KR20220102695A

KR20220102695A - 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220102695A
Application number: KR1020210004704A
Authority: KR
Inventors: 오원근; 이바울; 박은진; 윤인중; 김은희; 유성식; 김충식; 김성균
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-07-21
Also published as: KR102578233B1

Abstract

본 발명은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 백지, 울금 및 송지 추출물을 일정 비율로 포함함으로써 항바이러스 활성의 상승작용을 통하여 특히 동물의 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 치료와 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating avian influenza virus infection comprising Angelica dahurica, Curcuma longa and Resina Pini extracts}

본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 회복능을 보이는 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백지, 울금 및 송지 추출물을 일정비로 혼합하여 제조함으로써 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료에 상승효과를 갖는 생약조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 ‘올소믹소’과에 속하는 RNA 바이러스(Orthomyxovirus)로서 5개의 속(genus) 중 A, B, C형으로 분류된다. A형은 사람에게 주로 감염이 확인되며 B, C형에 비하여 돼지, 기타 포유류 및 다양한 야생조류에서 감염이 확인되고 있는 바이러스이다. 현재, 전 세계적으로 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자(Avian influenza), 돼지 인플루엔자(Swine influenza) 및 신종플루(Novel flu) 등은 모두 A형 바이러스에 속한다.

인플루엔자 바이러스의 표면에는 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA)라는 두 가지 당단백질이 존재하는데, HA는 18종이 있고 NA는 11종이 있으므로 18×11=198종류의 인플루엔자 바이러스가 발생할 수 있다. 인간은 돼지 인플루엔자(swine influenza), 조류 인플루엔자(avian influenza)와 이 밖의 동물로부터 기인한 동물원성 인플루엔자(zoonotic influenza)로부터 감염될 수 있으며 돼지 인플루엔자의 경우 H1N1, H1N2, H3N2, 조류 인플루엔자의 경우 H5N1, H7N9, H9N2 등이 감염을 일으킬 수 있다. 또한 최근 조류 인플루엔자 바이러스가 유전자 재조합 과정을 거치지 않고 직접 사람에게 전파된 예도 발생하고 있다.

조류인플루엔자(avian influenza, avian flu, bird flu, highly pathogenic avian influenza, HPAI) 또는 조류독감(鳥類毒感, bird flu)은 조류가 걸리는 전염성 호흡기 질병이다. 현재까지 알려져 있는 모든 조류인플루엔자는 하나의 종(種)인 'A형 인플루엔자'에 속하며, 최근 일반적으로 발견되는 조류인플루엔자는 그 변형인 H5N1 바이러스에 의해서다. 이 바이러스는 저병원성과 고병원성으로 구분되는데, 고병원성의 경우 인체 감염될 수 있다. 2013년 3월 4일 새로운 변형 H7N9 바이러스 감염자가 중국 상하이시 안후이성에서 사망하였다. H7N9 바이러스가 사람에게 감염된 것은 이 사례가 세계최초이다.특히 H5N1이나 H7N9처럼 사람에 감염되는 경우 제조 과정에서 달걀을 이용하는 백신 제조법의 특성상 백신을 만들기 어렵다. 조류독감은 1900년대초에 이탈리아에서 처음 보고되었으며, 전 세계적으로 확산이 가능하다고 보고 있다.

지금까지 인플루엔자 A 바이러스의 증식과 병리학적인 감염 기전에 근거한 다양한 목표점에 대한 치료제 개발이 시도되어 왔으며 현재 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루 치료제로는 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 선택적인 저해물질로 1996년에 개발되어 국내에는 2001년에 시판된 경구용 치료제 타미플루(oseltamivir phosphate)와 동일하게 2001년에 시판된 흡입형인 리렌자(zanamivir)가 있으며 최근 폴리머레이즈 억제제(polymerase inhibitor)로서 2018년에 미국과 일본에서, 2019년에 국내 판매 승인을 받아 출시된 경구용 치료제 조플루자(baloxabir) 등이 있다. 지난 20년간 독감치료제 시장을 독점해왔던 타미플루의 부작용으로는 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상이 보고되었으며, 일본의 경우 타미플루를 승인 후 확인된 소아환자의 사망예가 15건이 될 정도로 부작용을 갖고 있다. 또한, 타미플루에 대한 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있으며, 타미플루 내성 바이러스의 인간 대 인간 전염조차도 발견되고 있는 실정이다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루에 대한 바이러스 치료제의 개발은 인간의 보건안전에 필수적인 사항이며, 특히 한 번의 대유행을 경험한 인류에게 언제 다시 일어날지 모르는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루와의 전쟁에 있어서 더욱 필요하다.

바이러스의 감염 및 증식과정을 살펴보면 바이러스는 세포에 감염 후 세포 내에서 새로운 바이러스를 만들고 다른 세포로 전파되기 위하여 세포 외부에 존재하는 시알릭산(sialic acid)을 바이러스가 만든 뉴라미니데이즈를 이용하여 절단하는 것이 필요하다. 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스는 보통 타미플루가 결합하는 타미플루의 수용체 단백질의 아미노산을 변화시키는 3개의 유전적 변이(Arg292Lys, Asn274Ser, His295Tyr)를 통해 발생하는 것으로 알려져 있다. 3곳의 유전적 변이 중 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스의 변종으로 가장 많이 발현하는 295의 His가 Tyr으로 변화한 바이러스의 경우는 타미플루의 소수성 잔기 (hydrophobic residue)가 타미플루 수용체에 결합하지 못하게 변이된 경우이다. 이는 미국과 유럽에서 2007~2008년 시즌에 10~25% 확률로 발견된 바이러스로서 향후의 신종플루에 대한 변이가능성에 대한 위험도를 증가시키고 있다. 이들 타미플루 내성 바이러스의 등장에 따라 새로운 바이러스 치료제의 지속적인 개발이 요구되고 있다.

한편, 백지(Angelica dahurica)는 구릿대 또는 이의 뿌리로, 일본, 만주, 중국, 동시베리아에 분포하는 두해살이풀 또는 3년초이다. 뿌리줄기에 안겔리칼(Angelical), 에둘틴(Edultin), 펠로프테린(Phellopterin) 등이 함유되어 있고 씨에는 통경작용을 하는 임페라토린(Imperatorin)이 함유되어 있으며, 진통, 소종의 효능이 있고 냉을 없애주는 것으로 보고되고 있다.

산형과 식물들은 항미생물 및 항바이러스활성이 있음이 보고되고 있으며 특히 백지의 경우 본 발명자들이 옥시퓨세다닌(oxypeucedanin)과 같은 주요구성성분인 퓨라노쿠마린(furanocoumarin)계열의 화합물들이 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 감염억제능을 나타낸다는 사실을 보고하였다(Lee et al., 2020). 본 연구결과는 퓨라노쿠마린은 바이러스증식 단계의 초기에 작용하여 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 및 뉴클레오프로틴(nucleoprotein) 단백질을 합성하는 유전자의 발현을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스의 감염과 전파를 억제하였다. 뉴클레오프로틴(nucleoprotein)은 바이러스의 유전자정보를 포함하는 모든 리보뉴클레오프로틴(ribonucleoprotein, RNPs)의 구조를 구성하는 기본 단백질 중 하나로서 전사와 번역을 통하여 바이러스를 구성하는 각 단백질을 복제하기 위해 없어서는 안되는 단백질이다. 따라서 백지의 퓨라노쿠마린계 화합물들은 감염의 초기단계에서 이러한 뉴클레오프로틴의 합성을 저해함으로서 결론적으로 자손 바이러스를 구성할 단백질들을 만들지 못하게 하여 감염 및 전파를 억제하는 것이다. 또한 인플루엔자 바이러스는 DNA 분절을 통한 손상을 일으켜 세포의 세포자연사(apoptosis)를 오용하여 염증 등 인체유해반응을 일으킨다. 하지만 퓨라노쿠마린계 화합물들은 바이러스로 인해 유발된 비정상적 세포자연사를 억제함으로서 간접적으로 항인플루엔자 작용을 나타나는 것으로 기전을 밝혀 논문에 발표하였다.

울금(Curcuma longa)은 인도로부터 동남아시아를 중심으로 열대 및 아열대 지방에서 넓게 재배되고 있는 다년생 초본이다. 울금은 최근 우리나라의 남쪽 지역에서 재배되고 있는 식물로 카레 등의 원료로 사용되고 있다. 울금에는 방향성 정유가 1~5% 포함되어 있으며, 황색색소인 커큐민(curcumin) 등을 0.3% 정도 함유하고 있어 방향성 건위제로 간장염, 담도염, 담석증, 카타르성 황달 등에 사용되었다.

울금은 추출물을 포함하여 주요구성성분인 커큐미노이드(curcuminoid; curcumin, demethoxycurcumin, bis-demethoxycurcumin을 통칭)의 항바이러스 활성에 대한 광범위한 연구가 진행되어 왔다. 인간면역결핍 바이러스(HIV), C형 간염 바이러스(HCV), 에볼라 바이러스(ebola virus), 인플루엔자 바이러스(influenza) 등에 다양한 기전을 통한 효과가 있음이 현대의약학적으로 증명되었으며 미국에서는 건강기능성식품으로 활용되고 있다. 본 발명자들도 항인플루엔자 바이러스 활성에 관하여 울금을 이루는 주요구성성분인 커큐미노이드(curcuminoid)는 흥미롭게도 초기단계와 최종단계에서 각각 바이러스 표면 당단백질 중 하나인 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase)를 억제함으로써 항인플루엔자 활성을 나타낸다는 것을 보고하였다(Chen et al., 2010; Dao et al., 2012). 헤마글루티닌(hemagglutinin)은 숙주세포 표면의 시알릭산(sialic acid)과 결합하여 바이러스 입자가 세포 안으로 침입할 수 있도록 돕는 역할을 한다. 하지만 커큐미노이드(curcuminoid)가 결합부위에 먼저 결합함으로써 또는 바이러스 외피 구성성분의 변형을 일으킴으로 헤마글루티닌(hemagglutinin)이 결합하지 못하게 되는 것이며 커큐미노이드(curcuminoid) 3종 화합물의 공통점인 두 개의 인접한 카르보닐기/에놀기와 이로 인한 활성 메틸렌기가 활성에 기여할 것으로 예상되고 있다. 한편 뉴라미니데이즈(neuraminidase)는 세포내에서 복제 및 결합되어 완성된 자손 바이러스가 세포를 빠져나가는 단계에 있어서 세포의 시알릭산(sialic acid)과 결합된 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 결합을 끊어냄으로써 바이러스의 전파를 가능하게 하는 단백질이다. 하지만 커큐미노이드(curcuminoid) 화합물들은 비경쟁적으로 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 효소와 결합함으로 이의 작용을 억제하는 것으로 확인되었다.

송지(Resina Pini)는 한국, 중국, 일본 등에 자생하는 소나무(Pinus densiflora)의 줄기에 상처를 내어 채집한 진액, 즉 송진을 말린 것으로 동의보감의 약재로 수록되어 있으며 악성종양, 부스럼, 가려움증, 농혈 등에 효과가 있으며 오장을 편하게 하며 열을 제거한다고 알려져 있다.

송지를 구성하는 다이테르페노이드(diterpenoid)는 정유성분과 함께 피톤치드(phytoncide)라는 이름으로 현대인에게 많이 알려져 있으며 이를 구성하는 성분들은 바이러스를 포함한 다양한 항미생물활성을 나타낸다는 사실이 보고되고 있다. 본 발명자들은 아비에테인계(abietane) 및 랍데인계(labdane) 다이테르페노이드(diterpenoid)류의 물질들이 인플루엔자 바이러스 감염의 초기단계에 작용하여 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 및 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질의 유전적 합성을 저해함으로써 결과적으로 바이러스의 침입과 방출을 방해하여 억제능을 나타낸다는 사실을 최근 보고하였다(Ha et al., 2020). 본 발명자들은 또한, 송진으로부터 분리한 화합물들이 바이러스의 감염으로 인해 과도하게 생성되는 질산(NO)과 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현을 억제함으로써 바이러스 감염으로 인해 유발될 수 있는 2차 세균성 폐렴, 중이염 등의 합병증을 막는데 기여하는 기전을 규명하였다.

상기 기술한 바와 같이 단일물질, 특히 단일기전을 가진 물질의 경우, 내성출현이라는 위험성이 있으며 현재 경험하고 있는 약재 내성 바이러스 출현의 이유가 된다. 동시에 인수공통감염을 통한 인류에 위협이 되기 때문에 가금류 및 가축류의 질병예방목적으로 사용할 수 없다. 하지만 각기 다른 항인플루엔자 활성 기전을 가지는 울금, 백지 및 송지와 같이 다중성분을 포함하는 한약재 추출물은 바이러스 침입의 각 단계에 복합적으로 작용을 하기 때문에 각 단계 변이를 일으킬 우려를 줄일 수 있는 장점이 있으며 또한 서로 다른 기전을 가진 성분들의 상승효과를 기대할 수 있다. 따라서 본 연구에서 개발하고자 하는 조류독감 저해물질은 우리나라 전통의약학적으로 약용식물로 사용된 천연물로부터 유래하여 안전하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 면역증강작용을 기대할 수 있다. 이러한 병용 전략은 추출물이 바이러스 복제 단계 각각에 비선택적으로 작용함으로서 강력한 내성바이러스의 출현으로 인한 인류보건의 위험을 막을 수 있다는 장점을 또한 기대할 수 있다.

한국등록특허 제100962334호는 울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제100743861호는 솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물을 개시하고 있다. 또한 한국등록특허 제101782532호는 백지 추출물 또는 이로부터 분리된 퓨라노쿠마린을 함유하는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 본 발명의 생약 성분의 일정비 혼합에 의한 항 조류인플루엔자 바이러스 상승효과는 기재되어 있지 않다.

한국등록특허 제100962334호, 울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제, 2010. 06. 01. 등록. 한국등록특허 제100743861호. 솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물, 2007. 07. 24. 등록. 한국등록특허 제101782532호, 백지 추출물 또는 이로부터 분리된 퓨라노쿠마린을 함유하는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물, 2017. 09. 21. 등록. 한국등록특허 제101021830호, 크레이스토카릭스 오페르쿠라투스로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제, 2011. 03. 07. 등록. 한국등록특허 제100950445호, 감초로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제, 2010. 03. 24. 등록.

Chen D.Y., et al., Curcumin inhibits influenza firus infection and haemagglutination activity, Food Chem., 119, 1346-1351, 2010. Dao T.T., et al., Curcuminoids from Curcuma longa and their inhibitory activities on influenza A neuraminidases, Food Chem., 134, 21-28, 2012. Dawood F.S., et al., Emergence of a novel swine-origin influenza A (H1N1) virus in humans, N. Engl. J. Med., 360, 2605-2615, 2009. Dong J.Y., et al., Sesquiterpenoids from Curcuma wenyujin with anti-influenza viral activities, Phytochemistry, 85, 122-128, 2013. Ha T.K.Q., et al., Antiviral activities of compounds isolated from Pinus densiflora (Pine Tree) against the Influenza A virus, Biomolecules, 10, 711, 2020. Hauge S.H., et al., Oseltamivir-resistant influenza viruses A (H1N1), Norway, 2007~2008, Emerg. Infect. Dis., 15, 155-162, 2009. Kim Y., et al., Vitamin C is an essential factor on the anti-viral immune responses through the production of interferon-α/β at the initial stage of influenza A virus (H3N2) infection, Immune Netw., 13, 70-74, 2013. Lee B.W., et al., Antiviral activity of furanocoumarins isolated from Angelica dahurica against influenza A viruses H1N1 and H9N2, J. Ethnopharmacol., 259, 112945, 2020. Lee J.Y., The resistance situation of antiviral agent in Korea: 2008~2009 oseltamivir resistance of seasonal influenza A/H1N1, Infect. Chemother., 41(Suppl 2), S20-S24, 2009. Schnitzler S.U., et al., An update on swine-origin influenza virus a/h1n1: A review, Virus Genes, 39(3), 279-292, 2009. Wright P.F., et al., Orthomyxoviruses, Fields' Virology, 5th ed. New York:Wolters Kluwer Health, Lippincott Williams&Wilkins, 1691-1740, 2007. Zheng M., et al., Intranasal administration of chitosan against influenza A (H7N9) virus infection in a mouse model, Sci. Rep., 6, 28729, 2016. Zimmer S.M., et al., Historical perspective-emergence of influenza A (H1N1) viruses, N. Engl. J. Med., 361, 279-285, 2009.

본 발명의 목적은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백지, 울금 및 송지 추출물을 일정비로 혼합하여 제조함으로써 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방, 개선 또는 치료에 뛰어난 상승효과를 갖는 생약조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 개선용 동물 사료 첨가제를 제공하는 데 있다.

본 발명은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 1~5:1~5:1~5일 수 있다. 바람직하게는 백지, 울금 및 송지 추출물이 1~3:1~3:1~3일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1:1:3, 1:3:1, 3:1:1 또는 1:1:1일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 백지, 울금 및 송지 추출물이 1:1:3 또는 1:1:1일 수 있다. 단, 비율은 v:v:v이며 울금과 백지는 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 혼합에 사용하였다.

상기 백지 추출물은 퓨라노쿠마린(furanocoumarin)류의 옥시퓨세다닌(oxypeucedanin), 임페라토린(imperatorin), 펠로프테린(phellopterin), 비야크앙겔리신(byakangelicin), 비야크앙겔리콜(byakangelicol), 네오비야크앙겔리콜(neobyakangelicol), 베르갑텐(bergapten), 베르갑톨(bergaptol), 노다케닌(nodakenin), 소랄렌(psoralen) 및 잔토톡신(xanthotoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 옥시퓨세다닌(oxypeucedanin), 이소임페라토린(isoimperatorin), 임페라토린(imperatorin) 및 옥시퓨세다닌 하이드레이트(oxypeucedanin hydrate)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함할 수 있다.

상기 백지 추출물은 백지(Angelica dahurica)를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 백지 추출물은 백지를 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액 또는 저급 알코올로 추출한 추출물이거나, 또는, 이들의 부탄올 분획물일 수 있다. 상기 백지 추출물은 백지에 100% 에탄올을 사용하여 2시간 동안 초음파 추출기로 3회에 걸쳐 추출한 후, 부탄올로 분획한 분획물을 감압 농축하여 제조할 수 있다.

상기 백지 추출물에 포함되는 화합물은 백지를 50~100% C1 내지 C4의 저급 알코올 수용액 또는 저급 알코올로 추출한 추출물의 부탄올 분획물을 분리하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 100% 메탄올 또는 100% 에탄올로 추출한 추출물의 부탄올 분획물을, 크로마토그래피로 분리하여 얻을 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.

상기 울금 추출물은 디아릴헵타노이드계 화합물인 커큐민(curcumin), 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 및 비스데메톡시커큐민(bis-demethoxycurcumin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함할 수 있다.

상기 울금 추출물은 울금을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 울금 추출물은 울금을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출한 것일 수 있다. 상기 울금 추출물은 유기용매(알코올, 알코올 수용액, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지된 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 상기 크로마토그래피에는 실리카겔칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.

상기 송지 추출물은 7α-메톡시디하이드로아비에틱 에시드(7α-methoxydehydroabietic acid), 아비에타-8,11,13,15-테트라엔-18-오익 에시드(abieta-8,11,13,15-tetraen-18-oic acid), 카라맛수익 에시드(karamatsuic acid) , 7-옥소-13β -하이드록시아비에트-8(14)-엔-18-오익 에시드(7-oxo-13β-hydroxyabiet-8(14)-en-18-oic acid), 8(14)-포도칼펜-13-온-18-오익 에시드(8(14)-podocarpen-13-on-18-oic acid), 8(14)-포도칼펜-7,13-다이온-18-오익 에시드(8(14)-podocarpen-7,13-dion-18-oic acid) 및 4-에피-트랜스-코뮤닉 에시드(4-epi-trans-communic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함할 수 있다.

상기 송지 추출물은 송지를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 송지 추출물은 송지(Resina Pini)에 유기용매(알코올, 알코올수용액, 에틸아세테이트, 에테르, 아세톤, 클로로포름 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 칼럼 크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 상기 송지 추출물의 용매는 70 내지 100% 에탄올 또는 메탄올 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매일 수 있다. 상기 송지 추출물에 포함되는 화합물은 상기 유기용매 추출물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등을 이용하여 정제하여 분리할 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.

상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함 되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 세스퀴테르페노이드계 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용 될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 내지 대략 2000 ㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1 ㎎/㎏/일 내지 500 ㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상 될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 세스퀴테르페노이드계 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지 울금 및 송지를 각각 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것일 수 있다. 상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 중량비 1~5:1~5:0.1~0.5 로 혼합된 것일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물에 비타민 C 및 키토산을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 증상 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품을 제공한다.

본 발명은 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 증상 개선용 동물 사료 첨가제를 제공한다.

본 발명은 또한 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방용 천연소독제를 제공한다.

이때 상기 건강기능식품, 동물 약품, 동물 사료 첨가제 및 천연소독제는 상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지 울금 및 송지를 각각 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것의 혼합물일 수 있으며, 상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 중량비 1~5:1~5:0.1~0.5 로 혼합된 것일 수 있다. 또 하나 상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물에 비타민 C 및 키토산을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 세포병변 회복능을 보이는 백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물을 일정비로 혼합하여 제조함으로써 동물에서 조류 인플루엔자의 감염의 예방 또는 치료용 의약품으로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 양성대조군(Ribavirin, R)을 포함하여 백지, 울금 및 송지 추출물의 단독으로 처리했을 때와 1:1:1 혼합물의 H1N1 바이러스 감염에 대한 세포병변 회복능을 나타낸 그래프이다. 단, 비율은 v:v:v이며 울금과 백지는 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 혼합에 사용하였다.
도 2는 백지, 울금 및 송지 추출물의 비율별 혼합물의 H1N1 바이러스 감염 유도 세포병변 회복에 대한 상승 효과를 나타낸 그래프이다. 단, 비율은 v:v:v이며 울금과 백지는 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 혼합에 사용하였다.
도 3은 백지, 울금 및 송지 추출물의 1:1:1 (v:v:v)혼합물의 비타민 C 및 키토산 혼합물의 비율별 H1N1 바이러스 감염 유도 세포병변 회복에 대한 상승 효과를 나타낸 그래프이다. 단, 비율은 v:v:v이며 1:1:1 추출물 혼합물, 비타민C 및 키토산은 10 mg/mL 용액을 혼합에 사용하였다.
도 4은 마우스에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N2)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 마우스의 증체량을 나타낸 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 200 ㎎/mL이며, 괄호 안의 수치는 생존한 마우스의 수를 나타낸 것이다.
도 5은 마우스에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N2)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 마우스의 생존률의 변화를 나타낸 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 각기 200 ㎎/mL이다.
도 6은 닭에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 닭의 생존률의 변화를 나타낸 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 각기 50, 10 ㎎/mL이다.
도 7는 닭에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 닭의 상부 호흡기를 swab을 통해 채취한 샘플로부터의 바이러스 역가를 종란에 접종시켜 EID₅₀ 방법으로 나타낸 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 각기 50, 10 ㎎/mL이다.
도 8는 닭에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 닭의 배설강을 swab을 통해 채취한 샘플로부터의 바이러스 역가를 종란에 접종시켜 EID₅₀ 방법으로 나타낸 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 각기 50, 10 ㎎/mL이다.
도 9은 닭에서의 천연추출물 활성혼합물 처치군을 포함한 각 그룹의 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 각 군 닭의 적출한 기관(폐, 비장, 신장, 장, 뇌)에서의 바이러스 잔존량을 종란에 접종하여 EID₅₀ 방법으로 정량화한 그래프이다. 단, 천연추출물 활성혼합물의 농도는 각기 50, 10 ㎎/mL이다.

본 발명자는 울금, 백지 및 송지를 포함하는 생약 추출물의 약리활성을 갖는 화합물을 연구하는 중 조류 인플루엔자 감염 동물에서 본 발명의 생약 추출물이 뛰어난 항바이러스 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정 되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물의 제조>

울금(Curcuma longa)은 중국업체로부터 70% 주정 추출물을 동결건조하여 분말 형태로 공급받아 혼합물 제조에 사용하였다.

백지(Angelica dahurica) 9.6 kg을 70% 에탄올을 사용하여 초음파 추출기로 1회당 1시간 30분씩 총 3회에 걸쳐 추출하였다. 이 후, 추출액을 감압농축하고, 동결건조를 통하여 분말 형태로 만들어 혼합물 제조에 사용하였다.

송지(Resina Pini)는 추출물을 서울시 제기동 한약제 판매처인 덕현당으로부터 구입하여 혼합물 제조에 사용하였다.

상기에서 수득한 백지, 울금 및 송지 추출물을 하기 표 1과 같은 비율로 DMSO에 녹인 후 혼합(v/v)하여 sample 1 내지 10을 제조하였다. 단, 송지의 경우 예비실험을 통하여 10 ㎍/mL이 되도록 처리하였을　때 세포독성을 나타내었고, 1 ㎍/mL에서는 강한 활성을 보였다. 따라서 울금과 백지는 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 기준용액으로 하여 혼합에 사용하였으며 이하 실험의 편의성을 위하여 비율은 상기 기준용액의 부피비로 나타내었다.

	울금(CL)^*	백지(AD)^*	송지(PD)^*
sample 1	1	0	0
sample 2	0	1	0
sample 3	0	0	1
sample 4	1	1	1
sample 5	1	1	3
sample 6	1	3	1
sample 7	3	1	1
sample 8	1	1	5
sample 9	1	5	1
sample 10	5	1	1

^*단, 비율은 v:v:v이며 울금과 백지는 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 혼합에 사용함

< 실시예 2. 백지, 울금 , 송지 추출물 및 이들 혼합물의 인플루엔자 바이러스에 의한 세포병변 회복효과>

상기 실시예 1에서 제조한 sample 1 내지 4의 인플루엔자 바이러스(H1N1)에 의한 세포병변 회복능을 조사하였다. 인플루엔자 바이러스는 중앙백신연구소로부터 제공받은 인플루엔자 바이러스 H1N1(A/Sw/Kor/CAN1/04, KCTC11165BP)을 이용하였고, 바이러스 감염에 의한 세포의 생존율을 분석함으로써 항바이러스 활성을 확인하는 세포병변효과 회복 어세이(cytopathic effect reduction assay, CPE reduction assay)를 수행하였다.

96웰 플레이트(96 well plate)에 웰 당 1×10⁴ 개의 MDCK 세포를 분주한 후 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.4% L-글루타민이 포함된 DMEM배지를 넣고 하루 동안 배양한 후, 배양액을 버리고 PBS 용액으로 세척하였다. 이후 세포에 새 배지를 넣고, 상기 sample 1 내지 4를 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/mL이 되도록 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 이때, 세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군(Control)으로 이용하였고, 항바이러스제인 리바비린 10 μM을 처리한 것을 양성 대조군으로 이용하였으며, 각 실험군은 3반복 실시하였다.

3일 동안 배양한 세포를 이용하여 MTT 어세이를 수행하였다. 배양한 세포에 MTT용액을 넣고 37 ℃에서 반응시킨 후 배양액을 제거하고 200 ㎕의 DMSO를 넣었다. 피펫팅으로 잘 섞어 준 다음 10분 동안 방치한 후 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다. 이때, 정상 대조군의 세포생존율 대비 각각의 화합물에 의한 세포생존율을 백분율(%)로 환산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, H1N1 바이러스에 의하여 약 24%로 세포생존률이 감소한 MDCK 세포는 동일한 각 농도에서 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물(sample 1 내지 3)에 의하여 세포생존률이 증가하였다. 특히 백지(AD) 추출물 10 ㎍/mL 농도에서는 약 53%까지 세포생존률이 증가하여 항바이러스 활성이 좋은 것을 확인하였다. 커큐민 활성으로 잘 알려진 울금 또한 농도 의존적으로 항바이러스 활성을 나타내었다. 송지의 경우, 1 ㎍/mL에서는 59.3%로 증가하여 항바이러스 활성이 좋은 것을 확인하였으나, 이보다 높은 10 ㎍/mL 농도에서는 약 20%로 세포생존률이 오히려 감소하여 세포독성을 보였으며, 이는 일정 농도의 송지 추출물 적용의 경우 세포독성으로 인한 부작용을 고려해야 하는 문제가 있음을 알 수 있다. 또한, 송지의 성상이 비극성임으로 용해도가 극히 낮아 낮은 농도에서 적은 부피로 사용할 수 밖에 없다는 점을 고려하면 송지추출물을 안전하게 저농도 처리하면서 효과를 상승시킬 수 있는 혼합 조성물 적용이 필요한 것으로 판단하였다.

울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물을 기준용액 부피비 1:1:1로 혼합한 물질의 경우(sample 4), 단일물질에 비해 동일농도에서 더욱 강한 항바이러스활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물 혼합물 1 ㎍/mL 농도에서 백지(AD) 추출물 10 ㎍/mL 농도 효과보다 더 높은 항바이러스 활성을 확인함으로써, 안전하면서도 높은 항바이러스 활성을 갖는 것을 알 수 있었다.

이러한 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물의 항바이러스 상승효과는 각 식물의 서로 다른 기전으로 작용하기 때문으로 사료된다. 울금의 경우(Chen et al., 2010; Dao et al., 2012), 주요 구성성분인 커큐민(curcumin)을 포함한 커큐미노이드(curcuminoid)가 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase)를 억제함으로써 바이러스의 감염과 전파를 억제한다는 사실이 보고되어 있다. 또한 백지의 경우(Lee et al., 2020), 추출물을 포함한 주요 구성성분인 옥시퓨세다닌(oxypeucedanin)을 비롯한 주요 퓨라노쿠마린(furanocoumarin)이 세포내부로 들어가 바이러스 구성단백질을 만드는데 필수적으로 관여하는 뉴클레오프로틴(nucleoprotein)의 합성을 저해함으로 인플루엔자 바이러스의 감염을 억제함이 밝혀졌다. 소나무의 경우(Ha et al., 2020), 주요 구성성분인 다이테르페노이드(diterpenoid)가 인플루엔자 바이러스 표면 당단백질과 작용하기보다는 mRNA의 발현을 저해함으로 세포병변효과를 억제함이 보고 되었다. 따라서 세 종류의 서로 다른 식물 추출물은 서로 다른 기전을 통하여 인플루엔자 바이러스의 감염과 활성을 억제하며, 각 식물 추출물의 바이러스 억제효과가 또다시 각 식물 추출물의 항바이러스 효과를 높게 나타낼 수 있는 조건을 형성함으로 상승효과를 나타낸 것이라고 할 수 있다.

< 실시예 3. 백지, 울금 및 송지 추출물 비율별 혼합물의 항바이러스 활성>

백지(AD), 울금(CL) 및 송지(PD) 추출물의 혼합물의 비율별 항바이러스 활성 특성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 sample 4 내지 10의 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물의 비율별 혼합물을 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/mL 농도에서 세포병변회복능을 확인하였다.

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 96웰 플레이트(96 well plate)에 웰 당 1×10⁴ 개의 MDCK 세포를 분주하여 24시간 배양한 후, 배양액을 버리고 새 배지에 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물의 비율별 혼합물을 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/mL로 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 이때, 세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군(control)으로 이용하였고, 항바이러스제인 리바비린을 10 μM을 처리하여 양성 대조군으로 이용하였으며, 각 실험군은 3반복 실시하였다. 3일 동안 배양한 세포를 이용하여 MTT 어세이를 수행하고, 정상 대조군의 세포생존율 대비 각각의 화합물에 의한 세포생존율을 백분율(%)로 환산하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 울금(CL), 송지(PD) 및 백지(AD) 추출물 기준용액을 일정부피비로 혼합한 sample 4 내지 10을 투여했을 경우, 1:1:1, 1:3:1, 1:1:3 및 5:1:1(v:v:v)에서 높은 바이러스 억제능을 나타내었으며, 1 ㎍/mL로 처리하는 경우 1~5:1~5:1~5(v:v:v)인 모든 경우에서 바이러스 억제능을 나타내었다. 또한 본 발명자들의 예비실험의 결과를 참고하였을 때 이 비율 밖의 6~10:1:1, 1:6~10:1, 1:1:6~10 (v:v:v)의 비율, 즉 단일 식물의 비율이 올라감에 따라 저농도의 울금(CL), 송지(PD) 및 백지(AD) 추출물 혼합물의 상승작용보다는 각각 울금(CL), 송지(PD) 및 백지(AD) 추출물 단독효과와 더불어 송지의 세포독성효과와 유사하게 나타날 것을 예상할 수 있으므로 상기 기술한 송지추출물의 성상 및 세포독성으로 인한 제한점과 동물실험을 위한 백지 및 강황 추출물 생산단가를 고려하였을 때 기준용액 1:1:1(v:v:v)의 혼합물(무게비로는 1:1:0.1)의 비율이 가장 적합함을 확인하여 이를 이후의 실험에 이용하였다.

< 실시예 4. 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물과 비타민 C 및 키토산 혼합물의 항바이러스 활성 확인>

비타민 C 및 키토산의 경우 기존 보고된 연구결과에 따르면 비타민 C 및 키토산의 항인플루엔자 바이러스에 대한 효능이 in vivo 연구에서 확인(Zheng et al., 2016; Kim et al., 2013)되고 있어, 동물모델 또는 인체 적용 시, 본 발명의 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물과 함께 적용함으로써 약효의 상승효과를 기대할 수 있다. 따라서 백지, 울금 및 송지 추출물의 1:1:1(v:v:v) 혼합물을 비타민 C 및 키토산과 혼합한 혼합물의 항바이러스 활성을 확인하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 울금(CL), 백지(AD) 및 송지(PD) 추출물을 1:1:1(v:v:v)로 혼합한 혼합물과 비타민 C 및 키토산의 조합비율을 표 2와 같이 제조하였다. 단, 비율은 기준용액 부피비(v:v:v)이며, 비타민C 및 키토산은 각각 10 mg/mL 용액을 기준용액으로 하여 혼합에 사용하였다.

	Mixture(v:v:v) (CL:AD:PD=1:1:1)	Vitamin C	Chitosan
sample 4	10	0	0
sample 11	9	0	1
sample 12	9	1	0
sample 13	9	0.5	0.5

^*단, 비율은 v:v:v이며 울금, 백지, 비타민C 및 키토산은 10 mg/mL 용액을, 송지는 1 mg/mL의 용액을 혼합에 사용함

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 96웰 플레이트(96 well plate)에 웰 당 1×10⁴ 개의 MDCK 세포를 분주하여 24시간 배양한 후, 배양액을 버리고 상기 표 2의 비율로 제조한 sample 11 내지 14를 0.01, 0.1, 1 및 10 ㎍/mL 처리한 후 3일 동안 배양하였다. 이때, 세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군(Control)으로 이용하였고, 항바이러스제인 리바비린을 10 μM을 처리하여 양성 대조군으로 이용하였으며, 각 실험군은 3반복 실시하였다. 3일 동안 배양한 세포를 이용하여 MTT 어세이를 수행하고, 정상 대조군의 세포생존율 대비 각각의 화합물에 의한 세포생존율을 백분율(%)로 환산하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 송지(PD), 울금(CL) 및 백지(AD) 추출물을 1:1:1(v:v:v)로 혼합한 혼합물(sample 4)에 비타민 C 또는 키토산을 더 첨가한 혼합물(sample 11, 12)은 울금, 백지 및 송지 1:1:1 혼합물 단독 처리보다 근소하게 낮은 농도에서 항바이러스 활성이 더 높은 경향을 나타내었다. 그런데, 송지(PD), 울금(CL) 및 백지(AD) 추출물(1:1:1)에 비타민 C 및 키토산을 더 첨가한 혼합물(sample 13)은 송지(PD), 울금(CL) 및 백지(AD) 추출물 또는 여기에 비타민 C나 키토산만을 추가한 sample 11, 12보다 1/10의 농도에서도 높은 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통하여 비타민 C 및/또는 키토산을 백지, 울금 및 송지 혼합물에 첨가함으로써 울금, 백지 및 송지 혼합물의 항바이러스 효과를 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 실시예2 내지 4의 결과를 하기와 같이 표 3과 같이 나타낼 수 있다.

	울금 (CL)	백지 (AD)	송진 (PD)	Cell viability(%)
	울금 (CL)	백지 (AD)	송진 (PD)	0.01(㎍/mL)	0.1(㎍/mL)	1(㎍/mL)	10(㎍/mL)
Control	-			100±
H1N1 virus	-			23.8±
Ribavirin (10 μM)	-			69.8±
Ribavirin				31.6%	39.8%	42.6%	68.04%
sample 1	1	0	0	26.8%	30.4%	38.1%	38.8%
sample 2	0	1	0	29.1%	46.4%	47.1%	53.3%
sample 3	0	0	1	30.6%	50.2%	59.3%	19.9%
sample 4	1	1	1	32.4%	50.6%	56.6%	62.7%
sample 5	3	1	1	23.4%	24.4%	36.6%	40.7%
sample 6	1	3	1	34.1%	38.0%	57.9%	60.5%
sample 7	1	1	3	42.4%	47.8%	55.2%	60.6%
sample 8	5	1	1	48.7%	50.4%	53.4%	57.0%
sample 9	1	5	1	36.2%	41.3%	43.3%	57.2%
sample 10	1	1	5	25.8%	35.2%	44.3%	56.0%
1:1:1 test	1:1:1	vitaC	chito
sample 11	9	1	0	33.0%	42.9%	52.2%	60.9%
sample 12	9	0	1	35.2%	45.6%	50.7%	59.3%
sample 13	9	0.5	0.5	34.4%	50.6%	58.5%	59.8%

< 실시예 5. 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물의 조류 인플루엔자 감염 마우스에서의 항바이러스 활성 확인>

상기 실시예 4에서 확인한 천연추출물 활성혼합물을 조류 인플루엔자 바이러스 감염 동물모델에 적용하여 항 바이러스 활성을 확인하였다. 이를 위하여 백지, 울금 및 송지 추출물을 PEG(Polyethylene glycol):DMSO:H₂O 혼합용액 (1:8:16, v/v/v)으로 녹여 1:1:0.1(w/w/w)의 비율로 혼합한 뒤, 제조한 천연추출물혼합물과 비타민 C, 키토산을 9:0.5:0.5(v/v/v)로 혼합하여 최종적으로 천연추출물 활성혼합물을 완성하였다. 또한, 이와 관련된 기존에 보고된 논문을 참고하여 마우스실험을 위하여 샘플의 200 ㎎/mL으로 제조하였으며, 양성대조군은 oseltamivir를 사용하여 동일한 혼합용액에 1 ㎎/mL으로 제조하였다. 마지막으로 무처치대조군과 음성대조군을 위하여 혼합용액을 준비하였다.

조류 인플루엔자 바이러스는 충북대로부터 제공받은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 mouse adapted H5N2 Ab/Korea/ma81/07 (Av/ma81)을 이용하였고, 바이러스 감염에 의한 마우스의 생존율 및 증체량을 조류 인플루엔자에 대한 억제효과의 지표로 확인하였다.

본 실험을 위하여 6~8주령의 Balb/c 마우스 36마리를 사용하였으며 그룹당 9마리로(G1, 시험군; G2, 양성대조군; G3, 음성대조군; G4, 무처치대조군) 접종 6시간 전 각 그룹별로 천연추출물 활성혼합물 200 mg/ml을 존데 (Sonde) 도구를 이용하여 100 ㎕/mouse 양을 투여하였다. 그리고 혼합물 급이 6시간 이후 인플루엔자 바이러스를 공격접종하였다. 마우스를 Zoletil®50으로 복강에 접종하여 마취 후, 마우스 비강에 인플루엔자 바이러스 10^6. ⁵EID₅₀/ml (5LD₅₀, 50% 치사량; lethal dose 50)의 농도로 20 ㎕/dose 씩 접종하였다. 7일간 같은 시간에 추출물 혼합물을 급이하고 그룹별 생존율과 증체량을 확인하였다. 공격접종 3일 후 무처치대조군을 제외한 그룹당 6마리의 마우스를 채혈하였다. 공격접종 14일째 생존한 마우스의 폐를 적출하여 조직학적 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 조류 인플루엔자 바이러스를 투여한 군(G3)의 체중은 무처치군(G4)와 비교하여 바이러스 접종 8일까지 급격히 감소하였다. 단, 8일 이후 생존 마우스의 평군 체중은 급속히 무처치 대조군의 체중으로 회복되었는데, 이는 조류 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 자연치유 과정을 겪어 살아남은 적은 수의 마우스가 회복되면서 나타난 결과로 사료된다. 그러나, 도 5에서 보는 바와 같이, 감염 6일째 생존율은 33%로, 매우 낮음을 알 수 있다.

조류 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 타미플루를 처리한 양성 대조군(G2)의 경우, 마우스 체중은 무처치군(G4)과 비교하여 감소하였으나, 조류 인플루엔자 바이러스만을 투여한 음성 대조군(G3)보다는 체중감소가 적었다. 또한 도 5에서 보는 바와 같이, 감염 6일 후 생존율은 약 88%로 높은 생존율을 나타내었다.

본 발명의 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물을 조류 인플루엔자 바이러스 감염 마우스에 적용한 경우, 마우스 체중은 타미플루를 처리한 양성대조군과 유사한 감소반응을 보였다. 또한, 도 5에서 보는 바와 같이, 감염 6일 후 생존율은 약 67%로 양성대조군보다는 낮았으나, 음성대조군보다 2배 이상의 생존율을 나타내어, 본 발명의 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물이 조류 인플루엔자 바이러스 감염 마우스 예방/치료에 효과적으로 작용하는 것을 확인하였다.

< 실시예 6. 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물의 조류 인플루엔자 바이러스 감염 닭에서의 항바이러스 활성 확인>

6.1 백지, 울금 및 송지 추출물 혼합물의 조류 인플루엔자 바이러스 감염 닭 생존율에 미치는 효과

상기 실시예 4에서 제조한 천연추출물 활성혼합물의 닭에서의 고병원성조류 인플루엔자 바이러스(High Pathogenic Avian Influenza virus, HPAI) 억제능을 보기 위하여 생물안전 3등급 연구시설 (BL3)에서 평가를 실시하였다. 먼저 실시예 5와 동일한 방법으로 조류 인플루엔자 감염 예방 또는 치료 조성물을 제조하고, 양성대조군은 oseltamivir를 사용하여 동일한 혼합용액에 1 ㎎/mL으로 제조하였다. 마지막으로 무처치대조군과 음성대조군을 위하여 혼합용액을 준비하였다. 4주령 SPF(specific pathogen free) 병아리를 각 그룹당 10수로 하여 실험을 진행하였으며 먼저 공격접종 4시간 전, 상기 SPF 닭을 천연추출물 활성혼합물 저농도(Group 1, 10 mg/kg) 또는 고농도(Group 2, 50 mg/kg)로 혼합하여 급이를 시작하였으며 총 5일간(1dpi - 5dpi) 급이하였다. 최초 급이 6시간 후, 충북대학교에서 분양받은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 A/AP/Korea/W612/2017(H5N6)를 10^3.5EID₅₀/ml(5LD50)의 농도로 200 ㎕/dose씩 무처치대조군(Group 5)을 제외한 모든 그룹에 비강내로 공격접종하였다. 대조군은 추출물 혼합물의 용매를 동일량 처리하여 급이하였다. 접종 후, 7일차 까지의 생존율을 표 4 및 도 6에 나타내었다.

생존률 (%)
실험군	1dpi	2dpi	3dpi	4dpi	5dpi	6dpi	7dpi
G1(저농도 실험군)	100	83.3	50.0	50.0	33.3	33.3	33.3
G2(고농도 실험군)	100	83.3	83.3	83.3	83.3	83.3	83.3
G3(양성대조군 : 타미플루)	100	83.3	83.3	83.3	66.7	66.7	66.7
G4(음성대조군 : Challenge)	100	66.7	66.7	33.3	16.7	0	0
G5(무처치대조군)	100	100	100	100	100	100	100

표 4 및 도 6에서 보는 바와 같이, 조류 인플루엔자 바이러스 감염 음성대조군(G4)은 감염 6일째에 100% 폐사하였으며, 타미플루 처리한 양성대조군(G3)은 감염 6일째에 66.7% 생존하였다. 본 발명의 천연추출물 활성혼합물을 처리한 경우, 저농도 실험군(G1)은 33.3% 생존율을 나타내어 음성대조군과 비교하여 생존율이 증가한 것을 확인하였으며, 고농도 실험군(G2)의 경우, 생존율 83.3%로, 66.7%인 타미플루를 처리한 양성대조군보다도 높은 생존율을 나타내었다. 따라서, 천연추출물 활성혼합물이 특히 조류에서 효과적으로 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 증식을 억제함과 이러한 작용이 농도의존적으로 일어난다는 것을 모두 확인하였다. 현재 대한민국에서는 지난해 2020년 11월 26일을 시작으로 현재까지 전국 6개시,도 43 농가에서 고병원성 조류 인플루엔자(H5N8)가 발생하여 확진판정을 받았으며 감염된 가금류에 대해서는 매몰 및 살처분을 시행하여 막대한 경제적 손실의 어려움을 겪고 있다. 조류 인플루엔자 바이러스는 돼지 인플루엔자 바이러스에 비하여 숙주인 철새의 이동을 통한 확산범위가 넓기 때문에 우리나라에서 주기적으로 발생하여 더 큰 피해를 입히고 있다. 이러한 상황에서, 본 발명에서 규명한 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 천연물 복합물의 감염 및 전파 억제능을 통하여 축산 농가 가금류의 감염율을 낮추고 생존률을 증가시킬 수 있다면, 이에 대한 경제적, 환경적 측면에서 끼치는 파급효과가 상당할 것으로 판단된다.

6.2 조류 인플루엔자 바이러스 감염 닭의 장기에서의 바이러스 적정

상기 실시예 6.1에서 생존한 닭 및 폐사된 닭을 대상으로, 바이러스 공격접종 후, 4일째 각 시험군과 대조군에서 2마리씩 희생하여, 폐, 비장, 신장, 소장 및 뇌를 적출하였다. 이 후, 분쇄 및 희석하여 혈구응집반응실험(hemagglutination test, HA test)를 사용하여 바이러스 역가(EID50)를 측정하였다. 항원응집반응실험이란, 표면 당단백질인 hemagglutinin을 가지고 있는 바이러스가 적혈구와 만나게 되면 결합하는 성질을 이용하여 바이러스의 역가(titer)를 알아내는 검사법이다. 양성을 나타낼 때, 바이러스가 적혈구를 응집시켜 넓게 퍼져있지만, 음성일 때는 응집시키지 못하여 적혈구가 가라앉고, 기울였을 때 흐르는 양상을 나타낸다. 사용한 적혈구로는 0.5% chicken, turkey RBC(red blood cell; cRBC, tRBC)를 사용하였고, 희석에 PBS(Phosphate buffered saline)을 사용하였다. U bottom plate 사용하여 PBS를 96웰 플레이트(96 well plate)의 각 well에 50 ㎕씩 모두 넣었다. HA titer를 희석배수 4-8에 해당하도록 바이러스를 50 ㎕ 취하여 희석배수 2에 해당하는 가장 첫 번째 well에 한 칸씩 분주한 후, 다음 well에 대하여 2배 희석으로 단계희석을 진행하였다. 진행 후 RBC 50uL 씩 팁이 닿지 않도록 넣어주었다. 이후, 넣어준 후 플레이트를 부드럽게 쳐주었다. 음성대조군으로서, RBC의 상태를 확인하기 위해 마지막 칸에 PBS만 들어있는 well에 RBC를 넣어주었고, 30분간 incubation을 한 후, 응집여부를 확인하여 바이러스의 역가를(EID₅₀) 측정하였다. 그 결과를 표 5 및 도 7에 나타내었다.

실험군 (EID₅₀/0.2ml)	Lung	Spleen	Kidney	Intestine	Brain
G1(저농도 실험군)	4.0	2.3	3.0	4.3	2.0
G2(고농도 실험군)	0.5	0.2	0.3	0.5	0.2
G3(양성대조군 : 타미플루)	1.3	1.3	1.7	2.3	1.0
G4(음성대조군 : Challenge)	4.3	2.7	3.0	4.7	2.0
G5(무처치대조군)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

표 5 및 도 7에서 보는 바와 같이, 조류 인플루엔자 바이러스 감염 음성대조군(G4)은 폐, 비장, 신장, 소장 및 뇌에서 모두 바이러스가 높게 나타났으며, 특히 폐 및 장에서는 매우 높게 나타났다. 타미플루 처리한 양성대조군(G3)의 경우, 음성대조군과 비교하여 실험된 모든 장기에서 바이러스양이 감소하였다. 특히 폐에서의 감소량이 컸으나, 소장에서는 높은 바이러스량을 나타내었다. 본 발명의 천연추출물 활성혼합물을 처리한 경우, 저농도 실험군(G1)에서는 음성대조군과 큰 차이를 보이지 않았으나, 고농도 실험군(G2)의 경우, 폐, 비장, 신장, 소장 및 뇌 모두에서 바이러스양을 현저히 감소시켜 양성대조군보다 낮은 수준으로 떨어뜨렸다.

6.3 조류 인플루엔자 바이러스 감염 닭의 호흡기관에서의 바이러스 적정

공격접종 균주인 인플루엔자 바이러스는 조류에서 발병하는 바이러스로서 일반적으로 조류의 호흡기(기도, 폐)와 배설강에서 바이러스가 증식하기 때문에 감염 후 지속적인 swab을 실시하면 바이러스의 growth curve 및 사멸되는 결과를 모니터링 할 수 있다. 특이적으로 고병원성 인플루엔자 바이러스로 분류되는 H5형 바이러스는 일반적인 호흡기와 배설강 뿐만 아니라 뇌, 비장, 신장 등 다양한 기관으로 전이 되어 증식하기 때문에 고병원성 인플루엔자를 공격 접종하였을 시에는 조직들을 적출하여 바이러스 역가를 측정하면 바이러스의 병원성 및 백신 또는 치료물질에 의한 바이러스 경감 정도를 효과적으로 모니터링 할 수 있다. 따라서 실시예 6.1에서 생존한 닭의 상부 호흡기로부터 5일간 swab sample을 수득하여 상기 실시예 6.2와 동일한 방법으로 바이러스의 역가를 적정하였다. 그 결과를 표 6 및 도 8에 나타내었다.

실험군 (EID₅₀/0.2ml)	1dpi	2dpi	3dpi	4dpi	5dpi
G1(저농도 실험군)	2.67	3.50	3.67	2.50	1.33
G2(고농도 실험군)	2.67	1.00	0.80	0.50	0.10
G3(양성대조군 : 타미플루)	2.50	1.33	1.50	1.67	0.50
G4(음성대조군 : Challenge)	2.50	4.17	4.50	4.17	1.33
G5(무처치대조군)	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10

표 6 및 도 8에서 보는 바와 같이, 조류 인플루엔자 바이러스 감염 음성대조군(G4)은 감염 1일째부터 무처치대조군(G5)과 비교하여 닭의 호흡기관에서 매우 높은 바이러스 양을 나타내었다. 이후 2일째 및 3일째 증가하였으며, 4일째에 근소하게 감소하여 5일째 에는 감염 1일째의 약 절반으로 감소하였다. 그러나 감염 6일째에 음성대조군(G4) 100% 가 폐사하였다.

타미플루 처리한 양성대조군(G3)은 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으나, 2일째에는 1일째의 절반으로 감소하였으며, 3,4일째 조금 증가하다가 5일째에 0.5 EID₅₀/0.2ml 로 감소하였다. 본 발명의 천연추출물 활성혼합물을 처리한 경우, 저농도 실험군(G1)은 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으며, 2, 3일째에는 서서히 증가하였다가 4일째부터 감소하였다. 본 발명의 고농도 실험군(G2)의 경우, 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으나, 2일째부터 기관에서의 바이러스 양이 급격히 감소하였으며, 2-4일째에는 더욱 감소하다가 5일째에는 무처치대조군(G5)과 유사하게 바이러스가 거의 검출되지 않았다.

6.4 조류 인플루엔자 바이러스 감염 닭의 배설강에서의 바이러스 적정

생존한 닭의 배설강으로부터 swab sample을 수득하여 상기 실시예 6.2와 동일한 방법으로 바이러스의 역가를 적정하였고 그 결과를 표 7 및 도 9 나타내었다.

실험군 (EID₅₀/0.2ml)	1dpi	2dpi	3dpi	4dpi	5dpi
G1(저농도 실험군)	0.50	3.17	3.50	3.00	1.67
G2(고농도 실험군)	0.50	1.00	0.83	0.50	0.10
G3(양성대조군 : 타미플루)	0.50	1.17	1.17	1.50	0.50
G4(음성대조군 : Challenge)	0.50	3.50	4.00	4.17	1.67
G5(무처치대조군)	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10

표 7 및 도 9에서 보는 바와 같이, 조류 인플루엔자 바이러스 감염 음성대조군(G4)은 감염 2일째부터 증가를 나타내었으며, 감염 2일째에 무처치대조군(G5)과 비교하여 닭의 배설강에서 매우 높은 바이러스 양을 나타내었다. 이후 3일째 및 4일째 증가하였으며, 5일째에 감소하여 감염 1일째의 약 절반으로 감소하였다. 그러나 감염 6일째에 음성대조군(G4) 100% 가 폐사하였다.

타미플루 처리한 양성대조군(G3)은 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으며, 2일째에는 1일째보다 2배 이상 증가하였으나, 음성대조군(G4)의 절반 이하로 나타나 항바이러스 활성을 확인할 수 있었다. 이후, 3, 4일째에 조금 증가하다가 5일째에 0.5 EID₅₀/0.2ml 로 감소하였다. 본 발명의 천연추출물 활성혼합물을 처리한 경우, 저농도 실험군(G1)은 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으며, 2, 3일째에도 음성대조군(G4)과 유사하게 바이러스량이 급격히 증가하였다. 그러나 감염 4일째부터 감소하여 5일째에는 감염 1일째의 약 절반으로 감소하였다. 감염 6일째에 저농도 시험군(G1) 66.7% 가 폐사하였다.

본 발명의 고농도 실험군(G2)의 경우, 감염 1일째에는 음성대조군(G4)과 유사한 바이러스량을 나타내었으며, 2일째에는 1일째보다 증가하였으나, 양성대조군(G3)보다 그 바이러스 증가 수준이 낮았다. 이후 3, 4일째 계속 감소하여 바이러스 감염 5일째에는 무처치대조군(G5)과 유사하게 바이러스가 거의 검출되지 않았다.

상기와 같은 결과는 부작용이 거의 없는 100% 천연물로 이루어진 본 발명의 조성물이 조류 인플루엔자 바이러스 감염 동물에서 타미플루 효과, 또는 그 이상의 항바이러스 효과를 나타낼 수 있음을 시사하며, 특히 닭을 비롯한 가금류에서 뛰어난 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

< 제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 백지, 울금 및 송지 추출물이 혼합된 혼합물, 비타민 C 및 키토산 혼합물 20 g을 각각 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 백지, 울금 및 송지 추출물이 혼합된 혼합물 100 ㎎, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

Claims

백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지 울금 및 송지를 각각 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 중량비 1~5:1~5:0.1~0.5 인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 백지 추출물은 옥시퓨세다닌(oxypeucedanin), 이소임페라토린(isoimperatorin), 임페라토린(imperatorin) 및 옥시퓨세다닌 하이드레이트(oxypeucedanin hydrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함하며,
상기 울금 추출물은 커큐민(curcumin), 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 및 비스데메톡시커큐민(bis-demethoxycurcumin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함하며,
상기 송지 추출물은 7α-메톡시디하이드로아비에틱 에시드(7α-methoxydehydroabietic acid), 아비에타-8,11,13,15-테트라엔-18-오익 에시드(abieta-8,11,13,15-tetraen-18-oic acid), 카라맛수익 에시드(karamatsuic acid) , 7-옥소-13β -하이드록시아비에트-8(14)-엔-18-오익 에시드(7-oxo-13β-hydroxyabiet-8(14)-en-18-oic acid), 8(14)-포도칼펜-13-온-18-오익 에시드(8(14)-podocarpen-13-on-18-oic acid), 8(14)-포도칼펜-7,13-다이온-18-오익 에시드(8(14)-podocarpen-7,13-dion-18-oic acid) 및 4-에피-트랜스-코뮤닉 에시드(4-epi-trans-communic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물에 비타민 C 및 키토산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품.
제6항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지 울금 및 송지를 각각 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품.
제6항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 중량비 1~5:1~5:0.1~0.5 인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물에 비타민 C 및 키토산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품.
제9항에 있어서,
상기 동물 약품은 닭, 칠면조, 거위, 오리, 꿩, 메추라기, 비둘기, 타조 등과 같은 야생조류, 가금류, 돼지, 개 및 고양이로 이루어진 군에서 선택된 하나의 동물을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 동물 약품.
백지(Angelica dahurica), 울금(Curcuma longa) 및 송지(Resina Pini) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 증상 개선용 동물 사료 첨가제.
제11항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지 울금 및 송지를 각각 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 추출한 것의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 증상 개선용 동물 사료 첨가제.
제11항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물은 백지, 울금 및 송지 추출물이 중량비 1~5:1~5:0.1~0.5 인 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 증상 개선용 동물 사료 첨가제.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 백지, 울금 및 송지 추출물의 혼합물에 비타민 C 및 키토산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 증상 개선용 동물 사료 첨가제.