CN102099028B - 新型标准化组合物、制造方法及其在制备消除rna病毒感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的公开内容涉及从植物来源，即樟属、荔枝和花生属中获得的抗病毒制剂。本发明的公开内容提供了包含五聚原花青素类黄酮、三聚体和四聚体的组合物以及制备该组合物的方法。该组合物可改善免疫反应，并发现该组合物可用于治疗和控制HIV感染和AIDS以及用于预防、治疗和控制流感病毒和感染。

Description

新型标准化组合物、制造方法及其在制备消除RNA病毒感染药物中的应用
技术领域
本发明的公开内容涉及抗病毒制剂。本发明的公开内容提供了从植物中获取的抗病毒制剂，其改善免疫反应并发现可有效对抗HIV感染、AIDS以及流感病毒和感染。 
背景技术
儿茶素是属于类黄酮(flavonoid)家族的多酚植物代谢产物。儿茶素的分子式和分子量为C15H14O6和290g/mol。儿茶素和表儿茶素是差向异构体，用(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素表示，是自然界中发现的最常见的旋光异构体。 
原花青素或缩合单宁是类黄酮寡聚物，其结构单元(building block)为(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素。它们是类黄酮生物合成途径的寡聚终产物，目前在鉴定和识别它们对人类的有益效果。它们大量存在于果实、树皮、叶子和种子的植物界中，其中它们提供对于光、氧化和捕食者的保护。在许多植物中发现原花青素，主要有苹果、松树皮、肉桂树皮、荔枝果皮、花生、葡萄籽、可可、葡萄皮、山桑子(bilberry)、蔓越莓(cranberry)、黑加仑(black currant)、绿茶和红茶。 
基于连续单体单元之间的键合(linkage)，原花青素可以分类为A、B或C型多酚。 
一般地，在原花青素连续单体单元之间的键合在‘上’单元的第4位和‘下’单元的第8位之间时，产生B型原花青素。可替换地，当该键合存在于‘上’单元的C4和下单元的C6之间时，产生C型原花青素。B和C型多酚大量出现在许多植物源中。当连续单体单元通过‘上’单元的C2和C4与下单元C7位和C6/C8位(各自)处的氧之间的醚键连接时，形成A型原花青素。当与B和C型多酚相比时，A型多酚很少出现。 
对抗原的免疫反应
免疫***是在宿主体内通过鉴定和清除病原体而抵御疾病的一系列机制的集合。免疫***对病原体的反应从鉴定外源蛋白开始到最终破坏这种外源蛋白来源，从而保护该宿主。甚至来自单细胞生物的简单蛋白质的识别都涉及一系列复杂步骤，其导致该生物从宿主中的最终清除。这整个过程是对外源蛋白的存在或抗原的免疫反应。 
通过免疫***消除感染(Resolution of infection)是对抗原的免疫反应，并且其可以分成3阶段： 
激活和动员(Mobilization)：白细胞(WBC)在鉴定外源分子或抗原时被激活。免疫细胞如巨噬细胞和T细胞释放可将其它免疫细胞吸引到鉴定的外源分子部位的物质，并从而动员无数免疫细胞除去病原体。 
调节：必须控制引发的免疫反应，以便阻止对宿主造成过度损害。调节性T-淋巴细胞通过分泌用作免疫***信使的细胞因子使免疫反应容易控制，从而调节放大的免疫反应。 
消除：感染消除涉及限制病原体和从身体中清除它。在清除病原体之后，大部分WBC被破坏，残留的那些被称为‘记忆细胞’并通过引发对病原体的早期免疫反应保护宿主将来不受相同病原体感染。 
当宿主不能产生足以清除病原体的强大防御时，病原体可成功地引起感染。在此种情况下，宿主产生的抗体不足以中和现有数量的抗原。因此，游离的抗原成功地感染宿主。在此种情况下，可利用如抗生素和抗病毒剂的外部助剂(外援物，external aid)降低抗原数目。一旦抗原数目降低，则免疫反应足以清除病原体。 
HIV感染和AIDS： 
人类免疫缺陷病毒(HIV)是破坏免疫***的逆转录病毒。这种感染可以最终导致获得性免疫缺陷综合征(ADIS)，这是一种免疫***无法正常工作的严重和危及生命的病况。HIV主要感染人免疫***中的特定细胞：“辅助性”T淋巴细胞(具体为CD4+T细胞)、巨噬细胞和树突细胞。当CD4+T细胞数目下降到低于临界水平时，细胞介导的免疫丧失，身体逐渐变得对机会性感染更易感。 
HIV生命周期：一旦HIV进入宿主，则HIV需要特定宿主细胞以促进它的复制和繁殖。在HIV情况下，宿主细胞为T-细胞或CD4细胞。 
1.宿主识别和结合：HIV找到CD4细胞并通过该细胞表面上的共同受体经由“锁和钥”***粘附(连接)到其上。HIV表面上的蛋白质粘附到CD4细胞上的补体蛋白。 
2.粘附和进入宿主：在粘附之后，HIV将病毒蛋白质注射到T-细胞的细胞液(细胞质)中。这引起该细胞膜融合到HIV外膜中。 
3.病毒蛋白质的分解(disassembly)：为了将其遗传物质(RNA)用于繁殖，围绕RNA的保护性包膜必须溶解。没有这个步骤，RNA到DNA(新HIV复制的结构单元)的转化就不能发生，并且复制停止。 
4.逆转录：一旦在细胞里，HIV的单链RNA就必须转化成双链DNA。这个步骤由逆转录酶引起。逆转录酶利用来自T-细胞的结构单元从而帮助病毒RNA转化成DNA。该DNA包含HIV复制所需的遗传信息。 
5.复制和组装成新病毒粒子：为了复制，新形成的病毒DNA必须整合到宿主细胞核中。这个过程还没有完全了解，但据认为是由病毒转运蛋白辅助进行的。在整合时，该病毒逐步形成，同时宿主细胞制备它需要完成复制的蛋白质。一旦该材料可利用，则它们就被病毒基于需要和结构而剪切，并随后组装成新HIV。这个过程由蛋白酶辅助进行。 
6.从宿主细胞中出芽：病毒复制周期的最后步骤称为出芽。在遗传物质被包埋和宿主CD4细胞的膜构成新外膜的情况下，新形成的HIV夹断并进入循环，准备再次开始整个过程。 
目前干预：
目前干扰HIV复制和繁殖的方法包括：病毒进入抑制剂、膜融合抑制剂，和逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、成熟抑制剂等。FDA已批准许多药物用于治疗HIV感染。这些药物中的大部分通过它们的抗逆转录病毒(ARV)的作用机制起作用。 
人类免疫缺陷病毒(HIV)感染对全世界各国政治、经济、公共健康、社会和科学提出了挑战。在2007年结束时，全世界估计有3320万人带有HIV/AIDS。因此，迫切需要用更安全和更有效的药物控制和/或治疗这种疾病。这种病毒呈现的另外的挑战是其对突变的易感性。HIV的病毒蛋白质容易发生突变，因此耐药株造成另外的威胁，其致使需要更新的药物。 
流感病毒： 
流感是由正粘病毒科(流感病毒)的RNA病毒引起的传染性疾病，其影响鸟类和哺乳动物。通过这种病毒的感染主要影响鼻、喉、支气管，偶尔影响肺。 
流感病毒的结构：流感病毒分为3类：流感病毒A、B和C型。流感病毒的3种亚型整体结构非常相似。该病毒由病毒外膜构成，该病毒外膜包含两种主要类型的环绕中心核的糖蛋白。该中心核包含病毒RNA基因组以及包装和保护这种RNA的其它病毒蛋白。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒粒子外的两种大的糖蛋白。 
A型流感病毒：A型病毒是三种流感类型中毒力最强的人类病原体，并引起最严重的疾病。A型流感病毒可以基于抗体对这些病毒的反应再分类成不同血清型。已在人类中证实、按照已知人类流行病死亡人数排序的血清型为：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7。A型流感病毒在上世纪引起了数次流行，并继续引起每年的流行。新的流感毒株的出现继续对公众健康和科学界提出挑战。H1N1病毒是A型流感病毒的血清型，并为已知影响人类的毒力最强的毒株之一。H1N1血清型在1918年(西班牙流感(Spanish Flu))致使数百万人死亡，并且最近引起猪流感全球流行。 
流感病毒的生命周期：流感病毒复制和繁殖过程概述如下： 
1.宿主识别和结合：靶向宿主细胞的病毒利用HA蛋白结合在唾液酸上，该唾液酸结合在上皮细胞表面上的糖上。上皮细胞典型地存在于哺乳动物的鼻、喉和肺以及鸟的肠中。 
2.粘附和进入宿主：在结合之后，HA蛋白被剪切并且病毒通过内吞作用进入细胞。 
3.病毒蛋白质的分解：病毒一旦进入细胞，内体的pH和环境条件导致 
a.一部分HA将病毒包膜融合到液泡膜(vacuole membrane)。 
b.M2离子通道允许质子进入病毒核心，质子酸化了病毒核心，导致它的分解和病毒RNA的随后释放以及核心蛋白质进入宿主细胞细胞质中。 
4.逆转录：病毒RNA和核心蛋白此时被运送到细胞核中，其中RNA被转录并进一步被翻译成病毒蛋白。 
5.从宿主细胞中出芽：HA和NA蛋白在细胞膜附近形成簇，其随后也将病毒RNA和核心蛋白包在其中，然后导致病毒‘出芽’和用于随后感染的繁殖。 
从上面详述的感染和繁殖步骤可以看出，HA和NA在感染中发挥重要作用。在释放病毒粒子之前，NA也剪切唾液酸以便阻止HA结合到唾液酸上。 
A型流感病毒的目前干预：美国FDA批准了两类对抗A型流感病毒的药物：离子通道抑制剂如金刚烷(金刚烷盐酸盐和金刚烷乙胺)，和神经氨酸酶抑制剂，如奥塞米韦(TAMIFLU)和扎那米韦(RELENZA)。 
A型流感病毒易于突变。这些突变主要为病毒蛋白质的，如NA、HA和M2离子通道蛋白质，因而这些蛋白质的抑制剂将对突变株无效。该突变潜力和2009年A型流感全球流行表明迫切需要提供对抗这种病毒的治疗和预防的选择方案。 
现有技术 
Richard Anderson等人，“Isolation and characterization ofpolyphenols Type A polymers from cinnamon with insulin-likebiological activity”in the Journal of Agricultural and FoodChemistry，2004，pp 52，65-70.
这篇论文描述了商业肉桂的水性提取物，并且已经鉴定了在体外细胞系中增加葡萄糖代谢约20倍的多酚聚合物。他们已使用樟属桂皮(Cinnamomum cassia)(Korintji桂皮)用于制备这种提取物。这种品种具有较高含量的香兰素和肉桂醛。 
这篇论文进一步描述了用于制备和表征这种水性提取物的制备型HPLC方法。 
该出版物描述了儿茶素的A型双键结合(doubly linked)的原花青素。这篇论文已鉴定出从肉桂中分离的儿茶素的三聚体(分子量864)、四聚体(分子量1152)和寡聚体。 
Kilkuskie等人，“HIV and reverse transcriptase inhibition bytannins”in the Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，1992，Vol 2，pp 1529-1534.
该出版物评价了单宁和缩合单宁的抗HIV活性以及它们抑制逆转录酶的潜力。尽管这项研究发现了一些具有抗HIV活性的单宁，但它们具有关联毒性。该出版物描述了3种儿茶素缩合形式的化合物。分子40、44和45是儿茶素的二聚体、三聚体和四聚体。这篇论文总结出RT酶的抑制作用与这些单宁的抗HIV活性之间没有关系。另外，分子44和45分别表现出90％和73％的抗HIV活性，但没有表现出对RT酶的显著抑制。 
Michael Ovadia等人，专利申请US 2006 275515A1
这篇题目为“Anti-viral preparations obtained from a naturalcinnamon extract”的专利已描述了从肉桂中获得的天然水性提取物，其具有抗病毒特性。这篇文献描述了肉桂的水提取物，在有盐的情况下，该水提取物经历盐析析出沉淀。将这种沉淀物再溶解在水或缓冲液中，并利用琼脂糖凝胶色谱纯化，随后用另外的缓冲液和半乳糖洗脱。 
常用的盐析过程涉及高分子量分子(通常为肽)的选择。因此，这个过程很显而易见的是，这篇文献中描述的过程旨在回收高分子量分子(约10Kda)。 
按照权利要求，该组合物的活性成分具有大于10KDA的分子量，并且它对应于在280nm处约15至20OD之间的吸光度。这种化合物最终利用磷酸盐缓冲液和半乳糖从sepharon柱中洗脱。因此，最终的化合物具有高浓度的磷酸盐和半乳糖。 
此申请中描述的这种高分子量化合物已经在流感A PR 8病毒、副流感(仙台)病毒、到红细胞中的预吸收，和用流感或仙台病毒感染的小鼠体重增加和HIV合胞体研究进行了检测。 
此专利申请的实施例13描述了在MT2细胞中利用这个提取物完成的试验，从而检查对合胞体形成的影响。按照此申请的图15，在浓度为60～100微克时它抑制了合胞体形成。合胞体形成不是抗病毒活性的证实试验。这在下面出版物中用证据阐明。[Gueseppe pantaleo等人，Eur Jimmunology 1991，21，1771：1774‘dissociation between syncytiaformation and HIV spreading.Suppressing Syncytia formation does notnecessarily reflect inhibition of HIV infection.] 
尽管所公开的提取物表现出抑制合胞体形成的潜力，但应当注意，仅一些HIV株导致合胞体形成。另外，合胞体形成不能与HIV感染或AIDS 的存在或进展相联系。合胞体形成仅为可被一些株表达的表型。合胞体形成的缺乏不能与HIV的缺乏或感染的控制相联系。 
发明内容
本发明公开的目的 
本发明的公开内容的第一个目的在于提供一种组合物，该组合物包含植物来源的五聚原花青素类黄酮、三聚体和四聚体。 
本公开内容的第二个目的在于提供一种制备组合物的方法，该组合物包含植物来源，例如樟属(Cinnamomum)、荔枝(Litchi)和花生属(Arachis)的五聚原花青素类黄酮、三聚体和四聚体。 
本公开内容的第三个目的在于提供一种组合物，该组合物可改善受治疗者中的免疫反应并且也可有效对抗HIV感染、AIDS和流感病毒和感染。 
本发明公开的陈述 
因此，本发明的公开内容涉及一种组合物，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂；本发明的公开内容还涉及一种用于制备组合物的方法，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体，所述方法包含以下步骤：利用有机溶剂提取粉碎的植物块从而除去有毒物质、干燥该块从而除去有机溶剂、利用水性溶剂再次提取该干燥的块从而获得提取物、通过色谱柱纯化该提取物并接着浓缩、纯化、标准化和干燥，从而获得该组合物；本发明的公开内容还涉及一种改善对其有需要的受治疗者中的免疫反应的方法，所述方法包括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度 范围为约55％w/w约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及和可选地连同药用赋形剂；本发明的公开内容还涉及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录病毒感染的方法，所述方法包括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。 
附图说明
图1示出了类黄酮五聚体的分子结构。 
图2示出了类黄酮五聚体的EI-MS。 
图3示出了类黄酮五聚体的13C NMR。 
图4示出了组合物的快速色谱从而鉴定类黄酮五聚体。 
图5示出了黄酮五聚体的HPLC。 
具体实施方式
本发明的公开内容涉及一种组合物，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，该组合物从植物来源获得，该植物来源选自包括樟属、荔枝和花生属的组。 
在本公开内容的一个另外的实施方式中，五聚原花青素类黄酮的优选浓度范围为约80％w/w约99％w/w，三聚体和四聚体的浓度范围均为约0.5％w/w～约20％w/w。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述五聚原花青素类黄酮具有约1440的分子量。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述五聚体为A型原花青素五聚体。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述赋形剂选自包括树胶(gum)、造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂(矫味剂)、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂(spheronization agent)的组。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物被配制成各种剂型，该剂型选自包括片剂、锭剂(troche)、***片(lozenge)、水性或油性悬浮剂、分散粉剂或颗粒剂、硬或软凝胶胶囊中的乳剂、糖浆和酏剂的组。 
本发明的公开内容涉及一种用于制备组合物的方法，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体，所述方法包括以下步骤：利用有机溶剂提取粉碎的植物块从而除去有毒物质、干燥该块从而除去有机溶剂、利用水性溶剂再次提取该干燥的块从而获得提取物、以及通过色谱柱纯化该提取物，接着浓缩、纯化、标准化和干燥，从而获得该组合物。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，该粉碎的植物块选自包括樟属、荔枝和花生属的植物的组。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该有机溶剂选自包括乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸2-乙基己酯以及它们的任何组合的组。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述提取进行从约8小时到约12小时范围的时间段，优选约10小时。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述有毒物质包括香豆素和醛。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述提取物通过二阶段(两段，two stage)色谱柱过滤。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述色谱柱选自包括XAD-1180、XAD-7HP和XAD-1140树脂的组。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述用水性溶剂再提取在约3.8～约5.8的pH范围内进行，优选pH为约4.0。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述再提取在约30℃～90℃的范围内的温度下，优选在31℃～40℃之间的范围内，进行约8小时～约12小时范围内的时间段，优选约10小时。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述水溶剂是酸化的去离子水。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物进一步包含赋形剂，该赋形剂选自包括树胶、造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂的组。 
本发明的公开内容涉及一种改善对其有需要的受治疗者中的免疫反应的方法，所述方法包括向受治疗者给予药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、 浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该免疫反应在选自但不局限于流感、HIV感染和AIDS的组中的疾病中被改善。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该免疫反应在对其有需要的受治疗者中被改善。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约1mg/kg～约100mg/kg受治疗者体重的范围内。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述方法用于治疗、预防和控制由受治疗者中的病原体引起的感染。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述病原体包括A型流感病毒和HIV病毒。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述病毒类型为H1N1、H3N2、X4和R5热带(tropic)病毒。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者为动物或人类。 
本发明的公开内容涉及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的病毒感染的方法，其中所述方法包括给予受治疗者药物有效量的组合物作为抗病毒制剂的步骤，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及和可选地连同药用赋形剂。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，所述组合物抑制A型流感病毒、HIV的X4热带病毒和HIV的R5热带病毒。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约1mg/kg～约100mg/kg受治疗者体重的范围内。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者是动物或人类。 
本发明的公开内容涉及一种治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录病毒感染的方法，所述方法包括给予受治疗者药物有效量的组合物的步骤，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，所述逆转录病毒感染包括A型流感感染和HIV感染和AIDS。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该药物有效量的组合物在约1mg/kg～约100mg/kg受治疗者体重的范围内。 
在本发明的公开内容的一个另外的实施方式中，该受治疗者为动物或人类。 
本发明的公开内容涉及一种源自植物来源、标准化至如图1所示A型原花青素黄酮(flavanoid)五聚体的50％～99％的新型标准化组合物。本发明的公开内容还涉及一种获得源自植物来源、标准化至A型原花青素黄酮五聚体的50％～99％的新型标准化组合物的方法。本发明的公开内容还涉及源自植物来源、标准化至50％～99％的A型原花青素黄酮五聚体的新型标准化组合物在预防、治疗和控制HIV和流感感染方面的用途。 
本发明的公开内容还涉及源自植物来源、标准化至50％～99％的A型原花青素黄酮五聚体的新型标准化组合物在对其有需要的受治疗者中导致改善的对抗原的免疫反应的用途。 
在本发明的公开内容的另外的实施方式中，该免疫反应在性质上可以是治疗、控制或预防性的。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，用于获得组合物的植物来源为樟属、荔枝和花生属。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，该源自植物来源的新型标准化组合物标准化为A型原花青素黄酮五聚体。 
在本发明的公开内容的另一个实施方式中，如图1所示，五聚体具有1440的分子量。 
在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物包含在50％～99％范围内的五聚体。 
在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物包含在1％～35％范围内的三聚体和四聚体。 
在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该组合物为如图5中色谱图所表征的。 
在本发明的公开内容的另一个实施方式中，该新型组合物的单体单元选自儿茶素的组，优选儿茶素或表儿茶素。 
本发明的公开内容还涉及一种通过本文中示出的方法制造新型组合物的方法。 
在本发明的公开内容的一个实施方式中，该标准化组合物可选地还包含药用赋形剂。 
在本发明的公开内容的另外的实施方式中，该赋形剂选自包括添加剂、树胶、甜味剂、包衣、粘合剂、崩解剂、润滑剂、崩解剂、悬浮剂、溶剂、着色剂、助流剂、防粘剂、防静电剂、表面活性剂、增塑剂、乳化剂、调味剂、粘度增强剂和抗氧化剂的组。 
在本发明的公开内容的又一个实施方式中，该组合物被配制成这种剂型，如液体、粉剂、胶囊剂、片剂、可注射剂、贴片、软膏、凝胶剂、乳剂、乳膏剂、乳液、洁牙剂、喷雾剂和滴剂。在本公开内容的又一个实施方式中，该组合物是粉剂或液体。 
本发明的公开内容还涉及一种获得源自植物来源、标准化至50％～99％的A型原花青素黄酮五聚体的新型标准化组合物的方法，其中该方法包括以下步骤： 
1.将该植物原材料研磨成预定尺寸 
2.用有机溶剂提取从而除去不需要的有毒物质 
3.用去离子水对植物粉末进行水性提取 
4.利用二阶段(两段)色谱纯化装置进行提取物纯化 
5.干燥、混合和过滤从而获得包含如图1所示纯度为50％～99％的黄酮五聚体的组合物。 
本发明的公开内容还涉及本新型组合物可选地连同赋形剂在制造用于治疗和控制HIV以及预防、治疗和控制流感病毒感染的药剂方面的用途。本发明的公开内容还涉及本组合物可选地连同赋形剂在制造治疗和控制HIV感染以及预防、治疗和控制对其有需要的受治疗者中流感感染的药剂方面的用途。 
本发明的公开内容还涉及本组合物可选地连同赋形剂在制造改善对其有需要的受治疗者中的免疫反应的药剂方面的用途。本发明的公开内容还涉及本组合物在对其有需要的受治疗者中引起免疫反应改善方面的用途。 
在本发明的公开内容的又一个实施方式中，该受治疗者是动物和人类。 
本发明的公开内容还涉及一种制造源自植物来源、标准化至50％～99％的A型原花青素黄酮五聚体新型标准化组合物的方法，该方法包括以下步骤： 
1.研磨植物肉桂或荔枝果皮，或者带有红色种皮的花生壳(groundnutshell) 
2.利用主要由乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯或乙酸2-乙基己酯组成的有机(优选酯)溶剂作为单种溶剂或上述溶剂的混合物，提取该材料从而除去脂肪和毒素以及其它芳香化合物。这个步骤对于肉桂是可选的 
3.干燥所提取的植物材料从而不含该溶剂 
4.用pH为4或pH在3.8～5.8之间，优选pH为4.0的去离子水提取。利用二阶段(两段)色谱分离法进行提取物纯化，一阶段(一段)用于极性分子而另一阶段(一段)用于非极性分子 
5.利用醇溶剂洗脱所吸附的材料 
6.将所洗脱的溶剂浓缩为细粉末 
7.用水稀释该浓缩物，并可选地喷雾干燥从而清除残余的溶剂。 
通过上述方法获得的新型组合物包含50％-99％五聚体、1％-35％三聚体和1％-35％四聚体，并如图5中所示表征的。 
本发明的公开内容利用下面实施例进一步地详细描述。然而，这些实施例不应当理解为限制本发明公开内容的范围。 
实施例1 
将平均尺寸从16网目尺寸(mesh size)起的1000g粉碎的肉桂粉末浸泡在3000ml乙酸乙酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛(perforatedbottom sieve)的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在约8小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30℃下的强制通风炉(forced draft oven)中进行干燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装块用5000ml pH为4.0的酸性去离子水提取，将该提取物在35℃下在床层(bed)上循环约8小时从而实现有效提取。 
将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得具有80％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。该柱用不含附着物(adhering substance)的D.M.水彻底清洗，并且洗脱剂是中性的。将该柱进一步用175ml纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40℃的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。 
喷雾干燥器：             并流(同向流)气流(Co current airflow) 
进口温度：               140℃ 
出口温度                 60℃ 
雾化器(Atomizer)RPM      14000 
最终重量为5g。 
实施例2 
将平均尺寸从16网目尺寸起的1000g粉碎的肉桂粉末浸泡在3000ml乙酸乙酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在约10小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30℃下的强制通风炉中进行干燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装块用5升pH为4.0的酸性去离子水提取，将该提取物在35℃下在该床层上循环约8小时从而实现有效提取。 
将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得75％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体的组合物。首先将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分子，并且色谱分离的第二阶段用于提取组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D.M.水彻底清洗，并且洗脱剂是中性的。将该柱进一步用250ml纯甲醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40℃的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。 
喷雾干燥器：                并流(同向流)气流 
进口温度：                  145℃ 
出口温度                    60℃ 
雾化器RPM                   14000 
最终重量为4.5g。 
实施例3 
将平均尺寸从16网目尺寸起的1000g粉碎的肉桂粉末浸泡在2500ml乙酸丁酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在10小时的时间段内实现有效提取。弃 去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30℃下的强制通风炉中进行干燥。在通过蒸发除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。该填装块用酸性脱矿质水(demineralised water)提取，将该提取物在30℃下在该床层上循环约12小时从而实现有效提取。 
将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得89％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物首先通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D.M.水彻底清洗，并且洗脱剂是中性的。将该柱进一步用200ml纯乙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40℃的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。 
喷雾干燥器：            并流(同向流)气流 
进口温度：              145℃ 
出口温度                60℃ 
雾化器RPM               14000 
最终重量为4.8g。 
实施例4 
将平均尺寸从16网目尺寸起的1000g粉碎的肉桂粉末浸泡在2500ml乙酸丁酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在10小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30℃下的强制通风炉中进行干燥。在通过蒸发除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装块用5升酸性去离子水提取，将该提取物在30℃下在该床层上循环约12小时从而实现有效提取。 
将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得99％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体的组合物。首先将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D.M.水彻底清洗，并且洗脱剂是中性的。将该柱进一步用纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40℃的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。 
喷雾干燥器：        并流(同向流)气流 
进口温度：          145℃ 
出口温度            60℃ 
雾化器RPM           14000 
最终重量为5g。 
实施例5 
将平均尺寸从16网目尺寸起的1000g粉碎的肉桂皮(cinnamoncassia)粉末浸泡在3000ml乙酸乙酯中，并倒入具有200网目筛的多孔底筛的提取器中。将底部洗脱剂在填装块上反复循环从而在约8小时的时间段内实现有效提取。弃去洗脱剂，从提取器中取出该块并在30℃下的强制通风炉中进行干燥。在通过干燥除去溶剂之后，将该块再次填装在提取器中。将该填装块用5000ml pH为4.0的酸性去离子水提取，并且将该提取物在35℃下在该床层上循环约8小时从而实现有效提取。 
将该提取物通过二阶段色谱柱过滤，从而获得具有55％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体的组合物。将该提取物通过第一柱从而提取组合物的相对较小极性的分子，并且色谱分离的第二阶段用于组合物的相对较高极性的分子。所使用的树脂分别为XAD-1180和XAD-7HP树脂的等效物。将该柱用不含附着物的D.M.水彻底清洗，并且洗脱剂是中 性的。将该柱进一步用175ml纯异丙醇洗脱，并且所收集的洗脱剂在低于40℃的真空下浓缩，用水稀释并在下面条件下喷雾干燥。 
喷雾干燥器：        并流(同向流)气流 
进口温度：          140℃ 
出口温度            60℃ 
雾化器RPM           14000 
最终重量为2.5g。 
实施例6：荔枝干果皮中的提取物 
将1000g粉碎的干荔枝果皮浸泡在5000ml体积的酸化水中12小时时间并过滤澄清。将该澄清的滤液通过含有等效于XAD-1140和XAD-7HP的吸附树脂的柱从而捕获极性和相对非极性化合物。用乙醇洗脱为非极性柱的第一柱，并且浓缩洗脱液从而获得易流动粉末，产率500mg。用乙醇分开洗脱含有所有极性物质的第二柱，并浓缩从而获得1g粉末。在HPLC分析中，这个馏分表示85％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体。 
实施例7：磨碎的花生壳连同该磨碎的花生壳的红皮中的提取物 
将1000g干磨碎的花生壳连同该种子上的红皮浸泡在5000ml体积pH为3.8的酸化水中48小时，然后过滤得到澄清液体。使该澄清的滤液通过含有等效于XAD-1140和XAD-7HP的吸附树脂的柱从而捕获极性和相对非极性化合物。用乙醇洗脱非极性柱的第一柱，并浓缩洗脱剂从而获得易流动粉末，产率20g。用乙醇分开洗脱含有所有极性物质的第二柱，并浓缩得500mg粉末。在HPLC分析中，这个馏分表示如图5中所示的82％的分子量为1440的A型原花青素黄酮五聚体。 
实施例8：纯化从而获得黄酮五聚体 
将通过实施例1-6中详述的方法分离出的粉末溶解在200体积的水中，并过滤澄清。将该澄清的滤液在60℃下用活性炭处理从而脱去该溶液的颜色，并在滤纸上过滤澄清从而除去所有不溶性颗粒。将由此获得的过滤的溶液用乙酸乙酯提取两次从而除去所有可溶性溶剂，并浓缩从而得到粉末。使用下面参数以快速色谱利用0.1％含水甲酸和0.1％甲醇甲酸以梯度方式，在反向C-18硅胶上对该粉末进行柱色谱分析。 
设备：带有可变UV检测器的Combiflash Companion 
柱：Redisep 12gms(反相硅胶) 
检测波长：254nm和280nm 
流速：18ml/min 
峰管体积：18ml 
峰宽：1min 
阈值：0.20AU 
溶剂A：0.1％含水甲酸 
溶剂B：0.1％的甲酸在乙腈中的溶液 
弃去1～19号的馏分。收集20～22号的馏分并浓缩从而得到256g淡棕色粉末。在TLC筛选的0.1M乙酸钠∶乙腈＝7∶3比率的溶剂体系中，所得粉末在0.75Rt处出现UV吸收点，在用茴香醛/硫酸试剂喷雾时，出现被认为是原花青素特征的橙色斑点。 
在m/z 1439.9处的EI-MS(M-H)(如图2中示出的)离子峰对应于相当于总共5个单元的儿茶素组分(288倍)中的多个部分(multicompartment)。分离的化合物的分子量为1440.9。儿茶素单元的结构与通过偶联模式(coupling pattern)证实的表儿茶素结构一致。在δ4.84～4.91之间有两个信号，在黄烷-3-醇单元中2，3-顺式立体化学单峰(由于高分子量寡聚体引起的峰加宽)有四个信号。由于高分子量寡聚性质，所以在观 察的δ2.6～2.9m加宽的峰之间观察到在末端单元终环-CH2-亚甲基质子的4位置处的F-环信号。芳香族区域信号在δ6.6～7.6之间，如相对于环B和E的两个体系。在δ100.9处看到的符合C2碳和C4碳顶环C的δ27.9的13C碳信号，证实与中间体系环的双键合，如图3中所示出的。 
包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体、以及可选地包括药用赋形剂的组合物，通过按照如上所述的实施例1～8获得。另外，该组合物用于在下面实施例9～14中所述的体外和体内活性。 
实施例9：在用环磷酰胺处理的受治疗者中(受损的(compromised)免疫***)测试组合物对体液抗体滴度的影响 
基于所接受的治疗，将两种性别的瑞士小白鼠分成5组，每组6只动物。 
在0天时，所有五组均用生理盐水中的含1x108个细胞的绵羊红细胞(SRBC)敏化。2-5组用标准药物和测试组合物组合处理8天(0天～7天)。在7天时，通过眼球后穿刺(retro orbital puncture)从五组中的每只小鼠中采集血液样品，用于确定初次抗体滴度。随后在7天时，在抽血之后，用0.1ml SRBC到足垫(foot pad)中来激发(challenge)小鼠。在14天时，通过眼球后穿刺从每只小鼠中采集血液样品，用于确定二次抗体滴度。 
此测试的结果如下： 
Figure BDA0000044136430000241
体液免疫作为第一道防线保护宿主不受感染。提高的体液免疫提供了抗感染性病原体的更大保护。个体对抗原的反应变化取决于包括基因构成和个体经历的许多因素。环磷酰胺是压制免疫***的药物。通过使用这种药物，可根据它们对抗原的反应，判断这项研究中评价的所有动物。 
如上面表格中所示，测试组合物反映出免疫受损受治疗者的初次和二次抗体滴度的增加。初次和二次抗体滴度(体液免疫)呈多倍增大。这种免疫反应因为抗原的出现、SRBC而增强，并受到由于用环磷酰胺预处理所引起的免疫反应的波动的影响。 
实施例10：测试组合物对腹膜巨噬细胞、血液多核细胞吞噬活性的作用 
当有效时，增强对抗原的免疫反应，需要用于确定这种攻击有效性的进一步评价。该有效性通过清除病原体的免疫反应能力评价。这通过评价该反应的吞噬能力来确定。 
将任一性别的瑞士小白鼠分成3组，每组6只动物。向3组中的每组给予单剂量的对照和测试组合物。 
每组处理20天的时间段，并且在第21天腹膜内给予它们5ml冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)。随后，采集腹膜液并利用血细胞计数器中的WBC平方(square)计数巨噬细胞数目。评价每立方毫米的细胞计数。继续处理剩余的老鼠直至28天，并在第29天从眼球后丛(plexus)中抽血。将从每只小鼠中抽取的两滴血液放置在玻璃片(slide)上并使其凝结，然后将其放置在维持在37℃下的保湿室中25分钟。这些粘附细胞用白色念珠 
菌孢子悬浮液孵化，并通过染色观察。随后计数已摄取念珠菌悬浮液的细胞数目。 
吞噬指数和吞噬％利用下面公式计算： 
Figure BDA0000044136430000262
吞噬％＝每100个观察细胞中已摄取念珠菌的PMN细胞数目 
进行上述步骤，将结果列表： 
上述结果表明，腹膜巨噬细胞数量和吞噬活性增大。巨噬细胞数目的增大是对抗原的免疫反应提高的直接指示。另外，这些巨噬细胞的吞噬活性增大是它们对抗原有效性的证据。 
实施例11：测试组合物对宿主对抗大肠杆菌引起的腹部败血症的耐药性的作用 
将任一性别的瑞士小白鼠分成3组，并用对照和测试组合物处理。将单剂量给予小鼠，持续28天。在第29天时，给小鼠腹膜内注射PBS中的含2.5x109的大肠杆菌悬浮液。在注射之后24小时中，观察小鼠的死亡率。所观察到的死亡率是由于大肠杆菌感染所引起的并也称为败血症。进一步观察存活动物的死亡率，持续7天。 
此实验的结果列表如下： 
  组   处理   24小时的死亡率
  1   对照   8/8
  2   10mg/kg的测试组合物   8/8
  3   50mg/kg的测试组合物   3/8
从上面结果可以看出，在对照和低剂量测试组合物的情况下，死亡率是100％。在50mg/kg剂量的测试组合物下，死亡率降低了63％。与其它两组中所有8只小鼠都死亡相比，该8只小鼠中仅3只死亡。此外没有进一步观察到这个第3组中小鼠的死亡。 
这表明测试组合物对宿主的预防作用。用测试组合物进行的预处理降低了暴露到病原体的小鼠死亡率。这证实了测试组合物阻止病原体引起感染的能力，该病原体包括细菌和病毒。 
在病原体存在的情况下，这种阻止感染是由于组合物引发了免疫反应的增强引起的。这种反应使得宿主能够控制病原体数目，从而阻止感染。 
实施例12：A型(H1N1&H3N2)流感病毒的抑制 
此实施例表明测试组合物抑制H1N1和H3N2病毒的效能，并因此确立其作为治疗、预防和控制这种病毒感染的方法的有效性。 
在用H1N1和H3N2病毒注射前一天，将Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞(每孔3×105个细胞)接种到6-孔板中。3天后，在将3mL覆盖培养基(overlay medium)加入到每孔中之前，连续用稀释的H1N1和H3N2病毒感染细胞。在40个小时之后，该细胞用10％***固定1小时，并用1％结晶紫染色15分钟。根据计数的斑块确定病毒滴度。 
病毒对化合物的易感性通过空斑减少测定确定。该方法类似于空斑测定，不同之处在于，将指示量的化合物加入到覆盖培养基中。抑制百分比计算为[100-(VD/VC)]×100％，其中VD和VC分别指在存在和不存在该化合物的情况下的病毒滴度。空斑数目减少50％(EC50)所需要的化合物的最低浓度通过由空斑测定产生的剂量反应曲线回归分析来计算。 
Figure BDA0000044136430000282
从上面表格明显可以看出，用测试组合物处理的感染细胞表现出空斑形成的显著降低。另外，该测试组合物表现出对抗达菲耐药H1N1株的高 效性，因此证明了它作为潜在治疗流感(H1N1)病毒感染的有效性。并且，第2个表格还表明该测试组合物在抑制A型流感病毒的H3N2株方面的有效性。 
实施例13：测试组合物对PBMC刺激的HIV-1(X4热带病毒和R5热带病毒)的作用 
在将HXB2分子克隆转染到293T细胞中之后48小时获得HIV-1(HXB2-X4热带)病毒。病毒滴度通过实时PCR检测。然后将病毒对24孔中的植物凝集素(PHA)刺激的外周血单核细胞(PBMC)进行感染。在16-18小时之后，PBMC用磷酸盐缓冲溶液(PBS)进行清洗并加入具有2％胎牛血清(FBS)的新鲜Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基。在感染后3、5和7天(dpi)收集细胞和病毒汤(virus soup)。 
在用HXB2HIV-1病毒(X4病毒和R5病毒)转染的植物凝集素(PHA-2μg/mL)刺激的PBMC细胞中，测试该测试组合物和3个标准药物(AZT、AMD3100和Tak-779)。发现感染复数(MOI)为0.26。在感染后3天、5天和7天通过如上面描述的RT-PCR进行病毒载量检测。 
AMD3100仅表现出对抗CXCR4热带病毒的抑制活性(平均EC50＝2.05nM)，而Tak-779仅表现出对抗CCR5热带病毒的抑制活性(平均EC50＝0.56nM)。AZT表现出对CCR5热带和CXCR4热带病毒的抑制活性。该测试组合物对X4病毒表现出的EC50值为22.5μg/mL(15.625nM)，而对R5病毒为15.5μg/mL(10.77nM)。这些值是可比的，并在一些情况下比所使用的标准药物更有效。 
实施例9-11表明该测试组合物的免疫反应特性，而实施例12-13示出该测试组合物对抗HIV和流感病毒(H1N1)的抗病毒作用。结合在一起，实施例9-13表明该测试组合物通过两种长期的机制对阻止感染起作用：增强的免疫反应可以用作保护或预防选择从而同时阻止感染。其次， 在感染的情况下，测试组合物的抗病毒特性可减少病毒载量(HIV和流感)，从而使得免疫反应增强以消除感染并阻止进一步损害。重要的是要注意，这种免疫反应是仅在抗原存在的情况下引发的。这通过没有动物表现出炎症迹象和/或与过度激活免疫***关联的其它症状的事实证实。 
该测试组合物的这种特性使其非常适合长期用作阻止感染的预防剂。 
不仅在宽广的组合物浓度范围内，本公开内容的组合物可改善免疫反应，该组合物包含浓度范围为约55％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约35％w/w的三聚体和四聚体。在组合物的特定浓度范围内，该组合物引发免疫反应的效能更好/显著，该组合物包含浓度范围为约80％w/w～约99％w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为约0.5％w/w～约20％w/w的三聚体和四聚体。 
实施例14：示出该新型组合物在HIV和AIDS病人中的效能和安全性的概念验证性研究 
在40个抗逆转录病毒初始、无症状的HIV-1感染患者中，进行预期的、双盲、随机、安慰剂控制研究。在40个CD4计数为250-500/mm3之间的抗逆转录病毒初始、无症状的HIV-1感染患者中研究该测试组合物。该测试组合物以300mg/天测试12周，并以胶囊剂型给药。与表现出病毒载量增加67.28％的安慰剂相比，该测试组合物表现出病毒载量降低11.29％。CD4计数在两组中都减少，但发现测试组合物组中CD4计数减少百分比是安慰剂组中的一半(与安慰剂中13.88％的减少量相比，在测试组合物中为7.74％)。因此，发现该测试组合物对于大部分重要器官功能和生化参数都是安全和有效的。 
实施例14详述了测试组合物抑制病毒载量的能力，从而证实该测试组合物的抗病毒作用。而且，当与安慰剂相比时，WBC(CD4)计数的提高是改善免疫反应的重要指示。 

Claims (15)

1.一种用于制备组合物的方法，所述组合物包含浓度范围为55%w/w～99%w/w的A型五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为0.5%w/w～35%w/w的原花青素类黄酮的三聚体和四聚体，所述方法包括以下步骤：
a）利用有机溶剂提取来自于选自由樟属（Cinnamomum）、荔枝（Litchi）和花生属（Arachis）所构成的组中的植物的粉碎的植物块从而除去有毒物质，其中，所述提取进行从8小时到12小时范围的时间段，其中，所述有机溶剂选自由乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸2-乙基己酯以及它们的任何组合所构成的组；
b）干燥所述块从而除去所述有机溶剂；
c）利用水性溶剂再次提取干燥的所述块从而获得提取物，其中，所述用水性溶剂再次提取在3.8～5.8的pH范围内，在30℃～90℃的温度范围内，进行8小时～12小时的时间段，其中，所述水性溶剂是酸化的去离子水；以及
d）通过二阶段色谱柱纯化所述提取物，接着浓缩、纯化、标准化和干燥从而获得所述组合物，所述色谱柱选自由XAD-1180、XAD-7HP和XAD-1140树脂所构成的组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有毒物质包括香豆素和醛。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述提取进行了10小时的时间段；所述用水性溶剂再提取在4.0的pH下进行；并且所述再提取在31℃～40℃的温度范围内，进行10小时的时间段。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包含赋形剂，所述赋形剂选自由树胶、造粒剂、粘结剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、增塑剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、防静电剂、和滚圆剂所构成的组。
5.一种组合物，包含浓度范围为55%w/w～99%w/w的五聚原花青素类黄酮、浓度范围均为0.5%w/w～35%w/w的原花青素类黄酮的三聚体和四聚体、以及可选地连同药用赋形剂，其中，所述组合物通过权利要求1-4中任一项所述的方法制备。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述五聚原花青素类黄酮的浓度范围为80%w/w～98%w/w，三聚体和四聚体的浓度范围均为0.5%w/w～20%w/w。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述五聚原花青素类黄酮具有1440的分子量，并且所述五聚体为A型原花青素五聚体。
8.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述组合物被配制成各种剂型，所述剂型选自由片剂、锭剂、水性或油性悬浮剂、分散粉剂或颗粒剂、硬或软凝胶胶囊中的乳剂、糖浆和酏剂所构成的组。
9.权利要求5所述的组合物在制造用于改善对其有需要的受治疗者中在选自由A型流感感染和HIV感染所组成的组的疾病中的免疫反应的药物中的应用，所述药物包括药物有效量的所述组合物。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述药物有效量的组合物在1mg/kg～100mg/kg受治疗者体重的范围内；并且所述药物用于治疗、预防和控制由受治疗者中的病原体引起的感染。
11.根据权利要求9所述的应用，其中，所述A型流感病毒选自由流感病毒H1N1和H3N2组成的组，且所述HIV病毒选自由HIV X4热带病毒和HIV R5热带病毒组成的组。
12.根据权利要求9所述的应用，其中，所述受治疗者为动物或人类。
13.权利要求5所述的组合物在制造用于治疗、预防和控制对其有需要的受治疗者中的逆转录病毒感染的药物中的应用，所述药物包括药物有效量的所述组合物，其中，所述逆转录病毒感染选自由A型流感感染和HIV感染组成的组。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述药物有效量的组合物在1mg/kg～100mg/kg受治疗者体重的范围内；并且所述受治疗者为动物或人类。
15.根据权利要求13所述的应用，其中，所述A型流感感染是A型流感病毒导致的病毒感染，所述HIV感染是HIV的X4热带病毒或HIV的R5热带病毒导致的病毒感染。
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