CN104388463B - 黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默***及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默***CMV‑ZMBJ VIGS，以分离自田间自然侵染玉米的CMV‑ZMBJ分离物病毒粒子RNA为材料，经RT‑PCR扩增其基因组RNA1、RNA2和RNA3的全长cDNA，连入pCass‑Rz等植物双元表达载体，经转化农杆菌后具有侵染性，成功构建得到CMV‑ZMBJ侵染性cDNA克隆pCMV101、pCMV201和pCMV301。本发明构建的CMV‑ZMBJ VIGS***适用于多种植物基因功能的研究，仅需要将待研究植物基因的部分片段***载体即可用于基因的沉默，本发明方法简便、快速、高效、低成本、不需遗传转化。另外，CMV‑ZMBJ VIGS载体可用于玉米基因功能的研究，比现在常用于玉米基因功能研究的BMV VIGS载体适用寄主范围更广泛，不仅适用于Va35，也适用于B73、郑58、Mo17等玉米。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默***及其应用。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)作为一种有效的反向遗传学技术已广泛应用于植物基因功能的研究中，其作用原理是植物在抵御病毒侵染时会启动RNA沉默(RNA silencing)机制。植物体内的Dicer-like protein4可以识别病毒复制过程中产生dsRNA，并将其切割成21-24nt的siRNAs(small interfering RNAs)，siRNAs中的一条链与Agronaute(AGO)等蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA inducedsilencing complex,RISC)，并特异的与同源的靶标mRNA结合最终导致靶标mRNA的降解，这一过程即病毒诱导的基因沉默(VIGS)(Waterhouse and Fusaro,2006；Ding and Voinnet,2007)。同样的，如果将寄主植物基因的片段克隆到病毒VIGS载体中，当寄主植物通过RNA沉默引起防御反应时，相应的寄主基因也会被沉默(Baulcombe，1999)。
玉米(Zea mays)是在全世界范围内广泛种植的禾本科作物，是重要的粮食作物之一。2012年，我国玉米总产量达208,234,649.00吨，远远超过了水稻和小麦产量(205,985,229.00吨和120,583,200.00吨)(Food and Agriculture Organization of the UnitedNations,FAO2012)，成为我国产量最高的粮食作物。随着工业经济的增长，玉米不仅是饲喂牲畜的主要原料，在生产酒精、蔗糖和淀粉等工业原料方面发挥着越来越重要的作用。因此，一种有效的研究玉米基因的工具，对于了解玉米基因生物学功能、玉米抗逆境胁迫机制、抗感病机理和增加玉米产量具有非常重要的意义。
迄今为止，已经报道了雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)改造而成的VIGS载体可以用于沉默玉米等单子叶植物的基因。但是，BMV载体在研究玉米等单子叶植物基因功能方面存在很多的局限性。一方面，BMV侵染玉米植株时会引起严重的花叶或局部细胞坏死症状(Ding et al.,2006)，这会干扰后期对于玉米植株性状的观察；另一方面，BMV的侵染寄主十分有限，现报道BMV仅能侵染大麦和某些生态型的玉米(如Va35)(Ding et al.,2001)；再者，BMV的侵染对高温敏感，只有在低温下BMV才能侵染玉米(Ding et al.,1999)。因此，需要找到一种新的使用于玉米等单子叶基因功能研究的VIGS载体。
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)与BMV同属雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)，是黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员(King et al.,2012)。通过血清学和核酸序列分析，CMV的分离物可以分成I亚组(包含亚组IA和IB)和II亚组两个亚组，其中首次在我国发现、鉴定并分离获得田间自然侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ属于I亚组中的IB亚组(Wang et al.,2013)。CMV-ZMBJ在玉米上引起轻微花叶症状。尽管CMV已被改造成VIGS载体，并成功应用于大豆和金鱼草等植物中(Nagamatsu et al.,2007；Kim et al.,2011)，但没有成功应用于玉米，也没有CMV用于沉默玉米基因的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种既适用于本生烟等双子叶植物又适用于玉米等单子叶植物基因功能研究的VIGS载体。
为了实现本发明目的，本发明提供一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默***CMV-ZMBJ VIGS，由质粒pCMV2-2bN81-A、质粒pCMV101和质粒pCMV301组成。
其中，质粒pCMV101是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ(Wang et al.,Journal of Phytopathology,2013,161:880-883)的RNA1为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz等植物双元表达载体上构建得到的。
质粒pCMV301是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ的RNA3为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz等植物双元表达载体上构建得到的。
质粒pCMV2-2bN81-A是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ的RNA2为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz等植物双元表达载体上构建得到质粒pCMV201，并将质粒pCMV201中第2659-2752位核苷酸改造为多克隆位点，改造后的pCMV201命名为pCMV201-2bN81-A。
本发明中可以使用的植物双元表达载体包括但不限于pBI121、pKYLX7、pYL44、pBIN19、pC22、pGA482、pPCV001、pCGNOME547、pJJ1881、pPZP101/111、pGreen0029、pCAMBIA2300、pCAMBIA3100。
前述的基因沉默***CMV-ZMBJ VIGS，其中质粒pCMV2-2bN81-A、质粒pCMV101和质粒pCMV301的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-3所示。
本发明还提供所述基因沉默***CMV-ZMBJ VIGS在植物基因沉默中的应用，例如，用含有CMV-ZMBJ:待研究基因片段VIGS载体的农杆菌浸润本生烟等双子叶植物叶片，约9-12天实现对目标基因的沉默；或者，首先用含有CMV-ZMBJ:待研究基因片段VIGS载体的农杆菌浸润本生烟，3天后取本生烟接种叶的粗提物针刺接种玉米等单子叶植物种胚后，待种子发芽后种至营养土中，16h/24-16℃白天，8h/24-16℃黑夜条件下培养10-20天可引起基因沉默。
本发明还提供所述基因沉默***CMV-ZMBJ VIGS在研究植物基因功能中的应用，其是将待研究的基因片段***质粒pCMV2-2bN81-A的多克隆位点区域，并转化农杆菌，然后与分别转入pCMV101和pCMV301的农杆菌菌悬液混合，侵染植物，使用半定量或实时荧光定量RT-PCR等方法检测被沉默基因的表达水平。
本发明中涉及的植物包括双子叶植物和单子叶植物。所述双子叶植物包括但不限于本生烟等，所述单子叶植物包括但不限于玉米等。
本发明以首次分离自我国玉米生产田自然侵染玉米的CMV-ZMBJ分离物为材料，构建了其侵染性cDNA克隆，并经改造获得了一个可用于多种植物基因功能研究的VIGS载体，提供了一种研究植物基因功能的新***和新方法。
本发明的技术方案之一，是提供一种基于CMV-ZMBJ VIGS***研究本生烟等双子叶植物和玉米等单子叶植物基因功能的方法，包括如下步骤：
1.CMV-ZMBJ侵染性cDNA克隆的构建：以分离自田间自然侵染玉米的CMV-ZMBJ分离物病毒粒子RNA为材料，经RT-PCR扩增其基因组RNA1、RNA2和RNA3的全长cDNA，连入pCass-Rz等植物双元表达载体，经转化农杆菌后具有侵染性，成功构建得到CMV-ZMBJ侵染性cDNA克隆pCMV101、pCMV201和pCMV301。
2.pCMV201-2bN81-A载体的构建：将pCMV201中的2b蛋白的82-111氨基酸(2659-2752nt)区域改造为多克隆位点，用于外源基因的***，改造后的pCMV201命名为pCMV201-2bN81-A。
3.扩增植物待研究基因DNA片段，连入改造后的pCMV201-2bN81-A多克隆位点区域，并转化农杆菌，将成功转入pCMV201-2bN81-A:待研究基因片段的农杆菌，同分别转入pCMV101和pCMV301的农杆菌菌悬液以等浓度混合，用于农杆菌浸润接种植物。
4.如果pCMV2-2bN81-A载体中***的是本生烟等双子叶植物基因片段，农杆菌浸润接种植物后，直接观察CMV-ZMBJ VIGS在本生烟等双子叶植物上引起的症状，或使用半定量或实时荧光定量RT-PCR等的方法检测被沉默基因的表达水平。
5.如果pCMV2-2bN81-A载体中***的是玉米等单子叶植物基因片段，采用如下方法针刺接种玉米：使用农杆菌浸润接种后3天的本生烟接种叶片粗提物作为毒源，针刺接种玉米等单子叶植物种胚，将发芽的玉米种子种至营养土中，16h/24-16℃白天，8h/24-16℃黑夜培养条件下均可引起较高的玉米基因沉默效率。针刺接种后10-20天，植株叶片中相应内源基因被沉默，使用半定量或实时荧光定量RT-PCR等方法检测该叶片中被沉默基因的表达水平。
本发明构建的CMV-ZMBJ VIGS***适用于多种植物基因功能的研究，仅需要将待研究植物基因的部分片段***载体即可用于基因的沉默，本发明方法简便、快速、高效、低成本、不需遗传转化。另外，CMV-ZMBJ VIGS载体可用于玉米基因功能的研究，比现在常用于玉米基因功能研究的BMV VIGS载体适用寄主范围更广泛，不仅适用于Va35，也适用于B73、郑58、Mo17等玉米。
附图说明
图1为本发明实施例2中pCMV2-2bN81-A载体图谱；其中，表示2×35S启动子，表示去掉的2b氨基端部分，表示TRSV核酶位点，表示35S终止子，MCS表示多克隆位点，用于外源基因片段的***。
图2为本发明实施例4中NbPDS基因沉默后本生烟叶片表型；其中，A：CMV-ZMBJ：NbPDS浸润本生烟后9天后开始沿叶脉出现白化症状；B：12天后本生烟叶片出现大面积白化症状；C：对照组中，CMV-ZMBJ：GFP260浸润本生烟12天后，本生烟叶片仅有轻微花叶症状。
图3为本发明实施例5中ZmPDS基因沉默后B73玉米叶片表型；其中，CMV-ZMBJ：ZmPDSN(A)和CMV-ZMBJ：ZmPDSC(B)接种玉米后，叶片出现白化症状(接种21天后拍照)；而对照组中，CMV-ZMBJ：GFP260(C)针刺接种玉米种胚后叶片未出现白化症。
图4为本发明实施例5中实时荧光定量RT-PCR检测B73玉米叶片中ZmPDS的表达量。CMV-ZMBJ/ZmPDSN、CMV-ZMBJ/ZmPDSC和CMV-ZMBJ/GFP260针刺接种接种B73玉米种胚21天后，实时荧光定量RT-PCR检测ZmPDS基因在玉米第一片真叶中的表达量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1CMV-ZMBJ侵染性cDNA克隆的构建
本实施例中首先以首次分离自我国玉米生产田自然侵染玉米的CMV-ZMBJ分离物为材料，构建CMV-ZMBJ的侵染性cDNA克隆，构建侵染性克隆的的骨架载体为pCass-Rz。
具体实施方法如下：
(1)提取在心叶烟(Nicotiana occidentalis)中扩繁的CMV-ZMBJ的病毒粒子，所有的操作在0-4℃或冰上进行；
a.将侵染的组织、预冷buffer A(5mM EDTA；0.5M柠檬酸三钠，柠檬酸调节pH6.5-7.0；使用前加入0.5％巯基乙酸)和氯仿在预冷的搅拌机里按1g:2ml:2ml的比例混合；
b.在大的聚丙烯管中将这些混合物离心，4℃，10,000rpm，15min；
c.移出水层并通过一层的预先湿润(水湿润)的滤布过滤(避免过滤有机相)；
d.每100ml水提取液加10g PEG-8000，4℃搅拌40min直至完全溶解；
e.4℃，10,000rpm离心10min；
f.干燥(病毒)沉淀数分钟，吸水纸擦除管/瓶的内壁的剩余PEG溶液；
g.在buffer B(0.5mM EDTA；5mM四硼酸钠；2％Triton-X100；pH9.0)中重悬病毒，用最初使用的buffer A的体积的25-33％；
h.4℃搅拌40min，4℃，6,000rpm离心10min；
i.取上清进行超速离心步骤，4℃，40,000rpm，1h15min，(如果体积允许，用5ml的buffer A+10％蔗糖，在下面垫起水层，这将得到更干净的沉淀)干燥沉淀并重悬于3-5mlbuffer B中，从管中移出沉淀，4℃振荡过夜(高速振荡)至沉淀完全重悬；
j.4℃，6,000rpm，将病毒溶液离心10min；
k.取出上层清液，将上清离心4℃，40,000rpm超速离心1h15min，在其下面铺5ml的buffer C(5mM四硼酸钠；0.5mM EDTA；pH9.0)+10％蔗糖的垫子；
1.4℃，振荡器上将超速离心获得的沉淀在5ml buffer C中重悬，4℃保存病毒数月，或-80℃保存。
(2)提取CMV-ZMBJ病毒粒子中的RNA，病毒粒子RNA提取参照Dijkstra(1998)的方法：
a.100μl病毒粒子中加入160μl DEPC处理的ddH2O，再加入200μl RNA抽提缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0；200mM NaCl；5mM EDTA)，然后加入40μl10％SDS，混匀，室温保持5min；
b.加入2倍体积(800μl)的酚仿(苯酚：氯仿体积比1：1)，混匀，室温，12,000g离心5min，放冰上；
c.吸取上层水相，加入2倍体积的酚仿，混匀，12,000g离心5min，放冰上；
d.吸取上层水相，加入等体积的氯仿，混匀，12,000g离心5min，放冰上；
e.吸取上层水相，加入1/10倍体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀；
f.-80℃沉淀1h或-20℃沉淀过夜；
g.12,000g离心20min，用1ml75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥；
h.所得RNA溶于30μl DEPC处理的ddH2O中，-80℃保存备用。
(3)RT-PCR扩增CMV-ZMBJ基因组cDNA全序列
a.用下游引物CMV23R-BamH I(5ˊ-AATGGATCCGGTCTCCTTTTGGAG-3ˊ)作为反转录引物，经反转录后产生CMV-ZMBJ的cDNA。反转录酶为：Moloney murine leukemia virus(M-MLV)(Promega,USA)。
反转录反应体系如下：
42℃水浴条件下反应1h。反转录产物-20℃保存备用。
b.以病毒cDNA为模板，分别进行CMV RNAs1、2和3基因组全长片段的扩增，DNA聚合酶为：DNA Polymerase(NEB,UK)
PCR反应体系如下：
PCR程序为：98℃，30s；98℃，8s，63℃，20s，72℃，1min30s，30个循环；72℃延伸8min。
C12F和CMV1R-Kpn I、C12F和CMV23R-BamH I、C3F和CMV23R-BamH I分别用于CMVRNAs1、2和3全长的扩增。
c.扩增得到的CMV RNAs1、2和3基因组全长片段分别经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收洗脱至30μl dd H2O中，然后连入相应酶切处理的pCass-Rz载体。
具体步骤如下：
通过对CMV-ZMBJ RNAs1、2和3序列的分析，用Stu I和Kpn I限制性内切酶将RNA1连入pCass-Rz，RNAs2和3使用Stu I和BamH I限制性内切酶连入pCass-Rz。
Kpn I和BamH I酶切体系分别如下：
DNA 2-3μg
10×L Buffer 5μl
Kpn I 1μl
dd H2O补充至50μl，
37℃水浴6-8h。
或
DNA 2-3μg
10×K Buffer 5μl
BamH I 1μl
dd H2O补充至50μl
30℃水浴6-8h。
酶切产物切胶回收后进行连接反应。
连接体系如下：
16℃，反应16h以上。
d.连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(DH5α)，并进行重组质粒的鉴定，筛选出阳性克隆。
具体的大肠杆菌转化方法(热激法)如下：
将100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞置冰上融化，加入5-10μl连接产物或100ng质粒，轻轻混匀后置冰上放置15-30min，42℃热激90s后立即置冰上5min，再加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃，180rpm培养45min，5,000rpm，离心3min，吸弃800μl上层液，将剩余的100μl菌液吸打混匀涂布于含有相应抗生素的LB平板，37℃倒置培养10-12h。
重组质粒鉴定方法具体如下：
首先，采用比较质粒大小鉴定法：
将单菌落挑取至LB液体培养基中，37℃，180rpm摇培8-12h，碱裂解法或用质粒小提试剂盒提取质粒，经0.8-1.0％琼脂糖凝胶电泳，以空载体质粒为对照，选择比空载体质粒更大的质粒做进一步鉴定。
然后，使用酶切鉴定法：
在20μl反应体系中，加入200-300ng质粒DNA，加入0.3μl限制性内切酶和内切酶缓冲液2μl，加ddH2O至20μl，限制性内切酶活性温度下反应2-4h，0.8-1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
e.将筛选出的阳性克隆提取质粒后转化农杆菌，通过农杆菌浸润的方式接种本生烟，通过观察本生烟的发病情况确定该侵染性克隆是否具有侵染性。将分别含有CMV-ZMBJRNAs1、2和3的3个验证正确的侵染性克隆质粒分别命名为pCMV101、pCMV201和pCMV301。
大肠杆菌中提取质粒的方法具体如下：
挑取单菌落接种于3-5ml含有相应抗生素的LB液体培养基(含50μg/ml Amp+或Kan+)中，37℃，180rpm培养8-12h，收集菌体，使用天根公司质粒小提试剂盒提取质粒DNA，按使用说明书进行，具体步骤如下：用250μl溶液P1充分悬浮菌体后加入250μl溶液P2，轻轻混匀，再加入350μl溶液P3，立即轻轻混匀后于12,000rpm离心10min。将上清液转移到平衡好的吸附柱中，12,000rpm离心1min后加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm离心1min，再加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，重复洗涤一次后，12,000rpm离心2min，以完全除去漂洗液。将吸附柱放入一个新的离心管中，加入50μl 65℃预热的ddH2O，静置2min后，12,000rpm离心2min，即得到质粒DNA。
农杆菌转化方法(液氮冻融法)具体如下：
取200μl感受态细胞，加入1μg质粒DNA，冰浴20-30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5-10min，后加入800μl LB液体培养基(无抗生素)，28℃，180rpm恢复培养4-6h后，涂布于含有相应抗生素(50μg/ml Kan+和50μg/ml Rif+)的固体平板培养基上，28℃培养约36-40h。
农杆菌浸润接种本生烟方法具体如下：
首先，挑取相应的农杆菌菌体于2-5ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan+和50μg/mlRif+)中，28℃，180rpm摇培活化36h。再按1：100的比例取活化菌液接种于LB液体培养基(含50μg/ml Kan+和50μg/ml Rif+)中，28℃，180rpm摇培过夜。5,000rpm离心5min收集菌体，弃培养基，用重悬液(10mmol/l MgCl2，10mmol/L MES，100μmol/l AS)悬浮，稀释适当倍数紫外分光光度计测定OD600，用重悬液调整使其OD600为1.0，室温静置诱导至少3h。用无针头的注射器浸润接种烟草叶片。
表1 CMV-ZMBJ侵染性克隆构建使用的引物
注：引物序列中斜体表示酶切位点区域。
实施例2pCMV201-2bN81-A载体的构建
F1-I和R1-A扩增CMV-ZMBJ RNA2的1844-2658nt的上游片段。F2-A和CMV23R-BamHI扩增CMV-ZMBJ RNA2的2753-3054nt)的下游片段。上游片段的3ˊ端和下游片段的5ˊ端均通过引物引入的多克隆位点(5’-GGTACCTTGAGCTAGCAGGCCTCTAGA-3’)使上下游片段可以通过融合PCR融合在一起。这样，RNA22659-2752nt区域被替换为多克隆位点。融合PCR产物通过1847bp处的Nco I和3ˊ末端的BamH I再连接回pCMV201。
改造后的pCMV201被命名为pCMV2-2bN81-A(质粒图谱如图1所示)，多克隆位点用于***外源基因片段，同pCMV101和pCMV301一起构成CMV-ZMBJ VIGS载体。
表2 pCMV201-2bN81-A载体构建使用的引物
注：引物序列中斜体表示酶切位点区域，下滑线表示融合PCR中引入的多克隆位点区域。
实施例3pCMV201-2bN81-A:待研究基因片段载体构建及农杆菌浸润
(1)pCMV201-2bN81-A:NbPDS载体的构建
以本生烟cDNA为模板，用引物对NbPDSf和Nb-PDSr经PCR扩增得到目标片段NbPDS(NbPDS基因ORF467-764bp，288bp)，并利用Kpn I和Xba I将NbPDS克隆到pCMV2-2bN81-A载体中得到pCMV2-2bN81-A：NbPDS，经测序验证。以***260bp GFP片段的pCMV2-2bN81-A(pCMV2-2bN81-A：GFP260)作为阴性对照。
(2)pCMV201-2bN81-A:ZmPDS载体的构建
以B73玉米的cDNA为模板，用引物对ZmPDS1191F和ZmPDSR2、ZmPDS1415F和ZmPDS1665R经PCR分别扩增得到目标片段ZmPDSN(ZmPDS基因ORF1191-1424bp，234bp)和ZmPDSC(ZmPDS基因ORF1415-1665bp，250bp)，然后利用Kpn I和Xba I分别将ZmPDSN和ZmPDSC克隆到pCMV2-2bN81-A载体中，得到pCMV2-2bN81-A：ZmPDSN和pCMV2-2bN81-A：ZmPDSC，并测序验证。同样以pCMV2-2bN81-A：GFP260为阴性对照。
表3特异性扩增NbPDS和ZmPDS基因片段使用的引物
注：引物序列中斜体表示酶切位点区域。
(3)CMV-ZMBJ VIGS农杆菌浸润
克隆在pCass-Rz载体35S启动子下的CMV-ZMBJ侵染性克隆，可以通过农杆菌浸润的方式接种本生烟，并在本生烟中大量增殖。
具体的实施方法为：
a.将测序正确的pCMV2-2bN81-A:NbPDS、pCMV2-2bN81-A:ZmPDSN、pCMV2-2bN81-A:ZmPDSC和pCMV2-2bN81-A:GFP260载体质粒转化到农杆菌感受态细胞，操作方法同实施例1的描述；同时将-70℃保存的携带pCMV101和pCMV301的农杆菌菌种于LB平板(含50μg/ml Kan+，50μg/ml Rif+)上划线，28℃培养36-48h。
b.挑取相应的农杆菌菌体于2-5ml LB液体培养基(含50μg/ml Kan+和50μg/mlRif+)中，28℃，180rpm摇培活化36h。再按1：100的比例取活化菌液接种于LB液体培养基(含50μg/ml Kan+和50μg/ml Rif+)中，28℃，180rpm摇培过夜。5,000rpm离心5min收集菌体，弃培养基，用重悬液(10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，100μmol/L AS)悬浮，稀释适当倍数紫外分光光度计测定OD600，用重悬液调整使其OD600为1.0，室温静置诱导至少3h。
c.pCMV2-2bN81-A:NbPDS、pCMV2-2bN81-A:ZmPDSN、pCMV2-2bN81-A:ZmPDSC和pCMV2-2bN81-A:GFP260农杆菌菌悬液中均加入等体积的pCMV101和pCMV301的农杆菌菌悬液，混匀后，浸润接种。混合后的农杆菌液分别命名为CMV-ZMBJ:NbPDS、CMV-ZMBJ:ZmPDSN、CMV-ZMBJ:ZmPDSC和CMV-ZMBJ:GFP260。
实施例4CMV-ZMBJ VIGS***在本生烟中的应用
含有CMV-ZMBJ:NbPDS的农杆菌浸润本生烟后6天，每天观察一次本生烟叶片的表型，并记录叶片表型。
CMV-ZMBJ:NbPDS浸润本生烟后9天后开始沿叶脉出现白化症状(图2A)，12天后本生烟叶片出现大面积白化症状(图2B)，而对照组中，CMV-ZMBJ/GFP260浸润本生烟12天后，本生烟叶片仅有轻微花叶症状(图2C)。
实施例5CMV-ZMBJ VIGS***在玉米中的应用
通过大量的对比优化试验，我们发现采用针刺接种玉米种胚的方法接种CMV-ZMBJ，能够获得高效、稳定的接种效率。
农杆菌浸润本生烟后3天，取接种叶片，加入10倍体积(w/v)0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)研磨，转移至1.5ml离心管中，4℃，5,000rpm离心3min，取上清作为毒源针刺接种B73玉米种胚。选取正常发芽的种子种至营养土中，16h/24-16℃白天–8h/24-16℃黑夜条件下培养10-20天可引起玉米基因沉默。
针刺接种后21天，拍照记录玉米植株第一片真叶上PDS沉默产生的症状。并用实时荧光定量RT-PCR检测ZmPDS基因的沉默效率。
CMV-ZMBJ:ZmPDSN和CMV-ZMBJ:ZmPDSC针刺接种玉米种胚21天后，B73玉米叶片出现白化症状(图3A和B)，而对照组中，CMV-ZMBJ/GFP260针刺接种玉米种胚21天后，B73玉米叶片未出现白化症状(图3C)。玉米叶片出现了白色条纹，是ZmPDS基因沉默后出现的光漂白现象。如图4所示，实时荧光定量RT-PCR检测的结果表明CMV-ZMBJ:ZmPDSN和CMV-ZMBJ:ZmPDSC接种的实验组与CMV-ZMBJ:GFP260接种的对照组相比，玉米植株第一片真叶中ZmPDS基因的表达量明显下降。
实时荧光定量RT-PCR检测ZmPDS基因的表达量的具体实施方法如下：
针刺接种21天后，分别取ZMBJ-CM:ZmPDSN、CMV-ZMBJ:ZmPDSC和CMV-ZMBJ:GFP260接种植株的第一片***叶，用实时荧光定量RT-PCR检测ZmPDS基因的沉默效率。每种处理取3个样品，每次实验重复3次。
实时荧光定量RT-PCR用于检测ZmPDS表达量的引物为：ZmPDSf2020和ZmPDSr2206。Ubiquitin是一种高度保守的蛋白质，在实时荧光定量RT-PCR实验中作为内参基因，用于检测ZmUbi表达量的引物为：UbiqF和UbiqR。
a.用TRIzol法提取各样品的总RNA，操作方法同上所述；
b.用DNase I去除总RNA中的的基因组DNA并用酚仿抽提的方法进行纯化。
具体的DNase I去除总RNA中的的基因组DNA的体系如下：
37℃水浴中孵育30min。
酚仿抽提RNA的方法具体如下：
i.向DNase I去除总RNA中的的基因组DNA的反应体系中加入350μl DEPC H2O后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀；
ii.室温，12,000rpm离心5min，取上清；
iii.加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混匀；
iv.室温，12,000rpm离心5min，取上清；
v.加入1/10体积(v/v)3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积(v/v)冷无水乙醇，混匀后-80℃放置20min；
vi.4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；
vii.加入75％冷乙醇漂洗，4℃，12,000rpm离心5min，弃上清；
viii.干燥沉淀后，加入30μl DEPC H2O，并用NanoTM分光光度计检测RNA的浓度。
c.用1μg RNA和oligo dT引物反转录合成cDNA，ddH2O稀释10倍后作为模板用于实时荧光定量RT-PCR反应；
d.参照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书按照ABI7500Real-Time PCR体系的操作方法进行反应。
反应体系的配制：
每个样品进行三个反应，配制反应液时注意避光，在冰上完成。
e.使用ABI7500实时荧光PCR扩增仪，将PCR反应管放入PCR仪，按照两步法PCR扩增程序启动以下反应：
i.预变性：95℃，30s，1个循环；
ii.PCR反应：95℃，3s；60℃，34s；40个循环
iii.融解曲线分析：95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s，60℃，15s，一个循环。
f.实验结果分析：反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，用仪器测得的各反应的CT值按照2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。具体算法如下：
i.用内参基因(ZmUbi)的CT值归一所有测试样本目标基因的CT值：
△CT(测试样本)＝CT(目标基因，测试样本)－CT(内参基因，测试样本)
△CT(校准样本)＝CT(目标基因，校准样本)－CT(内参基因，校准样本)
ii.校准样本的△CT值归一测试样本的△CT值：
△△CT＝△CT(测试样本)－△CT(校准样本)
iii.计算表达水平比率：表达量的比值＝2-△△CT
表4实时荧光定量PCR中用到的引物
因此可见，CMV-ZMBJ VIGS***能高效地沉默本生烟和玉米叶片中的基因。通过本实施例也可以看出，CMV-ZMBJ VIGS***可以用于植物基因功能的研究。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (4)
1.黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默***，其特征在于，由质粒pCMV2-2bN81-A、质粒pCMV101和质粒pCMV301组成；
其中，质粒pCMV101是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ的RNA1为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz载体上构建得到的；
质粒pCMV301是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ的RNA3为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz载体上构建得到的；
质粒pCMV2-2bN81-A是以侵染玉米的黄瓜花叶病毒分离物CMV-ZMBJ的RNA2为模板，经RT-PCR获得全长cDNA，然后克隆至pCass-Rz载体上构建得到质粒pCMV201，并将质粒pCMV201中第2659-2752位核苷酸改造为多克隆位点，改造后的pCMV201命名为pCMV201-2bN81-A；
质粒pCMV2-2bN81-A、质粒pCMV101和质粒pCMV301的核苷酸序列分别如Seq ID No.1-3所示。
2.权利要求1所述的基因沉默***在植物基因沉默中的应用，其中所述植物为本生烟、玉米。
3.权利要求1或2所述的基因沉默***在研究植物基因功能中的应用，其中所述植物为本生烟、玉米。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其是将待研究的基因片段***质粒pCMV2-2bN81-A的多克隆位点区域，并转化农杆菌，然后与分别转入pCMV101和pCMV301的农杆菌菌悬液混合，侵染植物，使用半定量或实时荧光定量RT-PCR法检测被沉默基因的表达水平。
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