BRPI9908967B1 - processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta - Google Patents

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Abstract

"processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão e para conferir resistência ou imunidade a um patógeno viral sobre uma célula, tecido, órgão ou organismo inteiro, gene sintético capaz de reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo de uma célula, tecido, órgão ou organismo inteiro, construção de gene, uso da mesma, e, célula, tecido, órgão ou organismo inteiro" a presente invenção refere-se genericamente a um processo de modificar a expressão de gene e a genes sintéticos para modificar a expressão de gene endógena de uma célula, tecido ou órgão de um organismo transgênico, em particular um animal ou planta transgênico. mais particularmente, a presente invenção utiliza tecnologia de dna recombinante para pós-transcricionalmente modificar ou modular a expressão de um gene alvo de uma célula, tecido, órgão ou organismo interno, desse modo produzindo novos fenótipos. são também fornecidos novos genes sintéticos e construções de gene que são capazes de reprimir o retardo da ou de outro modo reduzir a expressão de um gene endógeno ou um gene alvo de um organismo, quando introduzidos no mesmo.

Description

“PROCESSO PARA REPRIMIR, RETARDAR OU DE OUTRO MODO REDUZIR A EXPRESSÃO DE UM GENE ALVO EM UMA CÉLULA DE PLANTA”.
CAMPO DA INVENÇÃO 1001J A presente invenção refere-se genericamente a um processo de modificar a expressão de gene e a genes sintéticos para modificar a expressão de gene de uma célula, tecido ou órgão de um organismo transgênico, em particular um animal ou planta transgênico. Mais particularmente, a presente invenção utiliza tecnologia de DNA recombinante para pós-transcricionalmente modificar ou modular a expressão de um gene alvo de uma célula, tecido, órgão ou organismo inteiro, desse modo produzindo novos fenótipos. Novos genes sintéticos e construções de gene que são capazes de reprimir o retardo da ou de outro modo reduzir a expressão de um gene endógeno ou um gene alvo de um organismo, quando introduzidos nele são também fornecidos.
GERAL
[002] Detalhes bibliográficos das publicações referidas neste relatório descritivo são coletados no final da descrição.
[003] Como aqui usado, o termo “derivado de” será entendido para indicar que um número inteiro especificado pode ser obtido de uma fonte ou espécie especificada, não obstante não necessariamente diretamente daquela fonte ou espécie especificada. Por todo este relatório descritivo, a não ser que o contexto requeira de outro modo, a palavra “compreende”, ou variações tais como “compreendem”, ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo” serão entendidas implicar a inclusão dc uma etapa, elemento, número inteiro, grupo de etapas, elementos ou números inteiros citados, porém não a exclusão de qualquer outra etapa, elemento, número inteiro, grupo de elementos ou números inteiros, porém não a exclusão de qualquer outra etapa, elemento, número inteiro, grupo de elementos ou números inteiros.
[004] Aqueles hábeis na técnica apreciarão que a invenção aqui descrita é susceptível a variações e modificações exceto aquelas especialmente descritas. Deve ser entendido que a invenção inclui todas tais variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, aspectos, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais de ditas etapas e aspectos.
[005] A presente invenção não é limitada no escopo pelas versões específicas aqui descritas, que são destinadas para fins de exemplificação somente. Produtos, composições e processos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da invenção, como aqui descrito.
[006] Os números de identidade de sequências (SEQ ID NOS.) contendo informação de sequência de nucleotídeo e aminoácido incluídos neste relatório descritivo, são coletados após o Resumo e foram preparados usando-se o programa Patentln Version 2.0. Cada sequência de nucleotídeo ou aminoácido é identificada na listagem da sequência pelo indicador numérico <210> seguido pelo identificador da sequência (p.e. <210>1, <210>2 etc.). O comprimento, tipo de sequência (DNA, proteína (PRT), etc.) e o organismo fonte para cada sequência de nucleotídeo ou aminoácido são indicados pela informação fornecida nos campos de indicador numérico <211>, <212> e <213>, respectivamente. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos referidas no relatório descritivo são definidas pela informação fornecida no campo de indicador numérico <400> seguida pelo identificador de sequência (p. ex., <400>1, <400>2 etc.).
[007] A designação dos resíduos de nucleotídeos referidos aqui é aquela recomendada pela IUPAC-IUC Biochemical Nomenclature Commission, em que A representa Adenina, C representa Citosina, G representa Guanina, T representa timina, Y representa um resíduo de pirimidina, R representa um resíduo purina, M representa Adenina ou Citosina, K representa Guanina ou Timina, S representa Guanina ou Citosina, W representa adenina ou Timina, H representa um nucleotídeo que não Guanina, B representa um nucleotídeo que não Adenina; V representa um nucleotídeo que não Timina, D representa um nucleotídeo que não Citosina e N representa qualquer resíduo de nucleotídeo.
[008] A designação de resíduos aminoácidos referidos aqui, como recomendada pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, é listada na Tabela 1. ___________________________________TABELA 1_______________________________ Aminoácido Código de três-letras Código de uma-letra Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Ácido aspártico Asp D
Cisteína Cys C
Glutamina Gin O
Ácido Glutâmico Glu E
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina He I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptofano Trp W
Tiros ina Tyr Y
Vai i na Vai V
Aspar lalo/Asparag i na Baa B
Glutamaío/Giutarnina Zaa Z
Qualquer aminoácido Xaa X
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[009] O controle das vias metabólicas em organismos eucarióticos é desejável para fins de produzir novos traços neles ou introduzir novos traços dentro de uma célula, tecido ou órgão particular de dito organismo. Embora a tecnologia do DNA recombinante tenha fornecido progresso significativo em um entendimento dos mecanismos regulando a expressão do gene eucariótico, muito menos progresso tem sido feito na atual manipulação da expressão de gene para produzir novos traços. Além disso, há somente meios limitados pelos quais a intervenção humana pode conduzir a uma modulação do nível da expressão de gene eucariótíca. 10010] Um caminho para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de gene utiliza uma molécula de mRNA que é transcrita do filamento complementar de um gene nuclear para aquele que é normalmente transcrito e capaz de ser traduzido para polipeptídeo. Embora o mecanismo preciso envolvido neste caminho não esteja estabelecido, foi postulado que um mRNA de duplo-filamento pode formar-se por formação de par de bases entre as sequências de nucleotídeos complementares, para produzir um complexo que é traduzido a baixa eficiência e/ou degradado por enzimas ribonucleases intracelulares antes de ser traduzido. 10011 ] AIternativamente, a expressão de um gene endógeno cm uma célula, tecido ou órgão pode ser suprimida quando uma ou mais cópias de dito gene, ou uma ou mais cópias de um gene substancial mente similar são introduzidas dentro da célula. Embora o mecanismo envolvido neste fenômeno não tenha sido estabelecido e parece envolver processos mecanicamente heterogêneo. Por exemplo, foi postulado que esta abordagem envolve repressão transcricional, em cujo caso estados somaticamente herdáveis reprimidos de cromatina são formados ou, altemativamente, um silêncio pós-transcricional em que ocorre o início da transcrição normalmente, porém os produtos de RNA dos genes cossuprimidos são subsequentemente eliminados.
[0012] A eficiência de ambas estas abordagens de alvejamento da expressão de genes específicos é muito baixa e resultados altamente variáveis são usualmente obtidos. Resultados inconsistentes são obtidos usando-se diferentes regiões de genes, por exemplo, regiões 5’-não-traduzidas, regiões 3’-não-traduzidas, regiões de codificação ou sequências de íntrons para alvejar a expressão de gene. Portanto, não existe atualmente consenso quanto à natureza das sequências genéticas que forneçam o mais eficiente meio para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de gene usando-se as tecnologias existentes. Além disso, tal elevado grau de variação existe entre gerações de modo que não é possível predizer-se o nível de repressão de um gene específico na progênie de um organismo em que a expressão de gene foi significativamente modificada.
[0013] Recentemente, Dorer e Henikoff (1994) demonstraram o silenciamento das cópias genéticas repetidas em tandem no genoma Drosophila e a repressão transcricional dos genes Drosophila Adh dispersos pelos genes Polycomb (isto é, o sistema Pc-G; Pal-Bhadra e outros, 1997). Entretanto, tal silenciamento de cópias genéticas repetidas em tandem é de pouca utilidade em uma tentativa para manipular a expressão de gene em uma célula animal por meios recombinantes, em que as sequências capazes de alvejarem a expressão de um gene particular são introduzidas em locais dispersos do genoma, ausente a combinação deste caminho com a tecnologia de alvejamento de gene. Embora teoricamente possível, tais combinações seriam esperadas funcionarem em somente baixa eficiência, com base na baixa eficiência dos caminhos de alvejaniento de gene usados em isolamento e, além disso, requereríam complicados sistemas vetores. Adicionalmente, a utilização de repressão tratisericional tal como o sistema Drmophila Pc-G, parecería requerer algum conhecimento dos mecanismos regularizadores capazes de modular a expressão de qualquer gene de alvo específico e, como consequência, seria difícil de implementar na prática como uma tecnologia geral para reprimir, retardar ou reduzir a expressão de gene em células animais.
[0014] O fraco entendimento dos mecanismos envolvidos nestes fenômenos tem significado que tem havido poucas melhorias nas tecnologias para modular o nível da expressão de gene, em particular tecnologias para retardar, reprimir ou de outro modo reduzir a expressão dos genes específicos empregando-se tecnologia de DNA recombinante. Além disso, como uma consequência da imprevisibílídade destes caminhos, não há atualmente meios comercialmente viáveis para modular o nível de expressão de um gene específico em utn organismo eucariótico ou procariótíco.
[0015] Assim, existe uma necessidade de processos aperfeiçoados de modular a expressão de gene, em particular reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de gene em células animais, para fins de introduzir nelas novos traços fenótipos. Em particular, estes processos devem fornecer meios gerais para modificação fenotípica, sem necessidade de realizar abordagens de alvejaniento genético concomitantes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0016] A invenção é baseada em parte na surpreendente descoberta pelos inventores de que as células que exibem um ou mais traços desejados podem ser produzidas e selecionadas de células transformadas, compreendendo uma molécula de ácido nucleico operacional mente ligada a um promotor, em que o produto de transcrição da molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de um transcrito de um gene alvo endógeno ou não-endógeno, cuja expressão destina-se a ser modulada. As células transformadas são regeneradas dentro dos inteiros tecidos, órgãos ou organismos capazes de exibir novos traços, em particular resistência a vírus e expressão modificada dos genes endógenos.
[0017] Portanto, um aspecto da presente invenção fornece um processo de modular a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão animal, dito processo pelo menos compreendendo a etapa de introduzir em dita célula, tecido ou órgão uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas, compreendendo múltiplas cópias de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de dito gene alvo ou uma sua região ou complementar a ela por um tempo e sob condições suficientes para tradução do produto mRNA de dito gene alvo a ser modificado, sujeito à condição de que a transcrição do dito produto de mRNA não seja exclusivamente reprimida ou reduzida.
[0018] Em uma versão particularmente preferida, as moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica múltiplas cópias de uma molécula de mRNA que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo do produto mRNA do gene alvo. Mais preferivelmente, as múltiplas cópias da molécula alvo são sequências de repetição direta em tandem.
[0019] Em uma versão mais particularmente preferida, a molécula de ácido nucleico ou a molécula de ácido nucleico exógena é em uma forma expressável de modo que ela é pelo menos capaz de ser transcrita para produzir mRNA.
[0020] O gene alvo pode ser um gene que é endógeno à célula animal ou, altemativamente, um gene exógeno tal como uma sequência genética viral ou exógena, entre outras. Preferivelmente, o gene alvo é uma sequência genética viral.
[0021] A invenção é particularmente útil na modulação da expressão de gene eucariótico, em particular na modulação da expressão de gene animal ou humana e, mesmo mais particularmente, na modulação da expressão de genes derivados de animais vertebrados e invertebrados, tais como insetos, animais aquáticos (p. ex., peixe, mariscos, moluscos, crustáceos tais como caranguejos, lagostas e camarões, aves e mamíferos, entre outros.
[0022] Uma variedade de traços são selecionáveis com apropriados procedimentos e números suficientes de células transformadas. Tais traços incluem, mas não são limitados a, traços visíveis, traços de resistência a doença e traços de resistência a patógenos. O efeito modulador é aplicável a uma variedade genéticas expressos em plantas e animais, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo oncogenes, fatores de transcrição e outros genes que codificam os polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular.
[0023] Por exemplo, uma alteração na produção de pigmento em camundongos pode ser construída por alvejamento da expressão do gene da tirosinase nele. Isto fornece um novo fenótipo de albinismo em camundongos pretos. Pelo alvejamento dos genes requeridos para replicação de vírus em uma célula de planta ou uma célula animal, uma construção de gene, que compreende múltiplas cópias da sequência de nucleotídeos codificando uma replicase viral, polimerase, proteína de revestimento ou gene de não revestimento, ou proteína de protease, pode ser introduzida dentro de uma célula em que é expressa, para conferir imunidade contra o vírus sobre a célula.
[0024] No desempenho da presente invenção, a molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena compreenderá geralmente uma sequência de nucleotídeo tendo mais do que cerca de 85% de identidade com a sequência genética alvo, entretanto, uma homologia mais elevada podería produzir uma modulação mais eficaz da expressão da sequência genética alvo. Homologia substancialmente maior, ou mais do que cerca de 90% é preferida e mesmo mais preferivelmente cerca de 95% para identidade absoluta é desejável.
[0025] A molécula de ácido nucleico dispersa introduzida ou a sequência de molécula de ácido nucleico exógena, necessitando menos do que homologia absoluta, também não precisa ser de comprimento total, em relação ao produto de transcrição primária ou mRNA totalmente processado do gene alvo. Uma homologia mais elevada de uma sequência menor do que o comprimento total compensa uma sequência homóloga menor mais longa. Além disso, a sequência introduzida não precisa ter o mesmo padrão de íntron ou exon, e a homologia dos segmentos não-codificantes será igualmente eficaz. Normalmente, uma sequência maior do que 20-100 deveria ser usada, embora uma sequência maior do que cerca de 200-300 nucleotídeos fosse preferida e uma sequência maior do que 500-1000 nucleotídeos fosse especialmente preferida, dependendo do tamanho do gene alvo.
[0026] Um segundo aspecto da presente invenção fornece um gene sintético que é capaz de modificar a expressão de gene alvo de uma célula, tecido ou órgão de um organismo procariótico ou eucariótico que é transfectado ou transformado com ele, em que dito gene sintético compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena compreendendo múltiplas cópias de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência do nucleotídeo do dito gene alvo ou um seu derivado ou uma sequência complementar a ele colocada operacionalmente sob o controle de uma sequência promotora que é operável em dita célula, tecido ou órgão.
[0027] Um terceiro aspecto da invenção fornece um gene sintético que é capaz de modificar a expressão de um gene alvo de uma célula, tecido ou órgão de um organismo procariótico ou eucariótico, que é transfectado ou transformado com ele, em que dito gene sintético pelo menos compreende múltiplas sequências genéticas estruturais, em que cada uma das sequências genéticas estruturais compreende uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de dito gene alvo ou um seu derivado ou uma sequência complementar a ele e em que ditas múltiplas sequências genéticas estruturais são colocadas operacionalmente sob o controle de uma única sequência promotora que é operável em dita célula, tecido ou órgão.
[0028] Um quarto aspecto da presente invenção fornece um gene sintético que é capaz de modificar a expressão de um gene alvo de uma célula, tecido ou órgão de um procarioto ou eucarioto que é transfectado ou transformado com ele em que dito gene sintético pelo menos compreende múltiplas sequências genéticas estruturais em que cada uma das ditas sequências genéticas estruturais é colocada operacionalmente sob o controle de uma sequência promotora que é operável em dita célula, tecido ou órgão e em que cada uma das ditas sequências genéticas estruturais compreende uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de dito gene alvo ou um seu derivado ou uma sequência complementar a ela.
[0029] Um quinto aspecto da presente invenção fornece uma construção de gene que é capaz de modificar a expressão de um gene endógeno ou gene alvo de uma célula, tecido ou órgão transformado ou transfectado, em que a construção de gene pelo menos compreende o gene sintético da invenção e uma ou mais origens de replicação e/ou sequências genéticas marcadoras selecionáveis.
[0030] A fim de se observar muitos novos traços de organismos multicelulares, tais como plantas e animais, em particular aqueles que são específicos de tecido ou específicos de órgão ou evolucionamente regulados, a regeneração de uma célula transformada, contendo os genes sintéticos e as construções de gene aqui descritas em um inteiro organismo, será necessária. Aqueles hábeis na técnica estarão cientes de que isto significa criar um inteiro organismo de uma célula de planta ou célula animal transformada, um grupo de tais células, um tecido ou órgão. Processos padrão para a regeneração de certas plantas e animais de células e tecidos isolados são conhecidos daqueles hábeis na técnica.
[0031] Portanto, um sexto aspecto da invenção fornece unia célula, tecido, órgão ou organismo compreendendo os genes sintéticos e as construções de gene aqui descritas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0032] A Figura 1 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pEGFP-Nl MCS, [0033] A Figura 2 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCMV.cass* [0034] A Figura 3 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCMV.SV40L.cass.
[0035] A Figura 4 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCMV.SV40LR.cass.
[0036] A Figura 5 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCR.Bgl-GFP-Bam.
[0037] A Figura ó é uma representação diagramátíca do plasmídeo do plasmídeo pBSII(SK+).EGFP.
[0038] A Figura 7 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCMV.EGFP.
[0039] A Figura 8 é uma representação diagramátíca do plasmídeo pCR.SV40L.
[0040] A Figura 9 é lima representação diagramátíca do plasmídeo pCR.BEV.l.
[0041] A Figura 10 é uma representação diagramática do plasmídeo pCR.BEV.2.
[0042] A Figura 11 é uma representação diagramática do plasmídeo pCR.BEV.3.
[0043] A Figura 12 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.EGFP.BEV2.
[0044] A Figura 13 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.2.
[0045] A Figura 14 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.3.
[0046] A Figura 15 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.VEB.
[0047] A Figura 16 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.GFP.
[0048] A Figura 17 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.SV40L-0.
[0049] A Figura 18 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.0.SV40L.BEV.
[0050] A Figura 19 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.0.SV40L.VEB.
[0051] A Figura 20 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEVx2.
[0052] A Figura 21 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEVx3.
[0053] A Figura 22 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEVx4;
[0054] A Figura 23 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.BEV.
[0055] A Figura 24 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.VEB.
[0056] A Figura 25 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.GFP.VEB.
[0057] A Figura 26 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.EGFP.BEV2.PFG.
[0058] A Figura 27 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.BEV.SV40LR.
[0059] A Figura 28 é uma representação diagramática do plasmídeo pCDNA3.Galt.
[0060] A Figura 29 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.
[0061] A Figura 30 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.EGFP.Galt.
[0062] A Figura 31 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.GFP.
[0063] A Figura 32 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.0.
[0064] A Figura 33 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.tlaG.
[0065] A Figura 34 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.0.SV40L.Galt.
[0066] A Figura 35 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galtx2.
[0067] A Figura 36 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galtx4.
[0068] A Figura 37 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.Galt.
[0069] A Figura 38 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.tla.G.
[0070] A Figura 39 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.GFP.tlaG.
[0071] A Figura 40 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.EGFP.Galt.PFG.
[0072] A Figura 41 é uma representação diagramática do plasmídeo pCMV.Galt.SV40LR.
[0073] A Figura 42 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.
[0074] A Figura 43 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.35S.SCBV.cass.
[0075] A Figura 44 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVY.
[0076] A Figura 45 é uma representação diagramática do plasmídeo pSP72.PVY.
[0077] A Figura 46 é uma representação diagramática do plasmídeo pClapBC.PVY.
[0078] A Figura 47 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVYx2.
[0079] A Figura 48 é uma representação diagramática do plasmídeo pSP72.PVYx2.
[0080] A Figura 49 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVYx3.
[0081] A Figura 50 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVYx4.
[0082] A Figura 51 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVY.LNYV.
[0083] A Figura 52 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVY.LNYV.PVY.
[0084] A Figura 53 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVY.LNYV.YVPA.
[0085] A Figura 54 é uma representação diagramática do plasmídeo pBC.PVY.LNYV.YVP
[0086] A Figura 55 é uma representação diagramática do plasmídeo pART27.PVY.
[0087] A Figura 56 é uma representação diagramática do plasmídeo pART27.35S.PVY.SCBV.O.
[0088] A Figura 57 é uma representação diagramática do plasmídeo pART27.35S.O.SCBV.PVY.
[0089] A Figura 58 é uma representação diagramática do plasmídeo pART27.35S.O.SCBV.YVP.
[0090] A Figura 59 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVYx2.
[0091] A Figura 60 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVYx3.
[0092] A Figura 61 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVYx4.
[0093] A Figura 62 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVY.LNYV.PVY.
[0094] A Figura 63 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVY.LNYV.YVPA.
[0095] A Figura 64 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.PVY.LNYV.YVP.
[0096] A Figura 65 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7.35S.PVY.SCBV.YVP.
[0097] A Figura 66 é uma representação diagramática do plasmídeo p ART7.3 5 S .PV Y x3. SCB V. YVPx3.
[0098] A Figura 67 é uma representação diagramática do plasmídeo pART7 .PVYx3 .LNYV. YVPx3.
[0099] A Figura 68 é uma representação diagramática do plasmídeo p ART7 .PV YMULTI.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00100] A presente invenção fornece um processo de modular a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão, dito processo compreendendo pelo menos a etapa de introduzir em dita célula, tecido ou órgão uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas, compreendendo múltiplas cópias de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de dito gene alvo ou uma sua região ou complementar a ele por um tempo e sob condições suficientes para tradução do produto mRNA de dito gene alvo a ser modificado, sujeito à condição de que a transcrição de dito produto mRNA não seja exclusivamente reprimida ou reduzida.
[00101] Por “múltiplas cópias” entende-se que duas ou mais cópias do gene alvo são apresentadas em estreita conexão física ou justapostas, na mesma ou em diferente orientação, na mesma molécula de ácido nucleico, opcionalmente separadas por um fragmento stuffer ou região intergênica, para facilitar a formação de estrutura secundária entre cada repetição em que esta é necessária. O fragmento stuffer pode compreender qualquer combinação de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido, moléculas de carboidrato ou moléculas de oligossacarídeo ou átomos de carbono ou um homólogo, análogo ou seu derivado, que seja capaz de ser ligado covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.
[00102] Preferivelmente, o fragmento stuffer compreende uma sequência de nucleotídeos ou um homólogo, análogo ou seu derivado.
[00103] Mais preferivelmente, o fragmento stuffer compreende uma sequência de nucleotídeos de pelo menos cerca de 10-50 nucleotídeos de comprimento, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 50-100 nucleotídeos de comprimento e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 100-500 nucleotídeos de comprimento.
[00104] Onde a molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena compreende sequências de junção de íntron/exon, o fragmento stuffer pode servir como uma sequência íntron colocada entre o local de união-3’ do gene estrutural mais próximo da terminação-5’ do gene e do local de união-5’ de sua seguinte unidade a jusante. Altemativamente, onde for desejável que mais do que duas unidades de sequência de nucleotídeo adjacentes da molécula de ácido nucleico exógena dispersa sejam traduzidas, o fragmento stuffer colocado entre elas não deve incluir sequências de junção de união íntron/exon ausentes, de códon de parada de tradução dentro da estrutura em ambas as extremidades do fragmento stuffer ou a adição de um códon de partida de tradução na extremidade 5’ de cada unidade, como será óbvio para aqueles hábeis na técnica.
[00105] Os fragmentos stuffer preferidos são aqueles que codificam proteínas marcadoras detectáveis ou análogos biologicamente ativos e seus derivados, por exemplo, luciferase, β-galacturonase, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase ou proteína fluorescente verde, entre outros. Os fragmentos stuffer adicionais não são excluídos.
[00106] De acordo com esta versão, o marcador detectável ou um seu análogo ou derivado serve para indicara expressão do gene sintético da invenção em uma célula, tecido ou órgão em virtude de sua capacidade de conferir um fenotípico detectável específico sobre ele, preferivelmente um fenótipo visualmente detectável.
[00107] Como aqui usado, o termo “modulação” será entendido como significando que a expressão do gene alvo é reduzida em amplitude e/ou o tempo da expressão de gene é retardado e/ou o padrão de desenvolvimento ou específico de tecido ou específico de célula da expressão do gene alvo é alterado, em comparação com a expressão de dito gene na ausência do processo inventivo aqui descrito.
[00108] Embora não limitando o escopo da invenção aqui descrita, a presente invenção é dirigida a uma modulação de expressão de gene que compreende a repressão, retardo ou redução de amplitude da expressão de gene alvo em uma célula, tecido ou órgão específico de um organismo eucariótico, em particular uma planta tal como uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, ou um humano ou outro animal e, mesmo mais particularmente, um animal vertebrado e invertebrado, tal como um inseto, animal aquático (p. ex., peixe, marisco, molusco, crustáceo tal como caranguejo, lagosta ou camarão, uma ave ou um mamífero, entre outros).
[00109] Mais preferivelmente, a expressão de gene alvo é completamente inativada pelas moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas, que foram introduzidas na célula, tecido ou órgão.
[00110] Embora não desejando ficarmos presos a qualquer teoria ou modo de ação, a expressão reduzida ou eliminada do gene alvo que resulta da execução da invenção pode ser atribuída à reduzida ou retardada tradução do produto de transcrição de mRNA do gene alvo ou altemativamente, a prevenção da tradução de dito mRNA, como consequência da degradação específica de sequência do transcrito de mRNA do gene alvo por um sistema de célula hospedeira endógena.
[00111] É particularmente preferido que, para resultados ótimos, a degradação específica da sequência do transcrito de mRNA do gene alvo ocorra antes do tempo ou estágio quando o transcrito de mRNA do gene alvo normalmente seria traduzido ou, altemativamente, ao mesmo tempo em que o transcrito de mRNA do gene alvo seria normalmente traduzido. Portanto, a seleção de uma apropriada sequência promotora, para regular a expressão da molécula de ácido nucleico dispersa introduzida ou molécula de ácido nucleico exógena, é uma importante consideração para execução ótima da invenção. Por esta razão, promotores constitutivos fortes ou sistemas promotores induzíveis são especialmente preferidos para uso na regulação da expressão das moléculas de ácido nucleico dispersas introduzidas ou moléculas de ácido nucleico exógenas.
[00112] A presente invenção claramente engloba expressão reduzida, em que a expressão reduzida do gene alvo é realizada por transcrição diminuída, sujeita à condição de que uma redução da transcrição não seja o único mecanismo pelo qual esta ocorre edita redução de transcrição seja pelo menos acompanhada por reduzida tradução do lago de mRNA de estado constante.
[00113] O gene alvo pode ser uma sequência genética que seja endógena para a célula animal ou altemativamente uma sequência genética não-endógena, tal como uma sequência genética que seja derivada de um vírus ou outro organismo patogênico exógeno e seja capaz de penetrar em uma célula e utilizar a maquinaria da célula em seguida à infecção.
[00114] Onde o gene alvo é uma sequência genética não-endógena para a célula animal, é desejável que o gene alvo codifique uma função que é essencial para replicação ou reprodução do patógeno viral ou outro. Em tais versões, a presente invenção é particularmente útil no tratamento profilático e terapêutico da infecção viral de uma célula animal ou para conferir ou estimular resistência contra dito patógeno.
[00115] Preferivelmente, o gene alvo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo de um patógeno viral de uma célula, tecido ou órgão de planta ou animal.
[00116] Por exemplo, no caso de animais e humanos, o patógeno viral pode ser um retrovírus, por exemplo um lentivírus, tais como os vírus da imunodeficiência, um vírus RNA de filamento único (+) tal como enterovírus bovino (BEV) ou Sinbis alphavirus. Altemativamente, o gene alvo pode compreender uma ou mais sequências de nucleotídeos de um patógeno viral de uma célula, tecido ou órgão animal, tal como, mas não limitado a, um vírus de DNA de duplo filamento, tal como vírus do herpes bovino ou vírus do herpes simples I (HSVI), entre outros.
[00117] No caso de plantas, o patógeno do vírus é preferivelmente um potyvirus, caulimovirus, badnavirus, geminivirus, reovirus, rhabdovirus, bunyavirus, tospovirus, tenuivirus, tombusvirus, luteovirus, sobemovirus, bromovirus, cucomovirus, ilavirus, alfamovirus, tobamovirus, tobravirus, potexvirus e clostrovirus, tais como mas não limitado a CaMV, SCSV, PVX, PVY, PLRV e TMV, entre outros.
[00118] Com referência particular a patógenos virais, aqueles hábeis na técnica estão cientes de que as funções codificadas por vírus podem ser complementadas em in trans por polipeptídeos codificados pela célula hospedeira. Por exemplo, a replicação do genoma do vírus do herpes bovino na célula hospedeira pode ser facilitada por polimerases de DNA de célula hospedeira que são capazes de complementar um gene de polimerase de DNA viral inativado.
[00119] Portanto, onde o gene alvo é uma sequência genética não-endógena para a célula animal, uma outra versão alternativa da invenção fornece o gene alvo para codificar um polipeptídeo viral ou exógeno que não é capaz de ser complementado por uma função de célula hospedeira, tal como uma sequência genética específica de vírus. Genes alvo exemplificativos de acordo com esta versão da invenção incluem, mas não são limitados a, genes que codificam proteínas de revestimento de vírus, proteínas de não-revestimento e polimerases de DNA dependentes de RNA e polimerases de RNA dependentes de RNA entre outras.
[00120] Em uma versão particularmente preferida da presente invenção, o gene alvo é o gene de polimerase de RNA dependente de RNA BEV ou um seu homólogo, análogo ou derivado ou sequências de codificação de protease Nia PVY.
[00121] A célula em que a expressão do gene alvo é modificada pode ser qualquer célula que seja derivada de uma planta ou animal multicelular, incluindo suas culturas de células e tecidos. Preferivelmente, a célula animal é derivada de um inseto, réptil, anfíbio, ave, humano ou outro mamífero. Células animais exemplificativas incluem células-tronco embriogênicas, fibroblastos de pele cultivada, células neuronais, células somáticas, células tronco hematopoiéticas, células-T e linhagens de células imortalizadas, tais como COS, VERO, HeLa, mouse C127, ovário de hamster chinês (CHO), WI-38, rim de hamster bebê (BHK) ou linhagens de células MDBK, entre outras. Tais células e linhagens de células são prontamente disponíveis àqueles hábeis na técnica. Portanto, o tecido ou órgão em que a expressão do gene alvo é modificada pode ser qualquer tecido ou órgão compreendendo tais células animais.
[00122] Preferivelmente, a célula de planta é derivada de uma espécie de planta monocotiledônea ou dicotiledônea ou uma linhagem de célula derivada dela.
[00123] Como aqui usado, o termo “molécula de ácido nucleico dispersa” será entendido como referindo-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende uma ou mais multi-cópias, preferivelmente repetições diretas em tandem, de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica ou complementar à sequência de nucleotídeo de um gene que se origina da célula, tecido ou órgão dentro do qual dita molécula de ácido nucleico é introduzida, em que dita molécula de ácido nucleico é não-endógena no sentido de que é introduzida na célula, tecido ou órgão de um animal via meios recombinantes e geralmente estará presente como ácido nucleico extracromossomal ou, altemativamente, como ácido nucleico cromossomal integrado, que é geneticamente-desligado de dito gene. Mais particularmente, a “molécula de ácido nucleico dispersa” compreenderá ácido nucleico cromossomal ou extracromossomal, que é desligado do gene alvo contra o qual é dirigido em um mapa físico, em virtude de não ser ligado em tandem ou, altemativamente, ocupar uma diferente posição cromossomal no mesmo cromossomo ou ser localizado em um diferente cromossomo ou presente na célula como um epissoma, plasmídeo, cosmídeo ou partícula de vírus.
[00124] “Molécula de ácido nucleico exógena” significa uma molécula de ácido nucleico isolada, que tem uma ou mais múltiplas cópias, preferivelmente repetições dirigidas em tandem, de uma sequência de nucleotídeo que se origina da sequência genética de um organismo que é diferente do organismo em que a molécula de ácido nucleico exógena é introduzida. Esta definição engloba uma molécula de ácido nucleico que se origina de um diferente indivíduo do mesmo agrupamento taxonômico mais baixo (isto é, da mesma população) que o agrupamento taxonômico em que dita molécula de ácido nucleico é introduzida, bem como uma molécula de ácido nucleico que se origina de um diferente indivíduo de um diferente agrupamento taxonômico que o agrupamento taxonômico em que dita molécula de ácido nucleico é introduzida, tal como um gene derivado de um patógeno viral.
[00125] Portanto, um gene alvo contra o qual uma molécula de ácido nucleico exógena atua na execução da invenção pode ser uma molécula de ácido nucleico que tenha sido introduzida de um organismo para outro organismo empregando-se tecnologias de transformação ou introgressão. Genes alvo exemplificativos de acordo com esta versão da invenção incluem o gene codificador-proteína fluorescente verde, derivado da água-viva Aequoria victoria (Prasher e outros, 1992; Publicação de Patente Internacional no. WO 95/07463), genes da tirosinase e, em particular, o gene da tirosinase de murinos (Kwon e outros, 1988), o gene lacl de Escherichia coli, que é capaz de codificar um repressor do polipeptídeo do gene lacZ, o gene oc-l,3-galactosiltransferase suíno (AcessoNCBI no. L36535) aqui exemplificado, e os genes estruturais PVY e BEV aqui exemplificados ou um homólogo, análogo ou derivado de ditos genes ou uma sequência de nucleotídeo complementar a ele.
[00126] A presente invenção é ainda útil para simultaneamente alvejar a expressão de diversos genes alvo, que são co-expressas em uma célula particular, por exemplo, pela utilização de uma molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena, que compreenda sequências de nucleotídeos que sejam substancialmente idênticas a cada um dos ditos genes alvo co-expressos.
[00127] “Substancialmente idêntica” significa que a molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena introduzida da invenção e a sequência alvo são suficientemente idênticas no nível da sequência de nucleotídeo, para permitir formação de pares bases entre elas sob condições intracelulares padrão.
[00128] Preferivelmente, a sequência de nucleotídeo de cada repetição da molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena da invenção e a sequência de nucleotídeo de uma parte da sequência genética alvo são pelo menos de cerca de 80-85% idênticas no nível de sequência de nucleotídeo, mais preferivelmente pelo menos cerca de 85-90% idênticas, mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 90-95% idênticas e ainda mesmo mais preferivelmente pelo menos cerca de 95-99% ou 100% idênticas no nível de sequência de nucleotídeo.
[00129] Apesar da presente invenção não ser limitada pelo preciso número de sequências repetidas na molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena da invenção, deve ser entendido que a presente invenção requer que pelo menos duas cópias da sequência genética alvo sejam expressas na célula.
[00130] Preferivelmente, as múltiplas cópias da sequência genética alvo são apresentadas na molécula de ácido nucleico dispersa ou na molécula de ácido nucleico exógena como sequências de repetição invertidas em tandem e/ou sequências de repetição diretas em tandem. Tais configurações são exemplificadas pelos “plasmídeos de teste” aqui descritos, que compreendem regiões de genes Galt, BEV ou PVY.
[00131] Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena que é introduzida na célula, tecido ou órgão compreende RNA ou DNA.
[00132] Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena compreende ainda uma sequência de nucleotídeo ou é complementara uma sequência de nucleotídeo que é capaz de codificar uma sequência de aminoácidos codificada pelo gene alvo. Mesmo mais preferivelmente, a molécula de ácido nucleico inclui um ou mais códons de partida traducionais ATG ou AUG.
[00133] Processos padrão podem ser usados para introduzir a molécula de ácido nucleico dispersa ou a molécula de ácido nucleico exógena dentro da célula, tecido ou órgão, para fins de modular a expressão do gene alvo. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser introduzida como DNA ou RNA nu, opcionalmente encapsulado em um lipossoma, em uma partícula de vírus como vírus atenuado ou associada com um revestimento de vírus ou uma proteína de transporte ou veículo inerte, tal como ouro ou como um vetor viral recombinante ou vetor bacteriano ou como uma construção de gene, entre outros.
[00134] Os meios de administração incluem injeção e ingestão oral (p.ex., em material alimentício medicado), entre outros.
[00135] As moléculas de ácido nucleico do presente pedido podem também ser supridas por um sistema de suprimento vivo, tal como empregando-se um sistema de expressão bacteriano otimizado por sua expressão em bactérias que podem ser incorporadas dentro da flora dos intestinos. Altemativamente, um sistema de expressão viral pode ser empregado. A este respeito, uma forma de expressão viral é a administração de um vetor vivo geralmente por pulverizador, alimento ou água em que uma quantidade eficaz de infecção do vetor vivo (p. ex., vírus ou bactéria) é fornecida ao animal. Outra forma de sistema de expressão viral é um vetor de vírus não-replicante, que seja capaz de infectar uma célula, porém não replicar ali. O vetor viral não-replicante fornece um meio de introduzir ao indivíduo humano ou animal material para expressão transiente nele. O modo de administrar tal vetor é o mesmo que um vetor viral vivo.
[00136] Os veículos, excipientes e/ou diluentes utilizados no suprimento das moléculas de ácido nucleico do presente pedido a uma célula hospedeira devem ser aceitáveis para aplicações humanas ou veterinárias. Tais veículos, excipientes e/ou diluentes são bem conhecidos daqueles hábeis na técnica. Veículos e/ou diluentes adequados para uso veterinário incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, soluções aquosas, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo da absorção, e similares. Exceto tanto quanto quaisquer meios ou agente convencionais sejam incompatíveis com o ingrediente ativo, seu uso na composição é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados dentro das composições.
[00137] Em uma versão alternativa, a invenção fornece um processo de modular a expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão, dito processo pelo menos compreendendo as etapas de: [00138] (i) selecionar uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas, que compreendam múltiplas cópias de uma sequência de nucleotídeo que seja substancialmente idêntica à sequência de nucleotídeo de dito gene alvo ou uma sua região ou que seja complementar a ela; e [00139] (ii) introduzir ditas moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas em dita célula, tecido ou órgão por um tempo e sob condições suficientes para tradução do produto mRNA de dito gene alvo a ser modificado, sujeito à condição de que a transcrição do dito produto mRNA não seja exclusivamente reprimida ou reduzida.
[00140] Para selecionar apropriadas sequências de nucleotídeos para alvejar expressão do gene alvo, diversos caminhos podem ser empregados. Em uma versão, múltiplas cópias das regiões específicas dos genes caracterizados podem ser clonadas em conexão operável com um promotor adequado e ensaiadas quanto à eficácia na redução da expressão de gene alvo. Altemativamente, biblioteca shotgun compreendendo múltiplas cópias de sequências genéticas podem ser produzidas e ensaiadas quanto a sua eficácia em reduzir a expressão de gene alvo. A vantagem associada com o último caminho é que não é necessário ter-se qualquer conhecimento anterior da significância de qualquer gene alvo particular no relatório descritivo de um fenótipo indesejável da célula. Por exemplo, biblioteca shotgun compreendendo fragmentos subgenômicos de vírus podem ser empregadas e testadas diretamente quanto a sua capacidade em conferir imunidade de vírus na célula hospedeira animal, sem conhecimento anterior do papel que quaisquer genes de vírus representam na patogênese da célula hospedeira.
[00141] Como aqui usado, o termo “coleção de ataque” é um conjunto de diversas sequências de nucleotídeos em que cada membro de dito conjunto é preferivelmente contido dentro de um adequado plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago ou molécula de vetor de vírus que seja adequado para manutenção e/ou replicação em um hospedeiro celular. O termo “coleção de ataque” inclui uma coleção representativa, em que a extensão de diversidade entre as sequências de nucleotídeos é numerosa, de modo que todas as sequências do genoma do organismo de que ditas sequências são derivadas estão presentes no “conjunto” ou, altemativamente, uma coleção limitada em que há um menor grau de diversidade entre ditas sequências. O termo “coleção de ataque” engloba ainda sequências de nucleotídeos aleatórias, em que a sequência de nucleotídeo compreende fragmentos de genoma viral ou celular, entre outros obtidos, por exemplo, por cisalhamento ou digestão parcial do DNA genômico usando-se endonucleases de restrição, entre outros caminhos. Uma “coleção de ataque” inclui ainda células, partículas de vírus e partículas de bacteriófagos compreendendo as sequências de nucleotídeos individuais do conjunto variado.
[00142] As bibliotecas shotgun de acordo com esta versão da invenção são “bibliotecas representativas” compreendendo um conjunto de sequências de nucleotídeos repetidas em tandem, derivadas de um patógeno viral de uma planta ou um animal.
[00143] Em uma versão particularmente preferida da invenção, a coleção de ataque compreende células, partículas de vírus ou partículas bacteriófagas compreendendo um conjunto variado de sequências de nucleotídeos repetidas em tandem, que codificam um conjunto variado de sequências de aminoácidos, em que o membro de dito conjunto variado de sequências de nucleotídeos é colocado operacionalmente sob o controle de uma sequência promotora que é capaz de dirigir a expressão da dita sequência de nucleotídeo repetida em tandem da célula.
[00144] Portanto, a sequência de nucleotídeo de cada unidade da sequência repetida em tandem pode compreender pelo menos cerca de 1 a 200 nucleotídeos de comprimento. O uso de fragmentos maiores, particularmente empregando ácido nucleico cisalhado aleatoriamente derivado de genomas virais de plantas ou animais, não é excluído.
[00145] A molécula de ácido nucleico introduzida é preferivelmente em uma forma expressível.
[00146] “Forma expressível” significa que a molécula de ácido nucleico do presente pedido é apresentada em um arranjo tal que ela pode ser expressa na célula, tecido, órgão ou organismo inteiro, pelo menos no nível transcricional (isto é, ela é expressa na célula animal para produzir pelo menos um produto mRNA que é opcionalmente traduzível ou traduzido para produzir um peptídeo, oligopeptídeo ou molécula de polipeptídeo recombinante).
[00147] Como exemplificação, a fim de obter-se expressão da molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena na célula, tecido ou órgão de interesse, um gene sintético ou uma construção de gene compreendendo dito gene sintético é produzido, em que dito gene sintético compreende uma sequência de nucleotídeo como descrito acima em condição operável com uma sequência promotora que é capaz de regular a expressão ali. Assim, a molécula de ácido nucleico do presente pedido será operacionalmente conectada a um ou mais elementos regularizadores suficientes para que ocorra a transcrição eucariótica.
[00148] Portanto, mais uma versão alternativa da invenção fornece um processo de modular a expressão de um gene alvo em célula, tecido ou órgão animal, dito processo pelo menos compreendendo as etapas de: [00149] (i) selecionar uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas, que compreendam múltiplas cópias, preferivelmente repetições em tandem, de uma sequência de nucleotídeo que seja substancialmente idêntica a sequência de nucleotídeo do dito gene alvo ou uma sua região ou que seja complementar a ela;
[00150] (ii) produzir um gene sintético compreendendo ditas moléculas de ácido nucleico dispersas ou moléculas de ácido nucleico exógenas;
[00151] (iii) introduzir dito gene sintético em dita célula, tecido ou órgão;e [00152] (iv) expressar dito gene sintético em dita célula, tecido ou órgão por um tempo e sob condições suficientes para tradução do produto mRNA de dito gene alvo a ser modificado, sujeito à condição de que a transcrição de dito produto mRNA não seja exclusivamente reprimida ou reduzida.
[00153] Referência aqui a um “gene” ou “genes” é para ser entendida em seu contexto mais amplo e inclui: [00154] (i) um gene genômico clássico, consistindo de sequências regularizadoras transcricionais e/ou traducionais e/ou uma região codificante e/ou sequências não-traduzidas (isto é, íntrons, sequências não-traduzidas-5’ e 3’; e/ou [00155] (ii) mRNA ou cDNA correspondendo às regiões codificantes (isto é, exons) e sequências não-traduzidas 5’- e 3’- do gene; e/ou [00156] (iii) uma região estrutural correspondendo às regiões codificantes (isto é, exons) opcionalmente compreendendo ainda sequências não-traduzidas e/ou uma sequência promotora heteróloga que consiste de regiões regularizadoras transcricionais e/ou traducionais, capazes de conferir características de expressão a dita região estrutural.
[00157] O termo “gene sintético” refere-se a um gene não-naturalmente ocorrente como aqui antes definido, que preferivelmente compreende pelo menos uma ou mais sequências regularizadoras transcricionais e/ou traducionais, operacionalmente ligadas a uma sequência genética estrutural.
[00158] O termo “gene estrutural” deve ser entendido como referindo-se a uma sequência de nucleotídeo que é capaz de ser transmitida para produzir mRNA e, opcionalmente, codifica um peptídeo, oligopeptídeo, polipeptídeo ou molécula de proteína biologicamente ativa. Aqueles hábeis na técnica saberão que nem todo mRNA é capaz de ser traduzido para peptídeo, oligopeptídeo, polipeptídeo ou proteína, por exemplo se o mRNA não tiver um sinal de partida de tradução funcional ou, altemativamente, se o mRNA for mRNA antissenso. A presente invenção claramente engloba genes sintéticos compreendendo sequências de nucleotídeos que não são capazes de codificar peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos ou proteínas biologicamente ativas. Em particular, os presentes inventores descobriram que tais genes sintéticos podem ser vantajosos na modificação da expressão do gene alvo das células, tecidos ou órgãos de um organismo procariótico ou eucariótico.
[00159] O termo “região de gene estrutural” refere-se àquela parte de um gene sintético que compreende uma molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena como descrito aqui, que é expressa em uma célula, tecido ou órgão sob o controle de uma sequência promotora a que ela é operacionalmente conectada. Uma região de gene estrutural pode compreender uma ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas e/ou moléculas de ácido nucleico exógenas, operacionalmente sob o controle de uma única sequência promotora ou múltiplas sequências promotoras. Portanto, a região de gene estrutural de um gene sintético pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é capaz de codificar uma sequência de aminoácidos ou é complementar a ela. A este respeito, uma região de gene estrutural que é usada na execução da presente invenção pode também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos embora não tenha um códon de iniciação de tradução funcional e/ou um códon de parada de tradução funcional e, como consequência, não compreenda uma estrutura de leitura aberta completa. No presente contexto, o termo “região de gene estrutural” também se estende a sequências de nucleotídeos não-codificantes, tais como sequências 5’-a montante ou 3’-a jusante de um gene que normalmente seria traduzido em uma célula eucariótica que expresse dito gene.
[00160] Portanto, no contexto da presente invenção, uma região de gene estrutural pode também compreender uma fusão entre dois ou mais quadros de leitura abertos do mesmo ou de diferentes genes. Em tais versões, a invenção pode ser usada para modular a expressão de um gene pelo alvejamento de suas diferentes regiões não-contíguas ou, altemativamente, para simultaneamente modular a expressão de diversos genes diferentes, incluindo diferentes genes de uma família de multigenes. No caso de uma molécula de ácido nucleico de fusão que seja não-endógena para a célula animal e, em particular, compreenda duas ou mais sequências de nucleotídeos derivadas de um patógeno viral, a fusão pode fornecer a vantagem adicional de conferir simultânea imunidade ou proteção contra diversos patógenos, pelo alvejamento da expressão de genes dos ditos diversos patógenos. Altemativamente ou em adição, a fusão pode fornecer imunidade mais eficaz contra qualquer patógeno pelo alvejamento da expressão de mais do que um gene daquele patógeno.
[00161] Regiões de gene estrutural particularmente preferidas de acordo com este aspecto da invenção são aquelas que incluem pelo menos uma estrutura de leitura aberta traduzível, mais preferivelmente incluindo ainda um códon de partida traducional localizado na extremidade-5’ do dito quadro de leitura aberto, embora não necessariamente no término-5’ da dita região de gene estrutural. A este respeito, apesar da região de gene estrutural poder compreender pelo menos uma estrutura de leitura aberta traduzível e/ou códon de partida traducional AUG ou ATG, a inclusão de tais sequências de forma alguma sugere que a presente invenção requer que ocorra a tradução da molécula de ácido nucleico introduzida a fim de modular a expressão do gene alvo. Embora não desejando ficarmos presos a qualquer teoria ou modo de ação, a inclusão de pelo menos uma estrutura de leitura aberta traduzível e/ou códon de partida traducional na molécula de ácido nucleico do presente pedido pode servir para aumentar a estabilidade de seu produto de transcrição de mRNA, desse modo melhorando a eficiência da invenção.
[00162] O número ótimo de sequências genéticas estrutural que podem ser envolvidas no gene sintético da presente invenção variará consideravelmente, dependendo do comprimento de cada uma das ditas sequências genéticas estrutural, sua orientação e grau de identidade entre si. Por exemplo, aqueles hábeis na técnica conhecerão a inerente instabilidade das sequências de nucleotídeos palindrômicas in vivo e as dificuldades associadas com a construção de longos genes sintéticos compreendendo sequências de nucleotídeos repetidas invertidas, por causa da tendência para tais sequências recombinarem-se in vivo. Apesar de tais dificuldades, o número ótimo de sequências genéticas estrutural a serem incluídas nos genes sintéticos da presente invenção pode ser determinado empiricamente por aqueles hábeis na técnica, sem qualquer experimentação indevida e pelos seguintes procedimentos padrão, tais como a construção do gene sintético da invenção empregando-se linhagens de células deficientes de recombinase, reduzindo-se o número de sequências repetidas a um nível que elimine ou minimize os eventos de recombinação e mantendo-se o comprimento total da sequência genética multiestrutural a um limite aceitável, preferivelmente não mais do que 5-10 kb, mais preferivelmente não mais do que 2-5 kb e mesmo mais preferivelmente não mais do que 0,5-2,0 kb de comprimento.
[00163] Onde a região de gene estrutural compreender mais do que uma molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena ela será referida aqui como uma “região de gene multiestrutural” ou termo similar. A presente invenção claramente estende-se ao uso de regiões de gene multiestrutural, que preferivelmente compreende uma sequência de repetição direta, sequência de repetição invertida ou sequência palindrômica interrompida de um gene estrutural particular, molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena, ou um seu fragmento.
[00164] Cada molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena contida dentro da unidade de gene estrutural multiestrutural do gene sintético do presente pedido, pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica a um diferente gene alvo do mesmo organismo. Tal arranjo pode ser de particular utilidade quando o gene sintético é destinado a fornecer proteção contra um patógeno em uma célula, tecido ou órgão, em particular um patógeno viral, pela modificação da expressão dos genes alvo virais. Por exemplo, o gene multiestrutural pode compreender sequências de nucleotídeos (isto é, duas ou mais moléculas de ácido nucleico dispersas ou exógenas) que sejam substancialmente idênticas a dois ou mais genes alvo selecionados da lista compreendendo polimerase de DNA, polimerase de RNA, protease Nia, e proteína de revestimento ou outro gene alvo que seja essencial para a infectividade, replicação ou reprodução viral. Entretanto, prefere-se com este arranjo que as unidades de gene estrutural sejam selecionadas de modo que os genes alvo a que elas são substancialmente idênticas sejam normalmente expressos aproximadamente no mesmo tempo (ou mais tarde) em uma célula, tecido ou órgão infectado quando o gene multiestrutural do gene sintético do presente pedido é expresso sob o controle da sequência promotora. Isto significa que a expressão de controle de promotor do gene multiestrutural usualmente será selecionada para conferir expressão na célula, tecido ou órgão durante o inteiro ciclo de vida do vírus, quando os genes alvo virais forem expressos em diferentes estágios de infecção.
[00165] Como com as unidades de sequência individuais de uma molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena, as unidades individuais do gene multiestrutural podem ser espacialmente conectadas em qualquer orientação em relação entre si, por exemplo, cabeça-com-cabeça, cabeça-com-cauda ou cauda-com-cauda e todas tais configurações estão dentro do escopo da invenção.
[00166] Para expressão em células eucarióticas, o gene sintético compreende geralmente, além da molécula de ácido nucleico da invenção, um promotor e, opcionalmente, outras sequências regularizadoras designadas para facilitar a expressão da molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena.
[00167] A referência aqui a um “promotor” é para ser entendida em seu contexto mais amplo e inclui as sequências regularizadoras transcricionais de um gene genômico clássico, incluindo a caixa TATA, que é requerida para iniciação de transcrição precisa, com ou sem uma sequência de caixa CCAAT e elementos regularizadores adicionais (isto é, sequências ativantes a montante, intensificadores e silenciadores) que alteram a expressão de gene em resposta aos estímulos desenvolvimentistas e/ou externos, ou em uma maneira específica de tecido. Um promotor é usualmente, mas não necessariamente, posicionado a montante ou 5’ de uma região de gene estrutural, cuja expressão ele regula. Além disso, os elementos regularizadores compreendendo um promotor são usualmente posicionados dentro de 2 kb do local de partida de transcrição do gene.
[00168] No presente contexto, o termo “promotor” é também usado para descrever uma molécula sintética ou de fusão, ou derivado que confira, ative ou aumente a expressão de uma molécula de ácido nucleico de uma célula.
[00169] Os promotores preferidos podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos regularizadores específicos, para aumentar mais a expressão da molécula senso e/ou para alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal de dita molécula senso. Por exemplo, os elementos regularizadores que conferem indutibilidade de cobre podem ser colocados adjacentes a uma sequência promotora heteróloga acionando a expressão de uma molécula senso, desse modo conferindo indutibilidade de cobre na expressão da dita molécula.
[00170] Colocando-se uma molécula de ácido nucleico dispersa ou exógena sob o controle regularizador de uma sequência promotora significa posicionar a dita molécula de modo que a expressão seja controlada pela sequência promotora. Os promotores são geralmente posicionados 5’ (a montante) em relação aos genes que eles controlam. Na construção de combinações heterólogas de gene estrutural/promotor é geralmente preferido posicionar-se o promotor a uma distância do local de partida de transcrição do gene que seja aproximadamente a mesma distância entre aquele promotor e o gene que ele controla em seu cenário natural, isto é, o gene de que o promotor é derivado. Como é sabido na técnica, alguma variação desta distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor. Similarmente, o posicionamento preferido de uma sequência reguladora com respeito a um gene heterólogo a ser colocado sob seu controle é definido pelo posicionamento do elemento em seu cenário natural, isto é, os genes de que ele é derivado. Repetindo, como é sabido na técnica, alguma variação nesta distância pode também ocorrer.
[00171] Exemplos de promotores adequados para uso nos genes sintéticos da presente invenção incluem promotores virais, fúngicos, bacterianos, animais e vegetais capazes de funcionar em células de plantas, animais, insetos, fúngicas, de levedura ou bacterianas. O promotor pode regular a expressão do componente de gene estrutural constitutivamente, ou diferencialmente com respeito à célula, o tecido ou órgão em que a expressão ocorre ou, com respeito ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, ou patógenos, ou íons metálicos, entre outros.
[00172] Preferivelmente, o promotor é capaz de regular a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão eucariótico, pelo menos durante o período de tempo durante o qual o gene alvo é expressado ali e, mais preferivelmente, também imediatamente precedendo o começo da expressão detectável do gene alvo de dita célula, tecido ou órgão.
[00173] Portanto, fortes promotores constitutivos são particularmente preferidos para fins da presente invenção ou promotores que possam ser induzidos por infecção de vírus ou o começo da expressão do gene alvo.
[00174] Os promotores operáveis por planta e operáveis por animal são particularmente preferidos para uso nos genes sintéticos da presente invenção. Exemplos de promotores preferidos incluem o promotor bacteriófago T7, promotor bacteriófago T3, promotor SP6, promotor- operador lac, promotor tac, promotor tardio SV40, promotor precoce SV40, promotor RSV-LTR, promotorCMV IE, promotor CaMV 35S, promotor SCSV, promotor SCBV e similares.
[00175] Em consideração do requisito preferido para expressão de elevado nível que coincida com a expressão do gene alvo ou preceda a expressão do gene alvo, é altamente desejável que a sequência promotora seja um promotor forte constitutivo, tal como o promotor CMV-IE ou a sequência de promotor precoce SV40, a sequência de promotor tardia SV40, o promotor CaMV 35S, ou o promotor SCBV, entre outros. Aqueles hábeis na técnica conhecerão prontamente as sequências promotoras adicionais que não aquelas especificamente descritas.
[00176] No presente contexto, os termos “em conexão operável com” ou “operacionalmente sob o controle” ou similares serão entendidos para indicar que a expressão da região do gene estrutural ou região de gene multiestrutural está sob o controle da sequência promotora com que ela é espacialmente conectada; em uma célula, tecido, órgão ou organismo inteiro.
[00177] Em uma versão preferida da invenção, uma região de gene estrutural (isto é, molécula de ácido nucleico dispersa ou molécula de ácido nucleico exógena) ou região de gene multiestrutural é colocada operacionalmente em conexão com uma orientação promotora relativa à sequência promotora, de modo que, quando é transcrita um produto mRNA é sintetizado que, se traduzido, é capaz de codificar um produto polipeptídeo do gene alvo ou um seu fragmento.
[00178] Entretanto, a presente invenção não é para ser limitada ao uso de tal arranjo e a invenção claramente estende-se para o uso de genes sintéticos e construções de gene em que a região de gene estrutural ou região de gene multiestrutural é colocada na orientação “antissenso” em relação à sequência promotora, de modo que pelo menos uma parte de seu produto de transcrição mRNA é complementar ao mRNA codificado pelo gene alvo ou um seu fragmento.
[00179] Claramente, quando a molécula de ácido nucleico dispersa, molécula de ácido nucleico exógena ou região de gene multiestrutural compreendem sequências de repetição diretas e/ou invertidas em tandem do gene alvo, todas as combinações das configurações supracitadas são englobadas pela invenção.
[00180] Em uma versão alternativa da invenção, a região de gene estrutural ou região de gene multiestrutural é operacionalmente conectada tanto a uma primeira sequência promotora como uma segunda sequência promotora, em que ditos promotores são localizados em suas extremidades distai e proximal, de modo que pelo menos uma unidade de dita região de gene estrutural ou região de gene multiestrutural é colocada na orientação “senso” em relação à primeira sequência promotora e na orientação “antissenso” relativa à segunda sequência promotora. De acordo com esta versão, prefere-se também que os primeiro e segundo promotores sejam diferentes, para impedir a competição entre eles por fatores de transcrição celular que ligam-se a eles. A vantagem deste arranjo é que os efeitos da transcrição dos primeiro e segundo promotores na redução da expressão de gene alvo da célula podem ser comparados para determinar a orientação ótima para cada sequência de nucleotídeo testada.
[00181] O gene sintético preferivelmente contém elementos reguladores adicionais para transcrição eficiente, por exemplo, uma sequência de terminação de transcrição.
[00182] O termo “terminador” refere-se a uma sequência de DNA no final de uma unidade transcricional que sinaliza a terminação da transcrição. Os terminadores são sequências de DNA 3’-não-traduzidas, contendo um sinal de poliadenilação, que facilita a adição de sequências de poliadenilato ao término 3’ de um transcrito primário. Os terminadores ativos em células de planta são conhecidos e descritos na literatura. Eles podem ser isolados de bactérias, fungos, vírus, animais e/ou plantas ou sintetizados de novo.
[00183] Como com as sequências promotoras, o terminador pode ser qualquer sequência terminadora que seja operável nas células, tecidos ou órgãos em que se pretende utilizar.
[00184] Exemplos de terminadores particularmente adequados para uso nos genes sintéticos da presente invenção incluem o sinal de poliadenilação SV40, o sinal de poliadenilação HSV TK, o terminador CYC1, o terminador ADH, o terminador SPA, o terminador do gene sintase da nopalina (NOS) do Agrobactrium tumefaciens, o terminador do gene do vírus mosaico da Couve-flor (CaMV) 35S, o terminador do gene zein de Zea mays, as sequências terminadoras do gene da pequena subunidade (SSU) de Rubisco, terminadores da sequência genética do vírus de retardamento do subtrevo (SCSV), qualquer terminador de E.coli rho-independente, ou o terminador alfa lacZ, entre outros.
[00185] Em uma versão particularmente preferida, o terminador é o sinal de poliadenilação SV40 ou o sinal de poliadenilação HSVTK que são operáveis em células, tecidos e órgãos animais, terminador da octopina sintase (OCS) ou nopalina sintase (NOS) ativo em células, tecidos ou órgãos de plantas, ou o terminador alfa lacZ, que é ativo em células procarióticas.
[00186] Aqueles hábeis na técnica conhecerão as sequências terminadoras adicionais que podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Tais sequências podem ser prontamente usadas sem qualquer experimentação indevida.
[00187] Meios para introduzir (isto é, transfectar ou transformar) células com os genes sintéticos aqui descritos ou uma construção de gene compreendendo os mesmos são bem conhecidos daqueles hábeis na técnica.
[00188] Em mais uma versão alternativa, uma construção de gene é usada que compreende duas ou mais regiões de gene estrutural ou regiões de gene multi estruturais em que cada uma das regiões de gene estrutural é colocada operacionalmente sob o controle de sua própria sequência promotora. Como com outras versões aqui descritas, a orientação de cada região de gene estrutural pode ser variada para maximizar seu efeito modulador sobre a expressão do gene alvo.
[00189] De acordo com esta versão, os promotores controlando a expressão da unidade de gene estrutural são preferivelmente sequências promotoras diferentes, para reduzir a competição entre eles para fatores de transcrição celular e polimerases de RNA. Os promotores preferidos são selecionados daqueles referidos acima.
[00190] Aqueles hábeis na técnica saberão como modificar o arranjo ou configuração dos genes estruturais individuais como descrito acima, para regular sua expressão pelas sequências promotoras separadas.
[00191] Os genes sintéticos descritos acima são capazes de serem mais modificados, por exemplo, pela inclusão de sequências de nucleotídeo marcadoras codificando uma enzima marcadora detectável ou um análogo funcional ou seu derivado, para facilitar a detecção do gene sintético de uma célula, tecido ou órgão em que é expresso. De acordo com esta versão, as sequências de nucleotídeos marcadoras estarão presentes em um formato traduzível e expressa, por exemplo, como um polipeptídeo de fusão com o(s) produto(s) de tradução de qualquer um ou mais dos genes estruturais ou, altemativamente, como um polipeptídeo de não-fusão.
[00192] Aqueles hábeis na técnica terão conhecimento de como produzir os genes sintéticos aqui descritos e das exigências para obter sua expressão, quando assim desejado. Em uma célula ou tipo de célula específico sob as condições desejadas. Em particular, será sabido por aqueles hábeis na técnica que as manipulações de gene requeridas para realizar a presente invenção podem requerer a propagação de uma construção de gene aqui descrita ou um seu derivado em uma célula procariótica tal como uma célula E. coli ou uma célula de planta ou uma célula animal.
[00193] Os genes sintéticos da presente invenção podem ser introduzidos em uma célula, tecido ou órgão adequado, sem modificação como DNA linear na forma de uma construção de gene, opcionalmente contidos dentro de um veículo adequado, tal como uma célula, partícula de vírus ou lipossoma, entre outros. Para produzir uma construção de gene, o gene sintético da invenção é inserido dentro de um vetor adequado ou molécula de epissoma, tal como um vetor bacteriófago, vetor viral ou um plasmídeo, cosmídeo ou vetor de cromossomo artificial, que seja capaz de ser mantido e/ou replicado e/ou expresso na célula, tecido ou órgão hospedeiro dentro do qual é subseqüentemente introduzido.
[00194] Portanto, mais um aspecto da invenção fornece uma construção de gene que pelo menos compreende o gene sintético de acordo com qualquer uma ou mais das reivindicações aqui descritas e uma ou mais origens de replicação e/ou sequências genéticas marcadoras selecionáveis.
[00195] As construções de gene são particularmente adequadas para a transformação de uma célula eucariótica para introduzir nela novos traços genéticos, além da condição de características de resistência a patógenos virais. Tais traços novos adicionais podem ser introduzidos em uma construção de gene separada ou, altemativamente, na mesma construção de gene que compreende os genes sintéticos aqui descritos. Aqueles hábeis na técnica reconhecerão as vantagens significativas, em particular em termos de reduzidas manipulações de gene e exigências de cultura de tecidos e eficácia de custo aumentada, da inclusão das sequências genéticas que codificam tais traços adicionais e os genes sintéticos aqui descritos em uma única construção de gene.
[00196] Usualmente, uma origem de replicação ou um gene marcador selecionável, adequado para uso em bactérias, é fisicamente separado daquelas sequências genéticas contidas na construção de gene que são destinadas a ser expressas ou transferidas para uma célula eucariótica, ou integradas dentro do genoma de uma célula eucariótica.
[00197] Em uma versão particularmente preferida, a origem de replicação é funcional em uma célula bacteriana e compreende a origem pUC ou CoIEl ou, altemativamente, a origem de replicação é operável em uma célula, tecido eucariótico e mais preferivelmente compreende a origem de replicação de 2 micros (2 pm) ou a origem de replicação SV40.
[00198] Como aqui usado, o termo “gene marcador selecionável” inclui qualquer gene que confira um fenótipo em uma célula em que é expresso, para facilitar a identificação e/ou seleção das células que são transfectadas ou transformadas com uma construção de gene da invenção ou seu derivado.
[00199] Os genes marcadores selecionáveis adequados, aqui contemplados, incluem o gene de resistência à ampicilina (Ampr), gene de resistência à tetraciclina (Ter), gene de resistência à canamicina bacteriana (Kan’), o gene de resistência à zeocina (Zeocin é uma droga da família da bleomicina, que é marca comercial da InVitrogen Corporation), o gene AURI-C que confere resistência à aureobasidina A antibiótica, gene de resistência à fosfinotricina, gene de fosfotransferase de neomicina (nptll), gene de resistência à higromicina, gene da β-glicuronidase (GUS), gene cloranfenicol acetiltransferase (CAT), gene codificador da proteína fluorescente verted ou o gene da luciferase, entre outros.
[00200] Preferivelmente, o gene marcador selecionável é o gene nptll ou gene Kanr ou gene codificante da proteína fluorescente verde (GFP).
[00201] Aquelas hábeis na técnica estarão cientes de outros genes marcadores selecionáveis úteis na execução da presente invenção e a invenção do presente pedido não é limitada pela natureza do gene marcador selecionável.
[00202] A presente invenção estende-se a todas as construções de gene essencialmente como aqui descritas, que incluem mais sequências genéticas destinadas para a manutenção e/ou replicação da dita construção de gene em procariotos ou eucariotos e/ou a integração de dita construção de gene ou uma parte dela dentro do genoma de uma célula ou organismo eucariótico.
[00203] Como com as moléculas de ácido nucleico dispersas ou exógenas, os processos padrão descritos acima podem ser usados para introduzir genes sintéticos e construções de gene dentro da célula, tecido ou órgão para fins de modular a expressão do gene alvo, por exemplo, transfecção ou transformação mediada por lipossoma, transformação de células com partículas de vírus atenuadas ou células bacterianas, união de células, procedimentos de transformação ou transfecção conhecidos daqueles hábeis na técnica ou descritos por Ausubel e outros (1992).
[00204] Meios adicionais para introduzir DNA recombinante dentro do tecido ou células de plantas incluem mas não são limitados a transformação empregando CaC12 e suas variações, em particular o processo descrito por Hanahan (1983), absorção de DNA direta dentro dos protoplastos (Krebs e outros, 1982; Paszkowski e outros, 1984), absorção mediada por PEG para protoplastos (Armstrong e outros, 1990), bombardeio de micropartículas, eletroporação (Fromm e outros, 1985), microinjeção de DNA (Crossway e outros, 1986), bombardeio de micropartículas de explantes de tecidos ou células (Christou e outros, 1988; Sanford, 1988), infiltração a vácuo de tecido com ácido nucleico ou, no caso de plantas, transferência mediada por T-DNA de Agrobacterium para o tecido de planta, como descrito essencialmente por An e outros (1985), Herrera-Estrella e outros (1983a, 1983b,1985).
[00205] Para bombardeio de micropartículas de células, uma micropartícula é propelida para dentro de uma célula para produzir uma célula transformada. Qualquer metodologia e aparelho de transformação de célula balística adequada pode ser usada na realização da presente invenção. Aparelho e procedimentos exemplificativos são descritos por Stomp e outros (Patente US no. 5.122.466) e Sanford e Wolf (Patente US no.4.945.050). Ao empregar procedimentos de transformação balísticos, a construção de gene pode incorporar um plasmídeo capaz de replicar-se na célula a ser transformada.
[00206] Exemplos de micropartículas adequadas para uso em tais sistemas incluem esferas de ouro de 1 a 5 pm. A construção de DNA pode ser depositada sobre a micropartícula por qualquer técnica adequada, tal como por precipitação.
[00207] Em mais uma versão da presente invenção, os genes sintéticos e as construções de gene aqui descritas são adaptadas para integração dentro do genoma de uma célula em que eles são expressos. Aqueles hábeis na técnica estarão cientes que, a fim de obter-se integração de uma sequência genética ou construção de gene dentro do genoma de uma célula hospedeira, certas sequências genéticas adicionais podem ser requeridas. No caso de plantas, sequências de bordas esquerda e direita do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobactrium tumefaciens geralmente serão requeridas.
[00208] A presente invenção estende-se ainda a uma célula, tecido ou órgão isolado compreendendo o gene sintético aqui descrito ou uma construção de gene compreendendo o mesmo. A presente invenção estende-se ainda para tecidos, órgãos e organismos inteiros regenerados derivados de ditas células, tecidos e órgãos e para seus propágulos e progênie.
[00209] Por exemplo, as plantas podem ser regeneradas de células, tecidos ou órgãos de plantas transformadas em meios contendo hormônio e as plantas regeneradas podem tomar uma variedade de formas, tais como quimeras de células transformadas e células não-transformadas; transformantes clonais (p.ex., todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não-transformados (p.ex., um rizoma transformado enxertado em um enxerto não-transformado da espécie cítrica). As plantas transformadas podem ser propagadas por uma variedade de meios, tais como por técnicas de propagação clonal ou procríação clássica. Por exemplo, plantas transformadas de uma primeira geração (ou Tl) podem ser autofecundadas para fornecer plantas transformadas de segunda geração homozigoto (T2), e as plantas T2 mais propagadas através de técnicas de procríação clássicas.
[00210] A presente invenção é ainda descrita com referência aos seguintes Exemplos não limitativos. EXEMPLO 1 Construções de gene compreendendo sequências genéticas de polimerase BEV ligadas a sequência promotora CMV e/ou sequência promotora SV40L 1. Plasmídeos Comerciais Plasmídeo pBluescript II (SK+) [00211] O plasmídeo pBluescript II (SK+) é comercialmente disponível na Stratagene e compreende a sequência promotora LacZ e o terminador de transcrição lacZ-alfa, com um sítio de múltipla clonagem para a inserção ali de sequências genéticas estruturais. O plasmídeo compreende ainda as origens de replicação ColEl e fl e o gene de resistência à ampicilina. Plasmídeo pSVL
[00212] O plasmídeo pSVL é obtenível comercialmente da Pharmacia e serve como uma fonte da sequência promotora tardia SV40. A sequência de nucleotídeo de pSVL é também publicamente disponível como GenBank Accession Number U13868.
Plasmídeo pCR2.1 [00213] O plasmídeo pCR2.1 é comercialmente disponível na Invitrogen e compreende a sequência promotora LacZ e o terminador de transcrição lacZ-a, com um sítio de clonagem para a inserção das sequências genéticas estruturais entre eles. O plasmídeo pCR2.1 é projetado para clonar os fragmentos de ácido nucleico em virtude da projeção-A freqüentemente sintetizada pela polimerase Taq durante a reação de cadeia de polimerase. Os fragmentos PCR clonados deste modo são flanqueados por dois sítios EcoRI. O plasmídeo compreende ainda as origens CoIEl e fl da replicaçâo e os genes de resistência da cananiicina e resistência da ampicilina.
Plasmídeo pEGFP-Nl MCS
[00214] O plasmídeo pEGFP-Nl MCS (Figura 1; Clontech) contém o promotor CMV IE operacional mente conectado a uma estrutura de leitura aberta codificando uma variante mu d ada-vermelho da proteína fluorescente verde do tipo selvagem (GFP; Prasher e outros, 1992; Chalfie e outros, 1994; Inouye e Tsuji, 1994), que foi otimizada para fluorescente mais brilhante. A variante GFP específica codificada por pEGFP-N 1 MCS foi revelada por Cormaek e outros (1996). O plasmídeo pEGFP-Nl MCS contém um sítio múltiplo de clonagem compreendendo sidos BgfII e BamHl e muitos outros sítios de clivagem de endonuclease de restrição, localizados entre o promotor CMV ΓΕ e a estrutura de leitura aberta GFP. Os genes estruturais clcmados dentro do sido múltiplo de clonagem serão expressos no nível transcricional se eles não tiverem um sítio de partida de tradução funcional, entretanto tais sequências genéticas estruturais não serão expressas no nível da proteína (isto é, traduzidas). As sequências genéticas estruturais inseridas dentro do sítio múltiplo de clonagem, que compreendam um sítio de partida de tradução funcional, serio expressas como polipeptídeos de fusão GFP se elas forem clonadas na estrutura com a sequência de codificação-GFP. O plasmídeo compreende ainda um sinal de políadenilação SV40 a jusante da estrutura de leitura aberta GFP para dirigir processamento apropriado da terminação-3’ do niRNA transcrito da sequência promotora CMV-IE. O plasmídeo compreende ainda a origem de replicaçâo SV40 funcional em células animais; o gene de resistência à ncomicina compreendendo o promotor prematuro SV40 (SV40 EP na Figura l) operacionalmente conectado ao gene de resistência à neomicina/canamicina derivado de Tn5 (Kan/neo na Figura 1) e o sinal de políaden ilação de timidina einase HSV (HSV TK poli (A) na Figura 1), para seleção de células transformadas na canamicina, neomicina ou G418; a origem pUCl9 da replieação que é funcional nas células bacterianas (pUC na Figura 1); e a origem de replieação fl para produção de DNA de filamento único (f 1 Ori na Figura 1). 2. Cassetes de Expressão Plasmídeo pCMV.eass [00215] O pl asm ideo pCMV.eass (figura 2) é ura cassete de expressão para acionar a expressão de uma sequência genética estrutural sob o controle da sequência promotora CMV-IE. O plasmídeo pCMV.eass foi derivado de pEGFP-Nl MCS por deleção da estrutura de leitura aberta GFP como segue: o Plasmídeo pEGFP-Nl MCS foi digerido com PinÁl e Not I, extremidade embotada empregando-se po lime rase Pful e em seguida religado. As sequências genéticas estruturais são clonadas dentro de pCMV.eass usando-se o sítio múltiplo de clonagem, que é idêntico ao sítio múltiplo de clonagem de pEGFP-Nl MCS, exceto que lhe falta o sítio PinhV
Plasmídeo pCMV.SV40L.eass [00216] O plasmídeo pCMV.SV40L.cass (figura 3) compreende o sitio polissintético A e a sequência promotora tardia SV40 do plasmídeo pCR.SV40L (Figura 4) subclonadas como ura fragmento Sal 1 dentro do sítio Sal I do plasmídeo pCMV.eass (Figura 2), de modo que as sequências promotora CMV-IE e promotora tardia SV40 são capazes de dirigir a transcrição na mesma direção. Portanto, o sítio sintético poli(A) na terminação 5’ da sequência promotora SV40 é usado corno um terminador de transcrição para genes estruturais expressos do promotor CMV IE deste plasmídeo, que também provê a inserção de dito gene estrutural via o sítio múltiplo de clonagem presente entre o promotor tardio SV40 e o sítio sintético poli(A) (Figura 5). Os sítios múltiplos de clonagem são localizados atrás dos promotores tardios CMV-IE e SV40, incluindo os sítios fíamHl e BgAL
Plasmídeo pCMV.SV40LR.cass [00217] O plasmídeo pCMV.SV40LR.cass (Figura 4) compreende a sequência promotora tardia SV40 derivada do plasmídeo pCR.SV40L, subclonada como um fragmento SalI dentro do sítio Sall do plasmídeo pCMV.cass (Figura 2), de modo que o promotor CMV-IE ou o tardio SV40 pode acionar a transcrição de um gene estrutural ou uma unidade de gene múltiplo estrutural, na orientação senso ou antissenso, como desejado. Um sítio múltiplo de clonagem é posicionado entre as sequências opostas de promotor CMV-IE e promotor tardio SV40 deste plasmídeo, para facilitar a introdução de uma sequência genética estrutural. A fim de que ocorra a expressão de uma sequência genética estrutural deste plasmídeo, ele deve ser introduzido com sua própria sequência de terminação de transcrição localizada na extremidade 3’, porque não há sequências de terminação de transcrição localizadas entre as opostas sequências de promotor CMV-IE e tardia SV40 deste plasmídeo. Preferivelmente, a sequência genética estrutural ou a unidade de gene multiestrutural que é para ser introduzida dentro de pCMV.SV40LR.cass compreenderá tanto um sinal de poliadenilação 5’ como 3’, como segue: (i) onde a sequência genética estrutural ou unidade de gene multiestrutural é para ser expressa na orientação senso da sequência promotora CMVIE e/ou na orientação antissenso do promotor tardio SV40, o sinal de poliadenilação 5’ será na orientação antissenso e o sinal de poliadenilação será na orientação senso; e (ii) onde a sequência genética estrutural ou unidade de gene multiestrutural é para ser expressa na orientação antissenso da sequência promotora CMV IE e/ou na orientação senso do promotor tardio SV40, o sinal de poliadenilação 5’ será na orientação senso e o sinal de poliadenilação 3’ será na orientação antissenso.
[00218] Altemativamente ou em adição, as sequências terminadoras adequadamente orientadas podem ser colocadas na terminação-5’ dos promotores CMV e SV40L, como mostrado na Figura 4.
[00219] Altemativamente, terminadores apropriadamente orientados poderíam ser colocados a montante dos promotores CMV e SV40L, de modo que a terminação transcricional podería ocorrer após a transcrição além de sua sequência de terminação normal dos dois promotores na direção antissenso. 3. Construções Intermediárias Plasmídeo pCR.Bgl-GFP-Bam [00220] O plasmídeo pCR.Bgl-GFP-Bam (Figura 5) compreende uma região interna da estrutura de leitura aberta GFP derivada do plasmídeo pEGFP-Nl MCS (Figura 1) colocada operacionalmente sob o controle do promotor lacZ. Para produzir este plasmídeo, uma região da estrutura de leitura aberta GFP foi ampliada de pEGFP-Nl MCS empregando-se os iniciadores de amplificação BGI-GFP e GFP-Bam e clorada dentro do plasmídeo pCR2.1. A região de codificação-GFP interna do plasmídeo pCR.Bgl-GFP não tem códons de partida e de parada traducionais funcionais. Plasmídeo pBSII(SK+).EGFP
[00221] O plasmídeo pBSII(SK+).EGFP (Figura 6) compreende a estrutura de leitura aberta EGFP derivada do plasmídeo pEGFP-Nl MCS (Figura 1) colocada operacionalmente sob o controle do promotor lacZ. Para produzir este plasmídeo, a região de codificação EGFP de pEGFP-N 1 MCS foi extirpada como um fragmento Notl/Xhol e clorada dentro dos sítios de clonagem Notl/Xhol do plasmídeo pBluescript II (SK+).
Plasmídeo pCMV.EGFP
[00222] O plasmídeo pCMV.EGFP (Figura 7) é capaz de expressar o gene estrutural sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Para produzir este plasmídeo, a sequência EGFP do plasmídeo pBSII(SK+).EGFP foi extirpada como fragmento BamHl/Sacl e clonada dentro dos sítios Bg/WJSacl do plasmídeo pCMV.cass (Figura 2).
Plasmídeo pCR.SV40L
[00223] O plasmídeo pCR.SV40L (Figura 8) compreende o promotor tardio SV40 derivado do plasmídeo pSVL (GenBank Accession No. U13868; Pharmacia), clonado dentro de pCR2.1 (Stratagene). Para produzir este plasmídeo, o promotor tardio SV40 foi amplificado usando-se os iniciadores SV401 e SV40-2, que compreendem os sítios de clonagem Sal I para facilitar a subclonagem do DNA amplificado dentro de pCMV.cass. O iniciador também contém um sítio sintético poli(A) na terminação 5’, de modo que o produto de amplificação compreende o sítio sintético poli(A) na terminação 5’ da sequência promotora SV40.
Plasmídeo pCR.BEV.l [00224] A região de codificação de polimerase de RNA dependente-RNA BEV foi amplificada como um fragmento de DNA de 1385 pb de um clone de cDNA de comprimento total codificando-o, empregando-se iniciadores designados BEV-1 e BEV-2, sob condições de amplificação padrão. O DNA amplificado continha um sítio de enzima de restrição 5 ’-BgI II, derivado da sequência de iniciador BEV-1 e um sítio de enzima de restrição 3’BamHI derivado da sequência de iniciador BEV-2. Adicionalmente, como a sequência de iniciador BEV-1 contém um sinal de partida de tradução 5’-ATG-3’ construído nas posições 15-17, o gene estrutural da polimerase BEV amplificada compreende o sítio de partida na estrutura com sequências de nucleotídeos codificando polimerase BEV. Assim, o gene estrutural de polimerase BEV amplificado compreende o códon de partida ATG imediatamente a montante (isto é, justaposto) à sequência codificante de polimerase BEV. Não há códon de parada de tradução no DNA amplificado. Este plasmídeo está presente como na Figura 9.
Plasmídeo pCR.BEV.2 [00225] A região de codificação de polimerase BEV completa foi amplificada de um clone de cDNA de comprimento total codificando-a, empregando-se os iniciadores BEV-1 e BEV-3. O iniciador BEV-3 compreende um sítio de enzima de restrição BamHl nas posições 5 a 10, inclusive e o complemento de um sinal de parada de tradução nas posições 11 a 13. Como consequência, uma estrutura de leitura aberta compreendendo um sinal de início de tradução e sinal de parada de tradução, contidos entre os sítios de restrição Bgl II e BamHl. O fragmento amplificado foi clonado dentro de pCR2.1 (Stratagene) para produzir o plasmídeo pCR2.BEV.2 (Figura 10).
Plasmídeo pCR.BEV.3 [00226] Um gene estrutural de polimerase BEV não traduzível foi amplificado de um clone de cDNA de polimerase BEV de comprimento total, empregando-se os iniciadores de amplificaçãoBEV-3 e BEV-4. O iniciador BEV-4 compreende um sítio de clonagem Bgfll nas posições 5-10 e as sequências a jusante deste sítio BglII são homólogas às sequências de nucleotídeos do gene de polimerase BEV. Não há códon de partida ATG funcional no produto DNA amplificado dos iniciadores BEV-3 e BEV-4. A polimerase BEV é expressa como parte de uma poliproteína e, como consequência, não há sítio de partida de tradução ATG neste gene. O DNA amplificado foi clonado dentro do plasmídeo pCR2.1 (Stratagene) para produzir o plasmídeo pCR.BEV.3 (Figura 11).
Plasmídeo pCMV.EGFP.BEV2 [00227] O plasmídeo pCMV.EGFP.BEV2 (Figura 12) foi produzido clonando-se a sequência de polimerase BEV de pCR.BEV.2 como um fragmento BglII/BamHI dentro do sítio BamHl de pCMV.EGFP. 4. Plasmídeos de Controle Plasmídeo pCMV.BEV.2 [00228] O plasmídeo pCMV.BEV.2 (Figura 13) é capaz de expressar a inteira estrutura de leitura aberta de polimerase BEV sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Para produzir pCMV.BEV.2, a sequência de polimerase BEV de pCR.BEV.2 foi subclonada na orientação senso como um fragmento Bg/II-para-BamHI dentro de pCMV.cass Bg/II/BamHI-digerido (Figura 2).
Plasmídeo pCMV.VEB
[00229] O plasmídeo pCMV.VEB (Figura 15) expressa um mRNA de polimerase BEV antissenso sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Para produzir o plasmídeo pCMV.VEB a sequência de polimerase BEV de pCR.BEV.2 foi subclonada na orientação antissenso como um fragmento Bg/II-paia-BamHI dentro de pCMV.cass Bg/II/BamHI-digerido (Figura 2).
[00230] O plasmídeo pCMV.BEV.GFP (Figura 16) foi construído clonando-se o fragmento GFP de pCR.Bgl-GFP-Bam como um fragmento BglII/BamHI dentro de plasmídeo pCMV.BEV.2. Este plasmídeo serve como um controle em alguns experimentos e também como uma construção intermediária.
Plasmídeo pCMV.BEV.SV40L
[00231] O plasmídeo pCMV.BEV.SV40-L (Figura 17) compreende um gene estrutural de polimerase BEV traduzível do plasmídeo pCR.BEV.2 inserido na orientação senso entre as sequências do promotor CMV-IE e promotor tardio SV40 do plasmídeo pCMV.SV40L.cass. Para produzir o plasmídeo pCMV.BEV.SV40L-O, o gene estrutural da polimerase BEV foi subclonado como um fragmento Bg/lI-a-BamHI dentro do DNA pCMV.SV40L.cass Bg/II-digerido.
Plasmídeo pCMV.O.SV40L.BEV
[00232] O plasmídeo pCMV.O.SV40L.BEV (figura 18) compreende um gene estrutural de polimerase BEV traduzível, derivado do plasmídeo pCR.BEV.2 clonado a jusante das sequências de promotor CMV-IE e promotor tardio SV40 em tandem, presentes no plasmídeo pCMV.S40L.cass. Para produzir o plasmídeo pCMV.O.SV40L.BEV, o gene estrutural de poli mera se BEV foi subclonado na orientação senso como uni fragmento BgAl-^-BamHl dentro de DNA pCMV.SV40L.cass BümHI-digerido. Plasmídeo pCMV.O.SV40L.VEB
[00233] O plasmídeo pCMV.O.SV40L.VEB (Figura 19) compreende um gene estrutural de polimerase BEV antissenso, derivado do plasmídeo pCR.BEV.2 clonado a jusante das sequências em tandem do promotor CMV-IE e promotor tardio SV40 presentes no plasmídeo pCMV.SV40L.cass, Para produzir o plasmídeo pCMV.O.SV40L.VEB, o gene estrutural de polimerase BEV foi subclonado na orientação antissenso como um fragmento Bg/II-a-BamWl dentro do DNA pCMV.SV40L.cass BcwiHl-dígerido. 5. Piasmkkos de Teste Plasmídeo pCMV.BEVx2 [00234] O plasmídeo pCMV.BEVx2 (Figura 20) compreende uma repetição direta de uma estrutura de leitura aberta de polimerase BEV sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Nas células eucarióticas pelo menos, a estrutura de leitura aberta localizada mais perto do promotor CMV-IE é traduzível. Para produzir pCMV,BEVx2, o gene estrutural da polimerase BEV do plasmídeo pCR.BEV.2 foi subclonado na orientação senso como um fragmento BgA\-&-Bam\\\ dentro de pCMV.BEV.2 digeri do, imediatamente a jusante do gene estrutural de polimerase BEV já presente ali. Plasmídeo pCMV.BEVx3 [00235] O plasmídeo pCMV.BEVx3 (Figura 21) compreende uma repetição direta de três estrutura de leitura aberta de polimerase BEV sob o controle do promotor CMV-IE. Para produzir pCMV.BEVx3, o fragmento de polimerase BEV de pCR.BEV.2 foi clonado na orientação senso como um fragmento BgiWBamHl dentro do sítio BamHl de pCMV.BEVxl, imediatamente a jusante das sequências de polimerase já presentes ali. Plasmídeo pCMV.BEVx4 [00236] O Plasmídeo pCMV.BEVx4 (Figura 22) compreende uma repetição direta de quatro estrutura de leitura aberta de polimerase BEV completa sob o controle do promotor CMV-1E. Para produzir pCMV.BEVx4, o fragmento de polimerase BEV de pCR.BEV.2 foi clonado na orientação senso como um fragmento Bg/II/BamHI dentro do sítio BamHI de pCMV.BEVx3, imediatamente a jusante das sequências de polimerase BEV já presentes ali.
Plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.BEV
[00237] O plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.BEV (Figura 23) compreende uma unidade de gene multiestrutural compreendendo dois genes estruturais de polimerase BEV colocados operável e separadamente sob o controle das sequências do promotor CMV-IE e promotor tardio SV40. Para produzir o plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.BEV, o gene estrutural de polimerase BEV traduzível presente em pCR.BEV.2 foi subclonado na orientação senso como um fragmento Bg/II-a-BamHI atrás da sequência promotora tardia SV40 presente em pCMV.BEV.SV40L-O ZtaraHI-digerido. Plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.VEB
[00238] O plasmídeo pCMV.BEV.SV40L.VEB (figura24) compreende uma unidade de gene multiestrutural compreendendo os genes estruturais da polimerase BEV colocados operável e separadamente sob o controle das sequências do promotor CMV-IE e promotor tardio SV40. Para produzir o plasmídeopCMV.BEV.SV40L.VEB, o gene estrutural da polimerase BEV traduzível de pCR.BEV.2 foi subclonado na orientação antissenso como um fragmento Bg/II-a-BamHI atrás da sequência de promotor tardio SV40 presente em pCMV.BEV.S40L-O BamHI digerido. Neste plasmídeo, o gene estrutural da polimerase BEV é expresso na orientação senso sob o controle do promotor CMV-IE para produzir um mRNA traduzível, enquanto o gene estrutural da polimerase BEV é também expresso sob o controle do promotor SV40, para produzir uma espécie de mRNA antissenso.
Plasmídeo pCMV.BEV.GFP.VEB
[00239] O plasmídeo pCMV.BEV.GFP.VEB (Figura 25) compreende uma repetição invertida de gene estrutural BEV, interrompida pela inserção de uma estrutura de leitura aberta GFP (fragmento de recheio) entre cada sequência genética estrutural BEV na repetição invertida. Para produzir o plasmídeo pCMV.BEB.GFP.VEB, o fragmento de recheio GFP de pCR.Bgl-GFP-Bam foi primeiro clonado na orientação senso como um fragmento Bg/II-a-BamHI dentro de pCMV.BEV.2 ZtaraHI-digerido para produzir um plasmídeo intermediário pCMV.BEV.GFP em que as sequências codificantes da polimerase BEV e GFP-codificantes são contidas dentro do mesmo fragmento 5’-Bg/lI-a-BamHl-3‘l. O gene estrutural de polimerase BEV de pCMV.BEV.2 foi então clonado na orientação antissenso como um fragmento Bg/11-a.-BamHI dentro de pCMV.BEV.GFP BamHI-digerido. O gene estrutural da polimerase BEV mais próximo da sequência de promotor CMV-IE do plasmídeo pCMV.BEV.GFP.VEB é capaz de ser transladada, pelo menos em células eucarióticas.
Plasmídeo pCMV.EGFP.BEV2.PFG
[00240] O plasmídeo pCMV.EGFPBEV2.PFG (Figura 26) compreende um palíndromo, interrompido pela inserção de uma sequência de polimerase BEV entre cada gene estrutural GFP da repetição invertida. Para produzir este plasmídeo, o fragmento GFP de pCR.Bgl-GFP-Bam foi clonado como um fragmento BglII/BamHI dentro do sítio BamHi de pCMV.EGFP.BEV2 na orientação antissenso relativa ao promotor CMV. Plasmídeo pCMV.BEV.SV40LR
[00241] O plasmídeo pCMV.BEV.SV40LR (Figura 27) compreende um gene estrutural consistindo da inteira estrutura de leitura aberta de polimerase BEV operável e separadamente sob controle das sequências do promotor CMV-IE oposto e promotor tardio SV40, desse modo produzindo potencialmente transcritos de polimerase BEV pelo menos de ambos filamentos do gene estrutural de polimerase BEV de comprimento total. Para produzir o plasmídeo pCMV.BEV.SV40LR, o gene estrutural de polimerase BEV traduzível presente em pCR.BEV.2 foi subclonado, como um fragmento Bg/II-a-BamHI, dentro do único sítio do plasmídeo pCMV.SV40LR.cass, de modo que a estrutura de leitura aberta BEV está presente na orientação senso relativa à sequência promotora CMV-IE.
[00242] Aqueles hábeis na técnica reconhecerão que é possível gerar um plasmídeo em que o fragmento de polimerase BEV de pCR.BEV.2 é inserido na orientação antissenso, relativa à sequência promotora CMV IE, empregando-se esta estratégia de clonagem. A presente invenção abrange tal construção de gene. EXEMPLO 2 Construções de gene compreendendo a sequência ou sequências genéticas estruturais de a-l,3-galactosiltransferase (Galt) de suíno operacionalmente conectadas à sequência promotora CMV e/ou a sequência promotora SV40L 1. Plasmídeos Comerciais Plasmídeo pcDNA3 [00243] O plasmídeo pcDNA3 é comercialmente disponível na Invitrogen e compreende o promotor CMV-IE e o terminador de transcrição BGHpA, com múltiplos sítios de clonagem para a inserção entre eles de sequências genéticas estruturais. O plasmídeo compreende ainda as origens de replicação CoIEl e fl e os genes de resistência a neomicina e resistência a ampicilina. 2. Plasmídeos intermediários Plasmídeo pcDNA3.Galt [00244] O plasmídeo pcDNA3.Galt (BresaGen Limited, South Australia, Austrália; Figura 28) é o plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen) e compreende a sequência de cDNA codificando o gene alfa-1,3-galactosiltransferase (Galt) de suíno, operacionalmente sob o controle da sequência promotora CMV-IE, de modo que é capaz de ser expresso por ela.
Para produzir o plasmídeo pcDNA3.Galt, o gene alfa-1,3-galactosiltransferase cDNA de suíno foi clonado como um fragmento EcoRl dentro do sítio de clonagem EcoRl de pcDNA3. O plasmídeo compreende ainda as origens de replicação CoIEl e fl e os genes de resistência à neomicina e ampicilina. 3. Plasmídeos de Controle Plasmídeo pCMV.Galt [00245] O plasmídeo pCMV.Galt (Figura 29) é capaz de expressar o gene estrutural Galt sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Para produzir o plasmídeo pCMV.Galt, a sequência Galt do plasmídeo pcDNA3.Galt foi extirpada como um fragmento EcoRl e clorada na orientação senso dentro do sítio EcoRl do plasmídeo pCMV.cass (Figura 2). Plasmídeo pCMV.EGFP.Galt [00246] O plasmídeo pCMV.EGFP.Galt (Figura 30) é capaz de expressar o gene estrutural Galt como um polipeptídeo de fusão Galt sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Para produzir o plasmídeo pCMV.EGFP.Galt, a sequência Galt de pCMV.Galt (Figura 29) foi extirpada como um fragmento Bg/II/BamHl e clorada dentro do sítio BamHl de pCMV.EGFP.
Plasmídeo pCMV.Galt.GFP
[00247] O plasmídeo pCMV.Galt.GFP (Figura 31) foi produzido clonando-se o cDNA de Galt como um fragmento EcoRl de pCDNA3 dentro de pCMV.EGFP Eco-RI-digerido na orientação senso. Este plasmídeo serve tanto como um controle como um intermediário de construção.
Plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.0 [00248] O plasmídeo pCMV.Galt.SV401.0 (Figura 32) compreende um gene estrutural Galt clonado a jusante do promotor CMV em pCMV.SV40L.cass. Para produzir o plasmídeo o fragmento cDNA Galt de pCMV.Galt foi clonado como um BGIII/BamHI dentro de pCMV.SV40L.cass BglII-digerido na orientação senso.
Plasmídeo pCMV.O.SV40L.tlaG
[00249] O plasmídeo pCMV.O.SV40L.tlaG (Figura 33) compreende um gene estrutural Galt clonado em uma orientação antissenso a jusante do promotor SV40L presente em pCMV.SV401.cass. Para produzir este plasmídeo o fragmento cDNA Galt de pCMV.Galt foi clonado como um BglII/BamHI dentro de pCMV.SV40L.cass BamHI-digerido na orientação antissenso.
Plasmídeo pCMV.O.SV40L.Galt [00250] O plasmídeo pCMV.O.SV40L.Gatt (Figura 34) compreende um gene estrutural Galt clonado a jusante do promotor SV40L presente em pCMV.SV40L.cass. Para produzir o plasmídeo o fragmento cDNA Galt de pCMV.Galt foi clonado como um BglII/BamHI dentro de pCMV.SV40L.cass BamHI-digerido na orientação senso. 4. Plasmídeo de Teste Plasmídeo pCMV.Galtx2 [00251] O plasmídeo pCMV.Galtx2 (Figura 35) compreende uma repetição direta de uma estrutura de leitura aberta Galt sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Pelo menos em células eucariotas, a estrutura de leitura aberta localizada mais próximo do promotor CMV-IE é traduzível. Para produzir pCMV.Galtx2, o gene estrutural Galt de pCMV.Galt foi extirpado como um fragmento Bgfll/BamRl e clonado na orientação senso dentro do sítio de clonagem BamHI de pCMV.Galt.
Plasmídeo pCMV.Galtx4 [00252] O plasmídeo pCMV.Galtx4 (Figura 36) compreende uma repetição direta quádrupla de uma estrutura de leitura aberta Galt sob o controle da sequência promotora CMV-IE. Em células eucariotas pelo menos, a estrutura de leitura aberta, localizada mais próxima do promotor CMV-IE, é traduzível. Para produzir pCMV.Galtx4, a sequência Galtx2 de pCMV.Galtx2 foi extirpada como um fragmento Bgll/BamRl e clorada na orientação senso dentro do sítio de clonagem BamHI de pCMV.Galtx2. Plasmídeo pCMV.Galt.SV401.Galt [00253] O plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.Galt (Figura 37) é projetado para expressar dois transcritos senso de Galt, um acionado pelo promotor CMV, o outro pelo promotor SV401. Para produzir o plasmídeo o fragmento cDNA Galt de pCMV.Galt foi clonado como um fragmento BglII/BamHI dentro de pCMV.O.SV40 BglII-digerido na orientação senso.
Plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.tlaG
[00254] O plasmídeo pCMV.Galt.SV40L.tlaG (Figura 3) é projetado para expressar um transcrito senso de Galt acionado pelo promotor CMV e um transcrito antissenso acionado pelo promotor SV40L. Para produzir o plasmídeo um fragmento cDNA Galt de pCMV.Galt foi clonado como um fragmento BglII/BamHI dentro de pCMV.O.SV40.talG na orientação senso. Plasmídeo pCMV.Galt.GFP.tlaG
[00255] O plasmídeo pCMV.Galt.GFP.tlaG (Figura 39) compreende um palíndromo Galt, interrompido pela inserção de uma sequência GFP entre o gene estrutural Galt na repetição invertida. Para produzir este plasmídeo o fragmento cDNA Galt BglII/BamHI de pCMV.Galt foi clonado dentro do sítio BamHI de pCMV.Galt.GFP no antissenso relativo ao promotor CMV. Plasmídeo pCMV.EGFP.Galt.PFG
[00256] O plasmídeo pCMV.EGFP.Galt.PFG (Figura 40) compreende um palíndromo GFP interrompido pela inserção de uma sequência Galt entre cada gene estrutural GFP de repetição invertida, cuja expressão é acionada pelo promotor CMV. Para produzir este plasmídeo, as sequências Galt de pCMV.Galt foram clonadas como um fragmento BGIII/BamHI dentro de pCMV.EGFP BamHI-digerido na orientação senso, para produzir o intermediário pCMV.EGFP.Galt (não mostrado); em seguida a isto mais sequências GFP de pCR.Bgl-pCMV.EGFP.Galt na orientação antissenso.
Plasmídeo pCMV.Galt.SV40LR
[00257] O plasmídeo pCMV.Galt.SV40LR (Figura 41) é projetado para expressar sequências cDNA GaIT clonadas entre os promotores CMV oposto e SV40L do cassete de expressão pCMV.SV40R.cass. Para produzir este plasmídeo sequências Galt de pCMV.Galt foram clonadas como um fragmento BglII/BamHI em pCMV.SV40LR.cass BglII-digerido na orientação senso relativa ao promotor 35S. EXEMPLO 3 Construções de gene compreendendo sequências Nia PVY operacionalmente ligadas à sequência promotora 35S e/ou sequência promotora SCBV 1: Vetor binário Plasmídeo pART27 [00258] O plasmídeo pART27 é um vetor binário, especificamente projetado para ser compatível com o cassete de expressão pART7. Ele contém origens de replicação bacterianas tanto para E.coli como Agrobacterium tumefaciens, um gene de resistência à espectinomicina para seleção bacteriana, bordas T-DNA esquerda e direita para transferência de DNA de Agrobacterium para células de planta e um cassete de resistência à canamicina para permitir a seleção de células de planta transformadas. O cassete de resistência à canamicina é localizado entre as bordas T-DNA, a pART27 também contém um único sítio de restrição Notl que permite a clonagem de construções preparadas em vetores tais como pART7 a serem clonados entre as bordas T-DNA. A construção de pART27 é descrita em Gleave, AP (1992).
[00259] Quando clonando inserções Notl dentro deste vetor, duas orientações de inserção podem ser obtidas. Em todos os seguintes exemplos a mesma orientação de inserção, relativa à direção do promotor 35S nas construções pART7 descritas, foi escolhida; Isto foi feito para minimizar quaisquer artefatos experimentais que possam surgir da comparação de diferentes construções com diferentes orientações de inserção. 2. Plasmídeos comerciais Plasmídeo pBC (KS-) [00260] O plasmídeo pBC (KS-) é comercialmente disponível na Stratagene e compreende a sequência promotora LacZ e o terminador de transcrição lacZ-alfa, com um sítio múltiplo de clonagem para a inserção nele de sequências genéticas estrutural. O plasmídeo compreende ainda as origens de replicação CoIEl e fl e um gene de resistência a cloroamfenicol. Plasmídeo pSP72 [00261] O plasmídeo pSP72 é comercialmente disponível na Promega e contém um sítio múltiplo de clonagem para a inserção nele de sequências genéticas estrutural. O plasmídeo compreende ainda a origem de replicação CoIEl e um gene de resistência a ampicilina. 3. Cassetes de Expressão Plasmídeo pART7 [00262] O plasmídeo pART7 é um cassete de expressão projetado para acionar a expressão de sequências clonadas atrás do promotor 35S. Ele contém um sítio múltiplo de clonagem para auxiliar na clonagem e uma região do terminador de sintase de octipina. O cassete de expressão 35S é flanqueado por dois sítios de restrição Not I, que permitem clonagem dentro dos vetores de expressão binários, tais como pART27 que contém um único sítio NotI. Sua construção como descrito em Gleave, AP (1992), um mapa é mostrado na Figura 43.
Plasmídeo pART7.35S.SCBV.cass [00263] O plasmídeo p35S.CMV.cass foi projetado para expressar duas sequências genéticas separadas, clonadas em um único plasmídeo. Para criar este plasmídeo, as sequências correspondendo ao terminador nos e ao promotor SCBV foram amplificadas por PCR, em seguida clonadas no sítio múltiplo de clonagem de pART7 entre o promotor 35S e OCS.
[00264] O plasmídeo resultante tem o seguinte arranjo de elementos: promotor 35S - sítio múltiplo de clonagem 1 - terminador NOS - promotor SCBV - sítio múltiplo de clonagem 2 - terminador OCS.
[00265] A expressão das sequências clonadas dentro do sítio múltiplo de clonagem 1 é controlada pelo promotor 35S, a expressão das sequências clonadas dentro do sítio múltiplo de clonagem 2 é controlada pelo promotor SCBV.
[00266] As sequências do terminador NOS foram amplificadas do plasmídeo pAHC27 (Christensen e Quail, 1996), usando-se os dois oligonucleotídeos; NOS 5’ (iniciador dianteiro; SEQID ??) 5 ’ -GGATTCCCGGGACGTCGCGAATTTCCCCCGATCGTTC-3 ’; e NOS 3’ (iniciador inverso; SEQ ID ??) 5 ’ -CCATGGCCATATAGGCCCGATCTAGTAACATAG-3 ’ [00267] Os resíduos de nucleotídeo 1 a 17 para NOS 5’ e 1 a 15 para NOS 3’ representam nucleotídeos adicionais projetados para auxiliar na preparação de construção pela adição dos sítios de restrição adicionais. Para NOS 5’, estes são BamHI, Smal, Aatll e as primeiras 4 bases de um sítio NruI, para NOS 3’ estes são sítios Ncol e Sfil. As sequências restantes para cada oligonucleotídeo são homólogas às terminações 5’ e 3’ respectivamente das sequências NOS de pAHC 27.
[00268] As sequências promotoras SCBV foram amplificadas do plasmídeo pSCBV-20 (Tzafir e outros, 1998), usando-se os dois oligonucleotídeos: SCBV 5’: 5’-CCATGGCCTATATGGCCATTCCCCACATTCAAG-3’; e SCBV 3’: 5’-AACGTTAACTTCTACCCAGTTCCAGAG-3’ [00269] Os resíduos de nucleotídeo 1 a 17 de SCBV 5’ codificam os sítios de restrição Ncol e Sfil projetados para auxiliar na preparação da construção, as sequências restantes são homólogas às sequências a montante da região promotora SCMV. Os resíduos de nucleotídeos 1 a 9 de SCBV 3’ codificam os sítios de restrição Psp10461 e Hpal projetados para auxiliar na preparação de construção, as sequências restantes são homólogas ao reverso e complemento de sequências próximo do sítio de iniciação de transcrição de SCBV.
[00270] Sequências amplificadas de pScBV-20 usando PCR e clonadas dentro de pCR2.1 (Invitrogen) para produzir pCR.NOS e pCR.SCBV respectivamente. Pequenos pCR.NOS de corte I/Sfil e pCR.SCBV de corte Sfil/Hpal foram ligados em pART7 corte I e um plasmídeo com uma orientação adequada foi escolhido e designado pART7.35S.SCBV.cass, um mapa desta construção sendo mostrado na Figura 43.
4. Construções Intermediárias Plasmídeo pBC.PVY
[00271] Uma região do genoma PVY foi amplificada por PCR usando-se RNA transcrito-inverso isolado de tabaco PVY-infectado como um gabarito usando-se protocolos padrão e clorada dentro do plasmídeo pGEM 3 (Stratagene), para criar pGEM.PVY. Um fragmento SalI/HindIII de pGEM.PVY, correspondendo às posições de fragmento SalI/HindIII 15362270 da sequência O da cepa PVY (Acc. No. D12539, Genbank) foi então subclonado dentro do plasmídeo pBC (Stratagene Inc.) para criar pBC.PVY (Figura 44).
Plasmídeo pSP72.PVY
[00272] O plasmídeo pSP72.PVY foi preparado inserindo-se um fragmento EcoRI/Sall de pBC.PVY dentro de pSP72 cortado EcoRI/Sall (Promega). Esta construção contém sítios de restrição adicionais flanqueando a inserção PVY, que foram usados para auxiliar nas subsequentes manipulações. Um mapa desta construção é mostrado na Figura 45. Plasmídeo ClapBC.PVY
[00273] O plasmídeo Cia pBC.PVY foi preparado inserindo-se um fragmento Clal/Sall de pSP72.PVY dentro de Clal/Sal cutpBC (Stratagene). Esta construção contém sítios de restrição adicionais flanqueando a inserção PVY que foram usados para auxiliar nas subsequentes manipulações. Um mapa desta construção é mostrado na Figura 46.
Plasmídeo pBC.PVYx2 [00274] O plasmídeo pBC.PVYx2 contém duas repetições diretas cabeça-com-cauda das sequências PVY derivadas de pBC.PVY. O plasmídeo foi gerado pela clonagem de um fragmento Accl/Clal PVY de pSP72.PVY dentro de Accl cutpBC.PVY e é mostrado na Figura 47.
Plasmídeo pSP72.PVYx2 [00275] O plasmídeo pSP72.PVYx2 contém duas repetições diretas cabeça-com-cauda das sequências PVY derivadas de pBC.PVY. O plasmídeo foi gerado pela clonagem de um fragmento Accl/Clal PVY de pBc.PVY dentro de Accl cutpSP72.PVY e é mostrado na Figura 48.
Plasmídeo pBC.PVYx3 [00276] O plasmídeo pBC.PVYx3 contém três repetições diretas cabeça-com-cauda das sequências PVY derivadas de pBC.PVY. O plasmídeo foi preparado pela clonagem de um fragmento Accl/Clal PVY de pSP72.PVY dentro de Accl cutpBC.PVYx2 e é mostrado na Figura 49.
Plasmídeo pBC.PVYx4 [00277] O plasmídeo pBC.PVYx4 contém quatro repetições diretas cabeça-com-cauda das sequências PVY derivadas de pBC.PVY. O plasmídeo foi gerado pela clonagem da repetição direta das sequências PVY de pSP72.PVYx2 como um fragmento Accl/Clal dentro de Accl cutpBC.PVYx2 e é mostrado na Figura 50.
Plasmídeo pBC.PVY.LNYV
[00278] Todas as tentativas para criar palíndromos diretos das sequências PVY falharam, presumivelmente tais arranjos de sequência sendo instáveis em hospedeiros de clonagem E. coli coniumente usados. Os palíndromos interrompidos, entretanto, provaram-se estáveis.
[00279] Para criar palíndromos interrompidos das sequências PVY um fragmento de “recheio” de aproximadamente 360 pb foi inserido dentro de Cia pBV.PVY a jusante das sequências de PVY. O fragmento de recheio foi produzido como segue: [00280] Um clone obtido inicialmente de uma coleção de cDNA, preparado de RN A genômieo do vírus amarela nc erótico da alface (LNYV) (Deitzgen e outros, 1989), sabido conter o gene 4b do vírus, foi amplificado por PCR usando-se os iniciadores: LNYV 1: S^ATGGGATCCGTTATGCCAAGAAGAAGGA-S’; e LNYV 2: 5 ’ -TGTGGATCCCTAACGGACCCGATG-3 ’ [00281] Os primeiros 9 nucleotídeos destes iniciadores codificam um sítio BamHI, os nucleotídeos restantes são homólogos às sequências do gene LNYV 4b.
[00282] Em seguida à amplificação, o fragmento foi clonado dentro do sítio EcoRI de p€R2.1 (Stratagene). Este fragmento EcoRI foi clonado dentro do sítio EcoRI de Cia pBC.PVY para criar o plasmídeo intermediário pBC.PVY.LNYV, que é mostrado na Figura 51.
Plasmídeo pBC.PVYXNYV.PVY
[00283] O plasmídeo pBC.PVYXNYV.YVP contém uma repetição direta interrompida das sequências PVY, Para criar este plasmídeo, um fragmento Hpal/HincII de pSP72 foi clonado dentro de pBC.PVY.LNYV Smal-digerido e um plasmídeo comendo a orientação senso isolado, um mapa desta construção sendo mostrado na Figura 52.
Plasmídeo pBC.PVYXNYV.YVPA
[00284] O plasmídeo pBV.PVY.LNYV.YVPA contém um palíndromo interrompido parcial das sequências PVY. Um braço do palíndromo contém todas as sequências PVY de pBC.PVY, o outro braço contém parte das sequências de PVY, correspondendo às sequências entre os sítios EcoRV e HincII de pSP72.PVY. Para criar este plasmídeo, um fragmento EcoRV/HincII de pSP72.PVY foi clonado dentro de pBC.PVY.LNYV Smal-digerido e um plasmídeo contendo a desejada orientação isolado, um mapa desta construção sendo mostrado na Figura 53.
Plasmídeo pBC.PYY.LNYV.YYP
[00285] O plasmídeo pBC.PVY.LNYV.YVP contém um palíndromo interrompido de sequências PVY. Para criar este plasmídeo, um fragmento Hpal/Hincll de pSP72. foi clonado dentro de pBC.PVY.LNYV Smal-digerido e um plasmídeo contendo a orientação antissenso isolado, um mapa desta construção sendo mostrado na Figura 54.
5. Plasmídeos de controle Plasmídeos pART7.PVY & pART7.PVY
[00286] O plasmídeo pART7.PVY (Figura 55) foi projetado para expressar sequências PVY acionadas pelo promotor 35S. Este plasmídeo serve como uma construção de controle nestes experimentos, em relação à qual todas as outras construções foram comparadas. Para gerar este plasmídeo, um fragmento Clal/Accl de ClapBC.PVY foi clonado na pART7 Clal-digerida e um plasmídeo com esperado expressar uma sequência PVY senso com respeito ao genoma PVY foi selecionado. As sequências consistindo do promotor 35S, sequências PVY e o terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27 Notl-digerida, um plasmídeo com a orientação de inserção desejada tendo sido selecionado e designado pART27.
Plasmídeos pART7.35S.PVY.SCBV.O & pART27.35S.PVY.SCBV.O
[00287] O plasmídeo pART7.35S.PVY.SCBV.O (Figura 56) foi projetado para atuar como um controle para co-expressão de múltiplas construções de um único plasmídeo em plantas transgênicas. O promotor 35S foi projetado para expressar as sequências senso PVY, enquanto o promotor SCBV estava vazio. Para gerar este plasmídeo, o fragmento PVY de Cia pBC.PVY foi clonado como um fragmento Xhol/EcoRl dentro de pART7.35S.SCBV.cass Xhol/EcoRl-digerido, para criar p35S.PVY.SCBV>0. As sequências consistindo do promotor 35S acionando as sequências PVY senso, do terminador NOS e do promotor SCBV e terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl e clonadas dentro da pART27, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção foi isolado e designado pART27.35S.PVY.SCBV.O.
Plasmídeos pART7.35S.O.SCBV.PVY & pART27.35S.O.SCBV.PVY
[00288] O plasmídeo pART7.35S.O.SCBV.PVY (Figura 57) foi projetado para atuar como um controle adicional para co-expressão de múltiplas construções de um único plasmídeo em plantas transgênicas. Não foram clonadas sequências expressíveis atrás do promotor 35S, enquanto o promotor SCBV acionou a expressão de um fragmento senso PVY. Para gerar este plasmídeo, o fragmento PVY de Cia pBC.PVY foi clonado como um fragmento Clal dentro do pART7.35S.SCBV.cass Clal-digerido, um plasmídeo contendo sequências PVY em uma orientação senso foi isolado e designado p35S.O.S.SCBV.PVY. Sequências, consistindo do promotor 35S e terminador NOS, as sequências PVY senso acionando o promotor SCBV e o terminador OCS foram extirpados como um fragmento Notl e clonados dentro de pART27, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção foi isolado e designado pART27.35S.O.SCBV.PVY.
Plasmídeos pART7.35S.O.SCBV.YVP & pART7.35S.O.SCBV.YVP
[00289] O plasmídeo pART7.35S.O.SCBV.YVP (Figura 58) foi projetado para atuar como um controle adicional para co-expressão de múltiplas construções de um único plasmídeo em plantas transgênicas. Não foram clonadas sequências expressíveis atrás do promotor 35S, enquanto o promotor SCBV acionou a expressão de um fragmento antissenso PVY. Para gerar este plasmídeo, o fragmento PVY de Cia pBC.PVY foi clonado como um fragmento Clal dentro do p35S.SCBV.cass Clal-digerido, um plasmídeo contendo sequências PCY em uma orientação antissenso foi isolado e designado p35S.O.SCBV.YVP. Sequências consistindo do promotor 35S e terminador NOS, as sequências PVY senso acionando promotor SCBV e o terminador OCS foram extirpados como um fragmento Notl e clonados dentro de pART27, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido isolado e designado pART27.35S.O.SCBV.YVP. 6. Plasmídeos de teste Plasmídeos pART7.PVYx2 & pART27.PVYx2 [00290] O plasmídeo pART7.PVYx2 (Figura 59) foi projetado para expressar uma repetição direta das sequências PVY acionadas pelo promotor 35S de plantas transgênicas. Para gerar este plasmídeo, repetições diretas de pBC.PVYx2 foram clonadas como um fragmento Xhol/BamHI dentro de Xhol/BamHI cut pART7. Sequências consistindo do promotor 35S, repetições diretas de PVY e do terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl de pART7.PVYx2 e clonadas dentro de pART27 Notl-digerido, um plasmídeo com a desejada orientação tendo sido selecionado e designado pART27.PVYx2.
Plasmídeos pART7.PVYx3 & pART27.PVYx3 [00291] O plasmídeo pART7.PVYx3 (Figura 60) foi projetado para expressar uma repetição direta das três sequências PVY acionadas pelo promotor 35S em plantas transgênicas. Para gerar este plasmídeo, repetições diretas de pBC.PVYx3 foram clonadas como um fragmento Xhol/BamHI dentro de Xhol/BamHI cut pART7. Sequências consistindo do promotor 35S, repetições diretas de PVY e terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl de pART.PVYx3 e clonadas dentro de pART27 Notl-digerido, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido selecionado e designado pART27.PVYx3.
Plasmídeos pART7.PVYx4 & pART27.PVYx4 [00292J O plasmídeo pART7.PVYx4 (Figura 61) foi projetado para expressar uma repetição direta das quatro sequências PVY acionadas pelo promotor 35S em plantas transgênicas. Para gerar este plasmídeo, repetições diretas de pBC.PVYx4 foram elonadas como um fragmento Xhol/BamHI dentro de Xhol/BamHI cut pART7. Sequências consistindo do promotor 35S, repetições diretas de PVY e terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl de pART7.PVYx3 e elonadas dentro de pART27 Notl-digerídü, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido selecionado e designado pART27.PVYx3.
Plasmídeos pART7.PVY.LNYV.PVY & pART27.PVY.LNYV.PVY
[00293] O plasmídeo pART7.PVY.LNYV.PVY (Figura 62) foi designado para expressar a repetição direta das sequências PVY acionadas pelo promotor 35S em plantas transgênicas. Esta construção foi preparada clonando-se a repetição direta interrompida de PVY de pBC.PVY.LNYV.PVY como um fragmento Xhol/Xbal dentro de pART7 digerida com Xhol/Xbal. Sequências consistindo do promotor 35S, repetições diretas interrompidas de PVY e terminador OCS foram extirpadas pART.PVY.LNYV.PVY como um fragmento Notl e elonadas dentro de pART27 Notl-digerido, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido selecionado e designado pART27.PVY.LNYV.PVY.
Plasmídeos pART7.PVY.LNYV. YVPA & pART27.PVY.LNYV. YVPA
[00294] O plasmídeo pART7.PVY.LNYV.YVPA (Figura 63) foi projetado para expressar o palíndromo interrompido parcial das sequências PVY acionadas pelo promotor 35S em, plantas transgênicas. Esta construção foi preparada clonando-se o palíndromo interrompido parcial das sequências PVY de pBC.PVY.LNYV.YVPA como um fragmento Xhol/Xbal dentro da pART7 digerida com Xhol/Xbal. As sequências consistindo do promotor 35S, do palíndromo interrompido parcial das sequências PVY e do terminador OCS foram extirpadas do pART7.PVY.LNYV.YVPA como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27 Notl-digerido, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido selecionado e designado pART7.PVY.LNYV.YVP.
Plasmídeos pART7.PVY.LNYV.YVP & pART27.PVY.LNYV.YVP
[00295] O plasmídeo pART7.PVY.LNYV.YVP (Figura 64) foi projetado para expressar o palíndromo interrompido das sequências PVY acionadas pelo promotor 35S em plantas transgênicas. Esta construção foi preparada clonando-se o palíndromo interrompido das sequências PVY de pBC.PVY.LNYV.YVPA como um fragmento Xhol/Xbal dentro de pART7 digerido com Xhol/Xbal. Sequências consistindo do promotor 35S, do palíndromo interrompido das sequências PVY e do terminador OCS foram extirpadas de pART7.PVY.LNYV.YVP como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido selecionado e designado pART27.PVY.LNYV.YVP.
Plasmídeos pART7.35s.PVY.SCBV.YVP & pART27.35S.PVY. SCBV. YVP
[00296] O plasmídeo pART7.35S.PVY.SCBV.YVP (Figura 65) foi projetado para coexpressar construções senso e antissenso em plantas transgênicas. Para gerar este plasmídeo, o fragmento PVY de Cia pBC.PVY foi clonado como um fragmento Xhol/EcoRI dentro de p35S.SCBV.O.SCBV.YVP xhol/EcoRI-digerido. Sequências, consistindo das sequências PVY senso de acionamento de promotor, do terminador NOS, do PVY antissenso de acionamento do promotor SCBV e do terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27, um plasmídeo com a desejada orientação de inserção tendo sido isolado e designado pART27.35S.PVY.SCBV.YVP.
Plasmídeos pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 & pART27.35S. PVYx3.SCBV.YVPx3 [00297] O plasmídeo pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 (Figura 66) foi projetado para coexpressar repetições senso e antissenso de plantas transgênicas. Para gerar este plasmídeo, o pART7.35S.O.SCBV.YVPx3 intermediário foi construído clonando-se a repetição PVY direta tripla de ClapBC.PVYx3 como um fragmento Clal/Accl dentro de p35S.SCBV.cass Cla-digerido e isolando-se um plasmídeo com uma orientação antissenso. Para p35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 a repetição PVY direta tripla de Cia pBC.PVYx3 foi clorada como um fragmento Kpnl/Smal dentro de p35S.O.SCBV.YVPx3 Kpnl/Smal-digerido para criar p35S.PVYx3.SCBV.YVPx3. Sequências incluindo tanto promotores, terminadores e repetições PVY diretas foram isoladas como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27. Um plasmídeo com uma apropriada orientação foi escolhido e designado pART27.35S.PVYx3.SCBV.
Plasmídeos pART7.PVYx3LNYV.YVPX3 & pART27.PVYX3. LNYV.YVPx3 [00298] O plasmídeo pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3 (Figura 67) foi projetado para expressar triplas repetições de sequências PVY como um palíndromo interrompido. Para gerar este plasmídeo foi construído um pART7x3.PVY.LNYV.YV intermediário pela clonagem de um fragmento PVY.LNYV.YVP de pBC.PBY.LNYV.YVP como um fragmento Accl/Clal dentro do plasmídeo pART7.PVYx2. pART7.35S.PVYx3.LNYV.YVPx3 foi feito clonando-se uma repetição direta PVY adicional de pBC.PVYx2 como um fragmento Accl/Clal dentro de pART7x3.PVY.LNYV.YVP. Sequências de pART7.35S.PVYx3.LNYV.YVPx3, incluindo o promotor 35S, todas as sequências PVY e o terminador OCS foram extirpadas como um fragmento Notl e clonadas dentro de pART27 Notl-digerido, um plasmídeo com uma apropriada orientação tendo sido escolhido e designado pART27.35S.PVYx3.LNYV.
Plasmídeos pART7.PVY multi & pART27.PVY multi [00299] O plasmídeo pART7.35S.PVY multi (Figura 68) foi designado para expressar repetições diretas de ordem mais elevada de regiões de sequências PVY de plantas transgênicas. Repetições diretas de ordem mais elevada de 72 PB da região Nia PVY de PVY foram preparadas recozendo-se dois oligonucleotídeos parcialmente complementares como segue: PVY1: 5 ’ -TAATGAGGATGATGTCCCTACCTTTAATTGGC AGAAATTT CTGTGGAAAGACAGGGAAATCTTTCGGCATT-3’; e PVY2: 5 ’ -TTCTGCC AATTAAAGGTAGGGAC ATC ATCCTC ATTAAAAT GCCGAAAGATTTCCCTGTCTTTCCACAGAAT-3 [00300] Os oligonucleotídeos foram fosforilados com T4 polinucleotídeo cinase, aquecidos e esfriados lentamente para permitir auto-cozimento, ligados com ligase T4 DNA, enchidos no final com polimerase Klenow e clonados dentro de pCR2.1 (Invitrogen). Plasmídeos contendo múltiplas repetições foram isolados e as sequências foram clonadas como fragmentos EcoRI em uma orientação senso dentro de pART7 EcoRI-digerido, para criar pART7.PVY multi intermediário. Para criar pART27.PVY multi, o promotor 35S, sequências PVY e o terminador foram extirpados como um fragmento Notl e clonados dentro de pART27 Notl-digerido. Um plasmídeo com uma apropriada orientação de inserção foi isolado e designado pART27.PVY multi. EXEMPLO 6 Inativação da expressão de gene de vírus em mamíferos [00301] As linhagens imunes são criadas expressando-se as sequências virais em linhagens de células estavelmente transformadas.
[00302] Em particular, os vírus líticos são usados para esta abordagem uma vez que a lise celular fornece triagens muito simples e também oferece a capacidade de diretamente selecionar eventos potencialmente raros que poderíam criar imunidade viral. Os fragmentos subgenômicos derivados de um vírus de RNA de filamento único simples (enterovírus bovino - BEV) ou um vírus de DNA de filamento duplo complexo, Vírus do Herpes Simples I (HSV I) são clonados dentro de um vetor adequado e expressos em células transformadas. As linhagens de células de mamíferos são transformadas com construções de gene projetadas para expressar sequências virais acionadas pelo forte promotor citomegalovírus (CMV-IE). As sequências utilizadas incluem genes de replicase virais específicos. As coleções “de ataque” aleatórias, compreendendo sequências genéticas virais representativas, podem também ser usadas e a molécula de ácido nucleico dispersa introduzida, para alvejar a expressão das sequências de vírus.
[00303] Construções de gene exemplificativas para uso neste procedimento, compreendendo sequências de nucleotídeo derivadas do gene polimerase de RNA BEV-dependentes, são aqui apresentadas.
Para construções de polimerase viral, grandes números (aproximadamente 100) das linhagens de células transformadas são geradas e infectadas com o respectivo vírus. Para células transformadas com biblioteca shotgun, números muito grandes (centenas) de linhagens transformadas são gerados e triados em massa para imunidade viral. Em seguida à prova do vírus, linhagens celulares resistentes são selecionadas e analisadas ainda para determinar as sequências conferindo imunidade a elas.
[00304] As linhagens de células resistentes são aprobativas da capacidade das sequências de nucleotídeos introduzidas para inativar a expressão de gene viral inativa em um sistema mamífero.
[00305] Adicionalmente, as linhagens resistentes obtidas de tais experimentos são usadas para mais precisamente definir as características moleculares e bioquímicas da modulação que é observada. EXEMPLO 8 Indução da resistência do vírus em plantas transgênicas [00306] Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404, foi transformada independentemente com as construções pART27,PVY, pART27.PVYx2, p ART27. P V Yx 3, pART27.PVYx4, pART27.PVY.LNYV.PVY, pART27.PVY.LNYV.YVPA, pART27. PVY.LNYV.YVP, pART27.35s.PVY.SCBV.O, pART27.35S.O.SCBV. PVY, pART27.35S.O.SCBV.YVP, pART27.35S.PVY.SCBV.YVP, pART27.35S.PVYx3.SCBV.YPVx3, pART27.PVYx3.LNYV.YVPx3 e pART27,PVYx10, usando-se uniões tri-parentais. As mini-preps DNA destas cepas foram preparadas e examinadas por restrição com Notl para assegurar que elas contivessem os apropriados vetores binários.
[00307] Nkotiami tabaccum (cultivar W38) foram transformados com estas cepas Agrobacterium empregando-se procedimentos padrão. Rebentos transformados putativos foram extirpados e enraizados em meios contendo canamicina. Sob estas condições, observamos consistentemente que somente rebentos transgênicos enraizarão em pratos de canamicina. Rebentos enraizados foram transferidos para o solo e permitidos estabelecerem-se. Após duas ou três semanas, vigorosas plantas com pelo menos três conjuntos de folhas foram escolhidas e infectadas com PVY, [00308J Inóculo viral foi preparado de tabaco W38 previamente infectado com o vírus, aproximadamente 2 g de material de folha, apresentando sintomas virais óbvios, foram moídos com carborundum em 10 ml de tampão de fosfato Na 100 mM (pll 7,5). O inóculo foi diluído a 200 ml com tampão de fosfato Na adicional. Duas folhas de cada planta transgênica foram borrifadas com carborundum, em seguida 0,4 ml de inóculo foram aplicados a cada folha e as folhas esfregadas razoavelmente com vigor com os dedos. Empregando-se este procedimento, 100% de plantas de controle não-transgênicas foram infectados com PVY.
[00309] Para ensaiar quanto à resistência e imunidade viral as plantas transgênicas são monitoradas quanto ao desenvolvimento de sintoma, A cepa PVY (PVY-d, um isolado PVY australiano) fornece óbvios sintomas no tabaco W38, um sintoma de limpeza de nervura é prontamente observado nas duas folhas acima das folhas inoculadas, as folhas subsequentes mostrando lesões cloróticas uniformes. O desenvolvimento sintomático foi monitorado durante um período de seis semanas.
[00310] As linhagens transgênicas foram descritas como resistentes se elas mostrassem reduzidos sintomas virais, que se manifestam como uma redução da folha mostrando lesões cloróticas. As faixas de resistência de resistência muito forte, onde somente algumas lesões virais são observadas em uma planta, a fraca resistência, que se manifesta como sintomas reduzidos sobre as folhas que se desenvolvem tarde no crescimento da planta.
[00311] As plantas transgênicas que não apresentaram absolutamente evidência de sintomas virais foram classificadas como imunes. Para assegurar que estas plantas eram imunes, elas foram reinoculadas com vírus, a maioria das plantas permaneceu imune, as poucas que apresentaram sintomas foram reclassificadas como resistentes.
[00312] Para as linhagens de planta geradas manchas do Sul são realizadas, a resistência nas gerações subsequentes sendo monitorada para determinar que resistência/imunidade é transmissível. Adicionalmente, a amplitude da resistência viral é monitorada por linhagens de prova com outras cepas PVY, para determinar se a susceptibilidade de faixa de hospedeiro é modificada.
[00313] Os resultados destes experimentos são descritos na Tabela 2. Estes dados indicam que as construções compreendendo repetições em tandem da sequência genética alvo, na configuração de palíndromos, palíndromos interrompidos como sequências de repetição direta, são capazes de conferir resistência viral e/ou imunidade nas plantas transgênicas.
[00314] Portanto, tais sequências de repetição invertida e/ou direta modulam a expressão do gene alvo do vírus da planta transgênica.
[00315] As construções combinando o uso de sequências de repetição direta e invertida, isto é, pART27.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3 e pART27.PVYx3.LNYV.YVPx3, são também úteis na modulação da expressão de gene. EXEMPLO 9 Inativação de Galt em células animais [00316] Para ensaiar para inativação Galt, células PK2 porcinas foram transformadas com as construções pertinentes. As células PK2 constitutivamente expressam a enzima Galt, cuja atividade resulta na adição de uma variedade de grupos a-l,3-galactosila a uma faixa de proteínas expressas na superfície de célula destas células. As células foram transformadas usando-se lipofectina e linhagens estavelmente transformadas foram selecionadas usando-se genetecina.
[00317] Como um ensaio inicial, linhagens de células foram sondadas quanto à presença do epítopo Galt-codificado, isto é, metades a-1,3-galactosila decorando as proteínas de superfície de célula, empregando-se a lectina IB4. A ligação de IB4 foi ensaiada in situ ou por classificação FACS.
[00318] Para ligação in situ, as células foram fixadas em suportes sólidos com metanol frio por 5min, as células foram ensaiadas em PBS (solução salina tamponada com fosfato). As células fixas foram sondadas usando-se 20 μg/ml IB4-biotina (Sigma) em 1% BSA,PBS por 30min em temperatura ambiente, as células foram lavadas em PBS em seguida sondadas com uma diluição 1:200 de ExtrAvidin-FITC (Sigma) em PBS por 30 min, seguido por mais enxágues em PBS. As células foram então examinadas usando-se microscopia de fluorescência, sob estas condições a superfície externa das células de controle PK2 uniformemente manchadas verde.
[00319] Para análise FACS, as células foram ressuspensas após tratamento com tripsina, lavadas em HBSS/Hepes (solução salina tamponada com Hank com Hepes 20 mM, pH 7,4) e sondadas com 10 um/ml de IB4-biotina (Sigma) em HBSS/Hepes por 45 minutos a 4o C. As células foram lavadas em HBSS/Hepes, sondadas com uma diluição 1:200 de ExtrAvidin-FITC (Sigma) em HBSS/Hepes por 45 minutos a 4oC e enxaguadas em HBSS/Hepes frio antes da classificação FACS.
[00320] Empregando-se esta abordagem, as linhagens de células transformadas são ensaiadas quanto à inativação Galt e a avaliação quantitativa da eficácia da construção é determinada. Além disso, as linhagens de células mostrando inativação Galt são isoladas e submetidas a mais análises moleculares para determinar o mecanismo de inativação de gene.
REFERÊNCIAS 1. An e outros (1985) EMBO J 4:277-284. 2. Armstrong e outros Plant Cell Reports 9:335-339, 1990. 3. Ausubel, F.M. e outros (1987) em: Current Protocols in Molecular Biologia,Wiley Interscience (ISBN 047140338). 4. Chalfie, M. e outros (1994) Science 263: 802-805. 5. Christensen, A.H. e Quail, P.H. (1996) Transgenic Research 5: 213-218 6. Christou, P. e outros Plant Physiol 87: 671-674, 1988 7. Cormack,B. e outros (1996) Gene 173: 33-38. 8. Crossway e outros, Mol. Gen. Genet. 202; 179-185, 1986. 9. Dorer, D.R., e Henikoff, S. (1994) Cell 7: 993-1002. 10. Fromm e outros. Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82:5824-5828, 1985. 11. Gleave, A.P. (1992) Plant Molecular Biology 20:1203-1207. 12. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166: 557-560 13. Herrera-Estella e outros, Nature 303: 209-213, 1983a. 14. Herrera-Estella e outros, EMBO J.2: 987-995, 1983b. 15. Herrera-Estella e outros em: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press,N.Y., págs.63-93, 1985. 16. Inouye, S. e Tsuji, F.I. (1994) FEBS Letts. 341: 277-280. 17. Jackson, IJ. (1995) Ann. Rev.Genet. 28: 189-217. 18. Krens, F.A. e outros, Nature 296: 72-74, 1982. 19. Kwon, B.S. e outros (1988) Biochem., Biophys. Res. Comm. 153: 13011309 20. Pal-Bhadra, M. e outros (1997) Cell 90: 479-490 21. Paszkowski e outros, EMBO J. 3:2717-2722, 1984 22. Prasher, D.C.e outros (1992) Gene 111: 229-233. 23. Sanford, J.C. e outros, Particulate Science and Technology 5: 27-37, 1987.
REIVINDICAÇÕES

Claims (11)

1. Processo para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo, dito método caracterizado pelo fato de compreender: (i) selecionar uma molécula de DNA de dupla fita exógena que compreende cópias múltiplas de uma sequência de nucleotídeo maior que 20 nucleotídeos que é idêntica à sequência de nucleotídeo do gene alvo ou uma região da mesma, em que as cópias múltiplas são apresentadas como uma sequência palindrômica interrompida, de modo que uma das cópias está em uma orientação senso e a outra está em uma orientação antissenso com as duas cópias sendo separadas por um fragmento síuffer; (íi) produzir um gene sintético compreendendo dita molécula de DNA de dupla fita exógena sob o controle de uma única sequência promotora; (iii) introduzir dito gene sintético dentro de uma célula de planta;e (iv) expressar dito gene sintético na dita célula de planta,
2. Processo de acordo com a reivindicação I, caracterizado pelo fato de que reprimir, retardar ou outro modo de reduzir a expressão de um gene alvo ser pelo menos parcial mente pós-transericional.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as cópias múltiplas são de uma sequência de nucleotídeo compreendendo 100 nucleotídeos.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de tabaco.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene alvo é endógeno à célula.
6. Processo de acordo com. qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o gene alvo é nao-endógeno à célula.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do gene alvo ser derivado do genoma de um patógeno de uma célula ou um organismo compreendendo a dita célula.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do patógeno ser um vírus.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a tradução do produto de transcrição de mRNA de dito gene alvo é reduzida ou retardada.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o transcrito de mRNA do gene alvo é degradado de maneira sequência-específica por um sistema endógeno da célula hospedeira.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o fragmento stuffer é de 10 a 500 nucleotídeos em comprimento.
BRPI9908967A 1998-03-20 1999-03-19 processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta BRPI9908967B1 (pt)

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