JPH06502413A - 抗ウイルス活性をもつプロアントシアニジンポリマーおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ウィルス活性をもつプロアントシアニジンポリマーおよびその製造法 関連出願への言及 本出願は１９９０年１０月１２日出願の５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ。

０７１５９６．８９３の部分継続出願であり、該出願は参照により本出願に包含 される。

■、技術分野 本発明は呼吸性ウィルス感染の治療における、２から３０のフラボノイド単位を 有するプロアントシアニジンポリマーの使用に関する。さらに、６から３０のフ ラボノイド単位を有するプロアントシアニジンポリマーの使用が一般にウィルス 感染の治療に有効であることが見いだされた。新しく発見されたある種のプロア ントシアニジンポリマーの化学的性質も包含する。

南アメリカに見られるクロトン・サルタリス（Ｃｒｏｔｏｎｓａｌｕｔａｒｉｓ ）、クロトン・ゴシピフオリウス（Ｃｒｏｔｏｎ　ｇｏｓｓｙｐｉｆｏｌｊｕｓ ）、クロトン・パラノステイマ（Ｃｒｏｔｏｎ　ｐａｌａｎｏｓｔｉｍａ）、ク ロトン・レチレリ（Ｃｒｏｔｏｎ　Ｉｅｃｈｌｅｒｉ）、クロトン・エリスロチ ラス（Ｃｒｏｔｏｎ　ｅｒｙｔｈｒｏｃｈｉｌｕｓ）およびりロトン・ドラコノ イデス（Ｃｒｏｔｏｎ　ｄｒａｃｏｎｏｉｄｅＳ）などを含む多くの異なるバズ の木の種は、サンブレ・デ・ドラゴ（Ｓａｎｇｒｅ　ｄｅ　Ｄｒａｇｏ）と呼ば れる赤いネバネバした乳液性の樹液を産出する。これはペルー系アマシンの混血 および土着民によってインフルエンザと下痢に最もよく用いられている。扁桃炎 、喉の感染、結核、消化性潰瘍、小腸の不調、リューマチのため、および受胎能 の増強に内服薬として用いられ、大人にも子供にも用いられている。この樹液は また、止血、庖疹および傷の治療にも広く用いられている。この樹液は抗炎症剤 として、また治癒過程を促進するために傷に直接つける。抜歯した後の患者の歯 茎にもこれを適用する。出血多量のときには膣の洗浄液としても用いられる。

クロトン・ドラコノイデスおよびクロトン・レチレリからのサンブレ・デ・ドラ ゴは抗炎症活性を示すシスビン（ｔａｓｐｉｎｅ）と同定されるアルカロイドを 含むことが示されている（Ｐｅｒｓｉｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｊ 、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、、　６８：１２４）　ｏシスビンは骨髄芽球症ウィ ルス、ラウシャー白血病ウィルスおよびサル肉腫ウィルスにおけるＲＮＡ依存性 ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することも示されている（Ｓｅｔｈｉ、　１９７ ７、　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、　１２ニア）。

力ロフィラム・イノフィラムは、インド、東アフリカからポリネシアに生息する 木である。その種子の油脂はｆＩＦｍ、口癖および皮膚病の治療に駆虫薬として 、またその他にも痛覚脱失などに民間薬として用いられている。インド、中国で は粉末の樹脂が潰瘍および傷の治療に用いられている。インドネシアでは腫脹腺 の治療に樹皮が外用薬として用いられ、また利尿薬として内服されている。樹液 は胸の痛みの緩和薬として、また腫瘍および腫脹に用いられている。葉の抽出物 は炎症を起こした目の洗浄液として用いられている。カンボジア人はめまいや偏 頭痛の治療用の吸入薬として葉の抽出物を用いる。サモア人は樹液を矢毒として 用いている。

プロアントシアニジンおよびプロアントシアニジンポリマーは多くの種類の植物 、特に木本性の成長をするもの（例えばバズの種および力ロフィラム・イノフィ ラムなど）に見られる無色のフェノール性物質である。ポリマー性のプロアント シアニジンの一般的化学構造は、５．　７．　３°、４°−テトラヒドロキシま たは５．７．３′、４’　、５’　−ペンタヒドロキシフラボノイド単位が次の 図に示すように、共通のＣ（４）　−Ｃ（６）および／またはＣ（４）　−Ｃ（ ８）結合で結合した線状鎖からなる。

生合成研究はプロアントシアニジンポリマーは以下に示すタイプのモノマー単位 からなることを示した（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７゜Ｊ、　 Ｃ，Ｓ、　Ｐｅｒｋｉｎ、　ｌ：１６２８を参照）。

ポリマー鎖のモノマー単位（一般に”ロイコアントシアニジン”と呼ばれている ）は、Ｃ環の２および／または４位の２つの立体化学、すなわちシス（エビカテ キンと呼ばれる）またはトランス（カテキンと呼ばれる）のいずれかに基づく。

したがって、ポリマー鎖は異なる構造単位に基づいており、これによって広範な ポリマー性プロアントシアニジンと多数の可能な異性体を作り出す（）ｌｅｍｉ ｎｇｗａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｊ、　Ｃ，Ｓ、　Ｐｅｒｋｉｎ、　 Ｉ：Ｉ２１７）　ｏ　Ｃ１３ＮＭＲはポリマー性プロアントシアニジンの構造の 同定に用いられており、最近の研究により二、三または四量体のプロアントシア ニジンの化学が明らかとなった。はとんどの植物ではフラボノイド３−オール単 位のより大きなポリマーが主なものであり、６以上の単位を含む２，０００ダル トン以上の平均分子量を有することが見いだされている（Ｎｅｗｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８７．　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ。

Ｃｈｅｍ、、　２５：ＩＩ８　）。

プロアントシアニジンはタンパク質結合能をもち、生物学的役割をもつ可能性が 報告されている（Ｎｅｗｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｍａｇ。

Ｒｅｓ、　Ｃｈｅｍ、、　２５：１１８）。プロアントシアニジンモノマーおよ びダイマーは毛細管の脆弱性の増加と関連する疾患の治療に用いられており、ま た実験動物で抗炎症効果を有することも示された（ＢｅＩａｄｉ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９７７、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　２８４：３５ ８）　、プロシアニジンモノマーはインビトロアッセイで単純ヘルペスウィルス に対する抗ウィルス活性をもつことが発見された（Ｂｅｌａｄｉ　ｅｔ　ａｌｌ 、前出）。Ｂｅ１ａｄｉらはアビゲニン（ａｐ　ｉ　ｇｅｎ　ｉ　ｎ）、ベラル ゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎＬケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）を含 む多数のフラボノイドモノマーおよびプロアントシアニジンモノマーの単純ヘル ペスウィルスに対する殺ウイルス効果を試験した。プロアントシアニジンモノマ ーがウィルス不活性化に最も有効であり、次いでベラルゴニジンとケルセチンで あることがわかった。アビゲニンは少しの効果を持つのみであった。ＨＥｐ−２ 細胞における単純ヘルペスウィルスの増殖に対するケルセチンとプロシアニジン モノマーの効果も研究された。Ｂｅ　Ｉ　ａｄ　ｉらが結論したように、試験し たモノマー性フラボノイドは殺ウイルス活性を示したが、インビトロアッセイで はウィルス増殖にわずかな阻害効果を示すのみであった。

本発明以前には呼吸性ウィルス感染の治療に２またはそれ以上のフラボノイド単 位を含むプロアントシアニジンの使用に関する開示はない。さらに、一般のウィ ルス感染の治療に６以上のフラボノイド単位のプロアントシアニジンの使用に関 する開示も何らない。

本発明の目的のためには、バズ種から単離されたプロアントシアニジンポリマー を［プロアントシアニジンポリマーＡ］と呼び、力ロフィラム・イノフィラムか ら単離されたものを［プロアントシアニジンポリマーＢ」と呼ぶ。しかし、この ような命名は単に議論を単純化するためのものであって、これらポリマーが異な る化合物のクラスにあることを必ずしも示唆するものではない。プロアントシア ニジン・ポリマーＡもプロアントシアニジン・ポリマーＢも本明細書で記載する プロアントシアニジン・ポリマーの言葉の範囲に入ると解されるものである。

２．３ＲＳウイルス ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌＶｉｒｕｓ：Ｒ３ Ｖ）はニューモウイルス属バラミクソウィルス科に属し、幼児および子供の細気 管支炎および肺炎などの下部呼吸器感染を引き起こす原因となるものである。こ のウィルスは子供の急性呼吸疾患に重要な原因となると考えられ、幼児の５０％ までがその最初の冬にＲ３Ｖ感染に苦しむと予期される。肺または心臓の疾患を もつ幼い子供では、Ｒ３Ｖによる致死率が３７％までであると報告されている。

Ｒ３Ｖ呼吸器感染は子供にはよく見られるが、このウィルスはどの年齢の感染者 の呼吸器分泌物にも見られる。高齢者が感染すると深刻で致命的な疾患と結びつ き、またＲ３Ｖ感染は免疫が抑制されている成人では発熱および肺浸潤の原因と なりうる（Ｅｎｇｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ａｎｎ、　Ｉｎｔ、 　Ｍｅｄ、、　１：２０３）。

不活化Ｒ３ＶのワクチンはＲ３Ｖ感染には効果がないことが明らかとなっており 、また次にＲ３Ｖに感染すると異常な免疫系と肺の炎症を引き起こす。したがっ て、最近の研究は有効な生ワクチンあるいは効果のある抗ウィルス化合物の開発 のいずれかに向けられている。

現在選択薬となっているリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ：　１−β−Ｄ−リボ フラノシルー１．　２．　４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、Ｒ８Ｖ またはインフルエンザウィルスによる急性呼吸系感染における疾患の重篤度とウ ィルスの脱落（ｓｈｅｄ）の量を減少することが見いだされた。現在ではりバビ リンはエアロゾル剤形で呼吸器のＲ３Ｖ感染の治療に用いられている。

しかしながら、その毒性のために、リバビリンは系統的に使用するには好ましく ない。さらに、リバビリンは動物に催奇性であることがわかった。このため女性 の健康管理で全員にリバビリンを投与したり、またこれにさらすことへの深刻な 憂慮を引き起こした（Ｇｌａｄｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｔｏｘ ｉｃ　Ｅｎｖ、　Ｈｅａｌｔｈ、　２８：１）。

２．４　中耳炎および外耳炎 中耳の炎症である中耳炎は、小さい子供に普遍的な風邪に次いで第２位の疾患で ある。すべての子供の６０％以上が６歳までに中耳炎の経験をもつ。急性中耳炎 の最大の危険は、ＲＳウィルス、ライノウィルス、インフルエンザウィルスまた はアデノウィルスによる感染にある（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ 、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　１９８２、　１３７７；　Ｒｕｕｓｋａｎｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｅｄｉａｔｒ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、Ｊ、、１９８９、 ９４；　５ａｎｙａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒ、、　１９８０ ．１１）　ｏ呼吸系ウィルス感染の予防が中耳炎の発生を少なくすることがわか った（ｌ（ｅｉｋｋｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＡＪＤＣ，４４５（１９９１） ）　ｏインフルエンザワクチンの使用が有効であることが発見された。しかしな がら、ワクチンを毎年投与する必要があること、最初に２回投与しなければなら ないこと、インフルエンザウィルスの抗原変異性の問題が絶えずあること、また 得られるワクチンの有効性が不安定なことやコストなどの多くの理由によってこ れは満足のいくアプローチではな２．５　インフルエンザウィルス インフルエンザウィルスはオルソミクソウィルス科に属し、広く世界中に分布し ている。２０世紀には５回の大流行があり、１９１８年の突発では少なくとも２ １００万人が死んだ。アメリカ合衆国では過去２０年間に５０％Å以上がインフ ルエンザ禍のために死んだとされる。はとんど毎冬、季節的に突発し、主として 呼吸器経路で伝染する。アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）は発熱期間を短 縮し、呼吸器系の症状をわずかに約５０％だけ軽減するが、中枢神経系のいくら かの副作用を起こすことが示された。まだ許可されていないが、リマンチジン（ ｒｊｍａｎｔｉｄｉｎｅ）は同様な効果を示すが、アマンタジンに見られるよう な中枢神経系の副作用は示さない。普遍的なインフルエンザ感染の併発症である 原発性インフルエンザウィルス肺炎は、リマンチジンかアマンタジンで治療でき ることは示されていない。予防的には、インフルエンザは不活化インフルエンザ ウィルスワクチンを用いて約８０％の防御効率でコントロールされた。

２．６　単純ヘルペスウィルス 単純ヘルペスウィルス（ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ：Ｈ３Ｖ） はヘルビトウイルス科に属し、広く世界中に分布している。ウィルスの伝染は人 から人への直接接触を介して起こり、主としてＨ３Ｖ−１は口腔から入り、Ｈ３ Ｖ−２の感染は生殖器を介してである。Ｈ５Ｖ抗体の普及は社会経済的な地位と 反比例し、発展途上国の成人では１００％近くがＨＳＶポジティブであり、開発 国では３０−５０％である。アシクロビル（ａＣｙｃｌｏｖｉｒ）、イドクスリ ジン（ｉｄｏｘｕｒｉｄｉｎｅ：ＩＤＵまたは２−デオキシ−５−ヨードウリジ ン）、トリフルリジン（ｔｒｏｆｌｕｒｉｄｊｎｅ）およびビダラビン（ｖｉｄ ａｒａｂｉｎｅ：アデニンアラビノシド、Ａｒａ−Ａ）が多様なＨ８■感染の治 療に有効であり、このうちトリフルリジンとアシクロビルが選択薬である。目の 感染症の選択薬であるビダラビンは***匍行疹またはその他の皮膚／生殖器感染 に対して局所投与で効果がない。アシクロビルは再発性生殖器感染に対して局所 投与で効果がない。しかしながら、静脈内投与および経口投与では効果がある。

神経節潜伏期がまだ存在し、治療を止めた後に再発するので、アシクロビルを再 発性ＨＳＶ生殖器感染の治療に日常的に使用することは推奨できない。

（本頁以下余白） ３、　発明の要約 本発明は、温血動物に、治療上効果的な量のプロアントシアニジンポリマーを含 む抗ウィルス剤を投与することから成る、呼吸器ウィルス感染症の治療方法に関 するものである。プロアントシアニジンポリマーは２−３０個のフラボノイド単 位を含むものが好ましく、２−１５個のフラボノイド単位を含むものがより好ま しく、２−１１個のフラボノイド単位を含むものが最も好ましい。

フラボノイド単位としてはカテキン、エビカテキン、ガロカテキン、ガロエビカ テキン、フラバノール、フラボノール、フラバンジオール、ロイコシアニジン、 アントレアニシン、またはその組合せが含まれるが、これらに限定されない。フ ラボノイド単位は単一にまたは二重に互いと結合することができる。より詳細に は、本発明の方法は、Ｒ３（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ）ウ ィルス並びにバラインフルエンザウィルス３、インフルエンザＡウィルス、イン フルエンザＢウィルス、および中耳炎や外耳炎と関連したウィルスにより引き起 こされる呼吸器感染症を治療するために使用される。プロアンドシアニジンポリ マーは静脈内に、腹腔内に、皮下に、筋肉内に、経口的に、局所的に、もしくは 吸入により投与することができる。

プロアントシアニジンポリマーは中耳炎と関連したウィルスの大部分に対して効 果的である。それらは水溶液中に溶けやすく、非経口、経口、局所（すなわち耳 や鼻）投与用に簡単に処方することができ、か（して中耳炎を予防または治療す るのに非常に適している。

同様に、プロアントシアニジンポリマーは外耳炎と関連したウィルスに対しても 効果的である。このようなウィルスは鼓膜の外側に存在しているので、プロアン ドシアニジンポリマーを適当な処方物として耳に局所投与して、ウィルスと直接 接触させることができる。

呼吸器ウィルス感染症を治療するのに有用なプロアントシアニジンは、■、■１ および１１１： Ｉ　ＩＩ ＩＸＩ 〔式中、ａ、ｂ＝１−３、ｘ＝ＯまたはＬ　ｎ＝ｏ−２８、好ましくは０−１３ 、より好ましくは０−９〕およびそれらのエステル、またはエーテルもしくは対 応するオキソニウム塩から選ばれた構造を有する。

呼吸器ウィルス感染症を治療するのに有用なプロアントシアニ〔式中、ｘ、ｙ＝ １−３、ｚ＝１または２〕を有する単量体フラボノイド単位、そのエステル、エ ーテルまたは対応するオキソニウム塩を２−３０個、好ましくは２−１５個、よ り好ましくは２−１１個含み得る。

さらに、本発明の他の態様は、温血動物に、治療上効果的な量の、６−３０個の フラボノイド単位、好ましくは６−１５個のフラボノイド単位、より好ましくは ６−１１個のフラボノイド単位を含むプロアントシアニジンポリマーを含む抗ウ ィルス剤を投与することから成る、ウィルス感染症の治療方法に関するものであ る。フラボノイド単位としてはカテキン、エビカテキン、ガロカテキン、ガロエ ビカテキン、フラバノール、フラボノール、フラバンジオール、ロイコシアニジ ン、アントシアニジン、またはその組合せが含まれるが、これらに限定されない 。フラボノイド単位は単一にまたは二重に互いと結合することができる。当該方 法はパラミクソウィルス、オルソミクソウィルス、またはヘルペスウィルスによ って引き起こされるウィルス感染症を治療するために使用される。プロアントシ アニジンポリマーは静脈内に、腹腔内に、皮下に、筋肉内に、経口的に、局所的 に、もしくは吸入により投与することができる。

本発明はまた、上記のＩ、１１およびＩＩＩ　［式中、ｎ＝４−２８、好ましく は４−１３、より好ましくは４−９］から選ばれた構造を有する、一般にウィル ス感染症を治療するのに有用なプロアントシアニジン類、およびそれらのエステ ル、エーテル並びに対応するオキソニウム塩に関するものである。

本発明はまた、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）種および力ロフィラム・イノフィラム （Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｉｎｏｐｈｙｌｕｍ）種から得られる新規なプロア ントシアニジン類、およびそれらのエステル、エーテル並びにオキソニウム誘導 体に関するものである。この種のプロアントシアニジンは植物全体、樹皮、葉、 根またはラテックスから単離することができる。好ましい態様では、クロトン・ レクレリ（Ｃｒｏｔｏｎ　Ｉｅｃｈｌｅｒｉ）と力ロフィラム・イノフィラムか らプロアントシアニジンが得られる。これらの新規プロアントシアニジンポリマ ーはＩＲ，ＵＶ−可視、および／または”ＣＮＭＲ分光分析により同定される。

−Ａのフーリエ変換赤外スペクトル。

−Ａの１Ｈ核磁気共鳴スペクトル。Ｄ２ｏ中にて４００ＭＨｚで測定。

殴３　１００ＭＨｚでのＤ２０中のプロアントシアニジンポリマーＡの幅広バン ドデカップリング１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル。

［ｉ１４　Ｄ２０中でｌｏＯＭＨｚにて得られた、力ロフィラム・イノフィラム から単離されたプロアントシアニジンポリマーＢの１３ＣＮＭＲスペクトル。

客」−カロフィラム・イノフィラムから単離されたプロアントシアニジンポリマ ーＢのフーリエ変換赤外スペクトル。

層重　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染したマウス（早期治療開始 ）における肺硬化に対するプロアントシアニジンポリマーＡとアマンタジン（Ａ ｍａｎｔａｄｉｎｅ）の効果。

１１７　インフルエンザＡＣＨＩＮＬ）ウィルスに感染したマウス（早期治療開 始）における肺ウイルス力価に対するプロアントシアニジンポリマーＡとアマン タジンの効果。

客」−インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染した雄マウス（早期治療開 始）における動脈の酸素飽和（ＳａＯ２）に対するプロアントシアニジンポリマ ーＡとアマンタジンの効果。

」　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染した雌マウス（早期治療開始 ）における動脈の酸素飽和（ＳａＯ２）に対するプロアントシアニジンポリマー Ａとアマンタジンの効果。

殴り　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染したマウス（晩期治療開始 ）における肺硬化に対するプロアントシアニジンポリマーＡとアマンタジンの効 果。

（晩期治療開始）における肺ウィルス力価に対するプロアントシアニジンポリマ ーＡの効果。

ｆｆ１１２　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染した雄マウス（晩期 治療開始）における動脈の酸素飽和（Ｓａｌｔ）に対するプロアントシアニジン ポリマーＡとアマンタジンの効果。

履貝　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染した雌マウス（晩期治療開 始）における動脈の酸素飽和（ＳａＯ２）に対するプロアントシアニジンポリマ ーＡとアマンタジンの効果。

即　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルスに感染したマウスにおける肺ウィル ス力価に対するリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）の効果。

Δ坪　インフルエンザＡ（ＨＩＮｊ）ウィルス感染マウスにおける肺硬化に対す る腹腔内リバビリン治療の効果。

履亜　インフルエンザＡ（ＨＩＮＩ）ウィルス感染マウスにおける血中５ａ０２ ％に対する腹腔内リバビリン治療の効果。

１１１７　マウスにおけるＨ５Ｖ−２膣障害に対するプロアントシアニジンポリ マーＡとガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）の効果。

辺り　５％局所処方物中のアシクロビル（ａｃｙｃ　ｌ　ｏｖ　ｉ　ｒ）および プランーボと比較した、５％および１０％局所処方物中のプロアントシアニジン ポリマーＡの効果。

本発明の抗ウイルス法において有用なプロアントシアニジンオリゴマーまたはポ リマーは、ロイコアントシアニジンのモノマー単位から構成される。ロイコアン トシアニジンは一般に単量体のフラボノイドであり、フラボノイドにはカテキン 、エビカテキン、ガロカテキン、ガロエピカテキン、フラバノール、フラボノー ル、フラバン−３，４−ジオール、ロイコンアニジン、アンドシアニジンが含ま れる。呼吸器ウィルス感染症の治療に有用なプロアントシアニジンポリマーは２ −３０個のフラボノイド単位を有し、２−１５個のフラボノイド単位をもつもの が好ましく、２−１１個のフラボノイド単位をもつものが最も好ましい。一般に インフルエンザウィルス、バラインフルエンザウィルス、パラミクソウィルス、 オルソミクソウィルス、またはヘルペスウィルスに関連した感染症を含むがこれ らに限定されないウィルス感染症の治療に有用なプロアントシアニジンポリマー は６〜３０個のフラボノイド単位を有し、６−１５個のフラボノイド単位をもつ ものが好ましく、６−１１個のフラボノイド単位をもつものが最も好ましいろい ろな数のフラボノイド単位をもつプロアントシアニジンポリマーが知られており 、例えばＷ、Ｌ、　Ｍａｔｔｉｃｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３．　ｐ、　１３０９−１３１１　（１９ ８４）；　Ｚ、　Ｃｚｏｃｈａｎｓｋａ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃ，Ｓ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、、　３７５　（１９７ ９）；　Ｗ、Ｔ、　Ｊｏｎｅｓ、　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１５．　ｐ、　１４０７−１４０９　（ １９７６）；　Ｂ、　Ｈａｓｌａｍ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｏ１ｙｐｈｅｎｏｌｓ、　ｐ、　７５　（１９８９）に報告され ている（これらの文献は全て参照によりここに引用するものとする）。これらの 文献に記載された範囲のフラボノイド単位を有するポリマーは本発明の方法にと って有用である。

（Ｆｉｌｉｃｅｓ）、球果植物類（Ｃｏｎｉｆｅｒａｅ）、単子葉植物および双 子葉植物を含むがこれらに限定されない、種々の植物から得られる（Ｊ、Ｂ、　 Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　ＴＨＢ　ＦＬＡＶＯＮＯＩＤＳ、　ＡＤＶＡＮＣＢＳ　Ｉ Ｎ　ＲＥ！５ＥＡＲＣＨ３ＩＮＣＥ　１９８０　（１９８８））。それらは木ま たは植物全体、樹皮、幹、根またはラテックスから得ることができる。

これらの植物原料は水および／または水混和性溶媒を使って抽出する。好適な溶 媒は１−３個の炭素原子を有するアルコールまたはアセトンである。水性抽出物 は直接使用するか、あるいは溶媒の除去後に使用する。溶媒を除去する場合は、 固体残留物を溶媒（好ましくは、低級アルコールまたはアセトン）に再溶解し、 不溶性の物質を除く。可溶性画分はゲル濾過（例えば、セファデックス）、逆相 カラムクロマトグラフィー（例えば、Ｃ−８）、またはＰＬ−ＧＥＬのようなゲ ル透過クロマトグラフィー（例えば、ジビニルベンゼン架橋ゲル）、もしくは膜 （例えば、アミコン膜）にかけ、移動相として水または水と水混和性溶媒を、場 合により緩衝液と共に、使用する。水混和性溶媒としては１−３個の炭素原子の アルコール、アセトンまたはアセトニトリルが好ましい。

本発明の有用なプロアントシアニジンポリマーは紫外線（ＵＶ）によって検出さ れた画分である。これらは約２００−３５０ｎｍの間に主要な最大ＵＶ吸収を有 し、一般に２００−２１０ｎｍと２７５−２８５ｎｍにピークがある。

本発明の土台の一部を構成する新規なプロアントシアニジンポリマー組成物に関 して、かかるポリマーは上記の抽出法を用いてクロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）の木ま たはカロフィラム（Ｃａｌｏｐｈｙｌ　ｌｕｍ）種から得られる。可溶性画分を ゲル濾過、逆相カラムクロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィーまたは 膜にかける。移動相としては水または水と水混和性溶媒を、場合により緩衝液と 共に、使用する。ポリマーを含む関連画分は約２００−３５０ｎｍの範囲のＵＶ により検出される。

本発明の好ましい態様によれば、新規なプロアントシアニジンポリマーを次のよ うにして調製できる：クロトンの木（例えば、Ｃｒａｙｏｎ　１ｅｃｈｌｅｒｉ 　）またはＣａ１ｏｐｈｙｌｌｕｎ＋　ｉｎｏｐｈｙｌｕｍから得られたラテッ クスを直接使用するか、あるいは水を除去して濃縮する（例えば、凍結乾燥する ）。これを水、約１−３個の炭素原子のアルコール、またはアセトンで抽出し、 水性の可溶性画分を得る。

凍結乾燥した、あるいは他の方法で濃縮した原料の水性可溶性画分を酢酸エチル ／水の溶液により分配し、そして移動相として水および／または水とアルコール および／または水とアセトンを、場合により緩衝液と共に、使用して、ゲル濾過 （例えば、セファデックス）にかける。発色バンドを含む両分を紫外線（ｕ　ｖ ）により検出しくλｍａｘ　約２００−３５０ｎｍ）、集めて濃縮し、必要なら ば再度ゲル濾過にかけて、プロアントシアニジンポリマーを得る。別法として、 上記の水性可溶性画分を凍結乾燥するか、濃縮するか、または直接使用し、移動 相として水および／または水とアルコールおよび／または水とアセトンを用いて 逆相カラムクロマトグラフィー（ＲＰ　ＨＰＬＣ）にかける。ｕｖ（λｍａＸ　 約２００−３５０ｎｍ）により検出された発色バンドを含む画分を集めて濃縮し 、必要ならば再度ＲＰ　ＨＰＬＣにかけて、プロアンドシアニジンポリマーを得 る。さらに、別の方法とじては、上記の水性可溶性画分を凍結乾燥するか、濃縮 するか、または移動相として水および／または水とアルコールおよび／または水 とアセトニトリルを、場合により緩衝液と共に、使用して、ゲル透過クロマトグ ラフィー（Ｇ　Ｐ　Ｃ）に直接かける。λｍａｘ約１ｌ９５−３５０ｎでＵＶに より検出された発色バンドを含む画分を集めて濃縮し、必要ならば再度ＧＰＣに かけて、プロアントシアニジンポリマーを得る。下記の第６．１．−６．３．節 に記載した実施例を参照されたい。

第６．２１節で述べるように、Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｓ　ＰＬ−ｇｅｔ　５ｍ 　５００　Ａ。

３００　ｘ　７．５　ｍｍおよびＴＨＦ−水（９５：５ｖ／ｖ）系を用いてＰｅ ｒｋｉｎ　ＥＩｎ＋ｅｒ　ＬＣ−６２０で１ｍｌ／分の流速でり０？トゲラフイ ーにかけたとき、プロアントシアニジンＡは７．２分の保持時間を有し、プロア ントシアニジンＢは６，５分の保持時間を有する。

プロアントシアニジンポリマーの典型的なスペクトルを図１および図５に示しで ある。

５、２．２．　有用なプロアントシアニジンポリマーおよびそれらの誘導体の合 成 ロイコアントシアニジンは温和なアルカリ性または酸性溶液中で縮合してプロア ントシアニジンを形成し得ることが知られている。例えば、Ｌ、Ｙ、　Ｆｏｏ　 ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、　Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、。

Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　８５　（１９８４）では、フラバノール単量体 から三量体を合成することができた。Ｊ、Ａ、　Ｄｅｌｃｏｕｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　１．、１７１１　（１９８３）には、温和な低ｐ Ｈ条件下で過剰量の（＋）−力チキンを用いると縮合反応が起こり、高級の、主 に直鎖の［４，８）−結合オリゴマーが形成されたと教示されている。とりわけ 、フラボノイド類似体の二量体、三量体および四量体が合成され、ＮＭＲスペク トルにより同定された。このような縮合反応を用いると、最高３０個のフラボノ イド単位をもつプロアントシアニジンポリマーを合成することができ、本発明方 法において使用することができる。上記の合成法に代わるものとして、有用なプ ロアンドシアニジンポリマーを製造するために酵素的合成法も使用される。ここ に例示される本発明の新規なプロアントシアニジンポリマー組成物もこのような 反応によって合成することができる。

プロアントシアニジンポリマーのエステルは、標準的なアシル化法により、例え ば塩基の存在下でのポリマーと酸塩化物または酸無水物との反応により、製造し 得る。ピリジン中で酸無水物と反応させる製造法は特に有用であり、この方法は Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　ｅｔａｌ、、　ＪＣ３，１３８７（１９７２）；　Ｆｌｅ ｔｃｈｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＣ５，１６２８（１９７７）およびＨｅｍｉ ｎｇｗａｙ、　ＪＣ５，１２９９（１９８２）によって幾つかの他の低分子量フ ラボノイドのアシル化に利用された。

エーテルは標準的なエーテル化法により、例えば塩基中でのポリマーとアルキル ハライドまたはアルキルトシレートとの反応により、製造し得る。メチルエーテ ルはジアゾメタンの使用により簡単に製造することができ、この方法はＴｈｏｍ ｐｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＣ３゜１３８７　（１９７２）；　Ｈｅｍｉｎ ｇｗａｙ、　ＪＣ３，１２９９（１９８２）によって幾つかの他の低分子量フラ ボノイドのエーテル化に利用された。

オキソニウム塩（ピリリウム塩やアントシアニジンとも呼ばれる）は、いわゆる Ｂａｔｅ−３ｍｉｔｈ反応（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ。

１９５３、３７７）により、水性またはアルコール性酸と共に温めることにより 製造し得る（Ｔｈｏｍｐｓａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＣ５，１３８７（１９７ ２）およびＨａｓｌａｍ、　ＰＬＡＮＴ　ＰＯＬＹＰＨＥＮＯＬＳ、１９８９． 　ｐ、　２８．　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｐｒｅｓｓ中で引用された文献も参照さ れた（す。この反応では鉄が有利に触媒作用を果たす（Ｐｏｒｔｅｒ　ｅｔ　ａ ｔ、、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ、　２５．２２３本発明により製造さ れた新規なプロアントレアニシンポリマーはメタノールと水に溶ける。これらの ポリマーは少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの程度で水や水溶液（アルコール溶液を 含む）に可溶である。

プロアントシアニジンポリマーは、分子量や他の化学的・物理的性質を調べるた めに多くの方法で分析された。プロアントシアニジンポリマーの種々の立体異性 体が得られており、これらも本発明の範囲内に含まれる。

カラムクロマトグラフィーを用いて、平均分子量が約７００ダルトンから約３０ ００ダルトン（それぞれ２−３から９−１１個の平均フラボノイド単位に対応す る）の間で変化する新規なプロアントシアニジンポリマーを含む水溶性画分を単 離した。

”Ｃ−ＮＭＲ分光分析法によると、プロアンドシアニジンポリマーはフラボノイ ド成分を含み、個々のフラボノイド環単位が様々な立体化学をもつことがわかる 。

ＵＶ−可視分光分析法は、幾つかのプロアントシアニジンポリマー内に１以上の フラビリウム成分が存在しうることと一致している。

プロアントシアニジンポリマーＡおよびプロアントシアニジンポリマーＢの特性 決定は、第６．３．および６．５８節の実施例でさらに論じることにする。これ らのポリマーの機能的誘導体も製造され、有用なプロアントシアニジンポリマー の製造用中間体として使用プロアントシアニジンポリマーは広範なウィルスに対 して１ｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで活性であることが見いだされ、かか るウィルスにより誘発される疾患の予防・治療用途に有利に使用することができ る。

プロアントシアニジンポリマーは、バラミクソウィルス（例えば、ＲＳウィルス ）、オルソミクソウィルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ）、ヘルペ スウィルス（例えば、ヘルペス・シンプレックスウィルス）を含むがこれらに限 定されないウィルスにより誘発される疾患、あるいはこれらのウィルス感染症に より悪化する疾患を予防および／または治療するために、単独でもしくは他の抗 ウィルス剤や抗菌剤との組合せて、使用されよう。

プロアントシアニジンポリマーはウィルス感染症の治療において以下のような、 しかしこれらに限られない利点を有する：ｌ）広範な抗ウィルス活性； ２）極めて低い毒性； ３）催奇形性がない；および ４）全身および局所の両方に適用できる。

５．５．　投与経路 本発明のプロアントシアニジンポリマーは、いろいろな経路で、例えば経口的に 、注射（静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内を含むがこれらに限定されない）により 、鼻、鼻咽頭、耳などへの局所適用により、あるいは気道へのエーロゾル投与に よる吸入などによって、予防および治療のために投与し得る。

本発明に従ってウィルスに対して使用する場合、プロアントシアニジンポリマー の効果的な投与量範囲は、経口投与（Ｐ、　Ｏ。

）の場合が約５．　０＝約３０ｍｇ／ｋｇで、腹腔内投与（１，Ｐ。

）の場合が約０．１−約１０ｍｇ／ｋｇで、エーロゾル投与の場合が約５−約３ ０ｍｇ／ｋｇ／日である。局所投与の場合は、適当なビヒクル中約５−約１５％ の濃度のプロアントシアニジンポリマーを適用する。

ヒトを含む温血動物に投与する場合は、プロアントシアニジンを水、水溶液また は生理学的に許容される担体もしくはビヒクルと組み合わせることができる。

以下の実施例は本発明を例示するためのものであって、いかなる場合も本発明の 範囲を制限するものではない。

（本頁以下余白） ６、実施例 一連の実験において、新規プロアントシアニジンポリマーを以下のようにして得 た。

ペルーのイキトスから１００キロメーターの地点にあるナネイ用流域にあるサン バブ口・デ・クヤナの村の近くで、クロトン・レクレリの木のラテックスを採り 、木を切り倒した。ラテックスは木に溝をつけることによって２４時間かけて採 集した。

クロトン・レクレリから得たラテックス（１リツトル）を、ラテン２２１部に対 してイソプロパツール３部（３リツトル）の比となるようイソプロパツールで希 釈し、１０℃で１５時間放置した。得られるイソプロパツール希釈したラテック スを遠心し、デカンテーションによって不溶性物質を除去し、母液（３，７リツ トル）を得た。母液を３３℃でロータリーエバポレーターで濃縮、乾燥し、深い 赤茶色粉末２４０ｇを得た。この濃縮物質（９８０ｇ）を移動相として水（２０ リツトル）を用いるセファデックスＣＭ−５０のゲル濾過に付した。赤い色素を 含む初期の溶出分画をλ２００−３５０ｎｍで検出するか、または透明カラムか ら溶出する赤いバンドを目で検出した。プロアントシアニジンポリマーを単離す るには、初期溶出分画を回収して、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび／ または以下に記載するＨＰＬＣに付した。

ＨＰＬＣは５μｍの濃縮サンプルを、ＩＣ−２００自動サンプラー、ＬＣ６００ ポンプおよびＬＣ−２３５ダイオードアレー検出器を備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ　ＬＣＡｎａｌｙｓｔ液体クロマトグラフシステムに注入して、Ｗａｔｅ ｒｓ　Ｕｌｔｒａｈｙｄｏｇｅｌ　５００　ＧＰＣカラムを用いて、周囲温度中 、Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　ＪａｃｋｓｏｎのＨＰＬＣグレードの水を０．８ｍ ｌ／分で流し、λ２８０および１９５ｎｍで検出することによって実施した。プ ロアントシアニジンポリマーはサンプルの濃度、カラム状態および温度により４ ．６−５．６分の保持時間を有することが明らかとなった。

セファデックスＣＭ−５０から単離した分画を含む赤色色素を集めて、水、１０ ％アセトン／水、２０％アセトン／水、そして最終的には４０％アセトン／水を 段階的グラジェントにして用いるＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＨＷ−４Ｏ８のゲル濾過 りＣ７７トグラフイー（２，５リツトル）に付した。λｍａｘ３４０　ｎｍでの 紫外−可視光線によって検出された後期溶出の赤色分画を集めて、上記ＨＰＬＣ 上で濃縮してさらに精製した。ＨＰＬＣから単離して集めた分画を再度Ｔｏｙｏ ｐｅａｒｌ　ＨＷ−４Ｏ３のゲル濾過クロマトグラフィーに付し、プロアンドシ アニジンポリマーＡと命名されるプロアントシアニジンポリマーを得た。

別のシリーズの実験では、以下のようにして新規プロアントシアニジンポリマー を得た。

クロトン・レクレリからの冷たい粗ラテックス４リットル（または水に含浸した 全植物体、樹皮または根）をイソプロパツール１２リツトルで希釈し、撹拌して １５時間５℃に貯蔵した。残渣を濾過により除去して、溶液を減圧濃縮して乾燥 し、固形物約９７０ｇを得た。

この固形物を水６リツトルとｎ−ブタノール３．６リツトル中に撹拌しながら加 えた。水相を分離して、濃縮乾固し７００ｇの物質を得、これを撹拌しながらメ タノール２リツトル中に加え、次いで酢酸エチル１２リツトルを加えた。溶液を １５時間、１５℃に保ち、固形物を濾過により除去して捨てた。溶液を濃縮乾固 し、約３９０ｇの粗プロアントシアニジンポリマーＡを得た。

プロアンドシアニジンポリマーＡ分画を以下に記載するように、陽イオン交換、 吸着およびサイズ排除クロマトグラフィーによって濃縮した：４５０−６００ｇ の粗プロアントシアニジンポリマーＡを脱イオン水を溶離剤とするＣＭ−セファ デックスＣ−５０プレカラムに通した。橙色と暗赤色の分画を回収して、次いで ４６０ｎｍにセットしたＵＶ検出器を備えた別のセファデックスＣ−５０カラム 上で脱イオン水を用いてクロマトグラフィーに付し、１−２リツトルの分画を回 収した。最初のピンクのバンドを捨てて、その後の流出液を広い赤茶色の幅広バ ンドが溶出されるまでセファデックスＧ−５０を含むカラムに通した。溶出物が 無色になるまで１５％水性アセトンをＧ−５０カラムに通した。溶出分画を第６ ．２節に記載するＨＰＬＣにより試験し、プロアントシアニジンポリマーＡを含 む分画を集めて蒸発乾固し、約２１０ｇのプロアントシアニジンポリマーＡを得 た。

６．２　プロアントシアニジンポリマーへの精製上記第６．　１節に記載の方法 で得た粗プロアンドシアニジンポリマーＡ約１５０ｇを２０％水性アセトン３０ ０ｒｒ＋Ｉ中に溶解し、混合型ゲル透過／吸着カラム（Ｔｏｙｏｐｅａ　ｒ　Ｉ 　ＨＷ４０Ｓ、粒子サイズ４０μｍの球状メチルメタクリレートポリマー）でク ロマトグラフィーに付した。１６リツトルを回収して、次いて溶出溶媒を４０％ 水性アセトンに変えてさらに８リットルを回収し、その後６０％水性アセトンで 溶出した。ＨＰＬＣによって示したプロアントシアニジンポリマーＡ分画（第６ ．３節参照）を集めて、減圧で溶媒を除去し、固形物的５７ｇを得た。

最終的精製は吸着クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーによって 以下のように行った：上記固形物５０−７５ｇを９０％エタノール中に溶解して 、セファデックスＬＨ−２０（ヒドロキシプロピル基がエーテル結合によってデ キストラン鎖のグルコース単位に結合している架橋デキストランゲル）を含むカ ラム上にのせた。９０％水性エタノール１０リツトル、次いで２０％水性アセト ン１５リツトル、４０％水性アセトン５リツトル、５０％水性アセトン５リツト ル、次いで６０％水性アセトン５リツトルで溶出した。２リツトルずつの分画を 回収し、ＨＰＬＣでアッセイした。プロアンドシアニジンポリマーＡを含む分画 を集めて、３５℃で蒸発乾固し、３５ｇの精製プロアントシアニジンポリマーＡ を得た。

ＨＰＬＣは、３０ｃｍの非水性の移動相用ゲル透過カラムを用い、固定相にはＰ ｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＰＬ−Ｇｅｌ　５ｍ　５００人（ジ ビニルベンゼン−ポリスチレンポリマー、５μ粒子、孔サイズ５００人）を用い た。ＨＰＬＣシステムはＵＶスペクトルを発生するダイオードアレー検出器を備 えており、検出器は２８０ｎｍにセットした。

サンプルを９５％水性Ｔ）ＩＦに溶解し、展開溶媒にもこれを用いた。１ｍｌ／ 分の流速でプロアントシアニジンポリマーＡの最大ピークは保持時間が７．２± ０．５分であり、プロアントシアニジンポリマーＢの保持時間は６．５±０．５ 分であった。これはプロアントシアニジンポリマーＢがプロアントシアニジンポ リマーＡよりも大きい分子量を有することを示唆する。

第６．１節で記載の方法により得た本発明のプロアントシアニジンポリマーＡは 、赤外スペクトルで３５５０−２５００に幅広の強いピークを示し、その他のピ ークは１６１２．１４４９．１３４８．１２０２．１１４４、＋１０７．１０６ ８および１０２７ｃｍ−’であった。図１参照。

ＪＨＮＭＲスペクトル（Ｄ２０中、４００ＭＨｚ、２４℃）では、δ７．　ｆ、 ６．９．６．　Ｉ、４．７および２．８ｐｐｍに非常に幅広のピークを示した。

図２参照。

Ｈ２Ｏ中のＵＶ−可視スペクトルでは、λ２０２．２３５（ショルダー）、２７ ５．３０５（ショルダー）、４６０に幅広のピークを示し、６００　ｎｍ以上ま でダラダラと吸収があった。本発明のポリマーのＵＶデータはその他の既知のプ ロアントシアニジンと極めてよく似ているが、可視のデータははっきりと異なる 。

既知のプロアントシアニジンモノマーおよびポリマーは無色で（λ２０５．２４ ０．２７５ｎｍ）、可視領域に全く吸収を示さないが、本発明で単離された新規 プロアントシアニジンポリマーＡのいくつかは着色しており、４６０ｎｍに可視 吸収をもつ。プロアンドシアニジンポリマーの色はプロアントシアニジンポリマ ー中に１以上のフラビリウム（ｆ　Ｉ　ａｖｙ　１　ｉ　ｕｍ）成分の存在を示 唆する。これは、フラビリウム成分を含む近縁のモノマー性アントシアニンにつ いて報告されている可視スペクトルデータと一致する（λ４６０−５６０ｎｍ） 。

Ｄ２０中、１００ＭＨｚでプロアンドシアニジンポリマーの１３ＣＮＭＲスペク トルをとった。この実験では幅広バンドがデカップリングされた。図３に示すよ うに、Ｄ、０中での１３ＣＮＭＲスペクトルは、δ１５５（Ｃ−５、Ｃ−７、Ｃ −９）、１４５　（Ｃ−３’　、Ｃ−５’　）’　、１４３　（Ｃ−３°、Ｃ− ４’　）、１３０　（Ｃ−１°、Ｃ’−１°°、Ｃ−４”）、１２８　（Ｃ−１ ’　）、１２１　（Ｃ−６）、１１６　（Ｃ−２°、Ｃ−５’　）、１０９（Ｃ −８、Ｃ−２′、（、−６°’）、９７　（Ｃ−６）、８２　（Ｃ−２）、７６ 　（Ｃ−２）、７３　（Ｃ−３）および３８（Ｃ−４）ｐｐｍ（’　はプロデル フィニジンＢ環のもの）に非常に幅広のピークを示した。１３ＣＮＭＲスペクト ルデータは本発明の新規抗ウイルス性プロアンドシアニジンポリマーと既知のプ ロアントシアニジンポリマーとの構造的相違のキーポイントを示唆する。

最も顕著な相違点は文献公知のその他のプロアントシアニジンポリマーの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルと比較して、本発明のプロアントシアニジンポリマーにはＩ０ ９ｐｐｍの領域に実質的により大きなピークがあることである［Ｃｚｏｃｈｅｎ ｓｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｊ、Ｃ、Ｓ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍ、 、　ｐ、３７５−７７；　Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｍａｂｒｙ 、　Ｔ、Ｊ。

編集、Ｔｈｅ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　ＨａＩＩ、　ＮＹ、　１９８２．　ｐ、５１ −１３２　（本明細書中に参照として包含される）に記載のスペクトルと比較さ れたい］。ポリマーの１３ＣＮＭＲスペクトルデータはポリマーがプロアントシ アニジンクラスであることを示唆する。特に、単離したプロアントシアニジンポ リマーの１３ＣＮＭＲのケミカルシフトのデータ（Ｃ−６“　＝１３２ｐｐｍＳ Ｃ−２’　＝Ｉ１５ｐｐｍ、Ｃ−３°およびＣ−４’　＝１４５ｐｐｍ、Ｃ−５ ’　＝１．１６ｐｐｍ、Ｃ−６’　＝Ｉ　Ｏ７ｐｐｍ、Ｃ−３’およびＣ−５’ 　＝１４６ｐｐｍ、　Ｃ−４’　＝１３３ｐｐｍ）は、個々のフラボノールＣ環 単位が、２．３−１−ランスおよび３．４−１−ランス［（＋）−カテキンと類 似；ＣＣ−２＝８３ｐｐ、ＣＣ−３＝７３ｐｐ、ＣＣ−４＝３８ｐｐ］並びに２ ．３−シス−３，４−１−ランス［（−）−エピカテキンと類似；ＣＣ−２＝７ ７ｐｐ、ＣＣ−３＝７３ｐｐ、ＣＣ−４＝７３ｐｐ］の両方の立体化学を有する プロシアニジンＢ環分子からなるポリマーと一致する。今回の実験データは、プ ロアントシアニジンポリマーＡがカテキン、エピカテキン、ガロカテキンおよび ガロエピカテキンからなることを示唆する。ＨＰＬＣデータは平均のフラボノイ ド単位数が約７であることを示唆する。ＨＰＬＣデータはまた、フラボノイド単 位の数が２から１１の範囲であることを示唆している。

プロアントシアニジンポリマーＡはメタノール、水および水溶液に可溶である。

プロアントシアニジンポリマーＡは少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で水に可 溶である。このポリマーは生理食塩水およびその他の塩溶液にはより低い溶解性 をもつ。マススペクトル分析はプロアントシアニジンポリマーＡが約２，１００ ダルトンの平均分子量をもつことを示唆する。

第６．１節に記載した方法と同様の方法によって、力ロフィラム・イノフィラム の全含浸植物体、樹皮、葉、根またはラテックスから本発明による新規なプロア ントシアニジンポリマーを単離することができる。好ましい方法によると、好ま しい抽出溶媒として水を用いる以外は、第６．　１節記載の方法によってプロア ントシアニジンポリマーが得られる。

一連の実験では、プロアントシアニジンポリマーＢと命名される新規プロアント シアニジンポリマーが力ロフィラム・イノフィラムのラテックスから得られた。

カロフィラム・イノフィラムからのラテックス２，８４９ｇをイソプロパツール と水のｌ：１混合物１２．４リットルと混合し、撹拌して３６時間室温に保存し た。濾過により残渣を除去し、溶液を減圧下で蒸発乾固し、固形物１３３．５ｇ を得た。

この固形物をメタノール３０ｇに撹拌しながら加えた。次いで溶液を固形物から 濾過し去り、水と酢酸エチルのｌ：１混合物を加えた。水分画を分離し、ｎ−ブ チルアルコールを加えた。水分画をアルコール分画から分離し、減圧濃縮して乾 燥し、約１０゜４ｇの粗プロアントシアニジンポリマーＢを得た。

粗プロアントシアニジンポリマーＢをＣＭ−５０セフアデツクスＣＣカラムに通 し、溶出溶媒として脱イオン水を用いた。赤色バンドを回収して、７０％水性エ タノール溶液次いで２０％、５０％および７０％水性アセトン溶液で溶出するＬ Ｈ−２０ＣＣカラムで分画化し、プロアンドシアニジンポリマーＢを得た。低濃 度ではプロアンドシアニジンポリマーＢの溶液は本質的には無色である。高濃度 ではプロアンドシアニジンポリマーＢの溶液は黄褐色である。

プロアントシアニジンポリマーＢの１３ＣＮＭＲスペクトル（図４）により、こ のポリマーがプロアントシアニジンポリマーのクラスに属し、主としてカテキン およびエピカテキンのモノマーフラボノイド単位からなることを確認した。ゲル 透過クロマトグラフィー（Ｇ　Ｐ　Ｃ）は、プロアントシアニジンポリマーＢが プロアントシアニジンポリマーＡよりも大きい分子量を有することを示唆する。

ＧＰＣデータと一致して、プロアントシアニジンポリマーＢのＨＰＬＣ−ＧＰＣ 保持時間は同じ条件下ではプロアントシアニジンポリマーＡよりも短く、これも プロアンドシアニジンポリマーＢの分子サイズが大きいことを示唆する。ＨＰＬ Ｃは、ポリマーＢが平均約３，０００ダルトンの分子量をもつことを示唆し、こ れは平均で約１０のフラボノイド単位数と対応する。ＨＰＬＣデータはまた、フ ラボノイド単位数が５から１６で変化することを示唆する。マススペクトル分析 はプロアントシアニジンポリマーＡが平均２．１００ダルトンの分子量であるこ とを示唆する。

プロアントシアニジンポリマーＢのフーリエ変換赤外スペクトルは、プロアント シアニジンポリマーＡと極めてよく似ている（図５および図１参照）。

同様に、プロアントシアニジンポリマーＢのＵＶ−可視スペクトルは、４６０　 ｎｍのピークを欠く以外はプロアントシアニジンポリマーＡのそれとよく似てい る。

一連の実験では、以下のウィルスに対するプロアントシアニジンポリマーＡの抗 ウィルス活性を試験した：ＲＳウィルスサブタイプ変異体であるＡ２−Ｔｒａｃ ｅｙ、Ａ−Ｌｏｎｇ、Ｂ−４６７９１、Ｂ−４７０６３およびＢ−１８５３７， バラインフルエンザウィルス、タイプ３　（ＰＩＶ−３）；アデノウィルス、タ イプ５および７：インフルエンザ、Ａ−Ｔａ　ｉｗａｎ　（ＨＩＮＩ）；Ａ−Ｌ ｅｎｉｎｇｒａｄ　（Ｈ３Ｎ２）；Ａ−Ｊａｐａｎ；Ａ−Ｐｏｒｔ　Ｃｈａｌｍ ｂｅｒｓ；Ａ−ＮＷＳ３３；Ｂ−ＵＳＳＲ；　Ｂ−Ｔａｍａ　；　Ｂ−ＲＦ　； ハシ力ウイルス、およびＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株。

ＡＴＣＣから得たハシ力ウイルス以外のすべてのウィルスはテキサス、ヒユース トンにあるＢａｙｌｏｒ　ＣｏＣｏ１１ｅ　。

ｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅのインフルエンザリサーチセンターから得た。比較のため 、リバビリンをスクリーニングアッセイに加えた抗ウィルス活性のアッセイには 次の方法を用いた。アッセイは９６ウエルの組織培養プレートで実施した。すべ て希釈液および組織培養懸濁液は、抗生物質ペニシリンとストレプトマイシンお よび２％ウシ胎児血清を含む最小必須培地（２％Ｆ　ＣＳ−ＭＥＭ）で調製した 。試験化合物（０，０５ｍ１）を、準集密的細胞単層のＨＥｐ２細胞（およそ３ ｘｌＯ”細胞）を含む試験プレートのウェルに四重試験で加えた。通常はＩｍｇ ／ｍｌの最終濃度で始める連続２倍希釈により化合物を希釈した。０．０５ｍ１ 中に適当な試験ウィルスを約１００の５０％組織組織感染価（ＴＣＩＤ、。）で 加えた。組織対照ウェルは、ウィルスまたは抗ウィルス化合物を含まない培地を 含み、そして抗ウイルス対照ウェルはウィルスなしの抗ウィルス化合物を含んで いた。リバビリンが抗ウィルス活性を示さないアデノウィルスを除いて、ポジテ ィブな抗ウイルス対照として各アッセイにリバビリンを加えた。各試験ウィルス のバック滴定も各アッセイに含めた。すべてのプレートを５％ＣＯ２インキュベ ーター中、３７℃でインキュベートした。

ウィルス対照ウェルを毎日観察した。これらのウェルが８０−１００％の細胞変 性効果（ＣＰ　Ｅ）を示したときに、すべてのウェルのＣＰＥを観察した。目視 および顕微鏡でＣＰＥを観察するのに加えて、合胞体形成の阻害をＲ３Ｖに対す る活性を確認するために用いた。

各抗ウイルスアッセイにおいて、５０％最小阻止濃度（ＥＤｓ。

）を測定した。ＥＤ、。は、ウィルス対照ウェルと比較してＣＰＥを５０％阻止 するウェル中で試験した化合物の５０％阻止濃度を決定することにより計算した 。ＥＤｉ、値の実際の計算はコンピュータープログラム”マイクロコンピュータ −による用量−効果分析”　（Ｃｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．　Ａｄｖ、 　Ｅｎｚ、　Ｒｅｇｕｌ、、　２２：２７−５５）を用いて行った。

迅速な成長を促すために低密度で接種した非感染組織培養細胞の成長に及ぼす各 化合物の効果も評価した。このアッセイから５０％最小毒性濃度（ＩＤ、ｏ）を 決定した。細胞毒性アッセイまたは細胞成長の阻止は以下の手法による。試験化 合物（０，１ｍｌ／ウェル）を連続的に２倍希釈した。適当なウェルに０．１ｍ ｌのヒトＨｅＬａ、Ａ３４９またはＨＥｐ２細胞、Ｏ，１ｍｌのマウス上９２９ 細胞、０．１ｍｌのサルＶｅｒｏ細胞、または０゜１ｍｌのイヌＭＤＣＫ細胞を 加えた。各ウェルに約３ＸｌＯ”個の細胞を加えた。対照ウェルは抗ウィルス化 合物を含まない培地中に、各種細胞濃度（例えば３ＸｌＯ’細胞、この数の１＝ ２、ｌ：４、ｌ：８およびｌ：１６希釈）を含むウェルからなる。特定化合物の ためにどのような賦形剤を使用する場合にも（例えば１０％　ＤＭＳＯ１５０％ メタノール）、連続的希釈からなる賦形剤対照を各アッセイに二重試験で含めた 。すべてのプレートを５％　ＣＯ２インキユベーター中、３７℃でインキュベー トした。細胞を含むが試験化合物を含まない対照ウェルが集密に達した後、すべ てのウェルに３−４４．５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェ ニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）を加えた。３時間後に、各ウェルに生じ た沈殿物を溶かすために各ウェルに酸アルコール（イソプロピルアルコール中、 ０．１ｍｌの０．４Ｎ　ＨＣＩ）を加えた。プレートリーダー（ＵＶ　ＭＡＸ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）でプレートを読んで各ウェルの吸光度を 測定した。吸光度を５０％減少させる最後のウェル中の抗ウィルス化合物の中央 濃度を決定して’ＩＤ５ｏＪと命名した。アッセイしたすべてのウェルの細胞成 長の阻止を顕微鏡で観察した。得られた結果を表１に示す。

（本頁以下余白） プロアントシアニジンポリマーＡによる抗ウィルス活性のｉｎ　ｖｉｔｒｏスク リーニングの結果ＥＤヶ（μｑ／ｍｌ） 試験１ 試験２ 試験３ 表１の最初の試験において、Ｒ３Ｖに対するプロアントシアニジンポリマーＡの ＥＤｓｏは８．５μｇ　／　ｍ　Ｉであると測定された。この活性はＲ３Ｖに対 して４．０μｇ／ｍｌの測定ＥＤ、。をもつりバビリンとよく匹敵するものであ る。プロアントシアニジンポリマーＡのＩＤ５Ｏ（細胞毒性指数）は９４μｇ／ ｍｌであった。表１の第２の試験では、Ｒ８Ｖに対するプロアントシアニジンポ リマーＡのＥＤ５．は１７．２μｇ（リバビリンは２４．２μｇ／ｍ１）であり 、ＩＤ、、は２５０μｇ／ｍｌであった。表１の第３の試験では、プロアントシ アニジンポリマーＡのＥＤ、。は１２μｇ／ｍ１で、ＩＤ、、は２５０μｇ／ｍ ｌよりも高かった。

各アッセイにおけるリバビリンと比較したプロアントシアニジンポリマーＡの抗 ウィルス活性の結果は、Ｉ　Ｄ　ｓｏ／　Ｅ　Ｄ　、。の比率として定義される 薬剤選択指数（Ｓ　Ｉ）を計算することにより決定した。Ｒ３Ｖに対するプロア ントレアニシンポリマーＡの選択指数は３つの試験において１１　１４．５およ び２１であった。

ウィルス評価（ＶＲ）は各化合物濃度で治療、感染した単層に与えられたＣＰＥ 値（ＣＰＥなしは０；１００％ＣＰＥは４）の合計を平均することにより算出し た。この平均を、同じ数のウィルス対照ウェルにおけるＣＰＥ値の合計の平均か ら引く。さらに肉眼で観察したすべての細胞毒性を反映するように調整を行った 。ＶＲ値は以下のように定めた：完全に抗ウィルス活性のときはＶＲが１以上； 中程度から疑わしい活性のときはＶＲが０．５−〇、９；やや活性のときはＶＲ が０．１−０．５゜やや活性というのは化合物自体の細胞毒性または細胞変性効 果によるものである可能性がある。Ｒ３Ｖに対するプロアントシアニジンポリマ ーＡのＶＲは１．５であり、これはインビトロアッセイにおける完全な抗ウィル ス活性を示す。また、３つの試験すべてにおいてプロアントシアニジンポリマー Ａはバラインフルエンザ及びインフルエンザタイルスに対して実質的な抗ウィル ス活性を示した。

別の一連の試験において、Ｒ３Ｖ、タイプＡおよびＢ、インフルエンザタイプＡ 　（Ｆ　１　ｕ−Ａ）およびＢ（Ｆｌｕ−Ｂ）、およびパラインフルエンザタイ プ１　（ＰＩＶ−１）および３（ＰＩＶ−３）に対するポリマーＡの抗ウィルス 活性を試験した。

使用した細胞系はヒトＨｅＬａ、Ａ５４９およびＨＥｐ−２細胞、マウスＬ９２ ９細胞、サルＶｅｒｏ細胞、イヌＭＤＣＫ細胞であった。

細胞の生存率および成長に及ぼすプロアントシアニジンポリマーＡの効果をミト コンドリアの呼吸測定により判定し、５０％最小毒性濃度（ＩＤｓ。）として表 した。このアッセイでは、ＥＤ５０アッセイと同様に、９６ウエルのミクロタイ タープレート上で連続２倍希釈、四重試験でアッセイした。再び、迅速な成長を 促すためにウェル当たり３ＸＩＯ’個の低密度で細胞をウェルに接種した。賦形 剤（プロアントシアニジンポリマーＡの場合は水）の連続希釈物からなる賦形剤 対照を二重試験で各アッセイに含めた。培地のみ、および培地プラス薬剤からな るブランクも含めた。

コントロールウェルの細胞の先端濃度が集密に達するまで（通常３日）すべての プレートを５％　ＣＯＺ中、３７℃でインキュベートシた。各アッセイのすべて のウェルの細胞毒性を顕微鏡で観察した。次いで、すべてのウェルに０．０５ｍ １のＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェ ニルテトラゾリウムプロミド＞　（ＰＢＳ中、５ｍｇ／ｍｌ）を加え、インキュ ベーションを続けた。３時間後に、各ウェルに酸アルコール（イソプロピルアル コール中、０．０５ｍ１のＩＮ　ＨＣｌ）を加えた。プレートリーダー（ＵＶ　 ＭＡＸ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍで各ウェル の吸光度（０，Ｄ、）を測定した。薬剤処理したウェルの吸光度（薬剤ブランク の平均を引いたもの）の平均を対照ウェルの吸光度（ブランクの平均を引いたも の）の平均で割って１００を掛けることにより、薬剤の各濃度における細胞の生 存率（％）を計算した。

賦形剤の細胞生存率に対する効果を同様に計算した。プロアントシアニジンポリ マーＡの毒性の用量応答曲線を作成してＩＤ６゜を決定した。

抗ウィルス活性のアッセイには以下の方法を用いた。アッセイは９６ウエルの組 織培養プレートで行った。すべて希釈液および組織培養懸濁液は、抗生物質ペニ シリンとストレプトマイシンおよび２％ウシ胎児血清を含む最小必須培地（２％ ＦＣ３−ＭＥＭ）で調製した。試験化合物（０，０５ｍ１）を、準集密的細胞単 層のＨＥｐ２細胞（およそ３ＸＩＯ’細胞）を含む試験プレートのウェルに四重 試験で加えた。通常は１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で始める連続２倍希釈物を用いて 化合物を希釈した。０．０５ｍ１中に適当な試験ウィルスを約１００の５０％組 織組織感染投与量（Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｓ。）で加えた。組織対照ウェルは、ウィル スか抗ウィルス化合物なしの培地をふくみ、抗ウイルス対照ウェルは、ウィルス なしの抗ウィルス化合物を含んでいた。リバビリンが抗ウィルス活性を示さない アデノウィルスを除いて、ポジティブな抗ウイルスコントロールとして各アッセ イにリバビリンを加えた。各試験ウィルスのバック滴定も各アッセイに含めた。

すべてのプレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。

ウィルス対照ウェルを毎日観察した。これらのウェルが８０−１００％の細胞変 性効果（ＣＰ　Ｅ）を示したときに、すべてのウェルのＣＰＥを観察した。目視 および顕微鏡でＣＰＥを観察するのに加えて、合胞体形成の阻害をＲ３Ｖに対す る活性を確認するために用いた。

各抗ウイルスアッセイにおいて、５０％最小阻止濃度（ＥＤ、。

）を測定した。ＥＤｓｏは、ウィルス対照ウェルと比較してＣＰＥを５０％阻止 するウェル中で試験した化合物の５０％阻止濃度を決定することにより計算した 。ＥＤ、Ｄ値の実際の計算はコンピュータープログラム”マイクロコンピュータ −による膜量効果分析”　（Ｃｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ａｄｖ、 　Ｅｎｚ、　Ｒｅｇｕｌ、、　２２：２７−５５）を用いて行った。

次いでプロアントシアニジンポリマーＡの選択指数をＩＤ、。のＥＤＩ。に対す る比として計算した。

結果を表２−６に示す。この結果は、プロアントシアニジンポリマーＡがＲ３Ｖ −ＡおよびＢ、　ＰＩＶ−Ｉ　ＰＩＶ−３、ＦＬＵ−ＡおよびＦＬＵ−Ｂのイン ビトロでの成長阻害においてリバビリンと同等に効果的であることを示すもので ある。選択指数値はプロアントシアニジンポリマーＡの低い細胞毒性を示してい る（本頁以下余白） ０−９０ｍｇ／ｋｇの投与量を用いた。すべての動物を５日目に殺した。肺を除 去して経膣膜洗浄した。回収した液体をＨＥｐ２細胞を用いるミクロタイターア ッセイでＲ３Ｖ力価を評価した。

アッセイは９６ウエルの組織培養プレートで行った。すべての希釈物および組織 培養懸濁液は、抗生物質と５％ウシ胎児血清を含む最小必須培地（５％　ＦＣＳ −ＭＥＭ）中に調製した。準集密的細胞単層（およそ３Ｘ１０’細胞）を含む試 験プレートのウェルに肺洗浄液を四重試験で加えた。０００５ｍｌ中に適当な試 験ウィルスを約１００の５０％組織組織感染投与量（ＴＣＩＤ５゜）で加えた。

組織対照ウェルは、培地を含むが、ウィルスを含まないものであった。すべての プレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。ウィルス 対照ウェルを毎日観察した。これらのウェルが８０−１００％のＣＰＥを示した ときに、すべてのウェルのＣＰＥを観察した。目視および顕微鏡でＣＰＥを観察 するのに加えて、合胞体形成の阻害をＲ３Ｖに対する活性を確認するために用い た。肺Ｒ３Ｖ力価１０ｇ１゜は、Ｄｕｂｏｖｉら（１９８３，１９８４）に記載 の方法で計算した。結果を表７．８に示す。

表７に示すように、すべての試験において、プロアントシアニジンポリマーＡは 対照と比較としてＲ３Ｖ力価の用量依存減少を示した。これはプロアントシアニ ジンポリマーＡがインビボでＲ８■に対して有効な抗ウィルス活性を有すること を示すものである。表８に示すように、プロアントシアニジンポリマーＡとリバ ビリンとの抗ウイルス効果の直接比較（腹腔内投与）は、本発明のポリマー組成 物が、現在ＲＳＶ感染の治療に用いられている薬剤であるリバビリンよりも有意 に有効であることを示している。

第１日月にヒスピッドコツトンラットにＲ３Ｖ　Ａ２を経鼻的に接種し、第２． ３および４日目にプロアントシアニジンポリマーＡを１．０−１０．０ｍｇ／ｋ ｇ経口投与した。すべての動物を第５日月に殺し、肺組織を回収した。肺を除去 して経膣膜洗浄した。上記したＨＥｐ２細胞を用いるミクロタイターアッセイに よって回収した液体のＲ３Ｖ力価を評価した。結果を表９に示す表９に示すよう に、経口投与したプロアントシアニジンポリマーは対照と比較として１０ｍｇ／ ｋｇで有意にＲ３Ｖ力価を低くした。これはプロアントシアニジンポリマーの経 口投与がＲ３Ｖに対して有効な抗ウィルス活性を有し、かつリバビリンよりも活 性であることを示唆する。

（本頁以下余白） 表７ コツトンラットのＲＳＶ感染に対する プロアントシアニジンポリマーＡの効果（腹腔内投与）処置　肺　２ （Ｍｑ／に９）　力価。

対照　３．９８±０．１４　−−− （１９０５）　８０．１−死滅 試験２ 対照　４．３　±０．８　−−−− （２０，０００） 処置　肺　２ （Ｍｑ／ｋｑ）　力価。

試験３ 対照　３．９８±０．１４　−−−− （９，５４９） ３．０　４．００±０．０２　ｎ、ｓ。

（１ｏ、ｏｏｏ）　ｏｘ　死滅 試験４ 対照　５．２２±０．２７　−−−− （１６５，９５８） 対照　４．５±０．２　＋＋＋＋ （３１，６２２） ３０　４．０±０．３　０．０３ （１０，０００）　６８．４％　死滅 ９０　２．８　±Ｏ，：３　＜０．０００１（６３１）　９８％死滅 表８ コツトンラットのＲ３Ｖｇ染に対するブ０７ントシアニジンポリマーＡおよびリ バビリンの効果（腹腔的投与）ブＯアントシアニジンポリマー　（８９／に９） 対照　４．５±０．２　−＋＋ 、：締力価はＲＳＶ力価１０９．。／９　肺を表す（平均±標準偏差） 表９ コツトンラットのＲＳＶ感染に対する 経ロブロアントシアニジンポリマーＡの効果処置　肺　Ｐ （Ｍ９／に９）　力価。

試験１ 対照　４．４５±０．５０　−−− （２８，１８１） （８９１２）　６８．４％　死滅 試験２ 肺　Ｐ 力価。

さらに上記の方法で実施した別の一連の試験において、ポリマーＡのＲ３Ｖに対 するインビボ活性が確認された。

プロアンドシアニジンポリマーＡは、３日間の腹腔的投与により１．５２±０． ６２ｍｇ／ｋｇ、３日間の経口投与により３゜６土１．６６ｍｇ／ｋｇの平均Ｅ Ｄ、、値を示した。表１０を参照。比較として用いた抗ウィルス剤であるリバビ リンは、腹腔的投与および経口投与でそれぞれ４０±６、および＞９０ｍｇ／ｋ ｇのＥ　Ｄ　ｓ。を示した。経口投与によるｌ０ｍｇ／ｋｇの用量でプロアント シアニジンポリマーＡは肺のＲ５Ｖ力価を６８−９２％減少し、腹腔的投与では ２１−８０％減少した。リバビリン（４０ｍｇ／ｋｇ）は経口投与で肺力価を＞ ９０％減少し、腹腔的投与で５０％減少した。

（来貢以下余白） ７　表１０．　ヒスピッドコツトンラットのＲＳＶ感染に対するプロアントシア ニジンポリマーＡの効果ヒ　３口膣腔内投与　ＥＤ、（ｍｑ／ｋｑ）ぼ ン ζ フ　平均±Ｓ、　Ｅ、　Ｍ。

１コ１」！ら６２　４虹上ｓ、ｓ ｔ　３　日１ｉ口投与　！：Ｄ、（ｍｇ／ｋｇ）＝Ｆツし屡辷１邑−３譚り上≦ し工６一一一一一一−ととＬアフリカミドリザルの呼吸合胞体ウィルス感染にお けるプロアントシアニジンポリマーＡの効果を調べるために、インビボ試験も実 施した。

プロアントシアニジンポリマーＡは２５ｍｇアリコートに秤量し、使用時まで乾 燥粉末として冷凍保存した。グルコースの０゜５％溶液を調製し凍結した。プロ アントシアニジンポリマーＡの２５ｍｇサンプルを０．５％グルコース５０ｍ１ に毎日溶解し、得られる溶液を０．２２μｍの膜フィルターで濾過することによ り滅菌した。次いで０．５ｍｇ／ｍｌ溶液を０．　５％グルコースで１＝２およ びｌ：５の希釈を行い、それぞれ０．２５ｍｇ／ｍ１および０．１ｍｇ／ｍｌの 濃度の溶液を得た。

３匹ずつのサルの群にプロアントシアニジンポリマーＡを、体重１ｋｇ当たり１ ｍｌで静脈内注射することにより、０．５ｍｇ／　ｋ　ｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ またはｏ、ｉｍｇ／ｋｇを投与した。各サルへの薬剤注入の投与時間は約１分で あった。３匹のサルからなるコントロール群には０．　５％グルコース溶液１ｍ ｌを投与した。

プロアントシアニジンポリマーＡで最初の処置をした４時間後に、各サルに貯蔵 呼吸合胞体ウィルス（１０−２希釈液）を感染させた。貯蔵ウィルスの力価はｌ Ｘｌ０’　ＴＣＩＤＳＯ／ｍｌであった。各サルには１０−２ウィルス希釈液１ ｍｌを気管内接種し、１ｍｌは外鼻孔に滴下して接種した。したがって、全ウィ ルス投与量は２ＸＩＯ’　ＴＣＩＤＳ。／サルであった。プロアントシアニジン ポリマーＡによる処置を８時間後に再開し、１群島たり３匹のサルにプロアンド シアニジンポリマーＡ１．０．０．５およびｏ、２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与 した。午前８時と午後８時の１日２回の処置を合計７日間続けた。

ウィルス脱落を検定するために、毎朝プロアンドシアニジンポリマーＡで処置す る前に、ダクロン製の鼻咽頭綿棒で喉の分泌物を毎日採集した。綿棒を組織培養 培地（１０％ウシ胎児血清およびペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾ ンを含む最小必須培地）１．０ｍｌ中に置いた。２４ウエルのプレート中に成長 させたＢ５Ｃ−４０細胞のウェルに二重試験で接種しておいた１０倍希釈物を調 製することによって、喉分泌物溶液の滴定を行った。Ｃ０２インキユベーター中 、３７℃でインキュベートした後、顕微鏡試験により各標品のウィルスの細胞変 性を観察し、１ｍ】当たりのＴＣＴＤ、、のｌｏｇ、。として力価を表現した。

毎朝の標品採集のときに、各サルの咳、クシャミおよび呼吸困難を含む鼻漏、そ の他の呼吸症状の有無を観察した。動物飼育者はサルの日常飼育における咳やク シャミがあれば記録した。ウィルス接種の１４日後に各サルから血液を採集し、 呼吸合胞体ウィルスの約１００　ＴＣＩＤ５ｏに対する中和アッセイにより、血 清の抗体力価を試験した。

プロアントシアニジンポリマーＡの静脈内投与の結果を表１１にまとめた。３匹 の対照群の各サルは呼吸合胞体ウィルスに感染し、口腔咽頭に７からＩＯ日日間 たはそれ以上の期間ウィルスを落屑した。３匹の対照のうちの２匹は、ウィルス 力価が５および６１ｏｇ＋ｏに達し、３匹目では３．５１ｏｇ＋。であった。最 高用量（Ｉｍｇ／ｋｇ／日）でプロアントシアニジンポリマーＡを投与されたサ ルではウィルス脱落の期間およびウィルス脱落の力価ははるかに低かった。１匹 目のサルはウィルスを１日、２匹目は３日間、３匹目は４日間脱落した。あるサ ルでは最大ウィルス力価は２］ｏｇであった。中程度の用量（０，５ｍｇ／ｋｇ ／日）でも２匹のサルに脱落期間の短縮が見られ、３匹目のサルは口腔咽頭に９ 日間ウィルスを分泌した。３匹のうちの２匹で最大力価は４１０ｇであり、３匹 目では３１ｏｇであったが、ウイルス力価は一般に低かった。最も低い用量（０ ，２ｍｇ／ｋｇ／日）では最小の効果が観察された。ウィルス脱落は６または７ 日間見られ、２匹のサルでは３１０ｇ１ｏの最大力価で、３匹目のサルでは５１ ｏｇであった。呼吸合胞体ウィルスに対する抗体力価を１４日日月すべてのサル で測定し、力価はｌ：４０から１：１６０であった。

各処理群に対する毎日の平均１０ｇ１ｏ力価を示す（表１２）。

サンプリングした各日において、３つの処置群のそれぞれにおける平均力価はコ ントール群の平均力価と比較してより低かった。

平均力価はＩｍｇ／ｋｇ／日処置群においてかなり低く、他の２群でも用量相関 の低下が見られた。

プロアントシアニジンポリマーＡで処置したサルよりも対照群のサルに臨床的症 状が多く観察された（表１３参照）。鼻漏が最もよく観察される症状であり、３ 匹のコントールのそれぞれに見られた。サンプリング期間および研究実施期間に おけるサルの毎日の観察において毒性は何ら観察されなかった。

（来貢以下余白） 要約すると、プロアントシアニジンポリマーＡはアフリカミドリザルの呼吸合胞 体ウィルス感染に対して顕著に有利な効果が見られた。用量１．０ｍｇ／ｋｇを １日２回で静脈内注射すると、口腔咽頭からのウィルス脱落期間を短縮し、ウィ ルス脱落の力価を低下させ、また臨床的症状を軽減させた。用量０．５ｍｇ／ｋ ｇを１日２回で投与しても上記した感染の３つのパラメーターすべてにおいて有 効に低下させた。ただし、高用量のときよりもその程度は少ないことが観察され た。

（来貢以下余白） ９、インフルエンザＡ治療のためのプロアントシアニジン・ポリ雄または雌のＢ ＡＬＢ／Ｃマウスをインビボ試験に用いて、インフルエンザＡに対するプロアン トシアニジンポリマーＡの効果性を研究した。マウスは１３〜１６ｇの体重で、 シモンセン・ラボラトリーズ（Ｇｉｌｒｏｙ、カリフォルニア州）から入手した 。マウスは、使用に先立って２４時間隔離され、Ｗａｙｎｅ　Ｌａｂ　ＢＩｏｘ と水道水で飼育された。動物を一度感染させたら、０．００６％オキシテトラサ イクリン（ファイザー、ニューヨーク、ニューヨーク州）を、起こりつる細菌の 二次感染を抑えるために、飲用水に添加した。

インフルエンザＡ／ＮＷＳ／３３　（ＨＩＮＩ）は、ミシガン大学（Ａｎｎ　Ａ ｒｂ。

ｒ、ミシガン州）のに、Ｗ、　Ｃｏｃｈｒａｎより得られた。ウィルスのプール は、マシン・ダービー大腎臓（ＭＤＣＫ）細胞の集密的細胞単層を感染させ、５ ％ＣＯ□中、３７℃で細胞を培養し、ウィルスの細胞変性効果が９０〜１００％ となる３〜５日目に細胞を採取することにより調製した。ウィルス株をアンプル に入れて、使用するまで一８０℃に保存した。

プロアントシアニジンポリマーＡは、毎日適当な濃度で、注射用滅菌水（ＷＦＩ ）に溶解して直ぐに使用した。ｌ−アマンタジンＨＣＩ　（アマンタジン）は、 シグマ（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、滅菌生理食塩水に溶解した。

１−β−Ｄ−リボフラノシルー１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミド （リバビリン）は、ｆｃＮ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、　（ コスタメーサ、カリフォルニア州）から購入して、滅菌生理食塩水に溶解した。

耳探針を備えたＯｈｍｅｄａ　Ｂｌｏｘ　３７４０パルス酸素計（Ｏｈｍｅｄａ 、ルイスビリ、オハイオ州）を用いた。

［マウスにおけるインフルエンザＡおよびＢウィルスの感染に対するセレナシフ リンの効果」　（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　５ｅｌｅｎａｚｏｆｕｒｉｎ　ｏｎＩｎ ｆｌｕｅｎｚａ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　 Ｍｉｃｅ″）　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓ、、　６：３４３−５３（１９８６ ）で、Ｓｉｄｗｅｌｌ、　ＲＷ、　Ｈｕｆｆｍａｎ　Ｊ）Ｉ、　Ｃａ１ｌ　Ｅ、 Ｗ。

、　Ａｌｇｈａｍａｎｄａｎ　）１．、Ｃｏｏｋ　Ｐ、Ｄ、、　Ｒｏｂｉｎｓ、 　Ｒ，に、により記載されたように、それぞれのマウスの肺をホモジナイズし、 異なる希釈の試料をＭＤＣＫ細胞中の感染性ウィルスについて三反復実験で検定 した。

２種類の実験を以下のように行なった。

実験１：　１７匹の雄マウスと１７匹の雌マウスに、約９０％致死量のウィルス （０，０６ｍｌ）を鼻内［（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ　（ｊ、ｎ、）］に感染 させた。このウィルス接種物は、ＭＤＣＫ細胞において約１０’細胞培養物５０ ％感染投与量に等しいものであった。３０、■０または３ｍｇ／ｋｇ／日のプロ アントシアニジンポリマーＡ１または１２５　ｍｇ／ｋｇ／日のアマンタジンを 用いる治療は、ウィルスにさらす２日前に始めて、毎日１回８日間続けた。動脈 酸素飽和（Ｓａｌｔ）のパルス酸素計の読みは、ウィルスにさらした後のｌＯ日 日間通して、５匹の雄マウスと５匹の雌マウスについて毎日測定し、１４日目止 ２１日日月再び測定した。感染の２．４．６．８、ｌ０１１４および２１日日月 、３匹のマウス（２匹の雄と１匹の雌、または２匹の雌と１匹の雄）を殺し、そ れらの肺を取出し、肺硬化の評定を行い、ウィルス力価のレーザーアッセイのた めに凍結した。硬化は、０（正常）から４（１００％硬化）まで評価した。５ａ Ｏｔの測定に用いた同じ動物を２１日間飼育し、死んだときに死（ｄｅａｔｈｓ ）と記録した。毒性対照として、３匹の雄と３匹の雌の偽感染マウスを、試験化 合物のそれぞれの投与量にて同時に処置した。これらの動物は、正常な未処置の マウスとともに、処置の前と最終処置の１８時間後ただちに体重の測定を行なっ た。

実験２：　この実験は、治療をウィルスにさらした４時間後に始めた以外は、実 験１と同じであった。

統計学的評価：　生存マウス数の増加は、カイ二乗分析を用い、Ｙａｔｅの補正 を行なって評価した。平均生存時間の増加、ウィルス力価および５ａＯｚ値の差 異は、を−試験により分析した。肺硬化評点は、評定された合計分析により評価 した。マツキントツシュＩ■コンピューター上で動（Ｅｘｓｔａｔｉｘ　（登録 商標）プログラムを用いて、士標準誤差（Ｓ、　Ｅ、　）を決定した。

これら実験の結果の概要は、表１４と表１５に示す。この二つの実験の概要は、 検定が行なわれたすべての時間点から集めた平均データを示す。これらの実験の 毒性対照は、３０　ｍｇノｋｇ／日の用量のプロアントシアニジンポリマーＡが マウスに対して毒性があることを示した。

実験ｌ　（早期治療開始）：　実験ｌの要約（表１４）は、肺硬化の減少に基づ いて３０および１０　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のプロアントシアニジンポリマー Ａがインフルエンザ病を顕著に抑制することを示している。ＩＯおよび３　ｍｇ ／ｋｇ／日の投与量を受けた感染雌マウスでは、３ａ０２％が顕著に増加した。

アマンタジンは、これらの実験では、ポジティブ対照として用いられた。アマン タジンは、この実験において著しく効果的とは思われなかった。しかし、この特 別なインフルエンザウィルスは、アマンタジンに抵抗性があることがその後わか った。

これらのパラメーターのより詳細な検査は、実験１の図６〜図９に見ることがで きる。肺の硬化（第６図）は、初期の試料採取臼に特に抑制された；　硬化は、 残りの実験を通して、すべてのグループで徐々に増加したが、ウィルス対照のレ ベルに達することはなかった。

肺ウイルス力価（第１Ｏ図）は、研究初期には減少しなかったが、８日目と１０ ０日目で（こ、プロアントシアニジンポリマーＡをｌＯおよび３　ｍｇ／ｋｇ／ 日の投与量で治療したマウスにおいて有意な減少が見られた。

ＳａＯ□のデータは雄および雌マウスのために分けたが、これは、それぞれの性 別の５匹の動物をこれらの測定に用いたためである。基本的に、５ａＯｚの減少 の抑制は、いずれかの化合物で処置した雄マウスにおいては見られなかった（第 １２図）。しかし、雌マウスは比較的よく応答するように思われ、ＩＯおよび３ 　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のプロアントシアニジンポリマーＡはＳａＯ□の減少 を約１０％だけ阻害した（第１３図）。注目すべきことは、この実験において、 治療は６日目で止め、処置された動物の５ａ０２はその翌日までに急速に減少し 始めたことである。このことは、治療をさらに２〜３日間続ける必要性を示唆し ている。

実験２（晩期治療開始）：　この実験の結果の要約は表１５に見られる。注目す べきことは、この遅延治療実験において、毒性対照のすべての雄マウスは、高投 与量のプロアントシアニジンポリマーＡ処置に耐えて生き延びたが、これらマウ スは顕著に体重を失ったことである。これらの動物は、実験１で用いたものより もわずかに年齢が高く、平均１ｇ多い体重を持っていた。　実験１に見られるよ うに、感染させて、治療したグループにおいて、生存マウスの有意な増加は見ら れなかったが、１０および３　ｍｇ／ｋｇ／日のプロアントシアニジンポリマー Ａで処置した雌マウスにおいて、平均生存時間の有意な増加が観察された（表１ ５）。全体的な平均肺肝点は再度減少した。

１日おきの肺硬化の所見は第１０図に示す。プロアントシアニジンポリマーＡ治 療は再び硬化の抑制をもたらしたが、早期に開始した治療の場合よりも程度は低 かった。

肺ウイルス力価（第１１図）は、プロアントシアニジンポリマーＡ治療によって 、わずかな程度減少しただけであった。

雄と雌マウスの５ａ０２データを図１２と図１３に要約する。実験１で観察され たように、雌マウスは、雄よりもプロアントシアニジンポリマーＡ治療に対し良 く応答する傾向があり、やや変動するが、ＳａＯ□減少の用量一応答抑制を有し ていた。本物質はネズミインフルエンザ感染症に対して中程度の効果を有してい るというのが、我々の結論である。

アマンタジンに活性がないことを鑑みて、インフルエンザウィルス感染症に対し て高い活性を持つことが知られているリバビリンを７５　ｍｇ／ｋｇ／日の投与 量で用いて実験を行なった（Ｓｉｄｗｅｌｌ、　Ｒ１、、Ｈｕｆｆｍａｎ、　Ｊ 、Ｈ，、Ｈａｒｅ、　Ｇ、Ｐ、、　Ａ１１ｅｎ、　Ｌ、Ｂ、、　Ｗｉｔｋｏｗｓ ｋｉ、　Ｊ。

Ｔ、、　Ｒｏｂｉｎｓ、　Ｒ，、”Ｂｒｏａｄ−５ｐｅｃｔｒｕｍ　ＡｎＬｉｖ ｉｒａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｒａｚｏｌｅ：　１−β−ｏ−ｒ　＋ 　ｂｏ　ｆ　ｕｒａｎｏｓｙ　１−１．２．４−　ｔ　ｒ　１ａｚｏ　Ｉｅ−３ −ｃａｒｂｏｘａｍｉ　ｄ■香B ５ｉｅｎｃｅ、　１７７：７０５−６　（１９７２））　。該薬物をウィルス接 種後の４時間口から始めて、腹腔内に毎日２回５日間投与した。本実験に用いら れた同じ病気のパラメータをリバビリンの実験にも用いた。

このリバビリン実験の全体的な結果を表１６に示す。この薬物は、致死毒性はな かったが、宿主に対して中程度の体重減少を引き起した。感染させ、リバビリン で処置したすべてのマウスは、その感染に耐えて生き残った。肺硬化と肺ウイル ス力価は著しく減少上平均３ａＯ２減少が抑制された。肺硬化、ウィルス力価、 および３ａ０２データをさらに詳しく図１４〜図１６に示す。

従って、この実験において、リバビリンは顕著なインフルエンザ抑制を示した。

プロアントシアニジンポリマーＡは、インフルエンザＡ　（ＨＩＮＩ）で感染さ せたマウスに腹腔内に毎日１回８日間投与するときに、感染の中程度の抑制を示 した。本物質は、ウィルスにさらす２日前に治療を始めたときに最も効能があっ たが、治療をウィルス接種の４時間後まで遅らせたときにも有意な抑制が見られ た。毒性対照のマウスは、約３０　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量に耐えて生き残るこ とはなかった。病気の抑制効果は、主としてｌｏ　ｍｇ／ｋｇ／日に限定された 。アマンタジンは、このインフルエンザウィルス株に対して効果的ではなかった 。リバビリンはウィルス感染症に対して抑制的であった。プロアントシアニジン ポリマーＡは、抗インフルエンザウイルス活性をもつと結論付けられる。

（来貢以下余白） らのサルはそれぞれ３匹のサルの４グループに無作為に分割した。プロアントシ アニジンポリマーＡを０．５％グルコースに溶解して、１Ｏ１３，３、または１ ．０　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量でそれぞれのグループに該薬物を投与した。３匹 のサルの対照グループには、該薬物を含まない０．５％グルコースを与えた。そ れぞれのサルは、毎日２回午前８時に７日間、分割用量として静脈内ポーラス注 射による治療を受けた。鎮静させたサルの伏在静脈内に注射した。表１７を参照 。

治療はウィルス接種の４時間前に始めた。４時間後に、ＰＩＶ−３の１０−２希 釈液を調製し、１　ｍｌ容量物を気管内に接種し、１　ｍｌ容量物を外鼻孔に置 いた。接種されたウィルスの力価は、ｍｌあたり１０３ＳＴＣＩＤ５．であった 。

咽喉スワブを毎日取り、ｌ　ｍＩの組織培養培地に置いた。液体をスワブからし ぼり出し、この組織培養液体をウィルスに対して滴定した。咽喉スワブの１０倍 希釈物を調製して、Ｖｅｒｏ細胞を播いた２４ウ工ル組織培養皿のウェル中に２ 通りずつ接種した。力価は、ウィルス細胞病理学のために培養物の顕微鏡検査に より決定した。鼻漏、くしゃみおよび咳を含む臨床的症状について、サルの観察 を毎日行なった。感染後の１４日間と２１日間に、血清中和検定法を用いるＰＩ Ｖ−３に対する抗体の検出のために血液を取った。

１２匹のサルそれぞれをＰＩＶ−３で感染させたが、ウィルス接種後の２４時間 以内にその大部分からウィルスが脱落した。ウィルスの脱落は、すべてのサルに おいて感染後８日目まで続き、一部のサルは９日目と１００日目通してウィルス が脱落した。表１８を参照。

それぞれのグループの平均ウィルス力価を表１９に示す。１０　ｍｇ／ｋｇ／日 のプロアントシアニジンポリマーＡは、感染後のすべての日において、ｌ　ｌｏ ｇもしくはそれよりも良く平均力価を減少させるように思われる。３．３　ｍｇ ／ｋｇ／日の投与量は、１０　Ｈ／ｋｇ／日の投与量よりも若干低い効果を有し ているように思われたが、再度すべての力価は対照よりも低かった。認めうる効 果は、１．０＋ｎｇノｋｇ／日では見られなかった。

呼吸器感染の症状は、プロアントシアニジンポリマー八で処置した３グループの いずれのグループよりも、対照のサルにおいてより共通していた。１グループに つき３匹のサルのＩＪ日日間観察において、症状は合計３３日間お二りうる。プ ロアントシアニジンポリマーＡを１０　ｍｇ／ｋｇ／日で受けたグループ（こお いて、これら３３日のうち７日のみに、症状のあるサルが観察された。３．３　 ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の結果は、わずかに２日であり、ｒ、　ｏ　ｍｇ／ｋｇ ／日の投与量の結果は７日であった。観察された主要な症状は、鼻漏であった（ 表２０を参照）。

ウィルス接種後の１４日間と２１日間のＰＩＶ−３に対する抗体力価を報告する 。すべてのサルは、未処置の対照と比較するときに、処置したサルにおいてわず かに高い力価を有すると思われる抗体を発現することが観察された。表２１を参 照。

従って、プロアントシアニジンポリマーＡは、１０および３．３ｍｇ／ｋｇ／日 のプロアンドシアニジンポリマーＡで処置したアフリカミトリサルにおいて、タ イプ３のパラインフルエンザウィルスの経過に有利な効果を持つように思えた。

プロアンドシアニジンポリマーＡは、感染サルの咽喉において脱落したウィルス の力価を減少させるように見え、この感染で見られた症状を軽減したようだ。

表１７．　タイプ３のパラインフルエンザウィルスに対するブロアノドシアニジ ン・ポリマーへの抗ウイルス活性を評価するために選ばれたアフリカミドリザル の治［群す４１１１ｔ　ｔｌ’ｌ　ｈｔ　（ｋ　ｇ）　ブロアントノアニノン・ ポリマーＡによる治療１０．１単純ヘルペスウイルスのタイプ２の膣炎の治療た めのプロアントシアニジンポリマーへの効果性プロアントシアニジンポリマーＡ の効果性を研究するために、単純ヘルペスウィルス・タイプ２に対するガンシク ロビルと比較させて、インビボ実験を行なった。ガンシクロビルは、単純ヘルペ スウィルス・タイプ２に対して効果的であることが知られている。

一連の実験において、両組酸物は腹腔内注入のために生理食塩水に溶解すること によって処方した。

実験の開始時にそれぞれおよそ２０グラムの体重のスイスのウェブスター雌マウ ス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　Ｌａｂｓ、　Ｇ１１ｒｏｙ、カリフォルニア州）に、単 純ヘルペスウィルス・タイプ２　（Ｈ５Ｖ−２）のＥ１９４株を膣内へ感染させ た。これは３段階の方法で達成した。最初に、それぞれのマウスの膣を０．ＩＮ のＮａＯＨに漬けた綿棒アプリケーターで５秒間消毒した。この処理は感染にう まくかかるように膣部分を刺激する。約１時間後、それぞれの膣を５秒間、湿さ れていないアプリケーターで拭く。次に、ウィルス培地に浸したアプリケーター を使い、それをそれぞれのマウスに約２０秒間塗りつけた。

該綿棒を、それが適所にある間、穏やかにかつゆっくりと前後に捻った。

ウィルス感染の６時間後、プロアントシアニジンポリマーＡ、ガンシクロビル、 またはブラシーボを腹腔内（ｉ、ｐ、）投与した。

治療はさらにウィルス感染後１〜７日月まで毎日２回腹腔内に行なった。それぞ れの化合物の毎日の投与量は、３０　Ｂ／ｋｇ／日であり、１回の注入に１５　 ｍｇ／ｋｇを投与する。感染の０日目は、１回の投与がなされるだけなので、そ の日の投与量は１５　ｍｇ／ｋｇ／日であった。

５匹のマウスのグループを、ウィルス感染について既に記載した方法を用いて偽 装感染させた。ただし、最終的にウィルスを存在させなかった。これらマウスは 、上記と同じ方法で、同じ回数処置した。マウスは毎日その生存がチェックされ 、最初の治療（０日目）前と最後の治療（８日目）後に、その体重を記録した。

感染マウスの病変評価は、感染の３〜Ｉ４日間、毎日決定した。

■＋の評価は、膣のまわりに接した赤みを示す。２＋は、肛門に向かって病変の 広がりを示す。３＋は、膣から肛門までの（通常は腫張を伴う）病変を示す。こ れには、一部のマウスが膣病変とさらに尾の病変を有することもあるために、バ リエーションがある。多くのマウスは死につつあるために、死期に近い病変評価 は、１４日間の終わりで終了させた。もし、このことがな哀れないとしたならば 、大部分の冒されたマウスが次々と死ぬにつれて、ブラシーボ群の病変評価が下 がったであろうと思われる。一部の動物は、後肢麻痺を現した（そしてその後に 死んだ）。この状態は病変評価に加えなかった。

死亡は２１日間毎日記録した。平均死亡日数の計算は、死んだマウスのみを考慮 に入れた。膣ウィルスの力価は、ウィルス接種の３日後に膣スワブより得られた ウィルスを滴定することにより行なわれた。これらの滴定は、Ｖｅｒｏ細胞中で 、９６ウエルプレート中で行なった。ウィルス力価の計算は、Ｒｅｅｄ、　Ｌｊ 、およびＭｅｕｎｃｈ。

Ｍ、、　Ａｍ、　Ｊ、　ｌ（ｙｇ、＋　２７：４９３−４９８　（１９３８）の ５０％終点希釈法で行なっ生存の統計学的解釈（フィッシャー精密試験）、死ま での平均日数（スチューデントを試験）およびウィルス・力価（スチューデント を試験）は、両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）分析により行なった。

以下の表２２は、標準偏差を伴う平均病変評点とこの実験の統計的分析を示す。

表２２．腹腔内プロアントシアニジン・ポリマーＡ治療のマウスにおける単純ヘ ルペスウィルス・タイプ２　ＧＩＳＶ−２）膣炎に対する効果。

プロアントシアニジンポリマーＡは、プラシーポ群に比較して、平均病変評点の 統計学的に有意な減少を示した。ガンシクロビルも効果的であった。第１７図は 、ブラシーボ群とガンシクロビルに比較して、ｋｇあたり３０　ｍｇのプロアン ドシアニジンポリマー八により示される病変抑制程度の視覚的印象を提供するも のである。表２３は処置したマウスの生存を示す。

化合物　投与量　生存マウス／全体（％）平均日数　ウィルス力価（３日目）（ 死までの平均日数とウィルス力価のパラメータ）プロアントシアニジンポリマー Ａは、増加した生存（ブラシーボ群の１５％に比べて４０％生存）を示した。ガ ンシクロビル群は、１００Ｘの生存を有した。表２３もプロアントシアニジンポ リマーＡで処置したマウスが、ブラシーボ群よりも少ないウィルスを持っていた ことを示しているが、この結果は統計学的に有意ではなかった。ガンシクロビル は、ウィルス力価の有意な減少をもたらした。

毒性対照マウスの結果は、マウスはプロアントシアニジンポリマーＡに対してよ く耐性があり、プロアンドシアニジンポリマーＡは用いられる投与量で副作用を 引き起こさないことを示した。

ガンシクロビルで処理したマウスは、プラシーボ群よりも体重増加が少なかった 。

従って、３０　ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で腹腔内に投与されたプロアントシアニ ジンポリマーＡは、このモデルにおいて、中程度の抗ウィルス活性を有した。マ ウスに対するプロアントシアニジンポリマーＡ製剤の明らかな毒性は存在しなか った。

プロアントシアニジンポリマーＡ組成物が経口投与される別の一連の予備実験は 、いくらかの抗Ｈ３Ｖ−２活性を示したが、これは最も高い投与量、すなわち２ ７０　ｍｇ／ｋｇ／日においてのみであった。

別の一連の実験において、プロアンドシアニジンポリマーＡ組成物は、Ｈ３Ｖ− ２に対する局所投与のために処方された。プロアントシアニジンポリマーＡの効 能をガンシクロビルおよびアシクロビルと比較する。ガンシクロビル粉末とアシ クロビルクリームの両方ともに、市販さたものを入手した。賦形薬として、そし て局所プラシーボ群として用いられるスクイブ・クリーム基剤＃８も、市販され ているものを入手した。

マウスの感染方法、感染を評価するために測定される毒性対照およびパラメータ ーの設定方法は、腹腔内試験について既に記載したものと同じであった。感染口 での局所処置は、＋６時間で行なった。この処置は、さらに７日間以上、毎日２ 回行なった。

プロアントシアニジンポリマーＡの２回投与による７、５日間の処置の結果、１ ０％用量についての評価期間の病変評点は統計学的に有意に減少した。このこと は、第１８図並びに表２４にグラフで紹介されている。５％用量もプラシーボ群 に比べて病変の進展を減少させたが、その結果は統計学的に有意ではなかった。

アシクロビル・クリームは、感染動物において、病変の形成をほとんど完全に妨 げた。５％および１０％の用量のプロアントシアニジンポリマーＡで処置したマ ウスは、ブラシーポ対照よりも数多くのマウスが感染に耐えて生き延び（表２５ ）、膣のウィルス力価は、１０％用量で減少した。さらに、１４日日月病変を持 たないマウスの数は、プラシーポ群におけるよりも多かった。非感染の毒性対照 マウスは、クリーム製剤による治療の結果として、体重が減少したり、死ぬこと はなかった（表２５）。

局所的に投与されたプロアントシアニジンポリマーＡは、１０％クリームとして 活性があったことを結論付けることができる。わ重症度までに進行した。プロア ントシアニジンポリマームクリーム処方物は、いくぶん乾燥した感触があったが 、これは、該組成物がスクイブ・クリーム基剤からの水の一部を水和して、吸収 するためであった。このことは、プロアントシアニジンポリマーＡクリームの効 能に影響を与えたかもしれない。当物質をクリーム基剤と混合する前に水中で部 分的に水和することは、より水性で生体に使用可能な局所投与用製品を提供する ことができよう。

表２４．プロアントシアニジン・ポリマーＡ局所治療のマウス］こおける単純ヘ ルペスウィルス・タイプ２　（Ｈ３Ｖ−２）膣炎に対する効果１１、Ｒ３Ｖの治 療のためのプロアントシアニジンポリマーＢの効プロアントシアニジンポリマー Ａの試験と同じ手順で行なったＲ８Ｖ抗ウィルス活性のインビトロ試験の結果は 、プロアンドシアニジンポリマーＢが効果的であり、６μｇ／ｍｌのＥＤｓ。を 有することを示すものである。

ここに記載され、特許請求された発明は、ここに開示された具体的な実施態様の 範囲に限定されるものではないが、これは、これら実施態様が本発明の幾つかの 側面の記載を意図するものであるからである。どんな同等な実施態様も本発明の 範囲内に入ることが意図される。実際、発明の多様な実施態様が、ここに示され 記載されたものに加えて、前述の記載に基づいて当業者に明白となるであろう。

そのような改良や修飾も、本特許請求の範囲に入ることが意図されるものである 。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ｔ”ｖｙ”　ｗｖ′ｖヘー／ｆＶ”＜−一〜翳２２０２００１８０　１６０　１ ４０　１２０　１００　８０　６０　４０　２０　０　ｐｐｍＦｆ６．４ ７　［（ Ｖ台＃賠士 ロ　ト　ψ　Ｃ？　１　〜　− （０１ＥＩＯ’ｌ）　！）＃χ’Ｉ（Ｐ（ｓ屑嬉士ＣＬ ε ｏ／、′０ΩＳ　調走 ＣＬ ε ｇ鰭！１１哨士 ロ　ψ　マ　ｃＸＪ。

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Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．治療上効果的な量のプロアントシアニジンポリマーを含む抗ウイルス剤を温 血動物に投与することから成る、呼吸器ウイルス感染症の治療方法。
2. ２．プロアントシアニジンポリマーが２−３０個のフラボノイド単位を含む、請 求項１記載の方法。
3. ３．プロアントシアニジンポリマーが２−１５個のフラボノイド単位を含む、請 求項１記載の方法。
4. ４．プロアントシアニジンポリマーが２−１１個のフラボノイド単位を含む、請 求項１記載の方法。
5. ５．フラボノイド単位がカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、ガロエピカテ キン、フラバノール、フラボノール、フラバンジオール、ロイコシアニジン、ア ントシアニジン、またはこれらの組合せである、請求項２、３または４記載の方 法。
6. ６．呼吸器ウイルスがＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｌａｌ）ウ イルスである、請求項１記載の方法。
7. ７．呼吸器ウイルスがパラインフルエンザウイルス３、インフルエンザＡウイル ス、インフルエンザＢウイルス、または中耳炎あるいは外耳炎に関連したウイル スである、請求項１記載の方法。
8. ８．治療上効果的な量の、６−３０個のフラボノイド単位を有するプロアントシ アニジンポリマーを含む抗ウイルス剤を温血動物に投与することから成る、ウイ ルス感染症の治療方法。
9. ９．治療上効果的な量の、６−１５個のフラボノイド単位を有するプロアントシ アニジンポリマーを含む抗ウイルス剤を温血動物に投与することから成る、ウイ ルス感染症の治療方法。
10. １０．治療上効果的な量の、６−１１個のフラボノイド単位を有するプロアント シアニジンポリマーを含む抗ウイルス剤を温血動物に投与することから成る、ウ イルス感染症の治療方法。
11. １１．フラボノイド単位がカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、ガロエピカ テキン、フラバノール、フラボノール、フラバンジオール、ロイコシアニジン、 アントシアニジン、またはこれらの組合せである、請求項８、９または１０記載 の方法。
12. １２．ウイルスがパラミクソウイルス、オルソミクソウイルスまたはヘルペスウ イルスである、請求項８記載の方法。
13. １３．プロアントシアニジンポリマーを静脈内に投与する、請求項１または８記 載の方法。
14. １４．プロアントシアニジンポリマーを腹腔内に投与する、請求項１または８記 載の方法。
15. １５．プロアントシアニジンポリマーを皮下に投与する、請求項１または８記載 の方法。
16. １６．プロアントシアニジンポリマーを筋肉内に投与する、請求項１または８記 載の方法。
17. １７．プロアントシアニジンポリマーを経口的に投与する、請求項１または８記 載の方法。
18. １８．プロアントシアニジンポリマーを局所的に投与する、請求項１または８記 載の方法。
19. １９．プロアントシアニジンポリマーをエーロゾルで投与する、請求項１または ８記載の方法。
20. ２０．プロアントシアニジンポリマーを約０．１−約１０ｍｇ／ｋｇの範囲で腹 腔内に投与する、請求項１４記載の方法。
21. ２１．プロアントシアニジンポリマーを約５．０−約３０ｍｇ／ｋｇの範囲で経 口的に投与する、請求項１７記載の方法。
22. ２２．プロアントシアニジンポリマーを適当なビヒクル中約５−約１５％の濃度 範囲で局所的に投与する、請求項１８記載の方法。
23. ２３．プロアントシアニジンポリマーを約５−約３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投 与する、請求項１９記載の方法。
24. ２４．フラボノイド単位が互いと単一にまたは二重に結合している、請求項２ま たは８記載の方法。
25. ２５．プロアントシアニジンがＩ、ＩＩおよびＩＩＩ：▲数式、化学式、表等が あります▼ＩＩＩ〔式中、ａ、ｂ＝１−３、ｘ＝０または１、ｎ＝０−２８〕か ら選ばれる構造を有する、請求項１記載の方法。
26. ２６．ｎが０−１３である、請求項２５記載の方法。
27. ２７．ｎが０−９である、請求項２５記載の方法。
28. ２８．プロアントシアニジンポリマーが構造ＩＶ：▲数式、化学式、表等があり ます▼ＩＶ〔式中、ｘ、ｙ＝１−３、ｚ＝１または２〕を有する単量体フラボノ イド単位を２−３０個含む、請求項１記載の方法。
29. ２９．プロアントシアニジンポリマーが２−１５個の単量体フラボノイド単位を 含む、請求項２８記載の方法。
30. ３０．プロアントシアニジンポリマーが２−１１個の単量体フラボノイド単位を 含む、請求項２８記載の方法。
31. ３１．プロアントシアニジンがＩ、ＩＩおよびＩＩＩ：▲数式、化学式、表等が あります▼Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ Ｉ〔式中、ａ、ｂ＝１−３、ｘ＝０または１、ｎ＝４−２８〕から選ばれる構造 を有する、請求項８記載の方法。
32. ３２．ｎが４−１３である、請求項３１記載の方法。
33. ３３．ｎが４−９である、請求項３１記載の方法。
34. ３４．次の性質： （ａ）水および／または水溶液中で溶解する能力；（ｂ）動物やヒトにｉｎ　ｖ ｉｖｏ投与した場合に顕著な抗ウイルス効果を発揮する能力；および （ｃ）カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、ガロエピカテキンおよびこれら の組合せより成る群から選ばれるフラボノイド単位を含む構造をもつこと； により特徴づけられる、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）種から得られるプロアントシ アニジンポリマー、そのエステル、エーテルおよびオキソニウム誘導体。
35. ３５．約２−約１１個のフラボノイド単位を有する、請求項３４記載のプロアン トシアニジンポリマー。
36. ３６．平均的７個のフラボノイド単位を有する、請求項３４記載のプロアントシ アニジンポリマー。
37. ３７．クロトン・レクレリ（Ｃｒｏｔｏｎ　Ｉｅｃｈｌｅｒｉ）から得られる、 請求項３４記載のプロアントシアニジンポリマー。
38. ３８．次の性質： （ａ）３３５０−２５００の範囲に強いピークを、１６１２、１４４９、１３４ ８、１２０２、１１４４、１１０７、１０６８および１０２７ｃｍ−１に他のピ ークを示す赤外分光分析；および （ｂ）波長２０２、２３５（肩）、２７５、および３０５（肩）に幅広のピーク を示す紫外分光分析； により特徴づけられる、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）種から得られるプロアントシ アニジンポリマー、そのエステル、エーテルおよびオキソニウム誘導体。
39. ３９．次の性質： （ａ）実質的に図１に示すような赤外スペクトル；および（ｂ）波長２０２、２ ３５（肩）、２７５、および３０５（肩）に幅広のピークを示す紫外分光分析； により特徴づけられる、クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）種から得られるプロアントシ アニジンポリマー、そのエステル、エーテルおよびオキソニウム誘導体。
40. ４０．さらに次の性質： （ｃ）約４６０ｎｍの波長での可視スペクトル吸収；により特徴づけられる、請 求項３８記載のプロアントシアニジンポリマー。
41. ４１．さらに次の性質： （ｃ）約４６０ｎｍの波長での可視スペクトル吸収；により特徴づけられる、請 求項３９記載のプロアントシアニジンポリマー。
42. ４２．さらに次の性質： （ｃ）実質的に図３に示すような１２Ｃ　ＮＭＲスペクトル；により特徴づけら れる、請求項３８記載のプロアントシアニジンポリマー。
43. ４３．さらに次の性質： （ｃ）実質的に図３に示すような１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル；により特徴づけら れる、請求項３９記載のプロアントシアニジンポリマー。
44. ４４．さらに次の性質： （ｄ）実質的に図３に示すような１３Ｃ　ＮＭＲスペクトル；により特徴づけら れる、請求項４０記載のプロアントシアニジンポリマー。
45. ４５．次の性質： （ａ）水および／または水溶液中で溶解する能力；（ｂ）抗ウイルス効果を発揮 する能力；および（ｃ）カテキンとエピカテキンから成るフラボノイド単位；に より特徴づけられる、カロフィラム・イノフィラム（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ　 ｉｎｏｐｈｙｌｕｍ）から得られるプロアントシアニジンポリマー、そのエステ ル、エーテルおよびオキソニウム誘導体。
46. ４６．実質的に図５に示すような赤外スペクトルにより特徴づけられる、請求項 ４５記載のプロアントシアニジン。
47. ４７．２０２−２０４ｎｍおよび２７５−２８０ｎｍに吸収ピークを有するスペ クトルによりさらに特徴づけられる、請求項４６記載のプロアントシアニジン。
48. ４８．実質的に図４に示すような１２Ｃ　ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴づ けられる、請求項４７記載のプロアントシアニジン。
49. ４９．効果的な量のプロアントシアニジンポリマーを含む抗ウイルス剤を温血動 物に投与することから成る、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ ）ウイルス感染症の治療方法であって、当該プロアントシアニジンポリマーが、 （ａ）クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）の木の全体、樹皮、幹、根またはラテックスを 、約１−３個の炭素原子の低級アルコール、アセトン、水または他の水混和性溶 媒もしくはこれらの組合せにより抽出して水性可溶性画分を集め；（ｂ）この水 性可溶性画分を、移動相として緩衝液を含むまたは含まない水および／または水 と水混和性溶媒を用いて、ゲル濾過にかけるか；あるいは移動相として水および ／または水と水混和性溶媒を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにかけるか ；あるいは移動相として緩衝液を含むまたは含まない水および／または水と水混 和性溶媒またはアセトニトリルを用いて、ゲル透過クロマトグラフィーにかける か；あるいはこれらの組合せにかけ；そして（ｃ）約２００−３５０ｎｍにλｍ ａｘを有する、紫外分光分析により検出可能な画分を集める； ことから成る方法によりクロトンの木から得られ、当該プロアントシアニジンポ リマーが、約０．１−１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量範囲で非経口的に、約５ ．０−３０．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量範囲で経口的に、５−３０ｍｇ／ｋ ｇ／日の投与量範囲で吸入により投与される点に特徴がある、上記の治療方法。
50. ５０．クロトンの木がクロトン・レクレリ（Ｃｒｏｔｏｎ　ｌｅｃｈｌｅｒｉ） である、請求項４９記載の方法。
51. ５１．次の工程： （ａ）クロトン（Ｃｒｏｔｏｎ）の木の全体、樹皮、幹、根またはラテックスを 、約１−３個の炭素原子の低級アルコール、アセトン、水または他の水混和性溶 媒もしくはこれらの組合せにより抽出して水性可溶性画分を集め；（ｂ）この水 性可溶性面分を、移動相として緩衝液を含むまたは含まない水および／または水 と水混和性溶媒を用いて、ゲル濾過にかけるか；あるいは移動相として水および ／または水と水混和性溶媒を用いて、逆相カラムクロマトグラフィーにかけるか ；あるいは移動相として緩衝液を含むまたは含まない水および／または水と水混 和性溶媒またはアセトニトリルを用いて、ゲル透過クロマトグラフィーにかける か；あるいはこれらの組合せにかけ；そして（ｃ）約２００−３５０ｎｍにλｍ ａｘを有する、紫外分光分析により検出可能な画分を集める； から成る方法によりクロトンの木から得られるプロアントシアニジンポリマー組 成物。
52. ５２．クロトンの木がクロトン・レクレリ（Ｃｒｏｔｏｎ　ｌｅｃｈｊｅｒｉ） である、請求項４６記載の組成物。
53. ５３．次の性質： （ａ）３３５０−２５００の範囲に強いピークを、１６１２、１４４９、１３４ ８、１２０２、１１４４、１１０７、１０６８および１０２７ｃｍ−１に他のピ ークを示す赤外分光分析；および （ｂ）波長２０２、２３５（肩）、２７５、および３０５（肩）に幅広のピーク を示す紫外分光分析； によりさらに特徴づけられる、請求項５１記載の組成物。
54. ５４．実質的に図３に示すような１３Ｃ　ＮＭＲスペクトルによりさらに特徴づ けられる、請求項５３記載のプロアントシアニジンポリマー。
55. ５５．波長４６０ｎｍでの可視スペクトル吸収によりさらに特徴づけられる、請 求項５４記載の組成物。