CN114015718B - 大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用 - Google Patents

大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用，具体是在获得大豆黄曲叶病毒基因组全序列的基础上，通过基因重组的方法将两个正向重复的大豆黄曲叶病毒基因组构建到双元表达载体pBinPLUS上，重组载体通过电击转化到农杆菌菌株EHA105中，获得的病毒载体能够成功侵染大豆、本氏烟等植物。本发明为研究该病毒基因组结构和功能及病毒与寄主之间的相互作用研究提供了成熟的体系。

Description

大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种植物DNA病毒-双生病毒科的大豆黄曲叶病毒(Soybean yellow leaf curl virus，SbYLCV)侵染性克隆载体构建。
背景技术
双生病毒是一类全球广泛存在的植物单链DNA病毒，大小约为18nm×30nm，病毒粒子为双二十面体结构，无包膜。双生病毒的基因组分为单组分和双组分，基因组大小一般为2.5-3.0Kb左右。
大豆黄曲叶病毒(SbYLCV)属于双生病毒科的单组分双生病毒，基因组全长2782bp。该病毒含有6个开放阅读框，其中病毒链编码V1和V2，互补链编码C1、C2、C3和C4。该病毒严重威胁豆科作物尤其是大豆作物的生产，植株被侵染后表现叶片卷曲、黄化和生长发育迟缓等症状。
使用抗病品种和治虫防病是防控双生病毒的重要措施，但是现有的抗性资源较少，且由于双生病毒的种类多、变异大，抗性也仅限于少数双生病毒的防控。病毒的侵染性克隆是开展病毒反向遗传学研究的基础，对于了解病毒编码的蛋白的功能、筛选抗性品种、研究植物与病毒的互作以及病毒的传播特性具有重要意义。对大豆黄曲叶病毒而言，目前还不知道有哪些大豆品种对该病毒具有抗性，且该病毒的传毒介体和编码的蛋白功能未知。
因此，对大豆黄曲叶病毒的致病性进行研究并筛选优质的抗病毒大豆品种成为本领域亟需解决的难题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本发明在获得大豆黄曲叶病毒基因组全序列的基础上，构建了该病毒的侵染性克隆。将两个串联重复的SbYLCV基因组序列构建入双元载体pBinPLUS中，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于研究该病毒功能和致病性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体，为pBinPLUS-SbYLCV，由两个串联重复的大豆黄曲叶病毒SbYLCV核苷酸全序列融合到pBinPLUS载体上制备得到，所述的大豆黄曲叶病毒SbYLCV核苷酸全序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明所述侵染性克隆载体pBinPLUS-SbYLCV的构建方法，包括以下的步骤：
(1)植物总DNA的提取；采用CTAB法提取病叶的总DNA；获得大豆黄曲叶病毒全序列；
(2)设计引物SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R，SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R，如SEQ ID NO:1-4所示；
使用引物对SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R获得约3kb的DNA片段，即***片段1，大小为基因组的1个拷贝；
使用引物对SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R获得约3kb的DNA片段，即***片段2，大小为基因组的1个拷贝；扩增的PCR产物纯化后分别获得两个含有不同酶切位点的SbYLCV核苷酸全序列；
(3)将纯化的扩增目的片段与经SalI和EcoRI双酶切的pBinPLUS载体进行重组反应，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆；
(4)提取培养包含目标克隆的质粒，通过DNA测序筛选出具有两个串联重复SbYLCV基因组核苷酸全序列的克隆，获得大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体pBinPLUS-SbYLCV。
其中，所述步骤(2)中，PCR扩增体系为16μL ddH2O、5μL 5×TransStart FastPfuBuffer、2μL 2.5μM dNTPs、上下游引物(10μM)各0.4μL、1μL模板DNA、0.2μL TransStartFastPfu DNA Polymerase，总反应体系为25μL；总反应条件为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃3min，35个循环；72℃10min。
其中，所述步骤(3)中，重组反应采用10μL体系，其中2μL 5×In-Fusion HDEnzyme Premix，2μL SalI和EcoRI双酶切线性化克隆载体pBinPLUS，0.5μL***片段1，1μL***片段2，最后用ddH2O调整体系至10μL。
本发明的大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体可以用于分析大豆黄曲叶病毒的致病性、作为毒源筛选抗病毒的大豆品种及研究大豆基因功能。
本发明还提供了一种携带大豆黄曲叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，通过电击转化方法将本发明的侵染性克隆载体导入农杆菌菌株EHA105中，即可得到含有SbYLCV侵染性克隆的农杆菌。
该农杆菌菌株可以用于大豆黄曲叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究中。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明提供的农杆菌菌株可以产生大豆双生病毒的侵染性克隆；
(2)利用本发明提供的侵染性克隆能够***侵染大豆，能够高效侵染茄科植物本氏烟，引起明显的病毒症状，且操作简单，重复性好；
(3)利用本发明提供的侵染性克隆可有效用于大豆双生病毒的致病性分析；
(4)通过突变病毒的基因，可用于研究病毒基因的功能。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用作进一步说明。
附图说明
图1为侵染性克隆载体pBinPLUS-SbYLCV扩增构建示意图。
图2为pBinPLUS-SbYLCV侵染性克隆接种本氏烟、番茄后的表型；
其中，A：pBinPLUS空载体接种的健康大豆对照；a：SbYLCV接种大豆14天后的症状；
B：pBinPLUS空载体接种的本氏烟对照；b：SbYLCV接种本氏烟30天后的症状。
图3为pBINPLUS-SbYLCV接种大豆、本氏烟后的PCR检测结果。其中，M：DNA Marker；1、2：pBinPLUS空载体接种的健康本氏烟对照；3、4：SbYLCV接种的本氏烟；6、7：pBinPLUS空载体接种的健康大豆对照；8、9：SbYLCV接种的大豆；5、10：PCR的阴性对照。
具体实施方式
本发明所提供的实施例如无特殊说明，则均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。
表1 SbYLCV侵染性克隆载体构建引物
实施例1大豆黄曲叶病毒基因组全序列的克隆和测定
(1)疑似感染双生病毒的大豆样品的采集
(2)植物总DNA的提取
将采用CTAB法提取病叶的总DNA，具体操作如下：称取0.1g植物新鲜叶片放入管中，液氮速冻后在磨样仪中(频率设定为40Hz)研磨1分钟至粉末。加入700μL 65℃预热的CTAB抽提液(使用时加入2％v/v的β-巯基乙醇)，65℃加热1h，每10-20分钟摇动一次离心管。加入等体积的24：1的氯仿：异戊醇，上下混匀抽提，4℃，10000rpm离心5min。将上清小心转入新的1.5mL的离心管中，加入1/10体积3M NaAc和等体积的-20℃预冷的无水乙醇，在-20℃冰箱中放置1h。4℃，12000rpm离心15min，弃掉上清。用1mL 70％的酒精洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心5min，重复三次。弃掉上清，37℃烘干10-15min。干燥后加入50μL ddH2O溶解。加入1μL RNAase(10μg/μL)混匀，37℃消化30min。-20℃保存。
(3)SbYLCV全序列扩增及基因组序列测定
取约100ng样品DNA，使用一对背靠背引物扩增出约3.0kb的DNA片段，切胶回收后连接到全氏金pEASY-Blunt Simple Cloning T载体上，将重组载体转化到大肠杆菌DH5α中，使用通用引物M13F和M13R筛选出阳性克隆；挑选阳性克隆过夜培养，提取含有目标克隆的质粒，通过DNA测序进行验证。获得序列如SEQ ID NO:9所示；背靠背引物如SEQ ID NO:7-8所示；M13-F和M13-R如SEQ ID NO:5-6所示。
实施例2大豆黄曲叶病毒侵染性克隆pBinPLUS-SbYLCV的构建(如图1)
根据实施例1获得的全序列，设计引物SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R，SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R，使用引物对SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R，获得约3kb的DNA片段，即***片段1，大小为基因组的1个拷贝；使用引物对SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R获得约3kb的DNA片段，即***片段2，大小为基因组的1个拷贝；扩增的PCR产物纯化后分别获得两个含有不同酶切位点的SbYLCV核苷酸全序列。
其中，PCR扩增体系为16μL ddH2O、5μL 5×TransStart FastPfu Buffer、2μL 2.5μM dNTPs、上下游引物(10μM)各0.4μL、1μL模板DNA、0.2μL TransStart FastPfu DNAPolymerase，总反应体系为25μL。总反应条件为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃3min，35个循环；72℃10min。
将纯化的扩增目的片段与经SalI和EcoRI双酶切的pBinPLUS载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选阳性克隆；提取培养包含目标克隆的质粒，通过DNA测序筛选出具有两个串联重复SbYLCV基因组核苷酸全序列的克隆，获得大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体pBinPLUS-SbYLCV。
其中，重组反应采用10μL体系，其中2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μLSalI和EcoRI双酶切线性化克隆载体pBinPLUS(100ng)，0.5μL***片段1(100ng)，1μL***片段2(130ng)，最后用ddH2O调整体系至10μL。
实施例3 pBinPLUS-SbYLCV侵染性克隆接种
将pBinPLUS-SbYLCV电击转化导入农杆菌菌株EHA105，经菌落PCR验证后，挑取单斑接种于含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)抗性的YEP培养基中28℃过夜振荡培养，当培养的菌液OD600＝1.0-1.5时，4000rpm，离心10min，弃掉上清培养基，收集菌体，然后用接种缓冲液(含10mM MgCl2，10mM MES(PH5.6)和100mM乙酰丁香酮的ddH2O溶液)重悬菌体，调整菌液浓度使其OD600＝1.0左右，室温避光静置2h。选取4-5叶期的本氏烟，注射时，在植物叶片背面轻轻刺几个小孔，通过小孔将菌液慢慢接种于叶片组织中。每个处理注射8-10株，植物接种后放置于25℃温室中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。
实施例4 pBinPLUS-SbYLCV侵染性克隆的侵染性测定
定期对接种植物进行症状观察，监测在不同植物上引起的变化。对出现症状或未出现症状的植株都进行PCR检测。症状观察表明，农杆菌浸润接种本氏烟后***侵染叶表现明显新生叶上卷，叶片皱缩卷曲畸形症状(如图2)；接种大豆后***叶表现明显的叶片上卷、皱缩及花叶症状(如图2)。
利用病毒特异性引物进行PCR检测，接种pBinPLUS-SbYLCV的本氏烟、大豆样品均能扩增到约1700bp大小的特异性条带(如图3)。这些结果表明构建到pBinPLUS-SbYLCV侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染本氏烟、大豆。
上述结果表明：本发明构建的pBinPLUS-SbYLCV侵染性克隆具有生物学活性，能成功侵染本氏烟、大豆。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 大豆黄曲叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
<130> DS211-055
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
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cctttgggcc cccataaatt ctttaaagtg ctttagataa tgcgggtcaa cgtcatcaat 1860
gacgttatac caggcatcat tactgtacac tttgggacta agatcaagat gaccacataa 1920
ataattatgt ggacccaatg aacgagccca catagttttt cctgttctac tttcaccttc 1980
aacaactata ctcatgggtc tccatggccg cgcagcggca tccttgacgt tctctgacat 2040
ccattcctca agttcttccg gaacttgatt gaaagaagaa gaagaaaaag ggcaaacaaa 2100
tacttctaaa ggagctgcga aaatcctatc tagattagaa tttaaattat gatactgtaa 2160
tataaaatct ttaggcatta attccctaat caaattaaga gcctctgact tactgccgct 2220
gttaagcgcc ttggcgtaag catcgttggc tgattgttgt cctcctcgtg cagatcgtgc 2280
gtcgatctga aactgtcccc attcgagggt gtctccgtcc ttgtcgatat aggacttgac 2340
gtcggagctg gatttagctc cctgtatatt tggatggaaa tatgctgacc tggttgggga 2400
tagcaggtcg aagaatctgt tattcgtgca gacgagtttc ccttcgaatt gcataagcac 2460
atggagatga gggctcccat cttcgtgaag ttctctgcag attttgatat agagcttatt 2520
gacagcagta tctaatttct gtaattggtc tagagtttcc tctttggtta gagaacaatg 2580
gggatatgta aggaaatagt ttttggcttg tatcctaaaa cgacgtggag gagccatttt 2640
atgtgtcgtt ttggattgga gacattcact aactcgtatg gcattggaga caggagtaca 2700
atatataggt gtctctaaat ggcattattg taatttggta aaggtagagt tgaaatttga 2760
aagcggccat ccgtataata tt 2782

Claims (7)

1.一种大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体，其特征在于：所述侵染性克隆载体为pBinPLUS-SbYLCV，由两个串联重复的大豆黄曲叶病毒SbYLCV核苷酸全序列融合到pBinPLUS载体上制备得到，所述的大豆黄曲叶病毒SbYLCV核苷酸全序列如SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，包括以下的步骤：
(1)获得大豆黄曲叶病毒SbYLCV核苷酸全序列；
(2)设计引物SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R，SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R，如SEQ ID NO:1-4所示；
使用引物对SbYLCV-insert1/SalI-F，SbYLCV-insert1-R获得约3kb的DNA片段，即***片段1，大小为基因组的1个拷贝；
使用引物对SbYLCV-insert2-F，SbYLCV-insert2/EcoRI-R获得约3kb的DNA片段，即***片段2，大小为基因组的1个拷贝；扩增的PCR产物纯化后分别获得两个含有不同酶切位点的SbYLCV核苷酸全序列；
(3)将纯化的扩增目的片段与经SalI和EcoRI双酶切的pBinPLUS载体进行重组反应，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆；
(4)提取培养包含目标克隆的质粒，通过DNA测序筛选出具有两个串联重复SbYLCV基因组核苷酸全序列的克隆，获得大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体pBinPLUS-SbYLCV。
3.根据权利要求2所述的大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增体系为16μL ddH2O、5μL 5×TransStart FastPfu Buffer、2μL2.5μM dNTPs、上下游引物10μM各0.4μL、1μL模板DNA、0.2μL TransStart FastPfu DNAPolymerase，总反应体系为25μL；总反应条件为：95℃2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃3min，35个循环；72℃10min。
4.根据权利要求2所述的大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：步骤(3)中重组反应采用10μL体系，其中2μL 5×In-Fusion HD Enzyme Premix，2μL SalI和EcoRI双酶切线性化克隆载体pBinPLUS，0.5μL***片段1，1μL***片段2，最后用ddH2O调整体系至10μL。
5.根据权利要求1所述的大豆黄曲叶病毒的侵染性克隆载体在分析大豆黄曲叶病毒的致病性、作为毒源筛选抗病毒的大豆品种及研究大豆基因功能的分子生物学中的应用。
6.一种携带大豆黄曲叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：通过电击转化方法将权利要求1所述的侵染性克隆载体导入农杆菌菌株EHA105中，即可得到含有SbYLCV侵染性克隆的农杆菌。
7.权利要求6所述农杆菌菌株在大豆黄曲叶病毒的致病性分析、病毒基因功能及大豆基因功能研究中的应用。
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