BRPI0912021B1

BRPI0912021B1 - Composição padronizada, método de fabricação e uso na resolução de infecção por vírus de rna

Info

Publication number: BRPI0912021B1
Application number: BRPI0912021-1A
Authority: BR
Inventors: Bhaskaran Sunil; Vishwaraman Mohan
Original assignee: Indus Biotech Private Limited
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2009-09-23
Publication date: 2020-03-24
Also published as: CN102099028A; RU2010148919A; KR20110070963A; WO2011018793A1; JP5369320B2; ES2529705T3; AU2009347566B2; CA2721040C; BRPI0912021A2; US20110039923A1; EP2328575B1; RU2472502C2; EP2328575A1; KR101323491B1; US8835415B2; CN102099028B; CA2721040A1; AU2009347566A1; JP2011530609A; EP2328575A4

Abstract

composição padronizada, método de fabricação e uso na resolução de infecção por vírus de rna a presente divulgação relaciona-se a preparações antivirais obtidas de fontes vegetais denominadas cinnamon, litchi e arachis. esta fornece uma composição e um processo para preparar a composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérico, trímeros e tetrâmeros. a composição melhora a resposta de imunidade e é considerada útil no tratamento e no controle de infecção por hiv e aids e para a prevenção, tratamento e controle do vírus influenza e infecção.

Description

COMPOSIÇÃO PADRONIZADA, MÉTODO DE FABRICAÇÃO E USO NA RESOLUÇÃO DE INFECÇÃO POR VÍRUS DE RNA

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção está relacionada com preparações antivirais. A invenção fornece preparações antivirais obtidas de plantas e que melhoram resposta imune e são consideradas como eficazes contra infecção por HIV, AIDS e vírus Influenza e infecção.

HISTÓRICO

Catequinas são metabólitos de planta polifenólicos, que pertencem à família flavonóide. A fórmula e o peso moleculares das catequinas são Ci₅Hi₄O₆e 290g/mol. A catequina e a epicatequina são epímeros, com (-)-epicatequina e (+)-catequina sendo os isômeros óticos mais comuns encontrados na natureza.

As procianidinas ou taninas condensadas são oligômeros de flavonóide, cujos blocos de construção são (+) - catequina e (-) - epicatequina. Eles são produtos finais oligoméricos da via biossintética de flavonóide e agora são identificados e reconhecidos por seus efeitos benéficos nos seres humanos. Eles estão presentes abundantemente no reino das plantas em frutas, cascas de árvore, folhas e sementes, onde fornecem proteção contra a luz, oxidação e predadores. As procianidinas são encontradas em muitas plantas, principalmente maçãs, casca de pinheiro, casca de canela, pericarpo da lixia, amendoins, semente de uva, coco, pele da uva, uva-do-monte, amora, groselha preta, chá verde e chá preto.

Com base na ligação entre unidades monoméricas sucessivas, as procianidinas são classificadas como polifenóis do Tipo A, B ou C.

Geralmente, a ligação entre unidades monoméricas sucessivas de procianidinas está entre a 4- posição da unidade “superior” e a 8- posição da unidade “inferior”,

2/37 levando a uma procianidina do Tipo B. Alternativamente, a ligação pode ocorrer entre C4 da unidade “superior” e Ce da unidade inferior, levando a uma procianidina do Tipo C. Polifenóis do tipo B e C são abundantemente vistos em muitas fontes botânicas. Quando unidades monoméricas sucessivas são ligadas por uma ligação de éter entre a C2 e C4 da unidade “superior” e o oxigênio da posição C7 e as posições C⁶/C⁸ (respectivamente) da unidade inferior, uma procianidina do Tipo A é formada. As procianidinas no tipo A são vistas raramente quando comparadas com polifenóis do tipo B e C.

Resposta Imunológica a um Antíqeno

O sistema imune é uma coleção de mecanismos dentro de um hospedeiro que o protege contra doenças através da identificação e eliminação do patógeno. A resposta do sistema a um patógeno começa a partir da identificação de uma proteína estranha à destruição final da fonte dessa proteína estranha, dessa forma, protegendo o hospedeiro. Mesmo o reconhecimento de uma proteína simples de organismo unicelular envolve uma série de etapas complexas, que levam à eliminação final do organismo do hospedeiro. Esse processo inteiro é a resposta imunológica à presença de uma proteína estranha ou do antígeno.

A resolução da infecção pelo sistema imune é a resposta imunológica ao antígeno, e pode ser dividida em 3 estágios:

Ativação e Mobilização: Os Leucócitos (WBC) são ativados quando identificam uma molécula estranha ou um antígeno. As células imunes como macrófagos e células T liberam substâncias que atraem outras células imunes ao local da molécula estranha, identificada e, dessa forma, mobilizam a miríade de células imunes para erradicar o patógeno.

Regulação: A resposta imune estimulada deve ser controlada a fim de prevenir dano

3/37 excessivo ao hospedeiro. Os linfócitos T reguladores facilitam o controle das respostas imunes através da secreção de citocinas, que agem como os mensageiros do sistema imune e, assim, regulam uma resposta imune exagerada.

Resolução: A resolução da infecção envolve o confinamento do patógeno e sua eliminação do corpo. Após o patógeno ser eliminado, a maioria dos leucócitos é destruída, aqueles que permanecem são chamados de “células de memória” e protegem o hospedeiro contra infecção futura pelo mesmo patógeno através da estimulação de uma resposta imune antecipada ao patógeno.

Um patógeno tem sucesso em causar uma infecção quando o hospedeiro é incapaz de superar uma defesa forte o suficiente para eliminar o patógeno. Nesses casos, os anticorpos produzidos pelo hospedeiro são insuficientes para neutralizar a quantidade de antígenos existentes. Assim, os antígenos livres tem sucesso na infecção do hospedeiro. Nesses casos, auxílios externos como antibióticos e antivirais são usados para reduzir a quantidade de antígenos. Uma vez que a quantidade de antígeno é reduzida, a resposta imunológica é suficiente para eliminar o patógeno.

Infecção por HlVe AIDS:

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovirus que destrói o sistema imune. Essa infecção pode eventualmente levar à Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), uma condição séria e de risco à vida na qual o sistema imune falha em funcionar adequadamente. O HIV primariamente infecta células específicas no sistema imune humano: os linfócitos T “de ajuda” (especificamente células T CD4+), macrófagos e células dendríticas. Quando a quantidade de célula T CD4+ diminui abaixo de um nível crítico, a imunidade mediada por célula é perdida e o corpo se torna progressivamente mais suscetível a infecções oportunistas.

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Ciclo de Vida do HIV: Uma vez que o HIV entrou no hospedeiro, o HIV precisa de células específicas do hospedeiro para facilitar sua replicação e propagação. A célula do hospedeiro no caso do HIV é a célula T ou célula CD4.

1. Reconhecimento do hospedeiro e ligação: O HIV busca células CD4 e se anexa nelas através de um sistema de “lock and key” [fechadura reconhece a chave] através de correceptores na superfície da célula. As proteínas na superfície do HIV se anexam às proteínas complementares na célula CD4.

2. Anexação e entrada no hospedeiro: Após a anexação, o HIV injeta proteínas virais nos fluidos celulares (citoplasma) da célula T. Isso causa uma fusão da membrana celular com o envelope externo do HIV.

3. Desmontagem das proteínas virais: A fim de usar seu material genético (RNA) para reprodução, o revestimento protetor que circunda o RNA deve ser dissolvido. Sem essa etapa, a conversão de RNA em DNA (os blocos de construção das novas cópias de HIV) não pode se realizar e a replicação é interrompida.

4. Transcrição reversa: Uma vez dentro da célula, o RNA de filamento único do HIV deve ser convertido ao DNA de filamento duplo. Essa etapa é realizada através da enzima transcriptase reversa. A transcriptase reversa usa blocos de construção da célula T para ajudar a converter o RNA viral em DNA. O DNA contém as informações genéticas necessárias para a replicação do HIV.

5. Replicação e montagem no novo virion: A fim de se replicar, o DNA viral recentemente formado deve se integrar no núcleo do hospedeiro. Esse processo ainda não é inteiramente compreendido, mas acredita-se que é auxiliado pelas proteínas de transporte viral. Na integração, o vírus fica em gestação enquanto a célula hospedeira prepara as proteínas que este exige para completar a replicação. Uma vez que os materiais estiverem disponíveis, eles são divididos pelo vírus com

5/37 base na exigência e estrutura e são subsequentemente montados no novo HIV. Esse processo é auxiliado pela enzima protease.

6. Brotamento a partir da célula hospedeira: A etapa final do ciclo de replicação viral é chamada de brotamento. Com seu material genético alojado e um novo revestimento externo feito a partir da membrana das células CD4 hospedeiras, o HIV recentemente formado se aperta e entra na circulação, pronto para começar o processo inteiro novamente.

Intervenções Atuais:

Os métodos atuais de interrupção da replicação e propagação do HIV incluem: Inibidores da entrada do vírus; Inibidores de Fusão de Membrana; e inibidores da transcriptase reversa; inibidores da integrase; inibidores da protease; inibidores de maturação, etc. A FDA aprovou diversos medicamentos para tratamento da infecção por HIV. A maioria desses medicamentos funciona através de seu mecanismo de ação antiretroviral (ARV).

A infecção com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) apresenta desafios políticos, econômicos, da saúde pública, sociais e científicos às nações no mundo inteiro. No final de 2007, uma estimativa de 33,2 milhões de pessoas estavam vivendo com HIV/AIDS no mundo inteiro. Dessa forma, há uma necessidade urgente pela administração e/ou tratamento dessa doença com medicamentos mais seguros e mais eficazes._Um desafio adicional apresentado por esse vírus é sua suscetibilidade à mutação. As proteínas virais do HIV são propensas à mutação e, dessa forma, estirpes resistentes ao medicamento possuem uma ameaça adicional que cria uma necessidade de classes mais novas de medicamentos.

Vírus Influenza:

A gripe é uma doença infecciosa, causada por vírus de RNA da família

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Orthomyxovirídae (os vírus da gripe), que afeta aves e mamíferos. A infecção por esse vírus afeta principalmente o nariz, a garganta, os brônquios e, ocasionalmente, os pulmões.

Estrutura do Vírus Influenza: Q vírus Influenza é classificado em 3 categorias: Vírus Influenza A, B e C. Os 3 subtipos de vírus da gripe tem uma estrutura geral muito semelhante. Os vírus são feitos de um envelope viral contendo dois tipos principais de glicoproteínas, que são enroladas ao redor de um núcleo central. O núcleo central contém o genoma de RNA viral e outras proteínas virais que embalam e protegem esse RNA. A hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA) são as duas glicoproteínas amplas no exterior das partículas virais.

Vírus Influenza A: Os vírus do tipo A são os patógenos humanos mais virulentos entre os três tipos de gripe e causam a doença mais severa. O vírus Influenza A pode ser subdividido em diferentes sorotipos, com base na resposta de anticorpo a esses vírus. Os sorotipos que foram confirmados nos humanos, ordenados pela quantidade de mortes pandêmicas humanas conhecidas, são: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7. Os vírus Influenza A causaram diversas pandemias durante o último século e continuam a causar epidemias anuais. O surgimento de novas estirpes de gripe continua a possuir desafios às comunidades da saúde pública e científica. O vírus H1N1 é um sorotipo do vírus Influenza A e é uma das estirpes mais virulentas, conhecidas que afetam os seres humanos. O sorotipo H1N1 foi responsável por milhões de mortes em 1918 (Gripe Espanhola) e está mais recentemente causando uma pandemia global de Gripe Suína.

Ciclo de Vida Viral da Influenza: O processo de replicação e propagação viral do Influenza é destacado abaixo:

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1. Reconhecimento do hospedeiro e ligação: A ligação do vírus à célula hospedeira usando a proteína HA ao ácido siálico se une a açúcares nas superfícies das células epiteliais. As células epiteliais estão tipicamente presentes no nariz, na garganta e nos pulmões de mamíferos e nos intestinos das aves

2. Anexação e entrada no hospedeiro: Após a ligação, a proteína HA é dividida e o vírus entra na célula por endocitose.

3. Desmontagem das proteínas virais: Uma vez que o vírus entra na célula, o pH e as condições ambientais do endossomo levam a

a. Uma parte da HA, o envelope viral funde-se à membrana do vacúolo

b. O canal de ion M2 permite a entrada de prótons ao centro viral, que acidificam o centro viral, levando a sua desmontagem e à subsequente liberação do RNA viral e proteínas centrais no citoplasma da célula hospedeira

4. Transcrição reversa: O RNA viral e as proteínas centrais são agora transportados para o núcleo celular onde o RNA é transcrito e ainda traduzido para proteínas virais.

5. Surgimento a partir da célula hospedeira: As proteínas HA e NA foram aglomerados próximos à membrana da célula, que subsequentemente também armazenam o RNA viral e as proteínas centrais, que, então, levam ao “brotamento” do vírus e propagação para infecção subsequente.

Conforme visto a partir das etapas de infecção e propagação detalhadas acima, a HA e NA tem um papel importante na infecção. Antes da liberação do virion, a NA também divide ácido siálico, a fim de prevenir a ligação da HA ao ácido siálico.

Intervenções Atuais para o vírus Influenza A: Há duas classes de medicamentos aprovados pela FDA Norte-Americana contra o vírus Influenza A: Inibidores do canal de íon como Adamantanos (cloridrato de amantadina e rimantadina); e inibidores da

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Neuraminidase como Oseltamivir (TAMIFLU) e Zanamivir (RELENZA)

O virus Influenza A é propenso a mutações. Essas mutações são primariamente de proteínas virais como NA, HA e proteínas de canal de ion M2 e, assim, inibidores dessas proteínas serão ineficazes contra estirpes mutantes. O potencial de mutação e a pandemia global de Influenza A de 2009 apresentam uma necessidade urgente de terapias, que ofereçam um tratamento e opções de prevenção contra esse vírus. ESTADO DA TÉCNICA

Richard Anderson et al, “Isolation and characterization of polyphenols Tyne A polymers from cinnamon with insulin-like biological activity” no Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, dd 52, 65-70,

Esse trabalho descreve um extrato aquoso de canela comercial e identificou polímeros polifenólicos que aumentam o metabolismo da glicose em aproximadamente 20 vezes em linhagens celulares in vitro. Eles usaram Cinnamomum cassia (Korintji cassia) para a preparação desse extrato. Essa variedade tem um alto conteúdo de coumarina e cinamaldeído.

Esse trabalho ainda descreve um método de HPLC preparatório para a preparação e caracterização desse extrato aquoso.

Essa publicação descreve procianidina de catequinas, do tipo A duplamente ligada. Esse trabalho identificou trímero (peso molecular de 864), tetrâmero (peso molecular de 1152) e oligômero de catequinas que são isolados da canela.

Kilkuskie et al, “HIV and reverse transcriptase inhibition by tannins” no Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1992, Vol 2, pp 1529- 1534.

Essa publicação avalia taninas e taninas condensadas com relação a sua atividade anti-HIV e seu potencial em inibir a enzima transcriptase reversa. Embora esse estudo tenha descoberto algumas taninas com atividade anti-HIV, elas foram

9/37 sobrecarregadas com as toxicidades associadas. Essa publicação descreve 3 compostos que são formas condensadas de catequinas. As moléculas 40, 44 e 45 são dímeros, trímeros e tetrâmeros de catequinas. Esse trabalho concluiu que não houve nenhuma correlação entre a inibição da enzima RT e a ação anti-HIV dessas taninas. Adicionalmente, as Moléculas 44 e 45 mostraram uma atividade anti-HIV de 90% e 73%, respectivamente, mas não mostraram inibição significativa da enzima RT.

Michael Ovadia et al. no Pedido de Patente Norte-Americana 2006 275515A1

Essa patente intitulada “Preparações antivirais obtidas de um extrato de canela natural descreveu um extrato aquoso natural, obtido da canela, tendo propriedades antivirais. Esse documento descreve um extrato aquoso de canela, que está sujeito à precipitação por sais, com um sal. Esse precipitado é novamente dissolvido em água ou tampão e purificado usando cromatografia em sefarose e subsequentemente eluído com outro tampão e galactose.

O processo comumente usado de precipitação por sal refere-se à seleção de moléculas de peso molecular alto (comumente peptídeos). Assim, é muito evidente a partir desse processo que o processo descrito nesse documento tem por objetivo recuperar as moléculas de peso molecular alto (aproximadamente 10Kda).

O princípio ativo da composição de acordo com a reivindicação tem um peso molecular maior do que 10KDA e responde a uma absorbância a 280nm e entre aproximadamente 15 e 20 OD. Esse composto é finalmente eluído a partir da coluna de sepharon usando fosfato tampão e galactose. Portanto, o composto final terá altas concentrações de fosfatos e galactose.

Esse composto de peso molecular alto descrito nessa aplicação foi testado em vírus PR 8 influenza A, vírus Para Influenza (Sendai), Pré-absorção nos eritrócitos e

10/37 ganho de peso em camundongos infectados com gripe ou o virus sendai e um estudo de HIV induzido por sincicio.

O exemplo 13 desse pedido de patente descreve um teste realizado com esse extrato em células MT2 para verificar o efeito na formação de Sincício. De acordo com a figura 15 desse pedido em concentrações de 60 a 100 microgramas, este inibe a formação de sincício. A formação de sincício não é um teste confirmatório da atividade antiviral. Isso é elucidado com evidência na seguinte publicação. [Gueseppe pantaleo et al Eur J immunology 1991,21,1771:1774 ‘dissociation between syncytia formation and HIV spreading. Suppressing Syncytia formation does not necessarily reflect inhibition of HIV infection.]

Embora o extrato divulgado tenha mostrado potencial para inibir a formação de sincício, deve-se observar que apenas algumas estirpes de HIV causam formação de sincício. Adicionalmente, a formação de sincício não pode ser vinculada à presença ou à progressão da infecção por HIV ou AIDS. A formação de sincício é meramente um fenótipo que pode ser expressado por algumas estirpes. A falta de formação de sincício não pode ser vinculada à ausência de HIV ou ao controle da infecção.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

O primeiro objetivo da invenção é fornecer uma composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica, trímero e tetrâmero de fonte vegetal.

O segundo objetivo da invenção é fornecer um processo para preparar composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica, trímero e tetrâmero de fontes vegetais, como Cinnamomum, Litchi e Arachis.

O terceiro objetivo da invenção é fornecer uma composição que melhore a resposta imune em indivíduos e também que seja eficaz contra a infecção por HIV, AIDS e o

11/37 vírus Influenza e infecção.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO

Conformemente, a presente invenção relaciona-se a uma composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis; um processo para preparação da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, processo este compreendendo as etapas de extração da massa da planta pulverizada usando solvente orgânico para remover substâncias tóxicas; secagem da massa para remover o solvente orgânico; re-extração da massa seca usando solvente aquoso para obter extrato; e purificação do extrato através de coluna cromatográfica, seguida por concentração, purificação, padronização e secagem para obter a composição; um método para melhorar a resposta imunológica em um indivíduo com necessidade disso, método este compreendendo a etapa de administração de quantidade farmaceuticamente eficaz da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis ao indivíduo; e um método de tratamento, prevenção e controle de infecções virais em um indivíduo com necessidade disso, método este

12/37 compreendendo a etapa de administração de quantidade farmaceuticamente eficaz da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis ao indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ACOMPANHANTES

Figura: 1 mostra a estrutura molecular do Pentâmero de Flavonóide

Figura: 2 mostra EI-MS do Pentâmero Pentamérico do Flavonóide

Figura: 3 mostra 13C NMR do Pentâmero do Flavonóide

Figura: 4 mostra a Cromatografia rápida da composição para identificar o Pentâmero do Flavonóide

Figura: 5 mostra a HPLC do Pentâmero do Flavonóide

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção relaciona-se a uma composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Em uma configuração da presente invenção, a composição é obtida de fonte vegetal, selecionada de um grupo compreendendo Cinnamomum, Litchi e Arachis. Em outra configuração da presente invenção, a concentração preferível do flavonóide procianidina pentamérica está variando de aproximadamente 80% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um, em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 20% w/w.

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Em outra configuração da presente invenção, o referido flavonóide procianidina pentamérica tem peso molecular de aproximadamente 1440.

Em outra configuração da presente invenção o, o referido pentâmero é pentâmero de procianidina do tipo A.

Em outra configuração da presente invenção, os referidos excipientes são selecionados de um grupo compreendendo gomas, agentes granulantes, ligantes, lubrificantes, desintegrantes, adoçantes, colorantes, aromatizantes, de revestimento, plastificantes, conservantes, de suspensão, emulsificantes, antiestáticos e de esferonização.

Em outra configuração da presente invenção, a referida composição é formulada em várias formas de dosagem, selecionadas de um grupo compreendendo comprimido, troches, lozenges, suspensões aquosas ou oleosas, pós dispersíveis ou grânulos, emulsão em cápsulas de gel duras ou macias, xaropes e elixires.

A presente invenção relaciona-se a um processo para preparação da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, processo este compreendendo as etapas de extração da massa da planta pulverizada usando solvente orgânico para remover substâncias tóxicas; secagem da massa para remover o solvente orgânico; re-extração da massa seca usando solvente aquoso para obter extrato; e purificação do extrato através de coluna cromatográfica, seguida por concentração, purificação, padronização e secagem para obter a composição.

Em uma configuração da presente invenção, a massa de planta pulverizada é selecionada de um grupo de plantas compreendendo Cinnamomum, Litchi e Arachis.

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Em uma outra configuração da presente invenção, o solvente orgânico é selecionado de um grupo compreendendo acetato etílico, acetato butílico, amilacetato, 2-etilhexil acetato e quaisquer combinações destes.

Em uma outra configuração da presente invenção, a referida extração é realizada durante um período de tempo variando de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 12 horas, preferivelmente durante aproximadamente 10 horas.

Em uma outra configuração da presente invenção, as referidas substâncias tóxicas incluem coumarina e aldeídos.

Em uma outra configuração da presente invenção, o referido extrato é filtrado através de coluna cromatográfica de dois estágios.

Em uma outra configuração da presente invenção, as referidas colunas cromatográficas são selecionadas de um grupo compreendendo resinas XAD-1180, XAD-7HP e XAD-1140.

Em uma outra configuração da presente invenção, a referida re-extração com solvente aquoso é realizada em um pH variando de aproximadamente 3,8 a aproximadamente 5,8, preferivelmente a aproximadamente 4,0.

Em uma outra configuração da presente invenção, a referida re-extração é realizada durante um período de tempo variando de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 12 horas, preferivelmente durante aproximadamente 10 horas, em uma temperatura variando de aproximadamente 30°C a 90°C, preferivelmente variando entre 31 °C e 40°C.

Em uma outra configuração da presente invenção, o referido solvente aquoso é água deionizada acidificada.

Em uma outra configuração da presente invenção, a referida composição ainda compreendendo excipientes selecionados de um grupo compreendendo gomas,

15/37 agentes granulantes, ligantes, lubrificantes, desintegrantes, adoçantes, colorantes, aromatizantes, de revestimento, plastificantes, conservantes, de suspensão, emulsificantes, antiestáticos e de esferonização.

A presente invenção relaciona-se a um método para melhorar a resposta imunológica em um indivíduo com necessidade disso, método este compreendendo a etapa de administração de quantidade farmaceuticamente eficaz da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis ao indivíduo.

Em uma outra configuração da presente invenção, a resposta imunológica é melhorada em doenças selecionadas de um grupo, mas não limitantes a, gripe, infecção por HlVe AIDS.

Em uma outra configuração da presente invenção, a resposta imunológica é melhorada em um indivíduo com necessidade desta.

Em uma outra configuração da presente invenção, a quantidade farmaceuticamente eficaz da composição está variando de aproximadamente 1mg/kg a aproximadamente 100mg/kg de peso corpóreo do indivíduo.

Em uma outra configuração da presente invenção, o referido método é usado no tratamento, prevenção e controle da infecção causada por um patógeno no indivíduo.

Em uma outra configuração da presente invenção, o referido patógeno inclui o vírus influenza A e os vírus HIV.

Em uma outra configuração da presente invenção, os referidos tipos de vírus são

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H1N1, H3N2, vírus X4 e R5 trópico.

Em uma outra configuração da presente invenção, o indivíduo é um animal ou ser humano.

A presente invenção relaciona-se a um método de tratamento, prevenção e controle de infecções virais em um indivíduo com necessidade disso, método este compreendendo a etapa de administração de quantidade farmaceuticamente eficaz da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis ao indivíduo.

Em uma outra configuração da presente invenção, a referida composição inibe o vírus Influenza A, vírus X4 trópico e R5 trópico do HIV.

A presente invenção relaciona-se a um método de tratamento, prevenção e controle de infecções retrovirais em um indivíduo com necessidade disso, método este compreendendo a etapa de administração de quantidade farmaceuticamente eficaz da composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com

17/37 excipientes farmaceuticamente aceitáveis ao indivíduo.

Em uma configuração da presente invenção, as referidas infecções retrovirais incluem infecção por influenza A e infecção por HlVe AIDS.

Em uma outra configuração da presente invenção, a quantidade farmaceuticamente eficaz da composição está variando de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100mg/kg de peso corpóreo do indivíduo.

A presente invenção relaciona-se a uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide conforme mostrado na FIGURA 1. A presente invenção relaciona-se também a um método de obtenção de uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide. A presente invenção relaciona-se também ao uso de uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide para a prevenção, o tratamento e o controle de infecção por HIV e influenza.

A presente invenção também relaciona-se ao uso de uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide para estimular uma resposta imunológica melhorada a um antígeno em um indivíduo com necessidade disso.

Em outra configuração da presente invenção, a resposta imunológica pode ser de natureza de tratamento, controle ou profilática.

Em uma configuração da presente invenção, as fontes botânicas usadas para obter

18/37 a composição são a Cinnamomum, Litchi e Arachis.

Em uma configuração da presente invenção, a nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas é padronizada a um pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide.

Em outra configuração da presente invenção, o pentâmero tem um peso molecular de 1440 conforme mostrado na FIGURA 1.

Em outra configuração da presente invenção, a composição compreende um pentâmero variando de 50% a 99%.

Em outra configuração da presente invenção, a composição compreende trímero e tetrâmero variando de 1% a 35%.

Em outra configuração da presente invenção, a composição é caracterizada pelo cromatograma na FIGURA 5

Em outra configuração da presente invenção, a unidade monomérica da nova composição é escolhida de um grupo de catequinas, preferível catequina ou epicatequina.

A presente invenção também relaciona-se a um método de fabricação da nova composição por um processo ilustrado neste documento.

Em uma configuração da presente invenção, a composição padronizada compreende opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Em outra configuração da presente invenção, os excipientes são selecionados de um grupo compreendendo aditivos, gomas, adoçantes, agentes de revestimento, ligantes, desintegrantes, lubrificantes, agentes de desintegração, de suspensão, solventes, corantes, deslizantes, antiaderentes, antiestáticos, surfactantes, plastificantes, emulsificantes, aromatizantes, aumentadores de viscosidade e antioxidantes.

19/37

Ainda em outra configuração da presente invenção, a composição é formulada em formas de dosagem como líquido, pó, cápsula, comprimido, injetável, adesivo, unguento, gel, emulsão, creme, loção, dentifrício, borrifo e pastilha. Ainda em outra configuração da presente invenção, a composição é um pó ou um líquido.

A presente invenção relaciona-se também a um método de obtenção de uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide, em que o processo compreende etapas de:

1. Trituração da matéria-prima botânica a um tamanho pré-determinado

2. Extração com um solvente orgânico para remover substâncias tóxicas indesejadas.

3. Extração aquosa do pó botânico com água deionizada

4. Purificação do extrato usando uma configuração de purificação cromatográfica de dois estágios

5. Secagem, mistura e peneiração para obter a composição compreendendo um pentâmero de um flavonóide de 50% a 99% de pureza, conforme mostrado na FIGURA 1.

A presente invenção ainda relaciona-se ao uso da presente composição nova opcionalmente junto com excipientes para produzir um medicamento para o tratamento e controle de HIV e prevenção, tratamento e controle da infecção viral por influenza. A presente invenção relaciona-se também ao uso da presente composição opcionalmente junto com excipientes para produzir um medicamento para tratar e controlar infecção por HIV e prevenir, tratar e controlar a infecção por influenza em um indivíduo com necessidade disso.

A presente invenção relaciona-se também ao uso da presente composição

20/37 opcionalmente junto com excipientes para produzir um medicamento que melhora a resposta imunológica em um indivíduo com necessidade disso. A presente invenção relaciona-se também ao uso da presente composição para estimular uma resposta imunológica melhorada em um indivíduo com necessidade disso.

Ainda em uma outra configuração da presente invenção, os indivíduos são animais ou seres humanos.

A presente invenção relaciona-se também a um processo para produzir uma nova composição padronizada, derivada de fontes botânicas, padronizadas a 50% a 99% de um pentâmero de procianidina do Tipo A de um flavonóide, compreendendo as etapas de:

1. Trituração da canela botânica ou pericarpo de lixia ou casca de noz moída com revestimento de semente avermelhado

2. Extração do material para remover as gorduras e toxinas e outros compostos aromáticos usando um solvente orgânico (preferivelmente éster), principalmente consistindo de acetato etílico, acetato butílico, amilacetato ou 2-etilhexil acetato como um solvente único ou uma mistura dos solventes acima. Essa etapa é opcional para canela

3. Secagem do material vegetal extraído para liberar o solvente.

4. Extração com água deionizada em pH 4 ou em pH entre 3,8 a 5,8, preferivelmente em pH 4,0. Purificação do extrato usando uma separação cromatográfica de dois estágios, um para moléculas polares e um para não-polares.

5. O material adsorvido é eluído usando um solvente alcoólico.

6. O solvente eluído é concentrado a um pó fino

7. A massa concentrada é diluída com água e é opcionalmente seca por borrifo para eliminar os solventes residuais.

21/37

A nova composição obtida pelo processo acima compreende pentâmero de 50% 99%, trímero de 1% - 35% e tetrâmero de 1% - 35% e é caracterizado conforme mostrado na FIGURA 5

A invenção é ainda elaborada com a ajuda dos seguintes exemplos. Entretanto, esses exemplos não devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Exemplo 1

1000g de pó de canela pulverizado com um tamanho médio variando de 16 tamanho de malha são embebidos em 3000ml de acetato etílico e despejados em um extrator tendo uma peneira perfurada no fundo da peneira de 200 malhas. O eluente do fundo é reciclado várias vezes sobre a massa embalada para atingir extração eficaz durante um período de aproximadamnte 8 horas. O eluente é descarregado e a massa é removida do extrator e seca em uma estufa de tiragem forçada a 30°C. Após a remoção do solvente por secagem, a massa foi novamente embalada no extrator. A massa embalada é extraída com 5000ml de água deionizada acidificada em pH 4,0 e o extrato é reciclado sobre o leito durante aproximadamente 8 horas a 35°C para atingir extração eficiente.

O extrato é filtrado através de uma coluna cromatográfica de dois estágios para obter a composição tendo 80% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440, o extrato é passado através da primeira coluna para extrair as moléculas polares relativamente menores da composição e o segundo estágio de separação cromatográfica é para as moléculas polares relativamente maiores da composição. As resinas usadas foram o equivalente de uma resina XAD-1180 e XAD-7HP, respectivamente. A coluna foi lavada completamente com água D.M. sem substâncias aderentes e o eluente é neutro. A coluna é ainda eluída com 175ml de álcool isopropílico puro e o eluente coletado é

22/37 concentrado sob vácuo abaixo de 40°C e diluído com água e seco por borrifo sob as seguintes condições

Secador por borrifo: Fluxo de ar concomitante

Temperatura de entrada: 140°C

Temperatura de saída: 60°C

RPM do atomizador: 14000

O peso final é 5g.

Exemplo 2

1000g de pó de canela pulverizado com um tamanho médio variando de 16 tamanho de malha são embebidos em 3000ml de acetato etílico e despejados em um extrator tendo uma peneira perfurada no fundo da peneira de 200 malhas. O eluente do fundo é reciclado várias vezes sobre a massa embalada para atingir extração eficaz durante um período de 10 horas. O eluente é descarregado e a massa é removida do extrator e seca em uma estufa de tiragem forçada a 30°C. Após a remoção do solvente por secagem, a massa foi novamente embalada no extrator. A massa embalada é extraída com 5 litros de Água Deionizada Acidificada em pH 4,0 e o extrato é reciclado sobre o leito durante aproximadamente 8 horas a 35°C para atingir extração eficiente.

O extrato é filtrado através de uma coluna cromatográfica de dois estágios para obter a composição de 75% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440. Primeiro, o extrato é passado através da primeira coluna para extrair as moléculas polares relativamente menores da composição e o segundo estágio de separação cromatográfica é para as moléculas polares relativamente maiores da composição. As resinas usadas foram o equivalente de uma resina XAD-1180 e uma XAD-7HP, respectivamente. A coluna foi lavada

23/37 completamente com água D.M. sem substâncias aderentes e o eluente é neutro. A coluna é ainda eluída com 250ml de álcool isopropílico puro e o eluente coletado é concentrado sob vácuo abaixo de 40°C e diluído com água e seco por borrifo sob as seguintes condições

Secador por borrifo: Fluxo de ar concomitante

Temperatura de entrada: 145°C

Temperatura de saída: 60°C

RPM do atomizador: 14000

O peso final é 4,5g.

Exemplo 3

1000g de pó de canela pulverizado com um tamanho médio variando de 16 tamanho de malha são embebidos em 2500ml de acetato butílico e despejados em um extrator tendo uma peneira perfurada no fundo da peneira de 200 malhas. O eluente do fundo é reciclado várias vezes sobre a massa embalada para atingir extração eficaz durante um período de 10 horas. O eluente é descarregado e a massa é removida do extrator e seca em uma estufa de tiragem forçada a 30°C. Após a remoção do solvente por evaporação, a massa foi novamente embalada no extrator. A massa embalada é extraída com Água Deionizada Acidificada e o extrato é reciclado sobre o leito durante aproximadamente 12 horas a 35°C para atingir extração eficiente.

O extrato é filtrado através de uma coluna cromatográfica de dois estágios para obter a composição de 89% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440. Primeiro, o extrato é passado através da primeira coluna para extrair as moléculas polares relativamente menores da composição e o segundo estágio de separação cromatográfica é para as moléculas polares

24/37 relativamente maiores da composição. As resinas usadas foram o equivalente de uma resina XAD-1180 e uma XAD-7HP, respectivamente. A coluna foi lavada completamente com água D.M. sem substâncias aderentes e o eluente é neutro. A coluna é ainda eluída com 200ml de álcool etílico puro e o eluente coletado é concentrado sob vácuo abaixo de 40°C e diluído com água e seco por borrifo sob as seguintes condições

Secador por borrifo: Fluxo de ar concomitante

Temperatura de entrada: 145°C

Temperatura de saída: 60°C

RPM do atomizador: 14000

O peso final é 4,8g.

Exemplo 4

1000g de pó de canela pulverizado com um tamanho médio variando de tamanho de malha 16 são embebidos em 2500ml de acetato butílico e despejados em um extrator tendo uma peneira perfurada no fundo da peneira de 200 malhas. O eluente do fundo é reciclado várias vezes sobre a massa embalada para atingir extração eficaz durante um período de 10 horas. O eluente é descarregado e a massa é removida do extrator e seca em uma estufa de tiragem forçada a 30°C. Após a remoção do solvente por evaporação, a massa foi novamente embalada no extrator. A massa embalada é extraída com 5 litros de água deionizada acidificada e o extrato é reciclado sobre o leito durante aproximadamente 12 horas a 30°C para atingir extração eficiente.

O extrato é filtrado através de uma coluna cromatográfica de dois estágios para obter a composição de 99% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440. Primeiro, o extrato é passado através da primeira coluna

25/37 para extrair as moléculas polares relativamente menores da composição e o segundo estágio de separação cromatográfica é para as moléculas polares relativamente maiores da composição. As resinas usadas foram o equivalente de uma resina XAD-1180 e uma XAD-7HP, respectivamente. A coluna foi lavada completamente com água D.M. sem substâncias aderentes e o eluente é neutro. A coluna é ainda eluída com álcool isopropílico puro. Ε o eluente coletado é concentrado sob vácuo abaixo de 40°C e diluído com água e seco por borrifo sob as seguintes condições

Secador por borrifo: Fluxo de ar concomitante

Temperatura de entrada: 145°C

Temperatura de saída: 60°C

RPM do atomizador: 14000

O peso final é 5g.

Exemplo 5

1000g de pó de canela cassia pulverizado com um tamanho médio variando de 16 tamanho de malha são embebidos em 3000ml de acetato etílico e desejados em um extrator tendo uma peneira perfurada no fundo da peneira de 200 malhas. O eluente do fundo é reciclado várias vezes sobre a massa embalada para atingir extração eficaz durante um período de aproximadamnte 8 horas. O eluente é descarregado e a massa é removida do extrator e seca em uma estufa de tiragem forçada a 30°C. Após a remoção do solvente por secagem, a massa foi novamente embalada no extrator. A massa embalada é extraída com 5000ml de água deionizada acidificada em pH 4,0 e o extrato é reciclado sobre o leito durante aproximadamente 8 horas a 35°C para atingir extração eficiente.

O extrato é filtrado através de uma coluna cromatográfica de dois estágios para

26/37 obter a composição tendo 55% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440, o extrato é passado através da primeira coluna para extrair as moléculas polares relativamente menores da composição e o segundo estágio de separação cromatográfica é para as moléculas polares relativamente maiores da composição. As resinas usadas foram o equivalente de uma resina XAD-1180 e XAD-7HP, respectivamente. A coluna foi lavada completamente com água D.M. sem substâncias aderentes e o eluente é neutro. A coluna é ainda eluída com 175ml de álcool isopropílico puro e o eluente coletado é concentrado sob vácuo abaixo de 40°C e diluído com água e seco por borrifo sob as seguintes condições

Secador por borrifo: Fluxo de ar concomitante

Temperatura de entrada: 140°C

Temperatura de saída: 60°C

RPM do atomizador: 14000

O peso final é 2,5g.

Exemplo 6: Extração do pericarpo seco de Lixia:

1000g de pericarpo seco de lixia pulverizado são embebidos em 5000ml de volume de água acidulada durante 12 horas e clarificados por filtração. O filtrado claro é passado através de uma coluna contendo uma resina adsorvente, equivalente a XAD-1140 e uma XAD-7HP para capturar os compostos polares e relativamente não-polares. A primeira coluna sendo a não-polar é eluída com álcool etílico e o eluente concentrado para obter uma produção de pó de fluxo livre de 500mg. A segunda coluna que contém todas as substâncias polares é eluída com álcool etílico separadamente e concentrada para obter 1g de pó. Na análise de HPLC, essa fração mostrou 85% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso

27/37 molecular 1440.

Exemplo 7: Extração de casca de noz moída iuntamente com pele vermelha da semente de noz molda,

1000g de casca de noz moída seca juntamente com a pele vermelha na semente são embebidos em 5000ml de volume de água acidulada em pH 3,8 durante 48 horas e são, então, filtrados para um líquido claro. O filtrado claro é passado através de uma coluna contendo uma resina adsorvente, equivalente a XAD-1140 e uma XAD-7HP para capturar os compostos polares e relativamente não-polares. A primeira coluna sendo a não-polar é eluída com álcool etílico e o eluente concentrado para obter uma produção de pó de fluxo livre de 20g. A segunda coluna que contém todas as substâncias polares é eluída com álcool etílico separadamente e concentrada a 500mg de pó. Na análise de HPLC, essa fração mostrou 82% de pentâmero de procianidina do Tipo A de flavonóide de peso molecular 1440 conforme mostrado na figura 5.

Exemplo 8: Purificação para obter Pentâmero de flavonóide

O pó isolado pelo procedimento detalhado nos Exemplos 1 - 6 é dissolvido em 200 volumes de água e clarificado por filtração. O filtrado claro é tratado com carvão ativado para descolorizar a solução a 60°C e clarificado por filtração no papel filtro para remover todas as partículas insolúveis. A solução filtração, dessa forma, obtida é extraída com acetato etílico duas vezes para remover todo o solvente solúvel e concentrada para obter um pó. O pó estava sujeito à cromatografia de coluna em silica gel C-18 de fase reversa usando 0,1% de ácido fórmico aquoso e 0,1% de ácido fórmico metanólico em maneira gradiente em cromatografia rápida usando os seguintes parâmetros.

Equipamento: Combiflash Companion com detector UV variável

28/37

Coluna: Redisep 12g (Sílica de Fase Reversa)

Comprimentos de onda de detecção: 254nm e 280nm

Taxa de fluxo: 18ml/min

Volume de Pico do Tubo: 18ml

Altudo do pico: 1 min

Limiar: 0,20 AU

Solvente A: 0,1% de Ácido Fórmico Aquoso

Solvente B: 0,1% de Ácido Fórmico em Acetonitrila

As frações números 1 a 19 foram descartadas. As frações números 20 a 22 foram reunidas e concentradas para obter 256g de pó colorido marrom pálido. O pó resultante no sistema de solvente de triagem de TLC de acetato sódio a 0,1 M: Acetonitrila = razão 7:3 mostrou um ponto de absorção UV em 0,75 Rt no borrifo com reagente Anisaldeído/ácido sulfúrico mostrou ponto da cor laranja, que é considerado como característica das proantocinidinas.

O EI-MS (M-H) (conforme mostrado na FIGURA 2) pico de íon em m/z 1439,9 correspondendo a um compartimento múltiplo de constituição de catequina (múltiplos de 288) correspondendo a um total de cinco unidades. O peso molecular do composto isolado é 1440,9. A configuração das unidades de catequina foi em conformidade com aquela da Epicatequina, que foi confirmada pelo modelo de acoplamento. Os dois sinais entre 4,84 e 4,91 quatro sinais de camiseta (ampliação de pico devido ao oligômero de peso molecular alto) de 2,3 cis estereoquímica na unidade de flavan-3-ol. .Os sinais do anel F na 4- posição da unidade terminal do anel Terminal - CH2-prótons de metileno foram observados entre Õ2,6 a 2,9m de ampliação de pico, observada devido à natureza oligomérica de peso molecular alto. Sinais de região aromática foram entre Õ6,6 e 7,6 como dois sistemas com relação

29/37 aos anéis B e E. Os sinais de 13C carbono vistos em 0100,9 confirmando ao C2 carbono e 027,9 do anel C superior de C4 carbono confirma a ligação dupla ao anel do sistema intermediário conforme mostrado na FIGURA 3.

Uma composição compreendendo o flavonóide procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w, opcionalmente junto com excipientes farmaceuticamente aceitáveis é obtida seguindo os exemplos 1 a 8 conforme mostrado acima. Além disso, a composição foi usada para atividades in vitro e in vivo mostrada abaixo sob os exemplos 9 a 14.

Exemplo 9: Efeito da composição de teste no título de anticorpo humoral em um indivíduo tratado com ciclofofamida (imunocomprometido).

Camundongos albinos suíços de ambos os sexos foram divididos em 5 grupos com seis animais por grupo, com base no tratamento que eles receberam.

No Dia 0, todos os cinco grupos foram sensibilizados com Hemácias de Ovelha (SRBCs) contendo 1x10 8 células em salina normal. Os grupos 2-5 foram tratados com medicamentos padrão e combinações da composição de teste durante 8 dias (Dia 0 ao Dia 7). No Dia 7, amostras de sangue foram coletadas de cada camundongo nos cinco grupos por punção retro-orbital para a determinação do título de anticorpo primário. Subsequentemente no dia 7, após a retirada do sangue, os camundongos foram desafiados com 0,1 ml de SRBCs na almofada da pata. No Dia 14, amostras de sangue foram coletadas de cada camundongo por punção retroorbital para a determinação do título de anticorpo secundário.

Os resultados desse teste são os seguintes:

GRUPO

TRATAMENTO

TÍTULO DE HA

30/37

		PRIMÁRIO NO DIA 7	SECUNDÁRIO NO DIA 14
1	Controle	5,33	13,33
2	Ciclofosfamida a 25mg/kg p.o	0,33	6,67
3	Ciclofosfamida (25mg/kg) + Composição de Teste (10mg/kg) p.o	0,33	13,33
4	Ciclofosfamida (25mg/kg) + Composição de Teste (25mg/kg) p.o	12	34,66
5	Ciclofosfamida (25mg/kg) + Composição de Teste (50mg/kg) p.o	13,33	40

A imunidade humoral serve como a primeira linha de defesa e protege o hospedeiro contra a infecção. Uma imunidade humoral elevada fornece uma maior proteção contra patógenos infecciosos. A resposta de um indivíduo a um antígeno varia e é dependente de numerosos fatores, incuindo a composição genética e o histórico do 5 indivíduo. A ciclofosfamida é um medicamento que suprimi o sistema imune. Usando esse medicamento, todos os animais avaliados nesse estudo podem ser julgados com relação a sua resposta ao antígeno.

Conforme mostrado na tabela acima, a composição de teste refletiu um aumento nos títulos de anticorpo primário e secundário de um indivíduo imunocomprometido. Há 10 um aumento de múltiplas vezes nos títulos de anticorpo primário e secundário (imunidade humoral). Essa resposta imunológica é montada em resposta à presença do antígeno, SRBCs e leva em consideração a variabilidade em respostas imunológicas devido ao pré-tratamento com ciclofosfamida.

Exemplo 10; Efeito da composição de teste no macrófaqo peritoneal, na atividade

31/37 fagocítica de células sanguíneas polinucleares

Montar uma resposta imunológica a um antígeno, enquanto eficaz, exige avaliação adicional para determinar a eficácia desse ataque. A eficácia é avaliada pela capacidade da resposta imunológica em eliminar o patógeno. Isso é determinado através da avaliação da capacidade fagocítica da resposta.

Camundongos albinos suíços de ambos os sexos foram divididos em 3 grupos, com seis animais em cada grupo. Doses únicas do controle e da composição de teste foram administradas a cada um dos 3 grupos.

Cada grupo foi tratado durante um período de 20 dias e no 21^e dia, eles receberam 5ml de fosfato tampão frio em salina (PBS) intraperitonealmente. Subsequentemente, o fluido peritoneal foi coletado e a quantidade de macrófago foi contada usando uma contagem de Leucócito quadrada em um hemocitômetro. A contagem celular foi estimada por milímetro cúbico. Os camundongos remanescentes foram mantidos continuamente em tratamento até o Dia 28 e no Dia 29, o sangue foi coletado do plexo retro-orbital. Duas gotas do sangue coletado de cada camundongo foram colocadas em um slide e deixadas coagular e, então, foram colocadas em uma câmara úmida mantida a 37°C durante 25 minutos. Essas células aderentes foram incubadas com suspensão de esporos de Candida albicans e observadas por coloração. Subsequentemente, a quantidade de células que ingeriu a suspensão com Candida foi contada.

O índice fagocítico e a % de fagocitose foram calculados usando a seguinte fórmula: índice Fagocítico = Quantidade total de Candida em 100 células PMN

Quantidade de células PMN envolvidas na Fagocitose % de Fagocitose = Quantidade de células PMN que ingeriram Candida fora de todas as 100 células

32/37 observadas

As etapas acima foram realizadas e os resultados tabulados:

GRU PO	TRATAMENTO	MACRÓFAGOS PERITONEAIS	ATIVIDADE FAGOCÍTICA DAS CÉLULAS PMN
Quantidade média de Candida/PMN	PMN mostrando fagocitose
1	Controle	3558 + 1361	2,185 + 0,34	81 + 3,88
2	Composição de Teste (25mg/kg)	4300+ 1241	2,73 + 0,37	95 + 2,73
3	Composição de Teste (50/kg)	7758 + 1512	1,901 +0,48	92 + 2,48

Os resultados acima mostram um aumento na contagem de macrófago peritoneal e atividade fagocítica. A quantidade elevada de macrófago é uma indicação direta de uma resposta imunológica elevada ao antígeno. Adicionalmente, a atividade fagocítica elevada desses macrófagos é evidência de sua eficácia contra um antígeno

Exemplo 11: Efeito da composição de teste na resistência do hospedeiro contra sepse abdominal induzida por E. coli.

Camundongos albinos suíços de ambos os sexos foram divididos em 3 grupos e tratados com o controle e a composição de teste. Doses únicas foram administradas aos camundongos durante 28 dias. No 29^s dia, os camundongos receberam injeção intraperitoneal com suspensão de E. coli contendo 2,5 x 10⁹ em PBS. Os camundongos foram observados com relação à mortalidade durante 24 horas após a injeção. A mortabilidade observada é devido à infecção por E. coli e também é chamada de sepse. Os animais que sobreviveram foram ainda observados durante 7 dias com relação à mortalidade.

Os resultados desse experimento são tabulados abaixo:

33/37

GRUPO	TRATAMENTO	MORTALIDADE EM 24 HORAS
1	Controle	8/8
2	Composição de Teste a 10mg/kg	8/8
3	Composição de Teste a 50mg/kg	3/8

Conforme observado a partir dos resultados acima, a mortalidade com o controle e a menor dose da composição de teste foi de 100%. Em uma dose de 50mg/kg da composição de teste, a mortalidade foi reduzida em 63%. Apenas 3 dos 8 camundongos morreram conforme comparado com todos os 8 mortos nos outros dois grupos. Ainda, nenhuma mortalidade adicional foi observada nesse 3^S Grupo.

Isso mostra o efeito profilático da composição de teste ao hospedeiro. O prétratamento com a composição de teste diminuiu a mortalidade dos camundongos expostos a um patógeno. Isso confirma a capacidade da composição de teste em prevenir a infecção por patógenos, incluindo bactérias e vírus.

Essa prevenção de infecção é devido à resposta imunológica melhorada estimulada pela composição na presença de um patógeno. Essa resposta permite ao hospedeiro controlar a quantidade do patógeno, dessa forma, prevenindo a infecção. Exemplo 12: Inibição do vírus Influenza A (H1N1 e H3N2)

Esse exemplo mostra a eficácia da composição de teste em inibir os vírus H1N1 e H3N2 e, dessa forma, estalece sua eficácia como um método de tratamento, prevenção e administração dessa infecção viral.

Células de rim canino Madin-Darby (MDCK) (3x10⁵ células por poço) foram inoculadas em placas com 6 poços um dia antes da infecção com o vírus H1N1 e H3N2. Três dias depois, as células foram infectadas com vírus H1N1 e H3N2 serialmente diluídas durante 1 hora antes de o meio de revestimento de 3mLter sido adicionado em cada poço. Após quarenta horas, as células foram fixadas com 10% de formalina durante 1 hora e coloridas com 1% de violeta cristal durante 15 minutos. Os títulos do vírus foram determinados de acordo com as placas contadas.

34/37

A suscetibilidade dos vírus a compostos foi determinada pelo ensaio de redução de placa. Os procedimentos foram semelhantes ao ensaio de placa, exceto que quantidades indicadas de compostos foram adicionadas ao meio de revestimento. A porcentagem de inibição foi calculada como [100 - (V_D / V_c)] ^x 100%, onde V_D e V_c5 referem-se ao título de vírus na presença e ausência do composto, respectivamente.

A concentração mínima de compostos exigida para reduzir em 50% a quantidade de placa (EC₅o) foi calculada por análise de regressão das curvas de dose-resposta geradas a partir dos ensaios de placa.

	Estirpe sensível (676)	Estirpe resistente (6706)
	Composição de Teste (pg/mL)
0	78,5	11
25	40	7
50	25,5	3,5
EC5 0	25,5 (17,7nM)	36,1 (25 nM)
Tamif	u (nM)
EC5 0	4,5	>5000

Composto de Teste (pg/mL)	H3N2
PFU	Taxa de inibição (%)
	141,67	0
	110,33	22,11
	57,33	59,53
	27,67	80,47
IC50	43,64

A partir da tabulação acima, fica claro que para a composição de teste é evidente que as células infectadas tratadas com a Composição de Teste mostraram uma redução marcante na formação de placa. Adicionalmente, a composição de teste mostrou ser altamente eficaz contra a estirpe de H1N1 resistente ao Tamiflu, dessa

35/37 forma, provando sua eficácia como um tratamento potencial da infecção viral por Influenza (H1N1). Ainda, a 2- tabela mostra a eficácia dos compostos de teste em inibir também a estirpe H3N2 do vírus Influenza A.

Exemplo 13: Efeito da composição de teste no HIV-1 estimulado por PBMC (vírus X4 trópico e vírus R5 trópico)

O vírus HIV-1 (HXB2-X4 trópico) foi obtido 48 horas após a transfecção do clone molecular HXB2 para 293 células T O título do vírus foi detectado por PCR em tempo real. O vírus foi, então, infectado à Célula Mononuclear de Sangue Periférico (PBMC) estimulada por fitohemaglutinina (PHA) em 24 poços. Após 16-18 horas, as PBMC foram lavadas com solução de fosfato tampão (PBS) e meio fresco do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 2% de Soro Fetal Bovino (FBS) foi adicionado. Células colhidas e sopa de vírus no dia 3, 5 e 7 após a infecção (dpi).

A composição de teste e 3 medicamentos padrão (AZT, AMD3100 e Tak-779) foram testados em células PBMC estimuladas por fitohemaglutinina (PHA-2 pg/mL), transfectadas com vírus HXB2 HIV-1 (vírus X4 e vírus R5). A multiplicidade de Infecção (MOI) foi considerada como 0,26. A detecção da carga viral foi realizada por RT-PCR conforme descrito acima no dia 3, dia 5 e dia 7 após a infecção.

AMD3100 exibiu atividade inibidora apenas contra vírus CXCR4 trópico (EC₅o média = 2,05nM) considerando-se que Tak-779 exibiu atividade inibidora apenas contra vírus CCR5 trópico (EC₅o média = 0,56nM). AZT exibiu atividade inibidora para o vírus CCR5 trópico e CXCR4 trópico. A composição de teste mostrou um valor de EC₅o de 22,5pg/mL (15,625nM) para o vírus X4 e 15,5pg/mL (10,77mN) para o vírus R5. Esses valores foram comparáveis e em alguns casos mais eficazes do que os medicamentos padrão usados.

Os Exemplos 9-11 exibem as propriedades da resposta imunológica da composição

36/37 de teste enquanto os Exemplos 12-13 mostram o efeito antiviral da composição de teste contra HIV e o virus Influenza (H1N1). Em combinação, os Exemplos 9-13 exibem que a composição de teste funciona para prevenir a infecção por um mecanismo de duas pontas: A resposta imunológica elevada pode agir como uma opção protetora ou profilática para prevenir a infecção em conjunto. Em segundo lugar, no caso de uma infecção, as propriedades antivirais da composição de teste reduzem a carga viral (tanto HIV quanto Influenza), dessa forma, permitindo que a resposta imunológica elevada resolva a infecção e prevenindo dano adicional. É importante observar que essa resposta imunológica é apenas estimulada na presença de um antígeno. Isso é confirmado pelo fato de que nenhum dos animais mostrou sinais de inflamação e/ou outros sintomas associados com um sistema imune sobre-ativado.

Essa propriedade da composição de teste a torna mais receptiva para uso a longo prazo como um agente profilático para prevenir infecção.

A composição da presente invenção melhora a resposta imunológica não apenas em amplas variações de concentração da composição compreendendo o flavonóide de procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 55% w/w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 35% w/w. A eficácia da composição em estimular resposta imunológica é melhor/extraordinária em variações específicas de concentração da composição compreendendo o flavonóide de procianidina pentamérica de concentração variando de aproximadamente 80% w/ w a aproximadamente 99% w/w, trímeros e tetrâmeros, cada um em uma concentração variando de aproximadamente 0,5% w/w a aproximadamente 20% w/w.

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Exemplo 14: Estudo de prova de conceito para mostrar a eficácia e a segurança da nova composição em pacientes com HIV e AIDS:

Um estudo prospectivo, duplo-cego, randomizado, placebo-controlado foi conduzido em 40 pacientes infectados por HIV-1, assintomáticos, que nunca receberam tratamento antiretroviral. A composição de teste foi estudada em 40 pacientes infectados por HIV-1, assintomáticos, que nunca receberam tratamento antiretroviral, cuja contagem de CD4 estava entre 250-500/mm³. A composição de teste foi testada em 300mg/dia durante 12 semanas e foi administrada em forma de dosagem em cápsula. A composição de teste mostrou uma diminuição na carga viral em 11,29% conforme comparada com placebo, que mostrou um aumento de 67,28%. Houve um declínio na contagem de CD4 em ambos os grupos, mas a diminuição percentual na contagem de CD4 no grupo da composição de teste foi considerada metade daquela do placebo (7,74% na composição de teste conforme comparada com 13,88% de diminuição no placebo). Assim, a composição de teste foi considerada como sendo segura e eficaz com relação à maior parte das funções de órgão vital e parâmetros bioquímicos.

O Exemplo 14 detalha a capacidade da composição de teste em inibir a carga viral, dessa forma, confirmando o efeito antiviral da composição de teste. Ainda, a melhoria na contagem de Leucócito (CD4) quando comparada com o placebo é uma indicação importante da melhoria na resposta imunológica.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, caracterizada por compreender flavonóide pentamérico de procianidina tipo A de concentração variando de 55% p/p a 99% p/p, trimeros e tetrâmeros, cada um a uma concentração variando de 0,5% p/p a 35% p/p, opcionalmente juntamente com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição ser obtida a partir de fonte vegetal selecionada a partir de um grupo compreendendo Cinnamomum, Litchi e Arachis.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração de procianidina flavonóide pentamérica varia de 80% p/p a 98% p/p, trimeros e tetrâmeros, cada um a uma concentração variando de 0,5% p/p a 20% p/p.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fatode que o referido flavonóide pentamérico de procianidina tem um peso molecularde

1440.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fatode que os referidos excipientes são selecionados de um grupo que compreende gomas, agentes de granulação, agentes de ligação, agentes lubrificantes, agentes de desintegração, agentes adoçantes, agentes corantes, agentes aromatizantes, agentes de revestimento, plastificantes, conservantes, suspensão agentes, agentes emulsificantes, agentes antiestáticos e agentes de esferonização.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida composição é formulada em várias formas de dosagem selecionadas a partir de um grupo que compreende comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões

Petição 870190118355, de 14/11/2019, pág. 24/52

2/3 aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsão em cápsulas de gel duro ou mole, xaropes e elixires.
7. Processo para preparação de composição, caracterizado pelo fato de compreender flavonóide pentamérico tipo procianidina de concentração variando de 55% p/p a 99% p/p, trimeros e tetrâmeros, cada um a uma concentração variando de 0,5% p/p a 35% p/p, o referido processo compreendendo as etapas de:

a) extração de massa vegetal pulverizada com solvente orgânico para remover substâncias tóxicas;

b) secagem da massa para remover o solvente orgânico;

c) re-extração da massa seca usando solvente aquoso para obter o extrato; e

d) purificação do extrato através de coluna cromatográfica seguida de concentração, purificação, padronização e secagem para obter a composição.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a massa de planta pulverizada é selecionada de um grupo de plantas compreendendo canela, lichia e amendoim.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é selecionado a partir de um grupo que compreende acetato de etila, butilacetato, amilacetato, 2-etil-hexilacetato e quaisquer combinações dos mesmos.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida extração é realizada por um período de tempo que varia de 8 horas a 12 horas, preferencialmente por 10 horas.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as referidas substâncias tóxicas incluem cumarina e aldeídos.

Petição 870190118355, de 14/11/2019, pág. 25/52

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12. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido extrato é filtrado através de coluna cromatográfica em duas etapas.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as referidas colunas cromatográficas são selecionadas de um grupo compreendendo resinas XAD-1180, XAD-7HP e XAD-1140.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida re-extração na etapa c) é realizada a um pH variando de 3,8 a 5,8, preferencialmente a 4,0.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a re-extração é realizada por um período de tempo variando de 8 horas a 12 horas, preferencialmente por 10 horas a uma temperatura variando de 300 ° C a 900 ° C, preferencialmente variando entre 310 ° C a 400 C.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido solvente aquoso é água desionizada acidificada.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a referida composição compreende ainda excipientes selecionados de um grupo que compreende gomas, agentes de granulação, agentes de ligação, agentes lubrificantes, agentes de desintegração, agentes adoçantes, agentes corantes, agentes aromatizantes, agentes de revestimento, plastificantes, conservantes, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, agentes antiestáticos e agentes de esferonização.