TWI389700B

TWI389700B - 解決ｒｎａ病毒感染之新穎標準化組成物、製造方法及用途

Info

Publication number: TWI389700B
Application number: TW99138909A
Authority: TW
Inventors: Sunil Bhaskaran; Mohan Vishwaraman
Original assignee: Indus Biotech Private Ltd
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2013-03-21
Also published as: TW201219048A

Description

解決RNA病毒感染之新穎標準化組成物、製造方法及用途

本發明係關於抗病毒製劑。本發明提供由植物所獲得之抗病毒製劑且其改良免疫反應且被發現有效對抗HIV感染、AIDS及流行性感冒病毒及感染。

背景

兒茶素為屬於類黃酮家族之多酚系植物代謝物。兒茶素之分子式及分子量為C₁₅ H₁₄ O₆ 及290 g/mol。兒茶素及表兒茶素為差向異構體(epimer)，其中(-)-表兒茶素及(+)-兒茶素為在自然界中發現之最普遍的光學異構體。

前花青素或縮合丹寧為類黃酮寡聚物，其結構單元(building block)為(+)-兒茶素及(-)-表兒茶素。其為類黃酮生物合成途徑之寡聚終產物且現已識別及辨識出其對人類之有益作用。其在植物界中大量存在於果實、樹皮、葉子及種子中，並在其中提供對抗光、氧化及捕食者之保護。在許多植物中發現前花青素，主要為蘋果、松樹皮、肉桂皮、荔枝果皮、花生、葡萄籽、可可、葡萄皮、山桑、蔓越莓(cranberry)、黑醋栗、綠茶及紅茶。

基於連續單體單元之間的鍵聯，前花青素分類為A型、B型或C型多酚。

通常，前花青素之連續單體單元之間的鍵聯位於『上部』單元之第4位與『下部』單元之第8位之間，產生B型前花青素。或者，鍵聯可存在於『上部』單元之C₄ 與下部單元之C₆ 之間，產生C型前花青素。B型及C型多酚在許多植物性來源中大量可見。當連續單體單元由『上部』單元之C2及C4與下部單元之C7位及C⁶ /C⁸ 位(分別)之氧之間的醚鍵聯連接時，形成A型前花青素。與B型及C型多酚相比，A型前花青素極為少見。

對抗原之免疫反應

免疫系統為宿主體內藉由識別及消除病原體來保護宿主對抗疾病之機制之集合。系統對病原體之反應由識別外來蛋白質開始至最終破壞此外來蛋白質之來源，從而保護宿主。即使自單細胞有機體辨識單純蛋白質亦涉及一系列複雜步驟，其引起自宿主最終消除有機體。此整個過程為對外來蛋白質或抗原之存在所作之免疫反應。由免疫系統解決感染為對抗原之免疫反應，且其可分為3個階段：活化及移動： 白血球(WBC)在識別出外來分子或抗原時活化。免疫細胞(如巨噬細胞及T細胞)釋放將其他免疫細胞吸引至所識別之外來分子之位置的物質且因此移動無數免疫細胞以消滅病原體。

調節： 必須控制所引發之免疫反應以免過度損害宿主。調節子T淋巴球藉由分泌充當免疫系統之信使之細胞激素而協助控制免疫反應，因而調節過度之免疫反應。

解決： 感染解決涉及約束病原體及將其自體內消除。消除病原體後，大部分之WBC受到破壞，剩餘之WBC稱為「記憶細胞」且藉由引發對病原體之早期免疫反應來保護宿主對抗未來由相同病原體引發之感染。

當宿主無法提供強大到足以消除病原體之防護時，病原體成功引起感染。在此等情況下，由宿主產生之抗體不足以中和現有數目的抗原。因此，游離之抗原成功感染宿主。在此等情況下，使用如抗生素及抗病毒劑之外來輔助以減少抗原數目。一旦抗原數目減少，則免疫反應足以消除病原體。

HIV感染及AIDS：

人類免疫缺乏病毒(HIV)為破壞免疫系統之反轉錄病毒。此感染可最終引起後天免疫缺乏症候群(AIDS)，即一種使免疫系統無法正常工作之嚴重且危急生命之病狀。HIV主要感染人類免疫系統中之特定細胞：「輔助」T淋巴球(具體為CD4⁺ T細胞)、巨噬細胞及樹狀細胞。當CD4⁺ T細胞數目下降至低於臨界水準時，細胞介導之免疫性喪失，且身體日益變得對伺機性感染更敏感。

HIV生命週期：一旦HIV進入宿主，則HIV需要特定宿主細胞以協助其複製及繁殖。HIV情況下之宿主細胞為T細胞或CD4細胞。

1.宿主之辨識及結合： HIV搜尋出CD4細胞且藉由「鎖及鑰(lock and key)」系統經由細胞表面上之共受體附著至CD4細胞。HIV表面上之蛋白質附著至CD4細胞上之互補蛋白質。

2.附著及進入宿主中： 附著後，HIV將病毒蛋白質注入T細胞之細胞液(細胞質)中。此舉使細胞膜與HIV之外套膜融合。

3.病毒蛋白質之分解： 為使用其遺傳物質(RNA)進行複製，必須溶解圍繞於RNA之保護性包衣。若無此步驟，則RNA無法轉化為DNA(新HIV複本之結構單元)，且複製停止。

4.反轉錄： 一旦在細胞中，則HIV之單股RNA必須轉化為雙股DNA。此步驟由酵素反轉錄酶引起。反轉錄酶使用來自T細胞之結構單元以幫助將病毒RNA轉化為DNA。DNA含有HIV複製所需的遺傳資訊。

5.複製及組裝為新病毒粒子： 為了複製，新形成之病毒DNA必須整合至宿主細胞核中。尚未完全理解此過程，但咸信此過程由病毒轉運蛋白質輔助。整合時，病毒逐步發展，而宿主細胞則製備其完成複製所需之蛋白質。一旦材料可用，則其由病毒基於需求及結構裂解且接著組裝為新HIV。此過程由蛋白酶酵素輔助。

6 .自宿主細胞出芽： 病毒複製週期之最終步驟稱為出芽(budding)。隨著其遺傳物質之收藏及由宿主CD4細胞之細胞膜形成之新細胞外被，新近形成之HIV斷開且進入循環中，準備再次開始整個過程。

當前介入：當前中斷HIV複製及繁殖之方法包括：病毒進入抑制劑；膜融合抑制劑；及反轉錄酶抑制劑；整合酶抑制劑；蛋白酶抑制劑；成熟抑制劑等。FDA已核准許多用於治療HIV感染之藥物。大部分之此等藥物藉由其抗反轉錄病毒(ARV)作用機制起作用。

人類免疫缺乏病毒(HIV)之感染對全球各國家提出政治、經濟、公共衛生、社會及科學挑戰。2007年末，估計全球有33.2百萬人攜帶HIV/AIDS活著。因此，迫切需要以更安全及更有效的藥物來管理及/或治療此疾病。由此病毒提出之另一挑戰為其對突變之敏感性。HIV之病毒蛋白質易於突變且因此藥物抵抗性病毒株形成額外的威脅，從而需要新種類藥物。

流行性感冒病毒：

流行性感冒為由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)之RNA病毒(流行性感冒病毒)引起之傳染病，其影響鳥類及哺乳動物。由此病毒引起之感染主要影響鼻、咽喉、支氣管及偶爾影響肺。

流行性感冒病毒之結構：流行性感冒病毒分類為3種類別：流行性感冒病毒A、B及C。流行性感冒病毒之3種亞型具有極類似的整體結構。病毒由含有兩種主要類型之醣蛋白之病毒套膜構成，該兩種主要類型醣蛋白纏繞中心核。中心核含有病毒RNA基因組及其他包裝及保護此RNA之病毒蛋白質。血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)為病毒粒子外部之兩種大的醣蛋白。

流行性感冒病毒A：A型病毒為3種流行性感冒類型中毒力最高的人類病原體且引起最嚴重疾病。A型流行性感冒病毒可基於對該等病毒之抗體反應而再分為不同血清型。已在人類中證實之血清型為(以已知的人類大規模流行死亡之數目排序)：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7。A型流行性感冒病毒已在上世紀引起若干次大規模流行且繼續引起年度流行病。流行性感冒之新病毒株之出現繼續對公共衛生及科學團體提出挑戰。H1N1病毒為A型流行性感冒病毒之血清型且為已知影響人類之毒力最高的病毒株之一。H1N1血清型在1918年引起數百萬之死亡(西班牙流感(Spanish Flu))且最近引起豬流感(Swine Flu)全球大規模流行。

流行性感冒病毒生命週期：流行性感冒病毒複製及繁殖過程概述如下：

1.宿主之辨識及結合： 病毒與宿主細胞之結合使用HA蛋白質與結合於上皮細胞表面上之糖之唾液酸的結合。上皮細胞典型地存在於哺乳動物之鼻、咽喉及肺中以及鳥類之腸中。

2.附著及進入宿主中： 結合後，HA蛋白質裂解且病毒藉由胞飲作用進入細胞。

3.病毒蛋白質之分解： 一旦病毒進入細胞，則內體(endosome)之pH及環境條件引起a.　一部分HA使病毒套膜與液泡膜融合，b. M2離子通道允許質子進入病毒核心，質子酸化病毒核心，引起病毒核心分解及病毒RNA及核心蛋白質隨後釋放至宿主細胞質中。

4.反轉錄： 病毒RNA及核心蛋白質現轉運至細胞核中，其中RNA經轉錄且進一步轉譯為病毒蛋白質。

5.自宿主細胞出芽： HA及NA蛋白質在細胞膜附近形成叢集，隨後亦覆蓋病毒RNA及核心蛋白質，接著引起病毒之「出芽」及繁殖以用於後續感染。

如自以上詳細描述之感染及繁殖步驟可見，HA及NA在感染中起重要作用。在釋放病毒粒子之前，NA亦裂解唾液酸以防止HA與唾液酸結合。

針對A型流行性感冒病毒之當前介入：存在兩類經美國FDA核准之針對A型流行性感冒病毒之藥物：離子通道抑制劑，如金剛烷(鹽酸金剛烷胺及金剛乙胺)；及神經胺酸酶抑制劑，如奧斯他偉(Oseltamivir；TAMIFLU)及紮那米偉(Zanamivir；RELENZA)。

A型流行性感冒病毒易於突變。此等突變主要為病毒蛋白質，如NA、HA及M2離子通道蛋白質，且因此該等蛋白質之抑制劑將對突變病毒株無效。突變的可能及2009年A型流行性感冒全球大規模流行表明迫切需要提供針對此病毒之治療及預防選項之療法。

R ichard Anderson等人,“ Isolation and characterization of polyphenols Type A polymers from cinnamon with insulin-like biolosical activity ”,在Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,第52頁、第65-70頁。

此文獻描述商品肉桂之水性萃取物且已識別使試管內細胞株中葡萄糖代謝增加約20倍之多酚系聚合物。其使用牡桂(Cinnamomum cassia ；克林奇肉桂(Korintji cassia))製備此萃取物。此變種具有高含量的香豆素及桂皮醛。

此文獻進一步描述用於製備及特徵化此水性萃取物之製備型HPLC方法。

此公開案描述兒茶素之A型雙鍵連接前花青素。此文獻已識別自肉桂分離之兒茶素之三聚物(分子量864)、四聚物(分子量1152)及寡聚物。

Kilkuskie等人,“HIV and reverse transcriptase inhibitio n by tannins ”, 在 Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,1992,第 2卷，第1529-1534頁。

此公開案評估丹寧及縮合丹寧之抗HIV活性及其抑制反轉錄酶酵素之能力。儘管此研究發現一些具有抗HIV活性之丹寧，但其亦具有相關毒性。此公開案討論了3種化合物，其為兒茶素之縮合形式。分子40、44及45為兒茶素之二聚物、三聚物及四聚物。此文獻認為RT酶之抑制與該等丹寧之抗HIV作用之間不存在相關性。此外，分子44及45分別展示90%及73%之抗HIV活性，但不展示顯著RT酶抑制。

Michael Ovadia等人,專利申請案US 2006 275515A1

此標題為“Anti-viral preparations obtained from a natural cinnamon extract ”之專利案描述由具有抗病毒性質之肉桂獲得之天然水性萃取物。此文獻描述肉桂之水萃取物，其經受用鹽進行之鹽析沈澱。此沈澱物再溶解於水或緩衝液中並使用瓊脂糖凝膠層析術加以純化且接著用另一緩衝液及半乳糖洗提。

常用之鹽析過程係指高分子量分子(通常為肽)之選擇。因此，由此過程顯見，此文獻中描述之過程之目的在於回收高分子量分子(約10 Kda)。

根據申請專利範圍之組成物之活性成份具有大於10 KDA之分子量且其對280 nm下吸光度之反應在約15與20 OD之間。最終使用磷酸鹽緩衝液及半乳糖自sepharon管柱洗提此化合物。因此，最終化合物將具有高濃度之磷酸鹽及半乳糖。

已在流行性感冒A PR 8病毒、副流行性感冒(仙台(Sendai))病毒、在感染流行性感冒或仙台病毒之小鼠中預吸收至紅血球中及體重增加、以及HIV合胞體研究中測試此申請案中描述之此高分子量化合物。

此專利申請案之實施例13描述在MT2細胞中用此萃取物進行之測試以檢驗對合胞體形成之作用。根據此申請案之圖15，在60至100微克濃度下，其抑制合胞體形成。合胞體形成並非抗病毒活性之確認測試。此在以下公開案中明確說明[Gueseppe pantaleo等人,Eur J immunology 1991,21,1771:1774‘dissociation between syncytia formation and HIV spreading. Suppressing Syncytia formation does not necessarily reflect inhibition of HIV infection’]。

儘管所揭示之萃取物展示抑制合胞體形成之能力，但應注意僅一些HIV病毒株引起合胞體形成。此外，合胞體形成無法與HIV感染或AIDS之存在或進程建立相關性。合胞體形成僅為可由一些病毒株表現之表現型。缺乏合胞體形成無法與不存在HIV或與感染之管理建立相關性。

本發明之目標

本發明之第一目標為提供包含來自植物來源之五聚前花青素類黃酮、三聚物及四聚物之組成物。

本發明之第二目標為提供製備包含來自植物來源(諸如肉桂屬(Cinnamomum )、荔枝屬及花生屬)之五聚前花青素類黃酮、三聚物及四聚物之組成物之方法。

本發明之第三目標為提供改良個體中之免疫反應且亦有效對抗HIV感染、AIDS及流行性感冒病毒及感染之組成物。

本發明之陳述

因此，本發明係關於組成物，其包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑；製備包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物之組成物的方法，該方法包含以下步驟：使用有機溶劑萃取粉化之植物體以移除毒性物質；乾燥植物體以移除有機溶劑；使用水性溶劑再萃取經乾燥之植物體以獲得萃取物；及經由層析管柱純化萃取物，接著濃縮、純化、標準化且乾燥以獲得組成物；改良有需要之個體中免疫反應之方法，該方法包含向個體投予醫學上有效量之組成物之步驟，該組成物包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑；及治療、預防及管理有需要之個體中反轉錄病毒感染之方法，該方法包含向個體投予醫學上有效量之組成物之步驟，該組成物包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。

本發明係關於包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑的組成物。

在本發明之一具體實例中，組成物由選自包含肉桂屬、荔枝屬及花生屬之群組的植物來源獲得。

在本發明之另一具體實例中，五聚前花青素類黃酮之較佳濃度在約80% w/w至約99% w/w範圍內，三聚物及四聚物各在約0.5% w/w至約20% w/w濃度範圍內。

在本發明之另一具體實例中，該五聚前花青素類黃酮具有約1440之分子量。

在本發明之另一具體實例中，該五聚物為A型前花青素五聚物。

在本發明之另一具體實例中，該等賦形劑係選自包含樹膠、成粒劑、黏合劑、潤滑劑、崩解劑、甜味劑、著色劑、調味劑、塗佈劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、抗靜電劑及滾圓劑(spheronization agent)之群組。

在本發明之另一具體實例中，該組成物經調配為選自包含錠劑、糖衣錠、***錠、水性或油性懸浮液、可分散性散劑或顆粒劑、硬凝膠膠囊或軟凝膠膠囊中之乳液、糖漿及酏劑之群組的各種劑型。

本發明係關於製備包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物之組成物的方法，該方法包含以下步驟：使用有機溶劑萃取粉化之植物體以移除毒性物質；乾燥植物體以移除有機溶劑；使用水性溶劑再萃取經乾燥之植物體以獲得萃取物；及經由層析管柱純化萃取物，接著濃縮、純化、標準化及乾燥以獲得組成物。

在本發明之一具體實例中，粉化之植物體係選自包含肉桂屬、荔枝屬及花生屬之植物之群組。

在本發明之另一具體實例中，有機溶劑係選自包含乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸2-乙基己酯及其任何組合之群組。

在本發明之另一具體實例中，該萃取進行約8小時至約12小時範圍內之時間，較佳為約10小時。

在本發明之另一具體實例中，該毒性物質包括香豆素及醛類。

在本發明之另一具體實例中，經由兩階段層析管柱過濾該萃取物。

在本發明之另一具體實例中，該層析管柱係選自包含XAD-1180、XAD-7HP及XAD-1140樹脂之群組。

在本發明之另一具體實例中，該使用水性溶劑之再萃取在約3.8至約5.8範圍內之pH下進行，較佳在約4.0之pH下進行。

在本發明之另一具體實例中，該再萃取在約30℃至90℃範圍內，較佳31℃至40℃之間範圍內之溫度下進行約8小時至約12小時範圍內之時間，較佳為約10小時。

在本發明之另一具體實例中，該水性溶劑為經酸化之去離子水。

在本發明之另一具體實例中，該組成物進一步包含賦形劑，該等賦形劑係選自包含樹膠、成粒劑、黏合劑、潤滑劑、崩解劑、甜味劑、著色劑、調味劑、塗佈劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、抗靜電劑及滾圓劑之群組。

本發明係關於改良有需要之個體中免疫反應之方法，該方法包含向個體投予醫學上有效量之組成物的步驟，該組成物包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。

在本發明之另一具體實例中，免疫反應在選自(但不限於)流行性感冒、HIV感染及AIDS之群組的疾病中得到改良。

在本發明之另一具體實例中，免疫反應在有需要之個體中得到改良。

在本發明之另一具體實例中，醫學上有效量之組成物在約1 mg/kg個體體重至約100 mg/kg個體體重範圍內。

在本發明之另一具體實例中，該方法用於治療、預防及管理個體中由病原體引起之感染。

在本發明之另一具體實例中，該病原體包括A型流行性感冒病毒及HIV病毒。

在本發明之另一具體實例中，該等病毒類型為H1N1、H3N2、X4及R5向性病毒(tropic virus)。

在本發明之另一具體實例中，個體為動物或人類。

本發明係關於治療、預防及管理有需要之個體中病毒感染之方法，其中該方法包含向個體投予醫學上有效量之作為抗病毒製劑的組成物之步驟，該組成物包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。

在本發明之另一具體實例中，該組成物抑制A型流行性感冒病毒、HIV之X4向性及R5向性病毒。

在本發明之另一具體實例中，個體為動物或人類。

本發明係關於治療、預防及管理有需要之個體中反轉錄病毒感染之方法，該方法包含向個體投予醫學上有效量之組成物之步驟，該組成物包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。

在本發明之一具體實例中，該反轉錄病毒感染包括A型流行性感冒感染及HIV感染及AIDS。

在本發明之另一具體實例中，個體為動物或人類。

本發明係關於源自於植物性來源之新穎標準化組成物，其標準化為如圖1所示之50%至99%之黃烷類(flavanoid)A型前花青素五聚物。本發明亦係關於獲得源自於植物性治療藥物源之新穎標準化組成物之方法，該組成物標準化為50%至99%之黃烷類A型前花青素五聚物。本發明亦係關於源自於植物性來源之新穎標準化組成物的用途，該組成物標準化為50%至99%之黃烷類A型前花青素五聚物，其係用於預防、治療及管理HIV及流行性感冒感染。

本發明亦係關於源自於植物性來源之新穎標準化組成物的用途，該組成物標準化為50%至99%之黃烷類A型前花青素五聚物，其係用於引起有需要之個體中改良之對抗原之免疫反應。

在本發明之另一具體實例中，可本質上治療、管理或預防免疫反應。

在本發明之一具體實例中，用於獲得組成物之植物性來源為肉桂屬、荔枝屬及花生屬。

在本發明之一具體實例中，源自於植物性來源之新穎標準化組成物係標準化為黃烷類A型前花青素五聚物。

在本發明之另一具體實例中，如圖1所示，五聚物具有1440之分子量。

在本發明之另一具體實例中，組成物包含50%至99%範圍內之五聚物。

在本發明之另一具體實例中，組成物包含1%至35%範圍內之三聚物及四聚物。

在本發明之另一具體實例中，組成物由圖5中之層析圖特徵化。

在本發明之另一具體實例中，新穎組成物之單體單元選自兒茶素類之群組，較佳為兒茶素或表兒茶素。

本發明亦係關於藉由此文獻中說明之過程製造新穎組成物之方法。

在本發明之一具體實例中，標準化組成物包含視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。

在本發明之另一具體實例中，賦形劑係選自包含添加劑、樹膠、甜味劑、塗佈劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、崩解劑、懸浮劑、溶劑、著色劑、滑動劑、抗黏劑、抗靜電劑、界面活性劑、增塑劑、乳化劑、香料、黏度增強劑及抗氧化劑之群組。

在本發明之又一具體實例中，組成物經調配為如液體、散劑、膠囊、錠劑、注射劑、貼片、軟膏、凝膠、乳液、乳膏、洗劑、牙粉、噴霧劑及滴劑之劑型。在本發明之又一具體實例中，組成物為散劑或液體。

本發明亦係關於獲得源自於植物性來源之新穎標準化組成物之方法，該組成物標準化為50%至99%之黃烷類A型前花青素五聚物，其中該方法包含以下步驟：

1.將植物性原料研磨為預定大小；

2.用有機溶劑萃取以移除非所欲之毒性物質；

3.用去離子水水性萃取植物性粉末；

4.使用兩階段層析純化裝置進行萃取物純化；

5.乾燥、摻合及篩選以獲得包含50%至99%純度之如圖1所示的黃烷類五聚物之組成物。

本發明亦係關於本發明之視情況包含賦形劑之新穎組成物之用途，其係用於製造用於治療及管理HIV以及預防、治療及管理流行性感冒病毒感染之醫藥品。本發明亦係關於本發明之視情況包含賦形劑之組成物之用途，其係用於製造用於在有需要之個體中治療及管理HIV感染以及預防、治療及管理流行性感冒感染的醫藥品。

本發明亦係關於本發明之視情況包含賦形劑之組成物之用途，其係用於製造用於改良有需要之個體中免疫反應之醫藥品。本發明亦係關於本發明組成物之用途，其係用於引起有需要之個體中改良之免疫反應。

在本發明之又一具體實例中，個體為動物及人類。

本發明亦係關於製造源自於植物性來源之新穎標準化組成物之方法，該組成物標準化為50%至99%之黃烷類A型前花青素五聚物，該方法包含以下步驟：

1.研磨植物肉桂或荔枝果皮或具有紅色種皮之碎堅果殼；

2.使用主要由乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯或乙酸2-乙基己酯組成之呈單一溶劑或以上溶劑之混合物形式的有機(較佳為酯)溶劑萃取材料以移除脂肪及毒素以及其他芳族化合物。此步驟對肉桂視情況選用；

3.乾燥所萃取之植物物質以移除溶劑；

4.用去離子水在pH 4下或3.8至5.8之間的pH下，較佳在pH 4.0下進行萃取。使用兩階段層析分離進行萃取物純化，一個階段用於極性分子且一個階段用於非極性分子；

5.使用醇溶劑洗提所吸附的物質；

6.將經洗提之溶劑濃縮為細粉；

7.用水稀釋經濃縮物質且視情況噴霧乾燥以消除殘餘溶劑。

由以上過程獲得之新穎組成物包含50%-99%五聚物、1%-35%三聚物及1%-35%四聚物且如圖5所示特徵化。

借助於以下實施例進一步詳細說明本發明。然而，不應認為該等實施例限制本發明之範疇。

實施例1

將1000 gm平均大小在16篩目範圍內之粉化之肉桂粉末浸泡於3000 ml乙酸乙酯中且傾入具有200篩目之多孔底部篩網之萃取器中。經約8小時時間經由經包裝物質(packed mass)反覆再循環底部洗提劑以達成有效萃取。棄去洗提液且自萃取器移出物質並在強制送風烘箱中30℃下乾燥。在藉由乾燥移除溶劑後，將物質再裝於萃取器中。用5000 ml經酸化之去離子水在pH 4.0下萃取經包裝物質且在35℃下經約8小時經由床再循環萃取物以達成有效萃取。

經由兩階段層析管柱過濾萃取物以獲得具有80%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)的組成物，使萃取物通過第一管柱以萃取組成物中之相對較低極性分子且第二階段層析分離係用於組成物中之相對較高極性分子。所用樹脂分別為XAD-1180及XAD-7HP樹脂之等效物。用去離子水充分洗滌管柱使其不含黏著物質且洗提劑為中性。再用175 ml純異丙醇洗提管柱且所收集之洗提劑在真空中低於40℃下濃縮並用水稀釋且在以下條件下噴霧乾燥：

噴霧乾燥器：並流氣流

入口溫度：140℃

出口溫度　60℃

霧化器RPM　14000

最終重量為5 gm。

實施例2

將1000 gm平均大小在16篩目範圍內之粉化之肉桂粉末浸泡於3000 ml乙酸乙酯中且傾入具有200篩目之多孔底部篩網之萃取器中。經10小時時間經由經包裝物質反覆再循環底部洗提劑以達成有效萃取。棄去洗提液且自萃取器移出物質並在強制送風烘箱中30℃下乾燥。在藉由乾燥移除溶劑後，將物質再裝於萃取器中。用5公升經酸化之去離子水在pH 4.0下萃取經包裝物質且在35℃下經約8小時經由床再循環萃取物以達成有效萃取。

經由兩階段層析管柱過濾萃取物以獲得75%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)之組成物。首先使萃取物通過第一管柱以萃取組成物中之相對較低極性分子且第二階段層析分離係用於組成物中之相對較高極性分子。所用樹脂分別為XAD-1180及XAD-7HP樹脂之等效物。

用去離子水充分洗滌管柱使其不含黏著物質且洗提液為中性。再用250 ml純甲醇洗提管柱且所收集之洗提液在真空中低於40℃下濃縮並用水稀釋且在以下條件下噴霧乾燥：

噴霧乾燥器：並流氣流

入口溫度：145℃

出口溫度　60℃

霧化器RPM　14000

最終重量為4.5 gm。

實施例3

將1000 gm平均大小在16篩目範圍內之粉化之肉桂粉末浸泡於2500 ml乙酸丁酯中且傾入具有200篩目之多孔底部篩網之萃取器中。經10小時時間經由經包裝物質反覆再循環底部洗提液以達成有效萃取。棄去洗提液且自萃取器移出物質並在強制送風烘箱中30℃下乾燥。在藉由蒸發移除溶劑後，將物質再裝於萃取器中。用經酸化之去離子水萃取封裝物質，在30℃下經約12小時經由床再循環萃取物以達成有效萃取。

經由兩階段層析管柱過濾萃取物以獲得89%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)之組成物，首先使萃取物通過第一管柱以萃取組成物中之相對較低極性分子且第二階段層析分離係用於組成物中之相對較高極性分子。所用樹脂分別為XAD-1180及XAD-7HP樹脂之等效物。用去離子水充分洗滌管柱使其不含黏著物質且洗提液為中性。再用200 ml純乙醇洗提管柱且所收集之洗提液在真空中低於40℃下濃縮並用水稀釋且在以下條件下噴霧乾燥：

噴霧乾燥器：並流氣流

入口溫度：145℃

出口溫度　60℃

霧化器RPM　14000

最終重量為4.8 gm。

實施例4

將1000 gm平均大小在16篩目範圍內之粉化肉桂粉末浸泡於2500 ml乙酸丁酯中且傾入具有200篩目之多孔底部篩網之萃取器中。經10小時時間經由經包裝物質反覆再循環底部洗提液以達成有效萃取。棄去洗提液且自萃取器移出物質並在強制送風烘箱中30℃下乾燥。在藉由蒸發移除溶劑後，將物質再裝於萃取器中。用5公升經酸化之去離子水萃取經包裝物質且在30℃下經約12小時經由床再循環萃取物以達成有效萃取。

經由兩階段層析管柱過濾萃取物以獲得99%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)之組成物，首先使萃取物通過第一管柱以萃取組成物中之相對較低極性分子且第二階段層析分離係用於組成物中之相對較高極性分子。所用樹脂分別為XAD-1180及XAD-7HP樹脂之等效物。用去離子水充分洗滌管柱使其不含黏著物質且洗提液為中性。再用純異丙醇洗提管柱且所收集之洗提液在真空中低於40℃下濃縮並用水稀釋且在以下條件下噴霧乾燥：

噴霧乾燥器：並流氣流

入口溫度：145℃

出口溫度　60℃

霧化器RPM　14000

最終重量為5 gm。

實施例5

將1000 gm平均大小在16篩目範圍內之粉化之肉桂(cinnamon cassia)粉末浸泡於3000 ml乙酸乙酯中且傾入具有200篩目之多孔底部篩網之萃取器中。經約8小時時間經由經包裝物質反覆再循環底部洗提液以達成有效萃取。棄去洗提液且自萃取器移出物質並在強制送風烘箱中30℃下乾燥。在藉由乾燥移除溶劑後，將物質再裝於萃取器中。用5000 ml經酸化之去離子水在pH 4.0下萃取經包裝物質且在35℃下經約8小時經由床再循環萃取物以達成有效萃取。

經由兩階段層析管柱過濾萃取物以獲得具有55%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)之組成物，使萃取物通過第一管柱以萃取組成物中之相對較低極性分子且第二階段層析分離係用於組成物中之相對較高極性分子。所用樹脂分別為XAD-1180及XAD-7HP樹脂之等效物。用去離子水充分洗滌管柱使其不含黏著物質且洗提液為中性。再用175 ml純異丙醇洗提管柱且所收集之洗提液在真空中低於40℃下濃縮並用水稀釋且在以下條件下噴霧乾燥：

噴霧乾燥器：並流氣流

入口溫度：140℃

出口溫度　60℃

霧化器RPM　14000

最終重量為2.5 gm。

實施例6：自荔枝乾燥果皮萃取：

將1000 gm粉化之乾燥荔枝果皮浸泡於5000 ml體積之經酸化水中並保持12小時時間且過濾澄清。使澄清濾液通過含有與XAD-1140及XAD-7HP等效之吸附樹脂之管柱以分離極性與相對非極性化合物。用乙醇洗提非極性第一管柱且濃縮洗提液以獲得自由流動粉末，產量為500 mgm。用乙醇洗提單獨含有所有極性物質之第二管柱且濃縮以獲得1 gm粉末。HPLC分析時，此餾分顯示85%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)。

實施例7：自具有花生種子之紅皮之花生殼萃取

將1000 gm具有種子上的紅皮之乾燥花生殼浸泡於pH 3.8下5000 ml體積之經酸化水中並保持48小時且接著過濾為澄清液。使澄清濾液通過含有與XAD-1140及XAD-7HP等效之吸附樹脂之管柱以分離極性與相對非極性化合物。用乙醇洗提非極性第一管柱且濃縮洗提液以獲得自由流動粉末，產量為20 gm。用乙醇洗提單獨含有所有極性物質之第二管柱且濃縮以獲得500 mg粉末。HPLC分析時，此餾分顯示82%之黃烷類A型前花青素五聚物(分子量為1440)，如圖5所示。

實施例8：純化以獲得黃烷類五聚物

將藉由實施例1-6中詳細描述之程序分離之粉末溶解於200體積水中且過濾澄清。在60℃下用活性炭處理澄清濾液以使溶液脫色且用濾紙過濾澄清以移除所有不溶粒子。用乙酸乙酯萃取由此獲得之經過濾溶液兩次以移除所有可溶溶劑且濃縮以獲得粉末。在急驟層析儀中使用0.1%甲酸水溶液及0.1%甲醇甲酸以梯度方式在逆相C-18矽膠上對粉末進行管柱層析，使用以下參數。

設備：具有可變UV偵測器之Combiflash Companion

管柱：Redisep 12 gm(逆相二氧化矽)

偵測波長：254 nm及280 nm

流率：18 ml/min

峰值管體積：18 ml

峰寬：1 min

臨限值：0.20 AU

溶劑A：0.1%甲酸水溶液

溶劑B：含0.1%甲酸之乙腈

棄去編號為1至19之餾分。彙集編號為20至22之餾分且濃縮以獲得256 gm淡褐色粉末。TLC篩選溶劑系統0.1 M乙酸鈉：乙腈=7:3比率上，所得粉末在經展示橙色斑之大茴香/硫酸試劑噴霧後展示0.75 Rt下之UV吸收斑，其被視為原花青素之特性。

m/z 1439.9下之EI-MS(M-H)(如圖2所示)離子峰值對應於與總共五個單元對應之兒茶素構造之多個區間(288重峰)。經分離化合物之分子量為1440.9。藉由偶合圖案確認，兒茶素單元之組態與表兒茶素之組態一致。黃烷-3-醇單元中2,3順式立體化學之單峰(由於高分子量寡聚物而使得譜峰加寬)之δ4.84至4.91四個信號之間的兩個信號。在由於高分子量寡聚性質而觀測到的δ2.6至2.9 m峰值變寬之間，觀測到末端單元終環-CH2-亞甲基質子之4位處之F環信號。如關於環B及E之兩個系統，芳族區域信號在δ6.6至7.6之間。δ100.9處可見之13C碳信號證實C2碳，且δ27.9處可見之13C碳信號證實C4碳，頂環C證實與中間系統環形成雙鍵，如圖3所示。

根據上述實施例1至8獲得包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑的組成物。此外，使用該組成物測試以下實施例9至14中所述之試管內及活體內活性。

實施例9：經環磷醯胺治療之個體(免疫功能不全)中測試組成物對體液抗體力價之作用

將任意性別之瑞士白化病小鼠(Swiss albino mice)基於其所接受之處理分為5組，每組6隻動物。

第0天，用於生理鹽水中之含有1×10⁸ 個細胞之綿羊紅血球(SRBC)對所有5個組進行敏化。用標準藥物及測試組成物組合處理第2-5組8天(第0天至第7天)。第7天，藉由後眼眶穿刺自5個組中之各小鼠收集血液樣本以用於測定一次抗體力價。接著在第7天，抽取血液後，藉由將0.1 ml SRBC注入足墊中對小鼠進行攻毒。第14天，藉由後眼眶穿刺自各小鼠收集血液樣本以用於測定二次抗體力價。

此測試之結果如下：

體液免疫性充當第一防線且保護宿主免於感染。體液免疫性提高使得對抗傳染性病原體之保護更強。個體對抗原之反應變化且視許多因素而定，該等因素包括遺傳組成及個體病史。環磷醯胺為抑制免疫系統之藥物。使用此藥物，可鑑別此研究中評估之所有動物對抗原之反應。

如上表所示，測試組成物反映免疫功能不全個體之一次抗體及二次抗體力價增加。一次抗體及二次抗體力價(體液免疫性)增加多倍。此免疫反應回應於抗原、SRBC之存在而發生且考慮由用環磷醯胺進行預處理所致之免疫反應變化。

實施例10：測試組成物對腹膜巨噬細胞、血液多核細胞吞噬活性之作用

對抗原之免疫反應儘管有效，但仍需進一步評估以測定此攻擊之有效性。藉由免疫反應消除病原體之能力評估有效性。藉由評估反應之吞噬細胞能力來測定消除病原體之能力。

將任意性別之瑞士白化病小鼠分為3組，每組6隻動物。向3個組中之各組給予單劑量之對照物及測試組成物。

各組處理20天之時間且在第21天，其腹膜內接受5 ml冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。接著，收集腹膜液且在血球計中使用WBC平方對巨噬細胞數目進行計數。估算每立方毫米之細胞計數。剩餘小鼠保持連續處理直至第28天且在第29天，由後眼眶叢抽取血液。將自各小鼠抽取之兩滴血液置於載片上並使其凝結，且接著置於保濕室中，保持在37℃下25分鐘。此等黏著細胞與白色念珠菌(Candida albicans )孢子懸浮液一起培育且藉由染色進行觀測。接著，對攝取念珠菌懸浮液之細胞之數目進行計數。

使用下式計算吞噬細胞指數及吞噬作用%：

吞噬作用%=每100個所觀測細胞中攝取念珠菌之PMN細胞之數目

進行以上步驟且將結果列表：

以上結果展示腹膜巨噬細胞計數及吞噬活性之增加。增加之巨噬細胞數目直接指示對抗原之免疫反應增強。此外，此等巨噬細胞之吞噬活性增加表明其針對抗原之有效性。

實施例11：測試組成物對宿主對抗大腸桿菌(E-coli)誘發之腹部敗血症之抗性的作用

將任意性別之瑞士白化病小鼠分為3組且用對照物及測試組成物處理。向小鼠投予單劑量歷時28天。第29天，向小鼠腹膜內注射於PBS中之含有2.5×10⁹ 個細胞之大腸桿菌懸浮液。注射後，經24小時觀測小鼠之死亡率。所觀測到之死亡率由大腸桿菌感染(且亦稱為敗血症)引起。經7天進一步觀測存活動物之死亡率。

此實驗之結果列於下表中：

如由以上結果可見，對照物及較低劑量測試組成物情況下之死亡率為100%。在50 mg/kg劑量之測試組成物情況下，死亡率降低63%。與其他兩組中所有8隻小鼠死亡相比，8隻小鼠中僅3隻死亡。此第3組中亦未進一步觀測到死亡率。

此展示測試組成物向宿主提供預防作用。用測試組成物進行之預處理降低暴露於病原體之小鼠之死亡率。此證實測試組成物預防由病原體(包括細菌及病毒)引起之感染的能力。

此感染預防係由組成物在病原體存在下引起之免疫反應改良引起。此反應使得宿主能夠控制病原體之數目，從而預防感染。

實施例12：A型流行性感冒(H1N1及H3N2)病毒之抑制

此實施例展示測試組成物抑制H1N1及H3N2病毒之功效且因此證實其作為治療、預防及管理此病毒感染之方法的有效性。

將馬丁-達比犬腎(MDCK)細胞接種至6孔板中(3×10⁵ 個細胞每孔)，次日用H1N1及H3N2病毒進行感染。3天後，用經連續稀釋之H1N1及H3N2病毒感染細胞1小時，接著將3 mL覆蓋培養基添加至各孔中。40小時後，用10%福馬林固定細胞1小時且用1%結晶紫染色15分鐘。根據溶菌斑計數測定病毒力價。

藉由溶菌斑減少檢驗測定病毒對化合物之敏感性。除將指示量化合物添加至覆蓋培養基中以外，程序與溶菌斑檢驗類似。抑制百分比計算為[100-(V_D /V_C )]×100%，其中V_D 及V_C 分別指代存在及不存在化合物下之病毒力價。藉由自溶菌斑檢驗產生之劑量-反應曲線之回歸分析計算減少50%溶菌斑數目所需之化合物最小濃度(EC₅₀ )。

由上表顯而易見，經測試組成物處理之感染細胞展示溶菌斑形成之顯著降低。此外，測試組成物展示高度有效對抗H1N1之達菲抵抗性病毒株，因此證明其作為流行性感冒(H1N1)病毒感染之可能治療之有效性。又，第二個表展示測試化合物亦有效抑制A型流行性感冒病毒之H3N2病毒株。

實施例13：測試組成物對PBMC刺激之HIV-1(X4向性病毒及R5向性病毒)之作用

在將HXB2分子純系轉染至293T細胞後48小時獲得HIV-1(HXB2-X4向性)病毒。藉由即時PCR偵測病毒力價。接著，用病毒感染24個孔中植物血球凝集素(PHA)刺激之末梢血液單核細胞(PBMC)。16-18小時後，用磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗滌PBMC且添加新鮮的具有2%胎牛血清(FBS)之洛斯維公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)培養基。在感染後第3天、第5天及第7天(dpi)收集細胞及病毒湯。

在經HXB2 HIV-1病毒(X4病毒及R5病毒)轉染之植物血球凝集素(PHA-2 μg/mL)刺激之PBMC細胞中對測試組成物及3種標準藥物(AZT、AMD3100及Tak-779)進行測試。發現感染倍率(MOI)為0.26。在感染後第3天、第5天及第7天，如上所述藉由RT-PCR進行病毒負荷偵測。

AMD3100僅呈現針對CXCR4營養性病毒之抑制活性(平均EC₅₀ =2.05 nM)，而Tak-779僅呈現針對CCR5營養性病毒之抑制活性(平均EC₅₀ =0.56 nM)。AZT呈現針對CCR5營養性病毒及CXCR4營養性病毒之抑制活性。測試組成物在X4病毒情況下展示22.5 μg/mL(15.625 nM)之EC₅₀ 值且在R5病毒情況下展示15.5 μg/mL(10.77 nM)之EC₅₀ 值。此等值為可比的且在一些情況下比所用標準藥物更有效。

實施例9-11呈現測試組成物之免疫反應性質，而實施例12-13展示測試組成物針對HIV及流行性感冒病毒(H1N1)之抗病毒作用。總而言之，實施例9-13表明測試組成物用以藉由兩管齊下的機制預防感染：增強之免疫反應可一起充當保護性或預防性選項以預防感染。其次，在感染情況下，測試組成物之抗病毒性質會降低病毒負荷(HIV及流行性感冒兩者)，從而允許增強之免疫反應消除感染且預防進一步損害。重要的是應注意，此免疫反應僅在抗原存在下引發。此係由沒有動物展示炎症跡象及/或其他與過度活化之免疫系統相關之症狀之事實證明。

測試組成物之此性質使其極適於長期用作預防劑以預防感染。

本發明組成物不僅在寬濃度範圍之包含約55% w/w至約99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物的組成物情況下改良免疫反應。組成物引起免疫反應之功效在特定濃度範圍之包含約80% w/w至約99% w/w範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在約0.5% w/w至約20% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物的組成物情況下更佳/極佳。

實施例14：用於展示新穎組成物在HIV及AIDS患者中之功效及安全性之概念驗證研究：

在40個未經歷抗反轉錄病毒、無症狀的HIV-1感染患者中進行預定、雙盲、隨機化、安慰劑控制研究。在40個未經歷抗反轉錄病毒、無症狀的HIV-1感染患者(其CD4計數在250-500/mm³ 之間)中研究測試組成物。經12週以300毫克/天對測試組成物進行測試且以膠囊劑型投予。與展示病毒負荷增加67.28%之安慰劑相比，測試組成物展示病毒負荷降低11.29%。兩個組中均存在CD4計數下降，但發現測試組成物組中CD4計數之降低百分比為安慰劑之一半(測試組成物情況下7.74%相比於安慰劑情況下13.88%降低)。因此，發現測試組成物相對於大部分生命器官功能及生化參數為安全且有效的。實施例14詳細描述測試組成物抑制病毒負荷之能力，從而證實測試組成物之抗病毒作用。又，與安慰劑相比，WBC(CD4)計數之改良為改良免疫反應之重要指示。

圖1 展示類黃酮之五聚物的分子結構。

圖2 展示類黃酮之五聚的五聚物之EI-MS。

圖3 展示類黃酮之五聚物的13C NMR。

圖4 展示組成物的急驟層析術以識別類黃酮之五聚物。

圖5 展示類黃酮之五聚物的HPLC。

Claims

一種組成物，其包含55% w/w至99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在0.5% w/w至35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物、以及視情況選用之醫學上可接受之賦形劑。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物係獲自選自包含肉桂屬(Cinnamomum )、荔枝屬(Litchi )及花生屬(Arachis )之群組的植物來源。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該五聚前花青素類黃酮之濃度較佳在80% w/w至98% w/w範圍內，三聚物及四聚物各較佳在0.5% w/w至20% w/w濃度範圍內。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該五聚前花青素類黃酮具有約1440之分子量；且該五聚物為A型前花青素五聚物。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該賦形劑係選自包含樹膠、成粒劑、黏合劑、潤滑劑、崩解劑、甜味劑、著色劑、調味劑、塗佈劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、抗靜電劑及滾圓劑之群組。
如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物經調配為選自包含錠劑、糖衣錠、***錠、水性或油性懸浮液、可分散散劑或顆粒劑、於硬凝膠膠囊或軟凝膠膠囊中之乳液、糖漿及酏劑之群組的各種劑型。
如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於改良有需要之個體中疾病的免疫反應，該疾病係選自包括流行性感冒、HIV感染及AIDS之群組。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該組成物呈1 mg/kg該個體之體重至100 mg/kg該個體之體重範圍內的醫學上有效量；且該組成物係用於治療、預防及管理該個體中由病原體引起之感染，該病原體包括選自由流行性感冒病毒H1N1及H3N2所組成之群組的A型流行性感冒病毒；及選自由HIV X4及R5向性病毒(tropic virus)所組成之群組的HIV病毒。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該個體為動物或人類。
如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於治療、預防及管理有需要之個體中病毒感染，該病毒感染係選自由包括A型流行性感冒病毒、HIV之X4向性及R5向性病毒所組成之群組。
如申請專利範圍第10項之組成物，其中該組成物呈1 mg/kg該個體之體重至100 mg/kg該個體之體重範圍內的醫學上有效量；且該個體為動物或人類。
一種製備組成物之方法，該組成物包含55% w/w至99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、各在0.5% w/w至35% w/w濃度範圍內之三聚物及四聚物，該方法包含以下步驟：a)粉化植物來源以取得粉化之植物體並使用有機溶劑萃取粉化之植物體以移除毒性物質；b)乾燥該植物體以移除該有機溶劑； c)使用經酸化的去離子水再萃取該經乾燥之植物體以獲得萃取物；及d)經由兩階段層析管柱純化該萃取物，接著濃縮、純化、標準化及乾燥以獲得該組成物。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該植物來源和該粉化之植物體係選自包含肉桂屬、荔枝屬及花生屬之植物之群組。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該有機溶劑係選自包含乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸2-乙基己酯及其任何組合之群組。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該萃取進行8小時至12小時範圍內之時間。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該萃取進行10小時之時間。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該毒性物質包括香豆素及醛類。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該再萃取在3.8至5.8範圍內之pH下進行；且該再萃取在30℃至90℃範圍內進行8小時至12小時範圍內之時間。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該再萃取在4.0之pH下進行；且該再萃取在31℃至40℃之間範圍內之溫度下進行10小時。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該層析管柱係選自包含XAD-1180、XAD-7HP及XAD-1140樹脂之群組。
如申請專利範圍第12項之方法，其中該組成物進一步包含選自包含樹膠、成粒劑、黏合劑、潤滑劑、崩解劑、甜味劑、著色劑、調味劑、塗佈劑、增塑劑、防腐劑、懸浮劑、乳化劑、抗靜電劑及滾圓劑之群組的賦形劑。
一種包含55% w/w至99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、及各在0.5% w/w至35% w/w濃度範圍內之三聚物與四聚物之組成物的用途，其係用於製造改良有需要之個體中疾病的免疫反應之醫藥品，該疾病係選自包含流行性感冒、HIV感染及AIDS之群組。
如申請專利範圍第22項之用途，其中該醫藥品提供呈1 mg/kg該個體之體重至100 mg/kg該個體之體重範圍內之醫學上有效量的組成物；且該組成物用於治療、預防及管理該個體中由病原體引起之感染，該病原體包括選自由流行性感冒病毒H1N1及H3N2所組成之群組的A型流行性感冒病毒；及選自由HIV X4及R5向性病毒所組成之群組的HIV病毒。
如申請專利範圍第22項之用途，其中該個體為動物或人類。
一種包含55% w/w至99% w/w濃度範圍內之五聚前花青素類黃酮、及各在0.5% w/w至35% w/w濃度範圍內之三聚物與四聚物之組成物的用途，其係用於製造治療、預防及管理有需要之個體中病毒感染之抗病毒製劑，該病毒感染係選自由包括A型流行性感冒病毒、HIV之X4向性及R5向性病毒所組成之群組。
如申請專利範圍第25項之用途，其中該抗病毒製劑提供呈1 mg/kg該個體之體重至100 mg/kg該個體之體重範圍內之醫學上有效量的組成物；且該個體為動物或人類。