CN107918017A - 一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法。该方法采用CaCV NP多克隆抗体对CaCV进行检测，具有快速、特异性强、灵敏度高、检测结果可靠的优点，而且不受寄主类型的影响，能有效地排除假阳性。CaCV抗原的浓度为6.25ng/ml，仍能特异性的识别CaCV抗原。

Description

一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法

技术领域

本发明涉及植物病毒的血清学检测技术领域，具体涉及辣椒褪绿病毒的血清学检测方法。

背景技术

番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒是单链RNA病毒，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，是该科中唯一侵染植物的病毒属。截止到目前，已报道该属的病毒有29种，其中有11个确定种，18个暂定种。辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)属于番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒中的一个暂定种。辣椒褪绿病毒(Capsicumchlorosis virus,CaCV)是一种危害农业生产的重要病毒，其基因组有3个单链RNA分子构成：S RNA编码核壳体蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)；M RNA编码糖蛋白前体(Gn/Gc)和非结构蛋白(NSm)；L RNA编码依赖RNA的RNA多聚酶(RdRp)。

1999年，CaCV最早发现于澳大利亚，自然寄主为辣椒和番茄。随后在澳大利亚东南部和西部也有报道，目前CaCV在东南亚的很多国家和地区均有报道，如中国大陆、泰国、印度、台湾等地区。2002年，Chen等人在中国广州市郊的花生上首次发现了CaCV，并指出该病毒能引起花生叶片产生黄斑、坏死斑，叶脉、茎及顶芽坏死，植株矮化。2002年，Zheng YouXiu等人从台湾的蝴蝶兰上发现了CaCV，感病叶片上出现褪绿斑。2013年，李婷婷等人在云南玉溪的番茄上发现了CaCV，在感病番茄的叶子上出现芽坏死，在番茄的果实上出现坏死环斑。因此，CaCV的传播区域越来越广，报道的寄主越来越多，给农业生产带来了较大的危害。

目前，在番茄斑萎病毒属病毒检测中，常见的有血清学方法、分子生物学方法、电镜检测和生物学测定等方法。

分子生物学方法中常采用PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction，PCR)和RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)方法来检测植物病毒。1996年，Weekes等人用RT-PCR方法成功的检测到Tospovirus属病毒，后来对RT-PCR又作了很多修改。2006年，Knierim等人用RT-PCR方法检测到CaCV，并得到CaCV(CaCV-AIT株系)的全基因组。1992年，Higuchi等人首次报道了实时荧光定量PCR(Realtimefluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR)方法。目前，RTFQ-PCR技术在CaCV常规检测方面应用不是很广泛。RT-PCR方法是根据Tospovirus属病毒NP基因序列的保守区域设计的，该基因在Tospovirus属不同种之间的同源性较高，如果仅以NP基因设计引物检测，遇到该属几种病毒复合侵染时则会出现假阳性，最终影响到我们的检测结果。此外，分子生物学方法检测周期长、成本较高，不利于大批量样品的检测。

电镜检测可以确定病毒形态、大小、结构、内含体组成和亚结构，判断病毒是否存在。2007年，Chen等人用电镜技术检测病株细胞中特征性的颗粒，从而鉴定了CaCV(CaCV-AIT株系)，并认为电镜技术是鉴定CaCV的一种辅助方法。2008年，Zheng等人用电镜技术检测了感病蝴蝶兰(Phalaenopsis orchids.)中CaCV的颗粒，结果发现CaCV为球状粒体，病毒直径70–100nm。CaCV的粒子形状与Tospovirus的其他病毒的粒子形态极为相似，病毒直径相差较小。通过电镜观察，依据病毒粒子的形状和大小可以判断到病毒的科或属，但不能确定到种，因此，电镜检测不能准确鉴定CaCV病毒。此外，电镜检测需要专门的设备，检测成本高，该检测方法不利于推广。

指示植物法检测病毒是比较传统的生物学检测方法，生物学测定是通过汁液摩擦接种指示植物进行鉴定，常用的指示植物有本氏烟、心叶烟、普通烟、矮牵牛、长春花等。但该方法也有很多局限性，如指示植物种类有限，许多其他病毒也可侵染指示植物并表现出相似的症状，同种病毒的不同株系间产生的症状有差异，复合侵染及病毒卫星RNA会影响病毒症状的表现，病毒常会产生潜隐症状，不同气候条件可改变症状表现等，因此生物学检测方法并不能作为Tospovirus属病毒检测的唯一依据，还需采用血清学和分子生物学方法等技术进一步确认病毒的种类。

血清学方法是一种快速、特异性强、灵敏度高，广泛应用于病毒检测和病害诊断的现代技术。也是目前用于检测Tospovirus属病毒常用的方法。血清学方法主要有蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)、免疫试纸条技术、酶联免疫吸附剂测定(Enzyme LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)等。1979年，Towbin等人开发了蛋白质免疫印迹方法(WB)，WB也是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。免疫试纸条技术能快速的检测出Tospovirus属病毒，目前，Tospovirus属病毒商品化的免疫试纸条有番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spotvirus，INSV)、鸢尾黄斑病毒(Iris yellow spot virus，IYSV)，该方法受到免疫试纸条种类较少、复合侵染时出现假阳性等因素限制，所以应用范围有限。1986年，Gonsalves和Trujillo开发的酶联免疫反应(ELISA)是Tospovirus属病毒检测和诊断的重要转折点。目前，Tospovirus属病毒商业化的单克隆抗体有TSWV；Tospovirus属病毒商业化的多克隆抗体有TSWV、INSV、IYSV、西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus，WSMoV)、花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus，GRSV)，此外还有两种共轭多克隆抗体，分别是西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus，WSMoV)&花生芽坏死病毒(Groundnut budnecrosis virus，GBNV)、花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus，GRSV)&番茄褪绿斑点病毒(Tomato chlorotic spot virus，TCSV)。随着ELISA技术的发展，双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)和斑点ELISA(dot-ELISA)逐渐用于Tospovirus属病毒的检测。2002年，McMichael等人以WSMoV多克隆抗体用ELISA的方法，通过交叉反应检测到WSMoV血清组的其他病毒，进一步通过分子检测，最终确定该病毒为CaCV。2005年，Premachandra等人用DAS-ELISA方法，以WSMoV多克隆抗体在花蓟马(Ceratothripoides claratris)体内检测其带毒情况，最终在花蓟马体内检测到CaCV。酶联免疫反应检测成本低、灵敏度高、特异性强。截止目前，商品化的抗体种类有限，因此在血清学快速检测中，很多病毒受到限制。CaCV血清学快速检测方法尚未构建，因此CaCV血清学检测方法的建立对CaCV的快速检测具有重要意义。WB技术、免疫试纸条技术和ELISA技术中均需要高质量的单克隆或多克隆抗体，因此,高质量抗体的获得成为血清学检测的核心，血清学方法的建立为快速检测奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是克服现有分子生物学方法成本高和生物学检测的周期长、样品容量小的不足，构建一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法，该方法可以实现快速、多样品的检测，其特征是在进行血清学检测时要用到制备的CaCV NP多克隆抗体，利用间接竞争ELISA法(Indirect competition ELISA，ID-ELISA)。本发明的详细技术方案如下：

一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法，包括以下步骤：

(1)样品的研磨：用pH 7.4的10×PBST缓冲液对样品研磨，每个样品加700μl pH7.4的10×PBST缓冲液；研磨后低温离心，离心条件为10000rpm，4℃，3min；同时，取健康样品作为阴性对照，取纯化后的浓度为200μg/ml CaCV NP蛋白稀释液为阳性对照，同时每个96孔酶标板中留3个空白对照，空白对照不加抗原，直接用pH 7.4的10×PBST缓冲液代替；

(2)包被：将样品离心后的上清液加入酶标板中，每孔加入200μl，每个样品重复3次，4℃过夜或37℃温育2-3h；

(3)封闭：将已包被的酶标板用洗涤液洗3次，每孔加入200μl封闭液，37℃温育1h，然后用洗涤液洗涤3次；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述封闭液为含0.05g/mlBSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；BSA即牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)

(4)一抗的孵育：在封闭好的酶标板中每孔加入200μl一抗稀释液，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤3次，所述一抗稀释液由CaCV NP多克隆抗体与抗体稀释液按CaCV NP多克隆抗体︰抗体稀释液的体积比为1:4000混合而成，所述抗体稀释液为含0.03g/ml的BSA的pH7.4的10×PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(5)二抗的加入：每孔加入200μl二抗稀释液，37℃温育1h，温育结束后用洗涤液洗涤4次；所述二抗稀释液由辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗与抗体稀释液以1︰5000体积比的比例稀释后的溶液，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(6)显色反应：每孔加入TMB显色底物溶液100μl，置24℃下放置30min；

(7)终止：每孔加入显色终止液50μl，然后在酶标仪上测定各孔的OD 450nm吸光值，待阳性对照呈现黄色而阴性对照未显色时，进行判定：取阴性对照OD450nm吸光值的2.5倍为临界值，样品的OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性即样品感染了辣椒褪绿病毒，样品的OD450nm吸光值＜2.5倍为阴性,所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2mol/L的硫酸溶液。

本发明根据CaCV基因组中S RNA的保守序列中核壳体蛋白基因(NP)序列设计1对特异性引物N，通过这1对引物N进行RT-PCR得到NP基因序列(片段全长为828bp)。通过原核表达、目的蛋白纯化、多克隆抗体制备及抗体检测等过程，最终利用制备的CaCV NP抗体构建了快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法。

本发明具有以下有益效果：

1.与传统的生物学测定和电镜技术检测鉴定方法相比，本发明方法具有快速、特异性强、灵敏度高、检测结果可靠的优点，而且不受寄主类型的影响，能有效地排除假阳性。CaCV抗原的浓度为6.25ng/ml，本发明方法仍能特异性的识别CaCV抗原。和前人所用的分子生物学方法相比较，真正实现了快速、准确，特异性强的特点。

2.本发明方法所用仪器设备简单，实验条件可选择，并且能一次对多个样品进行检测。

3.利用本发明方法可对田间样品CaCV的侵染情况进行大规模调查，早期预测辣椒褪绿病毒在田间的流行爆发趋势，以便及时采取防治措施。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是引物N的上游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是引物N的下游引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是M13F引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是M13R引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是T7F引物的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是T7R引物的碱基序列。

附图说明

图1：CaCV NP基因PCR扩增电泳图,图中M为Marker，泳道1为目的产物。

图2：CaCV NP多克隆抗体灵敏度检测结果。图中横坐标是CaCV抗原梯度稀释度，纵坐标是OD 450nm吸光值。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明作进一步阐述，以便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。

下列实施例中实验方法无特殊说明的均为常规方法，所用试剂、材料，均能从生化试剂等商店购买到。

实施例1 本发明CaCV NP基因引物设计和CaCV NP基因的克隆及测序

(1)CaCV NP基因引物设计与合成

CaCV NP基因是以在NCBI上报道的辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)(登录号：KJ603226.1)基因组中完整的NP基因为模板，使用Primer 5设计引物，其引物编号为引物N，它是由上游引物和下游引物组成，所述引物N的上游引物的碱基序列如SEQID NO：1所示，所述引物N的下游引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，该引物N的目标产物片段长度为828bp。

上述引物N由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

(2)CaCV NP基因的获得，按以下步骤进行：

①合成上述步骤(1)所述的引物N。该引物N由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

②样品的采集

本发明所用带CaCV病毒植物样品取自泰国马哈撒拉堪大学采集的1个蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis Salisb.)样品，该样品具有坏死、褪绿、叶片畸形、茎坏死等CaCV病毒典型症状。

③RNA的提取

应用通用植物总RNA提取试剂盒(购置于BioTeke公司)从上述步骤(2)中②取得的新鲜植株组织中提取RNA，操作步骤根据BioTeke公司提供的使用说明操作。

④RT-PCR反应

本实验用大连宝生物工程有限公司(即大连TaKaRa公司)提供的试剂盒的一步反应法(One Step法)完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应中途不需添加任何试剂，就可以完成由AMV反转录酶从RNA反转录为cDNA，再由AMV-Optimized Taq(LA PCR技术研制)扩增cDNA的全部反应。通过上述引物N进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系：

RT-PCR反应条件：50℃30min RT反应，94℃ 2min，从94℃ 30sec，55℃ 30sec至72℃ 2min PCR反应，35个Cycles，72℃10min。

⑤电泳检测

RT-PCR反应终止后，取3μl PCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测扩增结果。能够扩增出828bp左右的片段即为CaCV NP基因，如图1。

⑥测序

扩增的目标产物由北京华大基因生物技术有限公司用AB13370DNA自动测序仪进行测序。

⑦序列比对

将获得的序列通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析。证明该序列为CaCV NP基因序列。

⑧克隆转化

采用购自北京全式金生物技术有限公司的pEASY Blunt Zero Cloning Kit进行克隆，具体操作步骤见说明书。

⑨测序

将阳性菌液送往华大基因生物技术有限公司，用M13F引物和M13R引物测序。将测序结果通过NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比对分析。与NCBI报道的序列号为KJ603226.1、FJ011449.1、EU373799.1的CaCV NP基因的一致性均为98％。证明该序列为CaCV NP基因序列。

实施例2 CaCV NP多克隆抗体的制备

以实施例1中得到的CaCV NP基因的RT-PCR反应产物为目的基因产物,进行以下实验。

(1)原核表达载体构建及筛选

在微型离心管中，取目的基因产物0.5-4μl(根据目的基因产物体积可适当增减，最多不超过4μl)，采用购自北京全式金生物技术有限公司的pEASY Blunt E1 ExpressionKit进行原核表达载体构建，具体操作步骤见说明书。

原核表达载体构建完成以后，获得含有阳性重组子的菌液。用菌液PCR方法鉴定阳性重组子。菌液PCR反应条件：94℃预变性10min(裂解细胞，失活核酸酶)，从94℃变性30s，55℃退火30s至72℃ 1min进行35个循环，72℃延伸10min。用T7F引物和T7R引物对含有阳性重组子的菌液送往华大基因生物技术有限公司测序，确定序列的正确性。

(2)目的蛋白基因的诱导表达

取本实施例步骤(1)中阳性重组子的菌液于含15μl浓度为100mg/ml氨苄青霉素溶液(Amp⁺)的LB固体培养基中(分区划线)，37℃培养过夜；挑取单克隆接种于含5μl浓度为100mg/ml Amp⁺的LB液体培养基中，LB液体培养基的体积为5ml，振摇培养至OD600nm等于0.5时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至总浓度1mM，37℃诱导表达12h，离心，弃上清收集菌体沉淀，存入4℃冰箱中。

取1ml诱导菌体沉淀，加入不含变性剂(如盐酸胍，尿素等)pH 7.4的PBS缓冲液50μl，超声波裂解15min。分离上清和沉淀，取沉淀取40μl用pH 7.4的PBS缓冲液溶解，得沉淀溶解液，将上清液和沉淀溶解液分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测。

(3)SDS-PAGE电泳检测

按常规方法配制SDS-PAGE凝胶电泳所需的丙烯酰胺浓度为5％w/v的SDS-PAGE浓缩胶和甘氨酸浓度为12％w/v的SDS-PAGE分离胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。取本实施例2步骤(2)得到的上清液10μl与2×样品缓冲液10μl混合，得上清混合液，取本实施例2步骤(2)得到的沉淀溶解液10μl与2×样品缓冲液10μl混合，得沉淀混合液；

分别将上清混合液和沉淀混合液煮沸10分钟后，立即分别放入冰盒上冷却5min，分别取冷却后的上清混合液15μl和冷却后的沉淀混合液15μl，分别加入不同的加样孔中，打开电源将电压调到80v(一般15min左右)，待上清混合液和沉淀混合液跑过浓缩胶后，将电压调到120v至上清混合液和沉淀混合液电泳到胶底部为止。将凝胶小心取下放入容器中，加入200ml考马斯亮蓝染色液，用摇床摇过夜,待条带清晰后倒出考马斯亮蓝染色液，加入200ml考马斯亮蓝脱色液过夜，将考马斯亮蓝脱色液倒掉，用成像***拍照、分析、估算蛋白大小。通过SDS-PAGE凝胶电泳图得出上清混合液和沉淀混合液中的CaCV NP粗蛋白含量不一样，CaCV NP粗蛋白主要存在于沉淀混合液中，上清混合液中的CaCV NP粗蛋白极少量。并且沉淀混合液中的CaCV NP粗蛋白的分子量大小为30kDa，这和估算的目标蛋白分子量大小一样。

所述的2×样品缓冲液为：取100mM的pH6.8三羟甲基氨基甲烷盐酸，4％w/v十二烷基硫酸钠，0.2％w/v溴酚蓝，20％v/v甘油，200mM的β-巯基乙醇,用蒸馏水定容至1L。

(4)目的蛋白的纯化

取本实施例步骤(2)的沉淀溶解液进行目的蛋白的纯化，本实验采用HisTrap FFcrude亲和镍柱(GE公司)来纯化目的蛋白，具体操作步骤见说明书。

(5)纯化蛋白浓度的测定

采用碧云天生物技术研究所的BCA蛋白浓度测定试剂盒测定经纯化后蛋白质的浓度，具体操作步骤见说明书。纯化后CaCV NP蛋白质浓度2.41mg/ml，用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至浓度为200μg/ml，将浓度为200μg/ml CaCV NP蛋白稀释液为CaCV抗原，用于本发明方法步骤(1)中的阳性对照和实施例3的检测。

(6)纯化蛋白质谱鉴定

本实施例步骤(4)获得蛋白通过SDS-PAGE电泳检测(实验过程同本实施例步骤3)，将目的条带切胶，然后送至上海中科新生命科技有限公司进行串联飞行时间质谱(MALDITOF/TOF)质谱鉴定。

(7)纯化蛋白送公司免疫

取纯化好的蛋白质3-4mg用干冰包装好，寄往武汉三鹰生物生物技术有限公司免疫健康的大耳白兔(两只)最终得到多克隆抗体和抗血清，所得的CaCV NP多克隆抗体的浓度为400μg/ml。获得的CaCV NP多克隆抗体用于实施例3的实验。

实施例3 本发明CaCV NP多克隆抗体灵敏度检查

本实验采用ID-ELISA法检测CaCV NP多克隆抗体的灵敏度。具体的实验过程如下：

1)包被：用10×PBST缓冲液包被CaCV抗原,将实施例2步骤(5)中所述的浓度为200μg/ml CaCV NP蛋白稀释液(即为CaCV抗原)，用抗体稀释液进行梯度稀释，依次稀释为500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍的各CaCV抗原梯度稀释液，在酶标板的各孔中依次加入100μl前述各CaCV抗原梯度稀释液，4℃过夜或37℃温育2-3h。同时，取健康的蜘蛛兰(Hymenocallis littoralis Salisb.)样品加700μl pH 7.4的10×PBST缓冲液研磨，研磨后低温离心，离心条件为10000rpm，4℃，3min，取上清200ul加入酶标板的孔中，作为阴性对照。所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述BSA为牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)

2)封闭：将已包被的酶标板用洗涤液洗涤3次后，每孔加入100μl封闭液，37℃温育1h，然后用洗涤液洗涤3次。所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述封闭液为含的0.05g/ml BSA的PBST缓冲液。

3)一抗的孵育：在步骤2)封闭后的酶标板按原加有不同稀释倍数的CaCV抗原的各孔中加入200μl一抗稀释液，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤3次，所述洗涤液为10×PBST缓冲液；所述一抗稀释液是将实施例2步骤(7)获得的浓度为400μg/ml的CaCV NP多克隆抗体用抗体稀释液稀释为5000倍的CaCV NP多克隆抗体(即浓度为80ng/ml的CaCV NP多克隆抗体)，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液。

4)加二抗稀释液：每孔加入二抗稀释液200μl，37℃温育1h，然后用pH 7.4的10×PBST缓冲液洗涤4次。所述二抗稀释液为将辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记羊抗兔二抗用抗体稀释液稀释至5000倍，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的PBST缓冲液。

5)显色反应：每孔加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物溶液100μl，置24℃室温下放置30min。

6)终止：30min以后，每孔各加入终止液50μl，在酶标仪上测定各孔的OD450nm吸光值，以各孔的OD 450nm吸光值为纵坐标，以本实施例步骤1)中所述的CaCV抗原梯度稀释液的稀释度为横坐标，结果见图2。待阴性对照未显色时，进行判定：取阴性对照OD 450nm吸光值的2.5倍为临界值，反应孔OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性，反应孔OD 450nm吸光值＜2.5倍为阴性,所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2mol/L的硫酸溶液。

图2表明，在CaCV NP多克隆抗体稀释5000倍时(浓度为80ng/ml)，抗原的最大稀释倍数为32000倍，即抗原的浓度为6.25ng/ml，此时CaCV多克隆抗体仍能特异性的识别CaCV抗原，表明其CaCV NP多克隆抗体的灵敏度高。

实施例4 本发明CaCV NP多克隆抗体特异性检测

使用间接竞争ELISA法测定抗血清的特异性。测试以下3种病毒：

辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)、番茄斑萎病毒(Tomatospotted wilt virus，TSWV)和凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)。CaCV、TSWV和INSV阳性样品为购自德国微生物和细胞培养有限公司(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)。CaCV、TSWV和INSV的检测方法均采用间接竞争ELISA法(ID-ELISA)。CaCV NP多克隆抗体特异性检测时，间接竞争ELISA法的实验过程与实施例3不同之处是：CaCV、TSWV和INSV阳性样品为溶液，不需要研磨等处理。CaCV、TSWV和INSV三个阳性样品具体实验过程如下：

(1)抗原的稀释与包被：CaCV、TSWV和INSV阳性样品在使用前分别进行稀释，所述样品稀释液由阳性样品(CaCV、TSWV或INSV)与阳性样品稀释液按阳性样品︰阳性样品稀释液的体积比为1:20混合而成，混合后总体积为600μl，在酶标板(购自CorningIncorporated，货号：16913040)上每孔加200μl，每个阳性样品重复3次，4℃过夜或37℃温育2-3h；所述阳性样品稀释液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；同时，取pH 7.4的10×PBST缓冲液作为阴性对照；

(2)封闭：将已包被的酶标板用洗涤液洗3次，每孔加入200μl封闭液，37℃温育1h，然后用洗涤液洗涤3次；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述封闭液为含0.05g/mlBSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(3)一抗的孵育：在封闭好的酶标板中每孔加入200μl一抗稀释液，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤3次，所述一抗体稀释液由浓度为400μg/ml的CaCV NP多克隆抗体与抗体稀释液按浓度为400μg/ml的CaCV NP多克隆抗体︰抗体稀释液的体积比为1:4000混合而成，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(4)二抗的加入：每孔加入200μl二抗稀释液，37℃温育1h，温育结束后用洗涤液洗涤4次；所述二抗稀释液由辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗(购自Vazyme BiotechCo.,Ltd，货号：Ab203-01)与抗体稀释液以1︰5000体积比的比例稀释后的溶液，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(5)显色反应：每孔加入TMB显色底物溶液100μl，置24℃下放置30min；

(6)终止：每孔加入显色终止液50μl，然后在酶标仪上测定各孔的OD 450nm吸光值，所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2mol/L的硫酸溶液。

以上3种病毒用CaCV NP多克隆抗体检测结果见表1，从表1中可以看出，以P/N大于2为阳性，只有CaCV NP多克隆抗体与CaCV阳性样品才能发生阳性反应，其他2种阳性样品不能与CaCV NP多克隆抗体发生阳性反应，表明：本发明的CaCV NP多克隆抗体对CaCV病毒的检测特异性好，不与TSWV和INSV病毒发生交叉反应。

表1 CaCV NP多克隆抗体的特异性检测

注：P为待测病毒材料OD 450nm值，N为阴性对照OD 450nm值实施例5用本发明方法检测田间烟草CaCV的感病情况。

实施例5除以下步骤不同外，其余步骤与实施例4相同。

(1)样品的研磨：用pH 7.4的10×PBST缓冲液对样品研磨，每个样品加700μl pH7.4的10×PBST缓冲液；研磨后低温离心，离心条件为10000rpm，4℃，3min；同时，取健康烟草样品作为阴性对照，取实施例2步骤(5)中所述的浓度为200μg/ml的CaCV NP蛋白稀释液为阳性对照，同时每个96孔酶标板中留3个空白对照，空白对照不加抗原，直接用pH 7.4的10×PBST缓冲液代替；

通过以上步骤，对田间采集的36个烟草样品进行了检测。试验中有2孔阳性，2孔阴性，39个烟草样品中，每个样品2孔。通过检测，结果显示36个烟草样品中有5个烟草样品检测结果均为阳性。

以上实施例表明：本发明能对辣椒褪绿病毒进行快速检测，检测特异性好，灵敏度高，同时可以实现对样品大批量的检测，缩短了检测时间和检测成本，有利于实现对辣椒褪绿病毒的快速检测。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法

<150> 201611214083X

<151> 2016-12-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<223> 辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus，CaCV）的S RNA片段中的NP基因序列

<400> 1

acgcgtcgac tcacacttct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<223> 辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus，CaCV）的S RNA片段中的NP基因序列

<400> 2

cgggatccat gtctaacgtc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (1)..(24)

<223> M13F引物

<400> 3

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_

<222> (1)..(24)

<223> M13R引物

<400> 4

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(20)

<223> T7F引物

<400> 5

taatacgact cactataggg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> terminator

<222> (1)..(19)

<223> T7R引物

<400> 6

gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (1)

1.一种快速检测辣椒褪绿病毒的血清学方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品的研磨：用pH 7.4的10×PBST缓冲液对样品研磨，每个样品加700μl pH 7.4的10×PBST缓冲液；研磨后低温离心，离心条件为10000rpm，4℃，3min；同时，取健康样品作为阴性对照，取纯化后的浓度为200μg/ml CaCV NP蛋白稀释液为阳性对照，同时每个96孔酶标板中留3个空白对照，空白对照不加抗原，直接用pH 7.4的10×PBST缓冲液代替；

(2)包被：将样品离心后的上清液加入酶标板中，每孔加入200μl，每个样品重复3次，4℃过夜或37℃温育2-3h；

(3)封闭：将已包被的酶标板用洗涤液洗3次，每孔加入200μl封闭液，37℃温育1h，然后用洗涤液洗涤3次；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述封闭液为含0.05g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(4)一抗的孵育：在封闭好的酶标板中每孔加入200μl一抗稀释液，37℃孵育1h，然后用洗涤液洗涤3次，所述一抗稀释液由CaCV NP多克隆抗体与抗体稀释液按CaCV NP多克隆抗体︰抗体稀释液的体积比为1:4000混合而成，所述抗体稀释液为含0.03g/ml的BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(5)二抗的加入：每孔加入200μl二抗稀释液，37℃温育1h，温育结束后用洗涤液洗涤4次；所述二抗稀释液由辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗与抗体稀释液以1︰5000体积比的比例稀释后的溶液，所述抗体稀释液为含0.03g/ml BSA的pH 7.4的10×PBST缓冲液；所述洗涤液为pH 7.4的10×PBST缓冲液；

(6)显色反应：每孔加入TMB显色底物溶液100μl，置24℃下放置30min；

(7)终止：每孔加入显色终止液50μl，然后在酶标仪上测定各孔的OD 450nm吸光值，待阳性对照呈现黄色而阴性对照未显色时，进行判定：取阴性对照OD 450nm吸光值的2.5倍为临界值，样品的OD 450nm吸光值≥2.5倍为阳性即样品感染了辣椒褪绿病毒，样品的OD450nm吸光值＜2.5倍为阴性,所述显色终止液为用无菌水配制的浓度为2mol/L的硫酸溶液。