JP2015214501A

JP2015214501A - ウイルスの細胞内増殖抑制剤、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤および抗ウイルス剤

Info

Publication number: JP2015214501A
Application number: JP2014097204A
Authority: JP
Inventors: 雄二厚澤; Yuji Atsuzawa; 俊治服部; Toshiharu Hattori; 由之吉仲; Yoshiyuki Yoshinaka; 安貴子川▲崎▼; Akiko Kawasaki; 山本　直樹; Naoki Yamamoto; 直樹山本; 昇司山岡; Shoji Yamaoka
Original assignee: Nippi Inc
Current assignee: Nippi Inc
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2015-12-03

Abstract

【課題】エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とするウイルスの細胞内増殖抑制剤等を提供する。
【解決手段】エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤またはＭｎ−ＳＯＤ活性化剤である。ウイルスの細胞内増殖抑制効果は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶやインフルエンザウイルス、ネコカリシウイルスに対して有効であり、ウイルス種に依存せずにウイルスの細胞内増殖抑制効果を有することから、従来ウイルスのほかに新興・再興ウイルスにも抗ウイルス作用として使用することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤および抗ウイルス剤に関する。

ウイルス感染症に対するワクチンの開発は、人類の生存に計り知れない貢献をなして来た。しかしながら、ワクチンの開発が困難であるウイルス性疾患も多く、これらに対する予防法や治療法の開発は、膨大な研究にも拘らず有効なものは限られている。ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、コモンコールド、サイトメガロ、ＲＳ、新型インフルエンザに対するワクチン開発は困難を極め、新型ＳＡＲＳのほか、未知ウイルスや再興ウイルス等の感染症などに対する対策が急務とされている。

ワクチン以外の対策として、従来からウイルスに特異的な酵素を標的とした阻害剤がある。ヘルペスウイルスに対するチミジンキナーゼ阻害剤、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する逆転写酵素、プロテアーゼ阻害剤及びインテグラ―ゼ阻害剤、インフルエンザウイルスに対するノイラミニデース阻害剤などが代表的なものである。しかしながら、適用しうるウイルスの種類は限られたものとなっている。

また、細胞が内在的に兼ね備えているウイルス感染防御因子であるインターフェロンを利用する方法もある。Ｃ型肝炎ウイルスの約半分に有効であり、リバビリンなどとの併用により効果の向上が図られているが、これらもＣ型肝炎ウイルス以外のウイルス感染症には効果がない。

また、従来から天然物由来成分を利用するものもある。例えば、柿抽出物処理物を有効成分とするエンベロープウイルスに対する抗ウイルス剤がある（特許文献１）。柿抽出物処理物に含まれるカテキン類、ワットルタンニン、ペンタガロイルグルコース、コーヒータンニン、ピロガロール、没食子酸、五倍子タンニンなどを有効成分とするものである。

一方、プロアントシアニジンによる抗ウイルス作用を示す事例もある（特許文献２）。プロアントシアニジンは、リンゴ、ブドウ、松樹皮、ニッケイ、ピーナッツ種皮など多くの植物に含まれるポリフェノール化合物であり、カテキン、エピカテキンなどのフラバン−３−オールが重合した化合物である。ブドウ抽出物からアントシアニジンの重合体を抽出し抗ウイルス効果を評価したところ、アントシアニジンの３〜７重合体が有効であるという。

国際公開第０１／００６７８６９号特開２００５−３１４３１６号公報

抗ウイルス剤の作用機序は一通りでなく、ウイルスの細胞への吸着を阻害する薬剤、特定のウイルスの複製を阻害する薬剤、サイトカインの一種であるインターフェロンのように、ウイルスが感染する前の細胞に抗ウイルス性を発揮する(自然免疫能の誘導による)もの、特異的な免疫抗体でウイルスを排除する薬剤(ワクチン)、その他がある。薬剤の作用機序が判明することで抗ウイルス剤を効果的に使用することができる。

一方、抗ウイルス効果があるとされるプロアントシアニジンは、３以上のフラバン−３−オールやその誘導体が重縮合した種々の化合物の複合物である。構成するフラバン−３−オールやその誘導体としては、カテキンやエピカテキンのほかに３位のＯＨ基にエステル結合が形成されたエステル化プロアントシアニジンなども存在する。天然に存在するプロアントシアニジンの内、Ｂ型プロアントシアニジンは、フラバン−３−オールを２以上重縮合した化合物の複合物となっており、単に２量体、３量体などと称しても化合物は特定されておらず、各化合物の作用は未知である。同時に、プロアントシアニジンはガレートの修飾などによる構造の複雑さにより天然物からそれぞれの化合物を単離することは容易でなく、現在に至るまで構造と効能との明確な関連付けはなされていない。

しかも、プロアントシアニジンはポリフェノールの一種であり、高い抗酸化力を有するため、酸化されやすい。従来の植物からの抽出物を利用する方法では、抽出過程や作用を評価する過程で酸化される可能性もある。従って、より精製度の高い化合物を用いて評価した抗ウイルス剤の開発が望まれている。

更に、上述した様に、単に「抗ウイルス作用」と称しても、ウイルスが細胞に侵入した後に細胞内でウイルスの複製を抑制する、ウイルスの細胞内増殖抑制作用や、ウイルスと直接に接触することで、ウイルスの増殖を抑制するウイルス不活性化作用などがある。それぞれの作用に基づいて適切に使用することでより有用な効果を享受することができる。しかしながら、プロアントシアニジンに関し、特定の化合物に単離した抗ウイルス作用は評価されておらず、ましてウイルスの細胞内増殖抑制作用を有するか、ウイルス不活性化作用を有するか、また細胞に対する毒性の程度などが別個に評価されたこともない。従って、より具体的な抗ウイルス作用が評価された、プロアントシアニジンを有効成分とする抗ウイルス剤の開発が望まれている。

加えて、ウイルスが細胞内で増殖する機構が判明すれば、それを応用して新たな用途に拡大することができる。

上記現状に鑑み、本発明は、複合物であるプロアントシアニジンに含まれる各化合物について多面的に抗ウイルス作用を特定し、有効な抗ウイルス剤などを提供することを目的とする。

本発明者等は、種々のプロアントシアニジンを合成し、ウイルス不活性化作用、ウイルスの細胞内増殖抑制作用を評価したところ、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体が細胞毒性が低くかつウイルスの細胞内増殖抑制作用に優れること、これら化合物が細胞内Ｍｎ−ＳＯＤを誘導する活性を有すること、Ｍｎ−ＳＯＤは種々のウイルスに共通することから抗ウイルス剤として好適であることなどを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤を提供するものである。

また本発明は、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤を提供するものである。

更に本発明は、前記ウイルスの細胞内増殖抑制剤、または前記Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤を含む抗ウイルス剤を提供するものである。

本発明によれば、天然物由来のプロアントシアニジンに含まれる特定構造の化合物であるため安全性が高く、かつウイルスの細胞内増殖抑制効果やＭｎ−ＳＯＤ活性化作用に優れ、抗ウイルス剤として好適に使用することができる。

フラバン−３−オール３量体の合成方法の概要を示す図である。製造例７で合成したＥＣＯＡｃ−ＡｃＣの構造式を示す図である。プロアントシアニジンによるＳＡＲＳ−コロナウイルス（以下、ＳＡＲＳ−ＣｏＶと称する。）の細胞内増殖抑制の結果を示す図である。ウェルの左上から順次、ポリマー濃度０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの結果を示す。ウェル染色像の濃淡は、細胞増殖の程度を示し、淡色は細胞増殖が抑制されていることを意味する。また、プラーク数はウイルス数に相当する。本願では、検体を含まない対照と比べ、プラーク数が５０％に減少する濃度を有効濃度とした。プロアントシアニジンによるＳＡＲＳ−ＣｏＶ不活性化作用の結果を示す図である。ウェルの左上から順次、ポリマー濃度０μｇ／ｍｌ、１，０００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの結果を示す。有効濃度の評価は、図３と同様である。Ｍｎ−ＳＯＤおよび細胞障害性評価の際のＣＣＤ撮像画像(図５（Ａ）)と、エピカテキン３量体のα−チューブリンとＭｎ−ＳＯＤ量を示す図(図５（Ｂ））である。プロアントシアニジンによるＳＡＲＳ−ＣｏＶ不活性化作用、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの細胞内増殖抑制作用、細胞障害性に与える影響の結果を示す図である。図中、↑は指示濃度以上で効果があることを意味する。実施例２の結果を示す図である。エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）によるＡ型インフルエンザウイルスの細胞内増殖抑制の結果を示す図である。実施例３の結果を示す図である。エピカテキン４量体によるネコカリシウスウイルスの細胞内増殖抑制の結果を示す図である。実施例４の結果を示す図である。エピカテキン４量体によるＳＡＲＳ−ＣｏＶの細胞内増殖抑制の結果を示す図である。

本発明は、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤、およびＭｎ−ＳＯＤ活性化剤、並びにこれらウイルスの細胞内増殖抑制剤、およびＭｎ−ＳＯＤ活性化剤を含む抗ウイルス剤である。以下、本発明を具体的に説明する。

ポリフェノールの一種としてプロアントシアニジンがある。プロアントシアニジンにはＡ型、Ｂ型などがあり、例えばＢ型プロアントシアニジンは、フラバン−３−オールまたはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とし、その４位と８位とが２以上重縮合してなる化合物の総称である。酸処理によりシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン等のアントシアニジンを構成単位として生成するため、その前駆体の意味でプロアントシアニジンと称されている。天然物由来のプロアントシアニジンは、上記構成単位の重合体であるプロシアニジン、プロデルフィニジン、プロペラルゴニジンのほか、これらの立体異性体、配糖体、酸エステル体、その他の誘導体などを含み、更に重合度もそれぞれ相違するため極めて複雑な組成物となっている。

本発明では、抗ウイルス作用を持つプロアントシアニジンを特定するため、種々のプロアントシアニジンを有機合成し、抗ウイルス作用を評価した。その結果、極めて構造の類似する化合物であってもウイルスの細胞内増殖抑制効果やウイルス不活性化作用が相違すること、これにより使用方法を特定することでより有効な抗ウイルス効果を確保しうることが判明した。

本発明のウイルスの細胞内増殖抑制剤は、エピカテキン（以下、ＥＣとも表記される。）３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする。本発明において、「エピカテキン３量体」とは、エピカテキン３分子の４位と８位とが重縮合した化合物であり、ＥＣ−ＥＣ−ＥＣまたはＥＣ３量体と表記される。また、エピカテキン４量体とは、エピカテキン４分子の４位と８位とが重縮合した化合物であり、ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣまたはＥＣ４量体と表記される。同様に、エピカテキン６量体とは、ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣまたはＥＣ６量体と表記され、エピカテキンｎ量体は、（ＥＣ_ｎ−１−ＥＣ）またはＥＣｎ量体と表記される。なお、ＥＣ−ＥＣ−Ｃは、エピカテキン２分子とカテキン（以下、Ｃとも表記される。）との重縮合体である。これらプロアントシアニジンを合成してウイルスの細胞内増殖抑制を評価したところ、エピカテキンの重合度に対応してＩＣ_５０値で示されるウイルスの細胞内増殖抑制効果およびＣＴＣ_５値で示される細胞傷害性が増加することが判明した。ＥＣ３量体やＥＣ４量体などは、生体内に侵入したウイルスの増加を抑制でき、細胞障害性が低いため、抗ウイルス剤やウイルス感染予防剤として使用できる。

更に、フラバン−３−オールの３量体であっても構成するフラバン−３−オールの相違に応じて抗ウイルス作用に相違が生じることも判明した。後記する実施例に示すように、ＥＣ−ＥＣ−ＣはＥＣ３量体よりもウイルスの細胞内増殖抑制に対するＩＣ_５０値が低くより抗ウイルス作用に優れるが、ＣＴＣ_５値が高い。重合体を構成するフラバン−３−オールの相違によって抗ウイルス作用が異なることは従来全く知られていなかった。本発明は、特定構造のプロアントシアニジンを有機合成してウイルスの細胞内増殖抑制効果を評価することでそれぞれの抗ウイルス作用と化合物の構造との関係が明確となり、作用効果に対応する有効な投与方法が提案される。

本発明のウイルスの細胞内増殖抑制剤が有効なウイルスとしては、ＳＡＲＳ−コロナウイルス、インフルエンザ、ネコカリシウイルス、ノロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（エイズ）、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、疣贅ウイルス、ヘルペスウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルスなどがある。本発明のウイルスの細胞内増殖抑制剤は、後記する実施例に示すように、種々のウイルスに対して有効であった。よって、ウイルスに共通する機構に作用して抗ウイルス作用を発揮しうると推定され、従来公知のウイルスのほか、新たに発生するウイルスや再興ウイルスその他にも抗ウイルス作用を発揮しうる可能性がある。

なお、ウイルスの細胞内増殖抑制効果の作用機序の詳細は不明であるが、異なるウイルスに有効であることから、これらウイルスに共通する機能に作用していると考えられた。このような共通する機能としてＭｎ−ＳＯＤ活性化効果を評価したところ、後記する実施例に示すように、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体は、濃度依存的にＭｎ−ＳＯＤ活性化作用を示した。一般的に、ウイルスの急性感染では細胞に強い酸化ストレス反応（スーパーオキサイドの産生）が誘導され、細胞の代謝、高分子合成はウイルス産生の工場に置き換えられる。プロアントシアニジンは、細胞内Ｍｎ−ＳＯＤを誘導し、ス-パーオキサイドを消去することによりウイルス増殖抑制作用を発揮すると考えられる。なお、エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体は、濃度依存的にＭｎ−ＳＯＤ活性化作用を示すことから、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤としても使用することができる。

更に、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化と共に抗ウイルス作用が発揮された。エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とするウイルスの細胞内増殖抑制やＭｎ−ＳＯＤ活性化剤は、抗ウイルス剤として使用することができる。

加えて、本発明の抗ウイルス剤は、細胞内増殖抑制効果を有するため、予め摂取することで、その後にウイルスに感染した場合でも、細胞内のウイルス増殖を抑制することができ、ウイルス感染予防剤としても使用することができる。

本発明の抗ウイルス剤の成人１日当りの投与量は、投与方法によって適宜選択しうるが、通常、前記エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体の乾燥重量で５〜１００ｍｇ、より好ましくは１０〜４０ｍｇである。上記の投与量は、被検者の年齢、他の疾患、投与形態その他に応じて適宜選択することができる。

本発明の抗ウイルス剤やウイルス感染予防剤は、他の成分とともに経口剤または非経口剤として製剤化することができる。経口剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等が、非経口剤としては、皮下、筋注、静脈注射その他の注射剤、軟・硬膏剤、含嗽剤、スプレー剤等がある。製剤化において使用される他の成分としては、剤型に応じて従来公知の化合物を適宜使用することができ、例えばデキストリン・セルロース等の賦形剤、ゼラチン・アラビアゴム等の結合剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ゼラチン化澱粉、アルギン酸等の膨化剤、ショ糖・乳糖等の甘味料、セラック・砂糖等の被覆剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、緩衝剤等がある。

プロアントシアニジンの中でも、エピカテキン３量体やエピカテキン４量体は、比較的低分子であるため水に溶けやすい。従って、内服や舌下などによる内服が有効である。更に、エピカテキン３量体やエピカテキン４量体を食品の一部に混入させ、または健康食品や補助食品として摂取することで、その後にウイルスと接触した場合でもウイルスの細胞内増殖抑制により感染を予防することができる。

なお、食品の一部に混入する場合は、前記したエピカテキン３量体やエピカテキン４量体を原料の一部として配合し、目的の食品を調製すればよい。また、健康食品や補助食品として使用する場合は、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤またはドリンク剤タイプの機能性食品として調製してもよい。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

(製造例１：エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）の合成）
フラバン−３−オールオリゴマーの合成法を示す図１に準じて、エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）を合成した。なお、図１の化合物Ａにおいて、ＲがＨの場合はエピカテキンであり、Ｒ＝ＯＨの場合はエピガロカテキンである。

化合物Ａで示されるエピカテキンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、炭酸カリウム存在下にベンジルブロマイド（ＢｎＢｒ）を反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー、およびヘキサン−エチル酢酸による再沈澱により精製し、エピカテキンのＯＨ基がベンジル基で保護された化合物Ｂを合成した。

化合物Ｂをジクロロメタンに溶解し、３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（ＤＤＱ）存在下にエトキシエタノールを反応させた。シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、化合物Ｃを合成した。

化合物Ｃに４モル等量の化合物Ａを添加し、ルイス酸存在下に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）またはＳｎＣｌ_４により化合物Ｃの４位と化合物Ａの８位とを縮合させた。シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｄで示されるベンジル保護基が付いたエピカテキンの２量体を合成した。

化合物Ｄに１／４モル等量の化合物Ｃを添加し、ルイス酸存在下に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＭＳＯＴｆ）またはＳｎＣｌ_４により化合物Ｄと化合物Ｃとを縮合させた。シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｅで示されるベンジル保護基が付いたエピカテキンの３量体を合成した。

次いで化合物Ｅから、パラジウム触媒を用いた過水素分解反応によってベンジル基を脱保護した。ＨＰＬＣによる精製を行い、化合物Ｆで示されるエピカテキン３量体を合成した。

(製造例２、製造例３：エピカテキン４量体および６量体の合成）
化合物Ｄに代えて化合物Ｅを用いて化合物Ｃとの縮合反応を行い、精製および脱保護基処理を行いエピカテキン４量体を合成した。また、化合物Ｅと化合物Ｅとの縮合反応を行い、精製および脱保護基処理を行ってエピカテキン６量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）を合成した。

(製造例４：エピガロカテキン２量体（ＥＣＧ−ＥＣＧ）の合成）
前記したエピカテキン３量体の合成方法に準じて、エピカテキンに代えてエピガロカテキンを使用し、化合物Ｄに対応する化合物を合成した。次いで、この化合物から、パラジウム触媒を用いた過水素分解反応によってベンジル基を脱保護した。ＨＰＬＣによる精製を行い、エピガロカテキン２量体を合成した。

(製造例５：エピカテキンとカテキンとの重合体（ＥＣ−Ｃ）の合成）
化合物Ｃに４モル等量のベンジル保護基付きカテキンを添加して化合物Ｃとカテキンとの縮合反応を行い、精製および脱保護基処理を行い、エピカテキンとカテキンとの２量体（ＥＣ−Ｃ）を合成した。

(製造例６：エピカテキンとカテキンとの３量体（ＥＣ−ＥＣ−Ｃ）の合成）
化合物Ｃに４モル等量のエピカテキンとカテキンとの２量体（ＥＣ−Ｃ）との縮合反応を行い、精製および脱保護基処理を行い、エピカテキンとカテキンとの３量体（ＥＣ−ＥＣ−Ｃ）を合成した。

(製造例７：アセチル化エピカテキンと３−アセチルエピカテキンとの２量体（ＥＣＯＡｃ−ＡｃＣ）の合成
化合物Ｃに４モル等量のＴＢＤＭＳ基で保護した（＋）−カテキンをＳｎＣｌ_４を用いて縮合を行い、ＴＢＡＦでＴＢＤＭＳ基を脱保護し、生じた水酸基を無水酢酸でアセチル化し、最後にベンジル基を水酸化パラジウムで脱保護し、図２に示す構造のＥＣＯＡｃ−ＡｃＣを合成した。

（実施例１）
製造例１〜７で得たプロアントシアニジンについて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する作用を以下の評価方法に従って、評価した。

（評価方法）
（１)ウイルスストック液の調製と力価の測定
ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来、株式会社大日本製薬製）を１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養した。９０％単層を形成した培養細胞に、細胞１個当たりのＳＡＲＳ−ＣｏＶの数が０．１となる条件でウイルス感染を行い、３７℃で１６時間培養し、上清を回収してこれをウイルスストック液とした。なお、ＳＡＲＳ−ＣｏＶとして、フランクフルト大学医学部のドエル博士より分与されたＦＦＭ−１株を用いた。

ウイルスストック液をウイルス希釈液（１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ（−）（Ｍｇ^２＋，Ｃａ^２＋を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０））で１０倍階段希釈した。ベロ細胞で９０％単層が形成された２４穴ウェルに各希釈液ウイルス液０．２ｍｌを添加し、２５℃、６０分間感染させ、１．０％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）を加えて７日間培養した。培養後、培養液を取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄および脱色した。各ウェルのプラーク数を測定し、ウェル３個のプラーク数の平均値を１ｍｌに含まれるウイルス量（ＰＦＵ）とした。このプラーク法によるウイルスストック液の力価は、５×１０^７ＰＦＵ／ｍｌであった。

（２）ウイルスの細胞内増殖抑制作用およびＩＣ_５０値の測定
予め、前記ウイルスストック液を前記ウイルス希釈液にて希釈し、１００ＰＦＵ／０．２ｍｌのウイルス液を調製した。
ベロ細胞を培養した６穴ウェル（細胞数２×１０^６個）に、前記ウイルス液０．２ｍｌを添加し、２２℃で１時間感染させた。次いで、製造例１〜７で得た各プロアントシアニジンを培養液１ｍｌあたり０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌとなるように加え、０．９％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）で７日間培養した。培養後、前記プラーク法によってウイルス量を測定し、各プロアントシアニジンのＩＣ_５０値を求めた。各プロアントシアニジンのＩＣ_５０値を表１に、ＥＣ−Ｃ、エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）、ＥＣ−ＥＣ−Ｃ、エピカテキン６量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）のウェルの結果を図３に示す。

(３)ウイルス不活化作用
予め、ウイルスストック液をウイルス希釈液で希釈して、１０^８ＰＦＵ／ｍｌのウイルス液を調製した。このウイルス液１ｍｌに、製造例１〜７で得た各プロアントシアニジンおよびエピカテキンを０μｇ／ｍｌ、１，０００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌとなるように加え、２２℃で５分間反応させた。次いで各溶液を、ベロ細胞を培養した６穴ウェル（細胞数２×１０^６個）に０．２ｍｌずつ接種した。エピカテキン、エピカテキン２量体（ＥＣ−ＥＣ：ＥＣ２量体）、エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ：ＥＣ３量体）、エピカテキン６量体（ＥＣ６量体）のウェルの結果を図４に示す。

（４）Ｍｎ−ＳＯＤ活性および細胞毒性の測定
ベロ細胞を培養した６穴ウェル（細胞数１０^６個）に、エピカテキン３量体とエピカテキン６量体を０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、４８時間培養した。次いで、全細胞を０．４ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに回収し、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（ポリビニリデンフロオライド）に転写し、一次抗体として抗マウスα−チューブリンモノクローナル抗体（シグマ社製）、および抗ウサギＭｎ−ＳＯＤ抗体（ストレスゲン社）を使用し、二次抗体にはアルカリホスファターゼで標識した抗マウス-ヤギ抗体、または抗ウサギ−ヤギ抗体（サンタクルズ社）を用い、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリュウム塩、ベーリンガー社）による発色で検出し、免疫ブロットを行った。画像をＣＣＤカメラで撮影し、画像解析ソフト（バイオラド社製、イメージラボ）でα−チュブリンバンドおよびＭｎ−ＳＯＤの濃度を測定した。対照（０μｇ／ｍｌ）を１とし、各希釈液における相対的な濃度比を算出した。図５（Ａ）に撮像画像と、図５（Ｂ）にエピカテキン３量体のα−チューブリン量とＭｎ−ＳＯＤ量とを示す。また、エピカテキン４量体について同様に操作し、α−チューブリンに対するＭｎ−ＳＯＤ量の比を算出した。エピカテキン３量体およびエピカテキン４量体の、α−チューブリンに対するＭｎ−ＳＯＤ量の比をそれぞれ表２、表３に示す。

（５）ＣＴＣ_５値の測定
ベロ細胞を培養した６穴ウェル（細胞１０^６個）に、製造例１〜７で得た各プロアントシアニジンを０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、４８時間培養した。次いで、全細胞を０．４ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに回収し、全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（ポリビニリデンフロオライド）に転写し、一次抗体として抗ウサギα−チューブリン抗体を使用し、二次抗体にはアルカリホスファターゼで標識した抗ウサギ−ヤギ抗体（サンタクルズ社）を用い、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリュウム塩、ベーリンガー社）による発色で検出し、免疫ブロットを行った。画像を図５（Ａ）と同様にＣＣＤカメラで撮影し、画像解析ソフト（バイオラド社製、イメージラボ）でα−チュブリンバンドの濃度を測定した。対照（０μｇ／ｍｌ）を１とし、ＣＴＣ_５値（５％細胞障害が認められる濃度（μｇ／ｍｌ））を求めた。結果を表１に示す。

（結果）
（１）表１に示すように、ウイルス細胞内増殖抑制に関するＩＣ_５０値は、ＥＣ２量体（ＥＣ−ＥＣ）、ＥＣ３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）、ＥＣ４量体、ＥＣ６量体と、エピカテキンの重合度が増加するにつれて低下する傾向があり、ＥＣ６量体は、ＥＣ３量体の１／３量で同等の抗ウイルス作用を奏することが判明した。一方、エピカテキンの重合度の増加につれてＣＴＣ_５値が低下する傾向があった。
（２）表１に示すように、ＥＣ−ＥＣ−Ｃとエピカテキン４量体とは、共にＩＣ_５０値が１０μｇ／ｍｌであるが、ＥＣ−ＥＣ−ＣのＣＴＣ_５値は１００μｇ／ｍｌであるのに対しエピカテキン４量体は１００μｇ／ｍｌを超える。細胞障害性で比較すると、ＥＣ−ＥＣ−Ｃの細胞傷害性はエピカテキン６量体と同等である。実際にベロ細胞にＳＡＲＣ−ＣｏＶを感染させてＳＡＲＣ−ＣｏＶの細胞内増殖抑制効果を評価すると、図３に示すように細胞障害性を近似するウェルの濃淡は、ＥＣ−ＥＣ−Ｃとエピカテキン６量体とで略同等の淡色であった。これに対し、エピカテキン３量体のウェルは濃色である。エピカテキンを含む３量体であってもＥＣ３量体とＥＣ−ＥＣ−Ｃとは抗ウイルス作用が大きく異なることが判明した。
（３）図４は、ＳＡＲＣ−ＣｏＶにエピカテキン単量体（ＥＣ）、エピカテキン２量体（ＥＣ_２）、３量体（ＥＣ_３）、６量体（ＥＣ_６）を加えてそれぞれのウイルスの不活化作用を調べた結果を示す図である。各ウェルのプラーク数で比較すると、ＥＣ、ＥＣ_２、ＥＣ_３では１，０００μｇ／ｍｌでもウイルス不活性化作用が観察されなかったが、ＥＣ_６のプラーク数は他と比較して少なく、ウイルス不活性化効果が観察された。
（４）図５（Ａ）に示すように、エピカテキン３量体および６量体を作用させたベロ細胞は、α−チューブリンとＭｎ−ＳＯＤとを含む。図５（Ｂ）に示すように、エピカテキン３量体について、これを含まない対照を１としてチューブリン量とＭｎ−ＳＯＤとを測定すると、エピカテキン３量体の濃度依存的に、Ｍｎ−ＳＯＤ量が増加した。なお、α−チューブリンは化学的に安定な化合物であり細胞数を近似しうる。従って、α−チューブリン量に対するＭｎ−ＳＯＤ量を算出すると、細胞障害性を加味したＭｎ−ＳＯＤ活性を求めることができる。この結果を表２に示すが、エピカテキン３量体の添加量に対応してα−チューブリンに対するＭｎ−ＳＯＤ比が増加した。なお、表３に、エピカテキン４量体におけるα−チューブリンに対するＭｎ−ＳＯＤ比を示す。エピカテキン３量体と同様に、濃度依存的にα−チューブリンに対するＭｎ−ＳＯＤ比が増加する傾向が観察された。
（５）図６に、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキン２量体（ＥＣ_２）、エピカテキン３量体（ＥＣ_３）、エピカテキン４量体（ＥＣ_４）、およびエピカテキン６量体（ＥＣ_６）の、ウイルス不活性化、ウイルスの細胞内増殖抑制効果、細胞障害性を評価した結果を示す。エピカテキンは、その４量体まではウイルスを不活性化するのに１，０００μｇ／ｍｌ以上を要するため、ウイルス不活性化は弱い。一方、ウイルスの細胞内増殖抑制効果は、エピカテキン３量体およびエピカテキン４量体でそれぞれ３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌであった。なお、エピカテキン６量体は５μｇ／ｍｌでウイルスの細胞内増殖抑制効果を有するが、７０μｇ／ｍｌで細胞障害性を有した。これらから、ウイルスの細胞内増殖抑制剤として、エピカテキン３量体やエピカテキン４量体が、安全に使用できる薬物と推定された。

（実施例２）
ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞）によって９０％単層を形成した２４穴ウェルをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、０．５ｍｌの０．１％ＢＳＡと０．７５μｇ／ｍｌのトリプシンを含むＭＥＭ培地を加え、３ＴＣＩＤ_５０（細胞５０％が感染する濃度）のインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）と、エピカテキン３量体（ＥＣ−ＥＣ−ＥＣ）を０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌになるように添加し、２日間培養した。培養後に培地をクリスタルバイオレット液で染色した。なお、インフルエンザウイルスは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶと異なり、１個のウイルスが存在してもウェル全体の細胞が死滅するため細胞が染色されず、ウェルの濃淡を評価できない。このため、ウイルスの希釈度で細胞が生存するか死滅するかを判定し、希釈度でウイルス量を測定した。また、インフルエンザウイルスを添加しない系でも、上記と同様に操作した。図７に感染後、２日目の細胞の生死を示すウェルの結果を示す。インフルエンザウイルスを添加しない系を非感染細胞とし、インフルエンザウイルス添加系を感染細胞とした。ＥＣ−ＥＣ−ＥＣによる５０％阻害濃度は、３０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの間、ＩＣ_５０＝２０μｇ／ｍｌと判定された。

（実施例３）
インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）に代えてネコカリシウイルスを使用し、プロアントシアニジンとしてエピカテキン４量体を使用した以外は実施例２と同様に操作して、感染細胞に対する作用を評価した。図８に結果を示す。３０μｇ／ｍｌで明らかにウイルス増殖を抑制していた。

（実施例４）
インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１株）に代えてＳＡＲＳ−コロナウイルスを使用し、プロアントシアニジンとしてエピカテキン４量体を使用した以外は実施例３と同様に操作して、感染細胞に対する作用を評価した。図９に結果を示す。３μｇ／ｍｌで明らかにウイルス増殖を抑制していた。

Claims

エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、ウイルスの細胞内増殖抑制剤。
エピカテキン３量体および／またはエピカテキン４量体を有効成分とする、Ｍｎ−ＳＯＤ活性化剤。
請求項１記載のウイルスの細胞内増殖抑制剤、または請求項２記載のＭｎ−ＳＯＤ活性化剤を含む抗ウイルス剤。