C)分类(vii)以前申请资料(A)申请号：US 60/035,350(B)申请日期：19-FEB-1997(vii)以前申请资料(A)申请号：US 60/062,870(B)申请日期：21-OCT-1997(viii)代理人信息(A)姓名：Goldman，Michael L.(B)注册号：30，727(C)REFERENCE/DOCKET NUMBER：19603/1553(ix)通讯信息：(A)电话：(716)263-1304(B)电传：(716)263-1600(2)SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征：(A)长度：46个碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AGCTAATCTA GAACCATGGA TGACTCACTA AGGAAAGCAT TGTTGC 46(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：(A)长度：38碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：TACAGTTCTA GAACCATGGT CTGGAAAACC TTGACCAG 38(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：(A)长度：41碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TACAGTTCTA GAACCATGGT AAAGCGATTT TACTTTTGGT A 41(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：(A)长度：49碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：AGATTCTCTA GACCATGGTG ACTTGATGAG CAAAGTCTGT GAGGCTTGC 49(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：(A)长度：38碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：TACAGTTCTA GAACCATGGA AAATACAAGG ATCTCGGG 38(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：(A)长度：41碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TACAGTTCTA GAACCATGGT AGAAGGGGAA AGAGTATGCT G 41(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：(A)长度：36碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AGCATTGGAT CCATGGTTAA CACACTAAGC AAGCAC 36(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：(A)长度：36碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：TCTTGAGGAT CCATGGCTGA TCTTCATTCA TTTCAA 36(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：(A)长度：36碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TCTTGAGGAT CCATGGATCC TGATATATAG CCAAGA 36(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：(A)长度：39碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TACAGTGGAT CCATGGTTAA GGTAATCCAT AGGCTTGAC 39(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：(A)长度：36碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：TCTTGAGGAT CCATGGCTTA ATAACCTTCA TTATGC 36(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：(A)长度：36碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：TCTTGAGGAT CCATGGAAAA GTCTTGAAGT TGAATG 36(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：(A)长度：50碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：AGCTAATCTA GAACCATGGA TGAAAAATTA CCATAAAGAA AACTTCAGAC 50(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：(A)长度：53碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：AGCATTGGAT CCATGGTTAG TTACCTAGTT TTCTTTTCAG CACAGTGCAA ACT 53(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：(A)长度：30碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：TTGACTCCAT GGCAGGTGAA ACGCTTGACG 30(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：(A)长度：33碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：GTCGTACCAT GGCGAGAATA CTAACGAGTA AAC 33(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：(A)长度：44碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：TGAACATCTA GAACCATGGG TAAAGGAGAA GAACTTTTCA CTGG 44(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：(A)长度：44碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：TGAACAGGAT CCATGGTCTA CGAATGCTAT TATTTGTATA GTTC 44
Claims (92)
1.一种含有一个融合基因的DNA构建体，该融合基因包括：
一个性状DNA分子，它的长度不足以把期望的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物以及
一个沉默子DNA分子，它可操作地偶联到所述的性状DNA分子上，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默DNA分子共同把上述性状赋予该DNA构建体所转化的植物。
2.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
3.根据权利要求2的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
4.根据权利要求3的一种DNA构建体，其中所述的病毒的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及其组合。
5.根据权利要求3的一种DNA构建体，其中所述的病毒的cDNA分子来自一种植物病毒，该植物病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒或其组合。
6.根据权利要求2的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述性状是植物遗传性状。
7.根据权利要求6的一种DNA构建体，其中所述的植物DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
8.根据权利要求2的一种DNA构建体，进一步包括：
一段可操作地偶联到所述融合基因上的启动子序列以及
一段可操作地偶联到所述融合基因上用来终止转录的终止序列。
9.根据权利要求2的一种DNA构建体，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子、一个病毒基因沉默子及其组合。
10.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
11.根据权利要求10的一种DNA构建体，其中所述的病毒的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及及其组合。
12.根据权利要求10的一种DNA构建体，其中所述的病毒的cDNA分子来自一种植物病毒，该植物病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、非编码蛋白质的DNA分子、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒或其组合。
13.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
14.根据权利要求13的一种DNA构建体，其中所述的植物DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
15.根据权利要求1的一种DNA构建体，进一步包括：
一段可操作地偶联到所述融合基因上的启动子序列以及
一段可操作地偶联到所述融合基因上用来终止转录的终止序列。
16.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子及其组合。
17.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码可翻译的RNA分子。
18.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码不可翻译的RNA分子。
19.根据权利要求2的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子中的一个的长度足以赋予性状。
20.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的构建体导致植株内转录后基因沉默。
21.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA和沉默子DNA分子之间互不作用。
22.根据权利要求1的一种DNA构建体，其中所述的沉默子DNA分子位于所述性状DNA分子的3’端。
23.一个包含权利要求1中所述的DNA构建体的DNA表达载体。
24.根据权利要求23的一个DNA表达载体，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
25.根据权利要求24的一个DNA表达载体，其中所述的性状DNA是病毒cDNA，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
26.根据权利要求24的一种DNA表达载体，其中所述的性状DNA是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
27.一种用权利要求1中所述的DNA构建体转化的宿主细胞。
28.根据权利要求26的一种DNA宿主细胞，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
29.根据权利要求28的一种宿主细胞，其中所述的UM构建体存在于一个表达载体中。
30.根据权利要求28的一种宿主细胞，其中所述的宿主细胞是细菌。
31.根据权利要求28的一种宿主细胞，其中所述的宿主细胞是植物细胞。
32.一种用权利要求1中所述的DNA构建体转化的转基因植物。
33.根据权利要求32的一种转基因植物，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
34.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的性状DNA是一个植物病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
35.根据权利要求34的一种转基因植物，其中所述的病毒的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及及其组合。
36.根据权利要求34的一种转基因植物，其中所述的植物病毒的cDNA分子来自一种病毒，该病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、非编码蛋白的DNA分子、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒或其组合。
37.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的性状DNA是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
38.根据权利要求37的一种转基因植物，其中所述的植物DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
39.根据权利要求33的一种转基因植物，进一步包括：
一段可操作地偶联到所述融合基因上的启动子序列以及
一段可操作地偶联到所述融合基因上用来终止转录的终止序列。
40.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子及其组合。
41.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码可翻译的RNA分子。
42.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码不可翻译的RNA分子。
43.根据权利要求33的一种转基因植物，其中所述的植物选自苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜、甘蔗，拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨和百日菊。
44.根据权利要求32的一种转基因植物，其中所述的沉默子DNA分子异源于该植物。
45.根据权利要求32的一种转基因植物，其中所述的性状DNA分子异源于该植物。
46.一种赋予植物性状的方法，其中包括：
用权利要求1所述的DNA构建体转化植物。
47.根据权利要求46的一种方法，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
48.根据权利要求47的一种方法，其中所述的性状DNA是一个植物病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
49.根据权利要求48的一种方法，其中所述的病毒的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及其组合。
50.根据权利要求48的一种方法，其中所述的植物病毒的DNA分子来自一种病毒，该病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、非编码蛋白的DNA分子、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒和其组合。
51.根据权利要求47的一种方法，其中所述的DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
52.根据权利要求51的一种方法，其中所述的植物DNA分子是用于下面植物的，所述植物选自苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜、甘蔗、拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨、百日菊。
53.根据权利要求47的一种方法，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子及其组合。
54.根据权利要求47的一种方法，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码可翻译的RNA分子。
55.根据权利要求47的一种方法，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码不可翻译的RNA分子。
56.根据权利要求47的一种方法，其中所述的植物选自苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜、甘蔗。合适的观赏植物的实例是：拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨、百日菊。
57.根据权利要求47的一种方法，进一步包括：
增殖所述转基因植物的子代。
58.一种用权利要求1中所述的DNA构建体转化的转基因植物种子。
59.根据权利要求58的一种转基因植物种子，其中所述DNA构建体包括多个性状DNA分子，每个性状DNA分子的长度都不足以把相应的性状赋予该性状DNA分子所转化的植物。
60.根据权利要求59的一种转基因植物种子，其中所述的性状DNA是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
61.根据权利要求60的一种转基因植物种子，其中所述的病毒的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及其组合。
62.根据权利要求60的一种转基因植物种子，其中所述的病毒的cDNA分子来自一种病毒，该病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒或其组合。
63.根据权利要求59的一种转基因植物种子，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
64.根据权利要求63的一种转基因植物种子，其中所述的植物DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
65.根据权利要求59的转基因植物种子，进一步包括：
一段可操作地偶联到所述融合基因上的启动子序列以及
一段可操作地偶联到所述融合基因上用来终止转录的终止序列。
66.根据权利要求59的一种转基因植物种子，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子及其组合。
67.根据权利要求60的一种转基因植物种子，其中所述的病毒cDNA分子和所述的沉默子DNA分子编码可翻译的RNA分子。
68.根据权利要求60的一种转基因植物种子，其中所述的病毒cDNA分子和所述的沉默子DNA分子编码不可翻译的RNA分子。
69.根据权利要求59的一种转基因植物种子，其中所述的植物种子所对应的植物选自苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜、甘蔗、拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨、百日菊。
70.一种赋予植物性状的方法，其中包括：
种植权利要求58所述的转基因植物种子以及
增殖由所述的转基因植物种子发育而成的植株。
71.根据权利要求70的一种方法，其中所述的DNA构建体包括多个性状DNA分子，每一个性状DNA分子的长度都不足以赋予所述性状DNA分子转化的植物以所述性状。
72.根据权利要求71的一种方法，其中所述的性状DNA分子是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
73.根据权利要求72的一种方法，其中所述的病毒cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子，编码复制酶的DNA分子，非编码蛋白质的DNA分子，编码病毒基因产物的DNA分子，及其组合。
74.根据权利要求72的一种方法，其中所述的病毒的cDNA分子来自一种病毒，该病毒选自番茄斑萎病毒、凤仙花坏死环斑病毒，花生环斑病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、芜菁花叶病毒、烟草蚀纹病毒、木瓜环斑病毒、番茄斑点病毒、番茄黄色卷叶病毒或其组合。
75.根据权利要求71的一种方法，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
76.根据权利要求75的一种方法，其中所述的植物DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
77.根据权利要求71的一种方法，其中所述的沉默子DNA分子选自一个病毒的cDNA分子、一个编码水母绿色荧光蛋白的DNA分子、一个植物DNA分子及其组合。
78.根据权利要求71的一种方法，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码可翻译的RNA分子。
79.根据权利要求71的一种方法，其中所述的性状DNA分子和所述的沉默子DNA分子编码不可翻译的RNA分子。
80.根据权利要求71的一种方法，其中所述的植物种子所对应的植物选自苜蓿、水稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苣荬、圆白菜、抱子甘蓝、甜菜、欧防风、芜菁、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、小萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、倭瓜、南瓜、夏南瓜、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、木莓、凤梨、大豆、烟草、西红柿、高粱、木瓜、甘蔗、拟南芥菜、非洲紫苣苔、矮牵牛、天竺葵、一品红、菊花、康乃馨、百日菊。
81.根据权利要求71的一种方法，进一步包括：
增殖所述转基因植物的子代。
82.一种含有一个融合基因的DNA构建体，该融合基因包括：
多个性状DNA分子，并且其中至少有一些性状DNA分子的长度不足以把预期性状赋予该性状DNA分子所转化的植物，但是，上述多个性状DNA分子联合足以把预期性状赋予该DNA构建体所转化的植物，并导致该融合基因的沉默。
83.根据权利要求82的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性。
84.根据权利要求82的一种DNA构建体，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状。
85.一种包含权利要求82中所述的DNA构建体的DNA表达载体。
86.一种用权利要求82中所述的DNA构建体转化的宿主细胞。
87.一种用权利要求82中所述的DNA构建体转化的转基因植物。
88.根据权利要求87的一种转基因植物，其中所述的性状DNA分子是一个病毒的cDNA分子，所述的性状是对病毒性疾病的抗性，所述的cDNA分子选自编码外壳蛋白的DNA分子、编码复制酶的DNA分子、非编码蛋白的DNA分子、编码病毒基因产物的DNA分子以及其组合。
89.据权利要求87的一种转基因植物，其中所述的性状DNA分子是植物DNA分子，所述的性状是植物遗传性状，所述的DNA分子影响植物性状，所述植物性状选自颜色、酶的生成及其组合。
90.一种赋予植物性状的方法，其中包括：
用权利要求82中所述的DNA构建体转化植物。
91.一种用权利要求82中所述的DNA构建体转化的转基因植物种子。
92.一种赋予植物性状的方法，其中包括：
种植权利要求91中所述的转基因植物种子以及
增殖由所述的转基因植物种子发育而成的植株。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |